Isolatie van bodemmicro-organismen met behulp van iChip-technologie

Samenvatting

De iChip-techniek maakt gebruik van een goedkoop en eenvoudig in-situ isolatieapparaat dat de snelheid van de ontdekking van nieuwe micro-organismen uit de bodem verhoogt. Nieuwe micro-organismen kunnen worden gebruikt voor verder onderzoek met betrekking tot onder meer het bodemmicrobioom of de ontdekking van natuurlijke producten.

Samenvatting

De iChip-isolatietechniek maakt gebruik van een in-situ isolatieapparaat dat de kweekbaarheid van voorheen niet-kweekbare micro-organismen verhoogt. Micro-organismen zijn een belangrijke bron van nieuwe chemie en potentieel bioactieve moleculen. Slechts 1% van de micro-organismen in het milieu kan echter worden gekweekt met behulp van conventionele laboratoriummethoden. Met de toename van antimicrobiële resistentie is het vinden van nieuwe medicijnen om infecties en ziekten te bestrijden van het grootste belang, en een cruciale methode voor het vinden van nieuwe moleculen is de ontdekking van nieuwe micro-organismen. Door kolonies van bodemmicro-organismen te incuberen in de putjes van een plaat met 96 putjes, afgedicht met een semipermeabel membraan en bovenop de grond te incuberen, komen de microben in contact met water en groeifactoren uit de bodem, waardoor nieuwe microben in een laboratoriumomgeving kunnen worden geïsoleerd. Na een periode van domesticatie in een iChip kunnen micro-organismen mogelijk worden ondergekweekt op conventionele media en worden gebruikt voor verder onderzoek. Dit apparaat is waardevol voor de ontdekking van bioactieve moleculen en onderzoek naar het bodemmicrobioom en is eerder in beide toepassingen gebruikt.

Inleiding

Omgevingsbacteriën zijn een rijke bron van natuurlijke producten (NP's)¹. Deze metabolieten zijn niet van vitaal belang voor het voortbestaan van de micro-organismen, maar worden in plaats daarvan geproduceerd om hun kolonisatie te vergemakkelijken door andere micro-organismen in hun omgeving te overtreffen². Evolutie heeft de chemische structuren en activiteiten van NP's verfijnd, waardoor ze effectieve antimicrobiële middelen zijn geworden. Zo'n voorbeeld is daptomycine, een antibioticum dat in 2003 door de FDA is goedgekeurd³. In de afgelopen jaren is microbiële resistentie toegenomen in voorkomen en ernst, en nieuwe geneesmiddelen zoals daptomycine staan als laatstelijnsbehandelingen tegen infecties die resistentie tegen oudere antibiotica hebben ontwikkeld⁴. De ontwikkeling van nieuwe antibiotica en andere medicijnen is essentieel om veelvoorkomende infecties en ziekten behandelbaar te houden.

Hoewel NP's vaak goede aanwijzingen zijn voor geneesmiddelen, wendde de farmaceutische industrie zich tot synthetische methoden voor het ontdekken van geneesmiddelen na de gouden eeuw van antibiotica in de jaren 1950 tot 1960⁵. Tegen de jaren 1970 werden dezelfde micro-organismen en antimicrobiële metabolieten herhaaldelijk opnieuw geïsoleerd, waarbij steeds minder nieuwe kandidaat-geneesmiddelen werden ontdekt ^1,6. Het bodemmicrobioom bevat een grote microbiële diversiteit, maar slechts een klein aantal micro-organismen kan onder conventionele laboratoriumomstandigheden worden geïsoleerd. De overgrote meerderheid van de bodemmicro-organismen van micro-organismen die door genomica worden gedetecteerd, worden niet waargenomen wanneer ze worden gekweekt met behulp van conventionele kweekmethoden, wat ertoe leidt dat het probleem wordt genoemd als "de anomalie van het aantal grote platen"⁷. Deze niet-kweekbare microben worden microbiële donkere materie genoemd omdat bekend is dat ze bestaan, maar niet in vitro kunnen worden bestudeerd totdat ze kunnen worden geïsoleerd als zuivere culturen. Deze niet-kweekbare micro-organismen kunnen waarschijnlijk een schat aan kandidaat-geneesmiddelen produceren, wat van groot belang is in het tijdperk van microbiële resistentie.

