De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Retinale pericyten zijn essentieel voor de vasculaire ontwikkeling en stabiliteit van het netvlies en spelen een sleutelrol bij het behoud van de integriteit van het retinale vaatstelsel. Om een gedetailleerd beeld te geven van de morfologische kenmerken van pericyten, beschreef deze studie een nieuwe benadering die de retro-orbitale injectie van een fluorescerend middel, immunofluorescerende kleuring en weefselopruimende behandeling combineert. Ten eerste werd het fluorescerende tomatenlectine in de retro-orbitale sinus van de levende muis geïnjecteerd om het retinale vaatstelsel te labelen. Na 5 minuten werd de muis geofferd en werd het intacte netvlies voorzichtig uit de netvliesbeker verwijderd en immunofluorescerend gekleurd met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β om de pericyten te onthullen. Bovendien werd het gekleurde netvlies behandeld met weefselzuiverend reagens en in zijn geheel op het microscoopglaasje gemonteerd. Door deze benaderingen werden het retinale vaatstelsel en de pericyten duidelijk waargenomen in het transparante netvlies. Onder een confocale microscoop kregen we meer mogelijkheden om beelden met een hoge resolutie te maken voor het verder reconstrueren en analyseren van de morfologische kenmerken van pericyten langs de retinale vasculaire boom in een driedimensionaal beeld. Methodologisch gezien biedt dit protocol een effectieve benadering voor het visualiseren van pericyten in het retinale vaatstelsel, en biedt het waardevolle inzichten in hun rol onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.
Inleiding
Retinale pericyten zijn ingebed in het basaalmembraan langs de abluminale zijde van vasculaire endotheelcellen en vertonen een gaasachtig patroon van korteafstandsprocessen die rond de retinale bloedvaten zijn gewikkeld1. Dit intieme contact tussen pericyten en het retinale vaatstelsel draagt bij tot het behoud van de homeostase van het netvlies2. Hoewel talrijke studies morfologisch bewijs hebben geleverd voor pericyten in retinale vasculatuur, komt het grootste deel van ons begrip van de morfologische kenmerken van retinale pericyten voort uit conventionele histologische technieken3.
In lijn met deze studies hebben we deze studie ontworpen om effectief meer morfologische details van pericyten in de retinale microvasculatuur te laten zien door traditionele histologische technieken te combineren met moderne, geavanceerde wetenschappelijke methoden. De aanpak hier integreert drie belangrijke technieken: retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine in levende muizen, immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β (PDGFR-β) en de op oplosmiddelen gebaseerde weefselopruimingsstrategie. Retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine is bewezen effectief en betrouwbaar voor het observeren van het retinale vaatstelsel van muizen in zowel in vivo als in vitro omgevingen 4,5. PDGFR-β dient als een veelgebruikte biomarker voor de immunofluorescerende kleuring van pericyten6. Om beelden met een hoge resolutie vast te leggen van pericyten in het dikkere en hele netvlies, verbetert de weefselopruimingsstrategie de histologische transparantie 2,7,8.
Hoewel elk van deze technieken afzonderlijk is toegepast in netvliesstudies, blijft hun gecombineerde compatibiliteit voor het onderzoeken van pericyten in het retinale vaatstelsel van muizen onzeker. Aangezien de gemiddelde dikte van het netvlies van de muis ongeveer 180-220 μm9 is, resulteren antilichaamlabeling en confocale beeldvorming op dit dikke weefsel zonder ophelderingsbehandeling vaak in hoge achtergrondsignalen, wat de observatie van de ruimtelijke relatie tussen pericyten en bloedvaten bemoeilijkt10. Door middel van de hier beschreven benaderingen willen we een eenvoudige methode bieden voor het visualiseren van pericyten in het retinale vaatstelsel in een driedimensionaal (3D) beeld onder een confocale microscoop. Deze verbeterde cellulaire informatie van pericyten in het retinale vaatstelsel zou ons begrip van de retinale omgevingshomeostase kunnen verbeteren en potentiële strategieën voor vasculaire bescherming kunnen onderstrepen, waardoor de functionele resultaten bij retinale vasculaire aandoeningen worden verbeterd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voor deze studie werden drie jongvolwassen mannelijke C57BL/6-muizen (8-10 weken oud, met een gewicht van 20-25 g) gebruikt. Ze werden gehuisvest in een licht/donker-cyclus van 12 uur met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid en hadden vrije toegang tot voedsel en water. Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (goedkeuring nr. 2023-03-14-04) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).
1. In vivo retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine
- Injecteer 50 mg/kg pentobarbital intraperitoneaal om de muis te verdoven. Beoordeel de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een reactie op een teenknijpstimulus te evalueren.
