Methodenartikel

3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring

DOI:

10.3791/67436

⸱

1 november 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integration of Chinese and Western Medicine, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 2Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale pericyten zijn essentieel voor de vasculaire ontwikkeling en stabiliteit van het netvlies en spelen een sleutelrol bij het behoud van de integriteit van het retinale vaatstelsel. Om een gedetailleerd beeld te geven van de morfologische kenmerken van pericyten, beschreef deze studie een nieuwe benadering die de retro-orbitale injectie van een fluorescerend middel, immunofluorescerende kleuring en weefselopruimende behandeling combineert. Ten eerste werd het fluorescerende tomatenlectine in de retro-orbitale sinus van de levende muis geïnjecteerd om het retinale vaatstelsel te labelen. Na 5 minuten werd de muis geofferd en werd het intacte netvlies voorzichtig uit de netvliesbeker verwijderd en immunofluorescerend gekleurd met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β om de pericyten te onthullen. Bovendien werd het gekleurde netvlies behandeld met weefselzuiverend reagens en in zijn geheel op het microscoopglaasje gemonteerd. Door deze benaderingen werden het retinale vaatstelsel en de pericyten duidelijk waargenomen in het transparante netvlies. Onder een confocale microscoop kregen we meer mogelijkheden om beelden met een hoge resolutie te maken voor het verder reconstrueren en analyseren van de morfologische kenmerken van pericyten langs de retinale vasculaire boom in een driedimensionaal beeld. Methodologisch gezien biedt dit protocol een effectieve benadering voor het visualiseren van pericyten in het retinale vaatstelsel, en biedt het waardevolle inzichten in hun rol onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retinale pericyten zijn ingebed in het basaalmembraan langs de abluminale zijde van vasculaire endotheelcellen en vertonen een gaasachtig patroon van korteafstandsprocessen die rond de retinale bloedvaten zijn gewikkeld1. Dit intieme contact tussen pericyten en het retinale vaatstelsel draagt bij tot het behoud van de homeostase van het netvlies2. Hoewel talrijke studies morfologisch bewijs hebben geleverd voor pericyten in retinale vasculatuur, komt het grootste deel van ons begrip van de morfologische kenmerken van retinale pericyten voort uit conventionele histologische technieken3.

In lijn met deze studies hebben we deze studie ontworpen om effectief meer morfologische details van pericyten in de retinale microvasculatuur te laten zien door traditionele histologische technieken te combineren met moderne, geavanceerde wetenschappelijke methoden. De aanpak hier integreert drie belangrijke technieken: retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine in levende muizen, immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β (PDGFR-β) en de op oplosmiddelen gebaseerde weefselopruimingsstrategie. Retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine is bewezen effectief en betrouwbaar voor het observeren van het retinale vaatstelsel van muizen in zowel in vivo als in vitro omgevingen 4,5. PDGFR-β dient als een veelgebruikte biomarker voor de immunofluorescerende kleuring van pericyten6. Om beelden met een hoge resolutie vast te leggen van pericyten in het dikkere en hele netvlies, verbetert de weefselopruimingsstrategie de histologische transparantie 2,7,8.

Hoewel elk van deze technieken afzonderlijk is toegepast in netvliesstudies, blijft hun gecombineerde compatibiliteit voor het onderzoeken van pericyten in het retinale vaatstelsel van muizen onzeker. Aangezien de gemiddelde dikte van het netvlies van de muis ongeveer 180-220 μm9 is, resulteren antilichaamlabeling en confocale beeldvorming op dit dikke weefsel zonder ophelderingsbehandeling vaak in hoge achtergrondsignalen, wat de observatie van de ruimtelijke relatie tussen pericyten en bloedvaten bemoeilijkt10. Door middel van de hier beschreven benaderingen willen we een eenvoudige methode bieden voor het visualiseren van pericyten in het retinale vaatstelsel in een driedimensionaal (3D) beeld onder een confocale microscoop. Deze verbeterde cellulaire informatie van pericyten in het retinale vaatstelsel zou ons begrip van de retinale omgevingshomeostase kunnen verbeteren en potentiële strategieën voor vasculaire bescherming kunnen onderstrepen, waardoor de functionele resultaten bij retinale vasculaire aandoeningen worden verbeterd.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor deze studie werden drie jongvolwassen mannelijke C57BL/6-muizen (8-10 weken oud, met een gewicht van 20-25 g) gebruikt. Ze werden gehuisvest in een licht/donker-cyclus van 12 uur met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid en hadden vrije toegang tot voedsel en water. Deze studie is goedgekeurd door de ethische commissie van het Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (goedkeuring nr. 2023-03-14-04) en uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996).