De iChip-techniek is een methode die kan worden gebruikt om het herstel van nieuwe micro-organismen uit het milieu te vergroten ^8,9. Deze technologie helpt bij het simuleren van de natuurlijke omgeving van bacteriën tijdens incubatie, waardoor de kweekbaarheid van micro-organismen wordt vergroot die anders conventionele laboratoriumomstandigheden niet kunnen overleven¹⁰. Gemodificeerde iChips zijn al ontwikkeld en gebruikt om micro-organismen te isoleren uit veel verschillende bronnen, zoals bodem, sediment, mariene omgevingen en dierlijke darmen 11,12,13,14,15,16. Misschien wel het meest impactvolle geval van het gebruik van deze technologie is geweest door NovoBiotic Pharmaceuticals, waar een nieuwe bacterie, Eleftheria terrae, werd ontdekt¹⁷. Dit micro-organisme bleek Teixobactine te produceren, een antibioticum van een nieuwe klasse, dat verschillende resistente bacteriesoorten remt die relevant zijn voor de menselijke gezondheid zonder gedetecteerde resistentieontwikkeling ^5,18. Dit was een indrukwekkende ontdekking, aangezien Teixobactine de eerste nieuwe klasse antibiotica is die in decennia is ontdekt en een teken is dat deze techniek een veelbelovende route is voor nieuwe ontdekkingen van geneesmiddelen en het overwinnen van de grote anomalie van het aantal platen¹⁹. Hierin wordt een aangepaste iChip gepresenteerd op basis van een eerdere publicatie van Berdy et al. die is geoptimaliseerd voor gebruiksgemak en contaminatiepreventie⁹.

Protocol

1. Mediavoorbereiding en sterilisatie

1. Bereid en steriliseer succinaat minimal salts media (SMS), dat bestaat uit 0,1 g aardappelzetmeel, 1 g casaminozuren, 0,125 g caseïnedigestaat en 15 g bacteriologische of technische agar in 1 L water.
2. Autoclaaf-steriliseren van de media en 100 ml water van moleculaire kwaliteit met behulp van een vloeistofcyclus van 20 minuten en 121 °C.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat alle andere items die in contact komen met het agar-celmengsel steriel worden gekocht, inclusief pipetpunten en centrifugebuisjes, anders autoclaveer u ze ook.

2. Gewijzigde iChip-constructie

1. Verwijder de bodems van de putjes in vier platen met 96 putjes met behulp van een agarponsgereedschap van 5 mm.
2. Snijd polycarbonaatmembranen van 0,05 μm in rechthoeken van 7,6 cm x 11 cm, of gelijk aan de afmetingen van de bodem van de plaat met 96 putjes.
3. Plak met een siliconenkit 0,05 μm polycarbonaat membranen op de bodem van de 96-putjes platen, zorg ervoor dat de lijm de putjes afdicht, maar de openingen van de putjes niet volledig bedekt. Laat minimaal 24 uur drogen of volg de instructies op de lijm.
   OPMERKING: Afdichtmiddel moet waterdicht, niet giftig en 100% siliconen zijn. De meeste aquariumafdichtingsmiddelen zullen goed werken.

3. Bereiding van celsuspensies

1. Label vier centrifugebuisjes van 15 ml A-D en vier centrifugebuisjes van 50 ml E-H en voeg aan elk 4,5 ml steriel water toe.
2. Meet 1 g aarde af in een centrifugebuis van 50 ml, voeg 10 ml steriel water toe en draai gedurende 10 minuten.
3. Laat de suspensie 10 minuten bezinken.
4. Pipetteer 0,5 ml van het supernatans met cellen uit de grond in buis A en meng grondig.
5. Voeg 0,5 ml van de celsuspensie in buis A toe aan buis B en meng grondig. Breng 0,5 ml oplossing B over in buis C en meng grondig. Herhaal dit voor alle resterende centrifugebuisjes en voltooi een reeks 10-voudige verdunningen over de acht centrifugebuisjes.
6. Verwijder 0.5 ml uit buis H om een gelijk volume in alle buizen te hebben.
   OPMERKING: Deze concentraties zijn geoptimaliseerd voor lokale bodems. Wanneer u deze procedure voor de eerste keer probeert, voert u een groter bereik van verdunningen uit om de juiste monsterconcentratie te vinden.