- Plaats de muis in de rechter zijdelingse lighouding met het hoofd naar links gericht.
- Druk voorzichtig met twee vingers op het peri-orbitale gebied om het linkeroog van de muis bloot te leggen, zodat de injectie gemakkelijk kan worden toegediend in de linker retro-orbitale sinus van het dier11.
- Gebruik een spuit van 1 ml uitgerust met een naald van 27 G om voorzichtig ongeveer 2-3 mm in de orbitale veneuze sinus van de muis te prikken met de afschuining op de naald naar voren gericht in een hoek van 45°.
- Injecteer 0,1 ml (1 mg/ml) fluorescerend tomatenlectine in de orbitale veneuze sinus van de muis.
2. Perfusie en enucleatie van de ogen
- Injecteer 5 minuten na retro-orbitale injectie tribroomethanoloplossing (250 mg/kg) intraperitoneaal om de muis diep te verdoven. Euthanaseer het dier vervolgens via verbloeding en hartperfusie. Zodra de ademhaling stopt, opent u de borstholte met een chirurgische schaar12.
- Zodra de ademhaling stopt, opent u de borstholte met een chirurgische schaar. Steriliseer chirurgische instrumenten van tevoren en werk in een zuurkast. Gebruik een 24G-naald en steek deze 2 mm in de linker hartkamer via de linker ventrikeltop. Voer perfusie uit met een snelheid van 3 ml/min met 20 ml 0,9% fysiologische zoutoplossing gevolgd door 20 ml 4% formaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4).
- Plaats de geofferde muis op zijn zij en verwijder de huid die de ogen bedekt met een schaar. Reinig de ogen met een schaar en een tang.
- Snijd de oogzenuw en de omliggende weefsels door, til vervolgens het oog op en breng over naar een plaat met 12 putjes voor nafixatie in 4% formaldehyde in 0,1 M PB gedurende 2 uur.
- Cryoprotecteer het weefsel in 25% sucrose in 0,1 M PB (pH 7,4) bij 4 °C totdat het naar de bodem van de oplossing zinkt.
OPMERKING: Omdat oogweefsel goed uitdroogt in een sucrose-oplossing, kan het netvlies gemakkelijker en vollediger worden losgemaakt, waardoor latere uitgebreide onderzoeken mogelijk worden.
3. Dissectie van het netvlies
- Breng de ogen over in een petrischaaltje met 0,1 M PB (pH 7,4) met behulp van een plastic pasteurpipet.
- Prik met een scherpe schaar in de rand van het hoornvlies, knip rond het hoornvlies en de iris en gooi het weg.
- Gebruik een tang om de lens en glasvocht te verwijderen. Trek vervolgens het komvormige netvlies met een fijne tang weg van het midden van het oog. Spoel het netvlies met 0,1 M PB (pH 7,4) in een schoon petrischaaltje.
4. Immunofluorescerende kleuring en weefselklaring van het netvlies
- Verwijder voorzichtig het komvormige netvlies en incubeer het een nacht bij 4 °C in een 2% Triton X-100 oplossing in 0,1 M PB (pH 7,4).
- Breng het netvlies over in de blokkerende oplossing (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% natriumazide + 10% normaal ezelserum) en draai 's nachts met 72 tpm op de shaker bij 4 °C.
- Breng het netvlies over in de oplossing die de primaire antilichamen van geitenanti-PDGFR-β (10 μg/ml) bevat in verdunningsbuffer (0,1 M PB + 0,2 % Triton-X 100 + 0,2 % natriumazide + 1% normaal ezelserum) in een microcentrifugebuis en draai gedurende 2 dagen op de schudder bij 4 °C.
- Was het netvlies 2x met wasbuffer (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht in de wasbuffer bij 4 °C op de shaker.
- Breng de volgende dag het netvlies in een microcentrifugebuis over in de gemengde oplossing die het secundaire antilichaam van 1 mg/ml ezel-anti-geit 488 en 0,2 ng/ml fluorescerend nucleair 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat, en draai het gedurende 5 uur bij 4 °C met 72 tpm op de schudder.
- Was het netvlies in een 6-gaats bord met wasbuffer gedurende 1 uur, 2x, op kamertemperatuur. Bewaar het netvlies een nacht in de wasbuffer op de shaker bij 4 °C. Voer beeldvorming en analyse uit volgens stap 5 om de weergaven vóór het opruimen van het weefsel te verkrijgen.
- Breng het netvlies over naar het weefselzuiverende reagens en draai het voorzichtig met 60 tpm op de shaker gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Spoel na een weefselreinigingsbehandeling het komvormige netvlies met 0,1 M PB (pH 7,4) in een schoon petrischaaltje.
- Maak 4 radiale incisies die ongeveer 2/3 van de straal van het netvlies bereiken met behulp van een veerschaar om een bloembladvorm te creëren.