4. Gemodificeerde iChip-inoculatie

1. Dompel de iChips minimaal 15 minuten volledig onder in 95% ethanol.
2. Haal de platen uit de ethanol en leg ze op steriel keukenpapier. Terwijl u de ethanol laat verdampen, zet u de UV-sterilisator 15 minuten aan in de laminaire stromingskap om ze verder te steriliseren.
3. Pipetteer 360 μL steriele SMS-media in de eerste kolom van de plaat om als controleputjes te fungeren.
4. Voeg 45 ml tot 50 °C gekoelde SMS toe aan de celsuspensie in buis E en meng grondig om de celsuspensie en agar te combineren.
5. Pipetteer 360 μl van het agarcelmengsel uit stap 4.4 in alle andere putjes van de plaat met 96 putjes.
   OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt aanbevolen, omdat agar snel stolt. Het wordt afgeraden om het agar-celmengsel na het mengen opnieuw te verwarmen vanwege het risico dat de micro-organismen worden gedood.
6. Zodra de media zijn uitgehard, sluit u de bovenkant van de platen af met een PCR-plaatafdekking.
7. Herhaal stap 3.3 tot en met 3.6 met buizen F-H om in totaal vier iChips te vullen met tienvoudige verschillen in concentraties.
   OPMERKING: Media kunnen indien nodig 30 s in de magnetron worden bewaard met een losgemaakte dop of in een warmwaterbad van 60 °C tussen de platen om ervoor te zorgen dat ze voor elke plaat gesmolten blijven.

5. Incubatie

1. Plaats de platen in een doos met ongeveer een centimeter van de grond die in stap 3.2 is gebruikt, met de membraankant naar beneden en plaats het deksel.
2. Incubeer de platen in de afgedekte container, op een donkere plaats bij 25 °C.
   OPMERKING: Onderzoek na een week de inhoud van de gewijzigde iChips om er zeker van te zijn dat er geen besmetting tijdens de installatie is opgetreden. Besmetting wordt aangegeven door de overgroei van een enkele of enkele micro-organismen in alle putjes van een plaat.
3. Onderzoek na 6 weken de iChips. Gebruik de platen met groei in minder dan 25% van de putjes voor het isoleren van de kolonie.

6. Isolatie van de kolonie

1. Spoel de aangepaste iChips 3x af met steriel water om alle vuildeeltjes te verwijderen.
2. Veeg de boven- en zijkanten van de plaat af met 95% ethanol en vermijd de kant met het semi-permeabele membraan.
3. Snijd met een steriel mes door het plaatdeksel rond een putje met een kolonie.
4. Doorboor met behulp van een steriel strekengereedschap de kolonie en strijk op SMS-agar in platen van 100 x 15 mm met behulp van de vierkwadrantenmethode.
5. Herhaal dit voor alle andere kolonies in de iChips die één kolonie per putje groeien.
   OPMERKING: Voor kolonies die minuscuul zijn, kan de plaat terug op de grond worden geplaatst en worden uitgebroed tot deze groot genoeg is om te subculturen, zolang de plaatafdekking niet rond de put is verwijderd.
6. Incubeer de SMS-platen bij 25 °C en bewaak de groei.
7. Onderzoek kolonies om er zeker van te zijn dat axenische culturen zijn geïsoleerd.

7. Identificatie van micro-organismen

1. Sequentie van de genomen van de teruggevonden isolaten²⁰.
2. Evalueer de genomen met behulp van JSpeciesWS of een ander op het genoom gebaseerd identificatieplatform om de mate van gelijkenis van elk isolaat met bekende micro-organismen in GenomesDB te bepalen.
3. Categoriseer isolaten onder de door de gemeenschap geaccepteerde drempels voor soortidentificatie als verondersteld nieuw.

Resultaten

Een visueel overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Een succesvol gemodificeerd iChip-experiment resulteert in ten minste één plaat met groei in minder dan 25% van de putjes, zonder dat er groei optreedt in de controleputjes. Dit aantal putten met groei zorgt er over het algemeen voor dat afzonderlijke kolonies in putten worden geïsoleerd. Bovendien moet het aantal kolonies, of het aantal putjes dat kolonies bevat, vertienvoudigen met elke volgende plaat die wordt bereid uit de reeks verdunningen. Representatieve resultaten worden weergegeven in figuur 2. waarbij platen 7 en 8 succesvolle iChips zijn omdat ze groei bevatten in minder dan 25% van de putjes, en het percentage putjes met kolonies afneemt met elke plaat, zoals weergegeven in tabel 1. Als alle platen in een proef meer dan één kolonie per putje bevatten of geen kolonies in een putje, is dat een negatieve uitkomst.

Figuur 1: Schematisch overzicht voor het gebruik van een aangepaste iChip om bodemmicroben te kweken. (A,B) Constructie van de plaat (Stap 2). (C) Bereiding van het entmateriaal (stap 3). (D,E) iChip-installatie (stap 4). (F) Incubatie van de iChip (stap 5). (G-I) Overdracht van de isolaten naar conventionele media (stap 6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ichip	Concentratie van de grond in agarsuspensie	Putten met kolonies	Kolonievormende eenheden
E	5,0 x 10-6 g/ml	Alle	Te veel om te tellen
F	5,0 x 10-7 g/ml	Alle	Te veel om te tellen
G	5,0 x 10-8 g/ml	22	22
H	5,0 x 10-9 g/ml	6	6

Tabel 1: Representatieve gegevens van een succesvol iChip-experiment waarbij het aantal putjes met kolonies afneemt met elke verdunning in serie.

Figuur 2: Voorbeeldresultaten van twee succesvolle gemodificeerde iChips. De iChips waren afkomstig uit hetzelfde experiment waarin (A) de plaat bereid uit cel-agarmengsel G 22 kolonies bevat, en (B) de plaat bereid uit cel-agarmengsel H zes kolonies bevat, consistent met het 10-voudige verdunningsverschil tussen mengsels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Men kan kolonies visualiseren met het blote oog of microscopie, zoals weergegeven in Figuur 3A-G. Kolonies kunnen op het oppervlak van de agar groeien, zoals te zien is in figuur 3B of ingebed in de agar, zoals de kolonie in figuur 3F. Er kunnen gevallen zijn waarin er twee kolonies in dezelfde put zitten in een succesvolle gemodificeerde iChip, zoals in Figuur 3G. In sommige gevallen staan de kolonies ver genoeg uit elkaar om ze afzonderlijk met een naald te doorboren en te subculturen; het is echter onwaarschijnlijk dat die in figuur 3G gemakkelijk kunnen worden gekweekt als axenische micro-organismen. Voorbeelden van kolonies die van de iChip naar conventionele SMS-media worden overgebracht, worden weergegeven in figuur 4.

Figuur 3: Representatief microscopisch beeld van kolonies die in een iChip groeien na 6 weken incubatie. (A-F) Er worden enkelvoudige kolonies geobserveerd, waaruit gesubcultureerd moet worden, en in (G) worden twee kolonies dicht bij elkaar waargenomen, die moeilijk te verkrijgen zijn als axenische culturen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatief resultaat van een bacterie geïsoleerd uit de gemodificeerde iChip die ooit op een SMS-agarplaat groeide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het vermogen om kolonies van de gemodificeerde iChip op conventionele agarplaten te isoleren, bepaalt ook het succes van het experiment. Niet alle kolonies die in de gemodificeerde iChip groeien, zullen de overstap naar conventionele platen overleven. In een iChip worden kolonies blootgesteld aan groeifactoren en voedingsstoffen in de bodem, waardoor hun teeltbaarheid toeneemt. Voor sommige micro-organismen is een periode van domesticatie niet voldoende om ze onder conventionele omstandigheden te kweken. Het herstelpercentage van kolonies van een iChip naar platen zal variëren van experiment tot experiment, maar sommige zouden in platen moeten groeien, omdat deze methode ook gemakkelijk kweekbare micro-organismen zal kweken. De gemodificeerde iChips in figuur 2 bevatten bijvoorbeeld in totaal 28 kolonies en het aantal kolonies dat na de subcultuur op agarplaten groeide was 16, terwijl 12 de overdracht niet overleefden. Isolaten kunnen worden geïdentificeerd en gebruikt voor verder onderzoek zodra ze zijn gekweekt op agarplaten op ware grootte, zoals weergegeven in figuur 4.