- Maak het netvlies plat en monteer het op een microscoopglaasje en verwijder vervolgens het overtollige PB met een klein stukje absorberend papier. Houd de binnenkant van het netvlies naar boven gericht op het objectglaasje.
- Omcirkel het gemonteerde netvlies met een afstandsstuk en vul de opening met vers weefselopruimend reagens en een dekglaasje.
5. Beeldvorming en analyses
- Verkrijg de buitenaanzichten van het netvlies voor (na voltooiing van stap 4.6) en na de weefselopruimingsbehandeling.
- Scan de montageweergaven van het gelabelde netvlies met de scanner voor panoramische weefselplakjes. Gebruik een 2x objectievenlens met een NA van 0,08.
- Maak de beelden met een hogere vergroting door een confocaal beeldvormingssysteem dat is uitgerust met de volgende objectieven: 10x lens met NA van 0,40 en 40x lens met NA van 0,95. Stel het confocale gaatje in op 152 μm (10x objectieflens) en 105 μm (40x objectieflens). Stel de ruimtelijke resolutie van het vastleggen van afbeeldingen in op 1024 x 1024 pixels (10x objectieflens) en 640 x 640 pixels (40x objectieflens).
- Leg 50 beelden (Z-stack) vast in frames van 2 μm vanaf het gelabelde netvlies. Integreer alle afbeeldingen in één enkele in-focus onder de projectie-/topografiemodus. Klik voor de instelling op Beginbrandpuntsvlak instellen > Einde brandpuntsvlak instellen > Stapgrootte instellen > Dieptepatroon kiezen > Fotovastleggen > Z-serie.
- Leg beelden vast met behulp van de volgende excitatie- en emissiegolflengten voor verschillende fluorescentiesignalen: Groene fluorescentiesignalen bij 499 nm en 519 nm; rode fluorescentiesignalen bij 591 nm en 618 nm; en blauwe fluorescentiesignalen bij 401 nm en 421 nm.
- Reconstrueer de afbeeldingen in het driedimensionale patroon door confocale Z-stack-afbeeldingen te importeren in een analysesoftware door Nieuwe oppervlakken toevoegen > Volume-instellingen kiezen > Bronkanaal kiezen > Display aanpassen > Oppervlaktehoek aanpassen > Snapshot aanpassen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Van buitenaf, aanzichten van het hele netvlies, werd de weefseltransparantie van het hele netvlies verhoogd met behulp van de weefselopruimingsbehandeling in vergelijking met die van het netvlies zonder weefselopruiming (Figuur 1).
Voor het histologisch onderzoek van het hele netvlies werd het retinale vaatstelsel in rood gelabeld met fluorescerend tomatenlectine door middel van de retro-orbitale injectie, en worden de retinale pe...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie hebben we het technische proces beschreven voor het aantonen van de morfologie van pericyten in retinale vasculatuur met behulp van retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine, immunofluorescerend onderzoek met PDGFR-β en weefselklaring op basis van oplosmiddelen. De resultaten tonen aan dat deze technieken zeer compatibel zijn voor het markeren van pericyten in het hele netvlies. De combinatie van deze methodologieën biedt een effectieve aanpak voor het visua...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7244480), het CACMS Innovation Fund (nr. CI2021A03407), de National Natural Science Foundation of China (nr. 82004492), en de Fundamentele Onderzoeksfondsen voor de Centrale onderzoeksinstituten voor het algemeen welzijn (nrs. ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | Bescherm tegen licht |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | Bescherm tegen licht |
| C57BL/6 muis | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | SCXK (Jing) 2021-0006 | |
| Confocal beeldvormingssysteem | Olympus | FV1200 | |
| Geit anti-PDGFR-β | Research and Development | AF1042 | 25 µg |
| Imaris software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| Lycopersicon esculentum(Tomaatlecticine, DyLight594) | Thermo Fisher Scientific | L32471 | 1 mg |
| Microcentrifugebuisje | Axygen | MCT-150-C | 1,5 mL |
| Normaal ezelsserum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | 10 mL |
| Panoramisch weefselsnijder | Olympus | VS120-S6-W | |
| Photoshop en Illustrator | Adobe | CS6 | |
| RapiClear 1.52 Oplossing | SunJin Lab | RC152001 | 10 mL |
| Zes-well plaat | Costar | 3335 | |
| Springschaar | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Superfrost Plus microscoopglas | Thermo Fisher Scientific | 4951PLUS-001 | 25 mm x 75 mm x 1 mm |
Referenties
- Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733(2018).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546(2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296(2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
- Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
- Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807(2022).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742(2021).
- Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).
- Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).
- Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
- Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
- Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401(2016).
- Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
- Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).
- Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
- Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