Een succesvol gemodificeerd iChip-experiment moet resulteren in de isolatie van micro-organismen die op soortniveau verschillen van bekende micro-organismen. De mate van gelijkenis van elk isolaat met bekende micro-organismen wordt gevonden door het geïsoleerde DNA te vergelijken met het genoom van bekende micro-organismen. De tetra Z-scores van de micro-organismen die het dichtst verwant zijn aan elk isolaat beschrijven de procentuele gelijkenis. Figuur 5 laat zien dat van de twaalf geïsoleerde bacteriën er vier nieuwe soorten of hoger waren, twee waarschijnlijk nieuwe stammen waren en zes bekende micro-organismen waren. Het herstel van verschillende nieuwe soorten of stammen komt overeen met eerder gepubliceerde iChip-experimenten, wat aangeeft dat deze gewijzigde iChip-constructie de toename van het herstel van nieuwe soorten¹¹ niet belemmert.

Figuur 5: Het taxonomische classificatieniveau van isolaten die zijn teruggevonden uit een iChip-experiment. Procentuele gelijkenis werd bepaald op basis van de tetra Z-scores, die de gelijkenis van de isolaten met bekende bacteriën beschrijven, waarbij >99,9% gelijkenis aangeeft dat een soort overeenkomt, 98,9%-99,9% gelijkenis duidt op een mogelijke nieuwe soort, en <98,9% gelijkenis duidt op een nieuwe soort of hoger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Talrijke methoden, zoals genoommining en het onderzoeken van stille biosynthetische routes, hebben de afgelopen jaren de ontdekking van nieuwe bioactieve chemicaliën mogelijk gemaakt^21,22. NP's die met behulp van dergelijke methoden worden ontdekt, vertonen echter vaak een hoge structurele gelijkenis met bekende verbindingen. Door toegang te krijgen tot voorheen niet-gekweekte micro-organismen, zal een grotere chemische diversiteit en NP's met nieuwe werkingsmechanismen worden ontgrendeld die beter kunnen helpen bij het bestrijden van microbiële resistentie. Het is aangetoond dat de iChip-isolatietechniek de kweekbaarheid van nieuwe micro-organismen verhoogt, die kunnen worden gebruikt om bibliotheken van micro-organismen op te bouwen voor de ontdekking van nieuwe NP's.

De vroegste conceptualisering van een iChip werd gepubliceerd in 2002, die bestond uit enkele metalen ringen met een agarcelmengsel afgesloten met semi-permeabele membranen en in situ geïncubeerd²³. Het werd later in 2010 herhaald om een kleine chip met veel putten^{te bevatten 11}, gevolgd door de ontwikkeling van een goedkope iChip gemaakt van gewoon laboratoriummateriaal in een invloedrijke Nature Protocols-publicatie in 2017⁹. In deze publicatie zijn verschillende wijzigingen aangebracht in het Nature-protocol om de bruikbaarheid en het gebruiksgemak te verbeteren. Het Nature-protocol omvat het verlijmen van een semi-permeabel membraan aan beide zijden van een chip in vergelijking met deze methode, waarbij aan één kant een zelfklevende plaatafdekking wordt gebruikt. Er kunnen problemen optreden bij het gebruik van siliconenlijm om het membraan te bevestigen nadat de iChip is geladen. Voor zover wij weten, stoten alle niet-giftige siliconenlijmen azijnzuur uit terwijl ze uitharden, wat de levensvatbaarheid van de cellen kan beïnvloeden²⁴. Het protocol dat in deze video wordt beschreven, vermindert ook aanzienlijk de hoeveelheid handelingen die nodig zijn na inoculatie door het deksel van de PCR-plaat te gebruiken om de gevulde plaat af te dichten, waardoor de steriliteit verder wordt gegarandeerd en de insteltijd wordt verkort. Op basis van de identificatie van meerdere nieuwe isolaten uit dit experiment, remt het gebruik van slechts een enkel semi-permeabel membraan de toename van de snelheid van ontdekking van nieuwe organismen die is gerapporteerd voor iChips die zijn geconstrueerd met twee semipermeabele membranen. Er zouden echter verdere experimenten met een grotere steekproefomvang nodig zijn om de impact te kwantificeren.

Een andere methode om de iChips aan te passen is om alleen subcultuur te krijgen van de gemodificeerde iChips die groei bevatten in minder dan 25% van de putten. Als kolonies groeien in de meeste putjes van een plaat, zijn er waarschijnlijk enkele putjes die meerdere micro-organismen bevatten, zelfs als ze niet gemakkelijk zichtbaar zijn. Tijdens de ontwikkeling van de methode werd vastgesteld dat het grotendeels onmogelijk was om axenische culturen te verkrijgen bij het subkweken uit putten die meer dan één kolonie bevatten. De isolatie van niet-axenische culturen levert stroomafwaarts aanzienlijke problemen op in termen van bioactiviteitstesten en identificatie. Dus, voor de eenvoud, wordt aanbevolen om alleen gemodificeerde iChips met kolonies die in een deel van de putten groeien, te subculturen.

Het belangrijkste probleem dat zich kan voordoen bij iChip-methoden is de verontreiniging van putten of hele iChips met andere micro-organismen. Besmetting wordt aangegeven door kolonies die in de controleputjes groeien, of door hetzelfde micro-organisme dat over meerdere putjes of een heel gebied van de gemodificeerde iChip groeit. De bron van besmetting kan te wijten zijn aan onvoldoende sterilisatie van materialen tijdens het opzetten of aan een onjuiste aseptische techniek. Zorg er in dergelijke gevallen voor dat alle gebruikte materialen autoclaaf zijn of met ethanol zijn gesteriliseerd zoals aangegeven in de methode, en zorg ervoor dat er geen contact plaatsvindt tussen niet-steriele items en de gemodificeerde iChip, anders dan het agar-celmengsel. Als een overgroei van een enkel micro-organisme wordt waargenomen aan de onderkant of bovenkant van meerdere gemodificeerde iChip-putjes, is dit hoogstwaarschijnlijk het gevolg van een onvolledige afdichting tussen de putjes en het membraan. Zorg er in dit geval voor dat de gebruikte lijm 100% siliconen is, die niet wordt afgebroken in ethanol, en zorg ervoor dat het semipermeabele membraan en de PCR-plaatafdekking tijdens de bouw volledig rond elke put zijn afgedicht.

De verdunningsreeksen die in het huidige protocol worden gebruikt, moeten zorgen voor een adequate verdunning van de meeste grondsoorten met een opslagperiode van minder dan een week, aangezien deze een duizendvoudig scala aan verdunningen omvat. Er kan echter een aanzienlijke variatie zijn in het aantal micro-organismen tussen bodemsoorten. Als de controleputjes geen groei bevatten, maar er meerdere kolonies groeien in elk putje van alle vier de gemodificeerde iChips, waren de gebruikte celconcentraties niet laag genoeg. De verdunningsreeks moet worden gewijzigd om lagere celconcentraties te bereiken in de cel-mediamengsels die worden gebruikt om de gemodificeerde iChips op te zetten. Evenzo, als er geen groei wordt waargenomen in een van deze platen, moeten de concentraties die in de cel-mediamengsels worden gebruikt, worden verhoogd. Als alternatief is het mogelijk dat de temperatuur van de gebruikte media te hoog was voor het overleven van micro-organismen. In dat geval moet men de media zoveel mogelijk laten afkoelen zonder te stollen voordat ze aan de verdunde celsuspensie worden toegevoegd.

De technologie is een belangrijke vooruitgang in de richting van het overwinnen van de anomalie van het aantal grote platen. Het wordt echter nog steeds beperkt door de ongeschiktheid van conventionele kweektechnieken, zoals blijkt uit het aantal micro-organismen dat de overdracht van de gemodificeerde iChip naar conventionele agarplaten niet overleeft. Eerdere publicaties hebben gemeld dat meerdere rondes van subcultuur en incubatie in iChips de kweekbaarheid van de micro-organismen verder vergroten. De langere domesticatietijd en blootstelling aan bodemgroeifactoren tijdens het gebruik van agar in de iChip vergroten de kans dat een kolonie alleen op agar groeit. Er is echter niet gemeld dat deze benadering een grotere kans op nieuwe micro-organismen oplevert dan een enkele iChip-incubatie^25,26.

Veel andere tactieken worden onderzocht en aangepast om de kweekbaarheid van nieuwe micro-organismen te vergroten. Er is bijvoorbeeld voorgesteld om een heel iChip-apparaat te maken van een semi-permeabel materiaal om de co-cultuur van micro-organismen in naburige putten te vergemakkelijken²⁷. Dat gezegd hebbende, een voordeel van de constructie die in deze publicatie wordt beschreven, zijn de lage kosten, waarbij de kosten voor het bouwen van één plaat gelijk zijn aan ongeveer $ 12 ($ 4 per plaat met 96 putjes, $ 8 per membraan, $ 2 per PCR-hoes). Bovendien maakt de eenvoudige constructie het een ongecompliceerd hulpmiddel wanneer het wordt gebruikt zoals beschreven en biedt het veel mogelijkheden voor maatwerk. Hoewel dit protocol een medium gebruikt dat selectief is voor bacteriën, kan de experimentele opzet theoretisch worden afgestemd om zich te richten op een gewenste microbiële populatie door het gebruikte medium aan te passen, zoals het gebruik van bacterieonderdrukkende media om schimmels aan te pakken, of agar met een lage voedingswaarde voor het sporuleren van micro-organismen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.1-20 µL pipette tips	VWR	76322-158	Verpakking van 768
0.2 mL PCR tubes	ThermoFisher Scientific	AB0337	Verpakking van 1000
0.5-5 mL single channel pipette	VWR	CA11020-004
1 L glass bottle	Millipore Sigma	CLS13951L	Moet autoclaveerbaar zijn.
100 x 15 mm Petri plates	VWR	25384-342	Verpakking van 500
100% Silicone sealant	Marineland	31003
1000 µL multichannel pipette tips	ThermoFisher Scientific	9401113	Verpakking van 960
100-1000 µL pipette tips	VWR	76322-164	Verpakking van 768
100-1000 µL single channel pipette	VWR	76169-240
100-1200 µL multichannel pippette	ThermoFisher Scientific	46300800	Moet een volumecapaciteit van 360 µL hebben.
1-10 µL single channel pipette	VWR	76169-232
1-5 mL pipette tips	VWR	CA11020-008	Verpakking van 500
15 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-918	Verpakking van 500
16s rRNA-F primer (AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) – 10mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-06	10 µg
16s rRNA-R primer (ACGGCTACCTTGTTACGACTT) – 10mM	Integrated DNA Technologies	51-01-19-07	10 µg
4 mm cork borer	VWR	470121-860
50 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-940	Verpakking van 500
95% ethanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500	500 mL
96-well plate	VWR	10062-900	Verpakking van 100
Autoclave	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L, 115 VAC
Bacteriological agar	ThermoFisher Scientific	443570010	1 kg
bin	Thomas Scientific	1216H91	5 bins per pack
Casamino acids	ThermoFisher Scientific	223120	500 g
Casein digest	ThermoFisher Scientific	211610	500 g
Electrofluoresis grade agarose	Thermo Fisher Scientific	J66501.30	250 g
iBright FL1500 Imaging System	ThermoFisher Scientific	A44115
Laminar flow hood	CleanTech	1000-6-A
Minion Nanopore Sequencer	Oxford Nanopore Technologies	MinIon Mk1C
NanoDrop One/One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W
Nuclease Free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9937	10 x 50 mL
Nucleobond HMW DNA kit	Takara	740160.2
Paper towel	VWR	89402-824
Phusion Green Hot Start II High-Fidelity PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	F566L	500 Reactions
Potato starch	ThermoFisher Scientific	419690025	2.5 kg
QIAGEN CLC Genomics Workbench Software or similar	Qiagen
Rapid Barcoding 24 Kit	Oxford Nanopore Technologies	SQK-RBK114.24
SimpliAmp thermal cycler	Applied Biosystems	A24811
Sterile Inoculation loops with needle	VVWR	76534-512	Verpakking van 1000
Sterile surgical blade	VWR	76457-444
SYBR Safe, or simmilar	ThermoFisher Scientific	S33101
UltraPure Agarose	ThermoFisher Scientific	16500-500
Vortex	VWR	76549-928	Moet 15 en 50 mL centrifuge tubes kunnen bevatten
VWR Stereo Zoom Trinocular Microscope	VWR	89404-476
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes	Millipore Sigma	WHA113502	L x B 8 in. x 10 in., poriegrootte 0.03 μm