1. In vivo retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine

  1. Injecteer 50 mg/kg pentobarbital intraperitoneaal om de muis te verdoven. Beoordeel de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van een reactie op een teenknijpstimulus te evalueren.
  2. Plaats de muis in de rechter zijdelingse lighouding met het hoofd naar links gericht.
  3. Druk voorzichtig met twee vingers op het peri-orbitale gebied om het linkeroog van de muis bloot te leggen, zodat de injectie gemakkelijk kan worden toegediend in de linker retro-orbitale sinus van het dier11.
  4. Gebruik een spuit van 1 ml uitgerust met een naald van 27 G om voorzichtig ongeveer 2-3 mm in de orbitale veneuze sinus van de muis te prikken met de afschuining op de naald naar voren gericht in een hoek van 45°.
  5. Injecteer 0,1 ml (1 mg/ml) fluorescerend tomatenlectine in de orbitale veneuze sinus van de muis.

2. Perfusie en enucleatie van de ogen

  1. Injecteer 5 minuten na retro-orbitale injectie tribroomethanoloplossing (250 mg/kg) intraperitoneaal om de muis diep te verdoven. Euthanaseer het dier vervolgens via verbloeding en hartperfusie. Zodra de ademhaling stopt, opent u de borstholte met een chirurgische schaar12.
  2. Zodra de ademhaling stopt, opent u de borstholte met een chirurgische schaar. Steriliseer chirurgische instrumenten van tevoren en werk in een zuurkast. Gebruik een 24G-naald en steek deze 2 mm in de linker hartkamer via de linker ventrikeltop. Voer perfusie uit met een snelheid van 3 ml/min met 20 ml 0,9% fysiologische zoutoplossing gevolgd door 20 ml 4% formaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (PB, pH 7,4).
  3. Plaats de geofferde muis op zijn zij en verwijder de huid die de ogen bedekt met een schaar. Reinig de ogen met een schaar en een tang.
  4. Snijd de oogzenuw en de omliggende weefsels door, til vervolgens het oog op en breng over naar een plaat met 12 putjes voor nafixatie in 4% formaldehyde in 0,1 M PB gedurende 2 uur.
  5. Cryoprotecteer het weefsel in 25% sucrose in 0,1 M PB (pH 7,4) bij 4 °C totdat het naar de bodem van de oplossing zinkt.
    OPMERKING: Omdat oogweefsel goed uitdroogt in een sucrose-oplossing, kan het netvlies gemakkelijker en vollediger worden losgemaakt, waardoor latere uitgebreide onderzoeken mogelijk worden.

3. Dissectie van het netvlies

  1. Breng de ogen over in een petrischaaltje met 0,1 M PB (pH 7,4) met behulp van een plastic pasteurpipet.
  2. Prik met een scherpe schaar in de rand van het hoornvlies, knip rond het hoornvlies en de iris en gooi het weg.
  3. Gebruik een tang om de lens en glasvocht te verwijderen. Trek vervolgens het komvormige netvlies met een fijne tang weg van het midden van het oog. Spoel het netvlies met 0,1 M PB (pH 7,4) in een schoon petrischaaltje.

4. Immunofluorescerende kleuring en weefselklaring van het netvlies

  1. Verwijder voorzichtig het komvormige netvlies en incubeer het een nacht bij 4 °C in een 2% Triton X-100 oplossing in 0,1 M PB (pH 7,4).
  2. Breng het netvlies over in de blokkerende oplossing (0,1 M PB + 1% Triton-X 100 + 0,2% natriumazide + 10% normaal ezelserum) en draai 's nachts met 72 tpm op de shaker bij 4 °C.
  3. Breng het netvlies over in de oplossing die de primaire antilichamen van geitenanti-PDGFR-β (10 μg/ml) bevat in verdunningsbuffer (0,1 M PB + 0,2 % Triton-X 100 + 0,2 % natriumazide + 1% normaal ezelserum) in een microcentrifugebuis en draai gedurende 2 dagen op de schudder bij 4 °C.
  4. Was het netvlies 2x met wasbuffer (0,1 M PB + 0,2% Triton-X 100) op kamertemperatuur en bewaar ze vervolgens een nacht in de wasbuffer bij 4 °C op de shaker.
  5. Breng de volgende dag het netvlies in een microcentrifugebuis over in de gemengde oplossing die het secundaire antilichaam van 1 mg/ml ezel-anti-geit 488 en 0,2 ng/ml fluorescerend nucleair 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) bevat, en draai het gedurende 5 uur bij 4 °C met 72 tpm op de schudder.
  6. Was het netvlies in een 6-gaats bord met wasbuffer gedurende 1 uur, 2x, op kamertemperatuur. Bewaar het netvlies een nacht in de wasbuffer op de shaker bij 4 °C. Voer beeldvorming en analyse uit volgens stap 5 om de weergaven vóór het opruimen van het weefsel te verkrijgen.
  7. Breng het netvlies over naar het weefselzuiverende reagens en draai het voorzichtig met 60 tpm op de shaker gedurende 1 uur bij 37 °C.
  8. Spoel na een weefselreinigingsbehandeling het komvormige netvlies met 0,1 M PB (pH 7,4) in een schoon petrischaaltje.
  9. Maak 4 radiale incisies die ongeveer 2/3 van de straal van het netvlies bereiken met behulp van een veerschaar om een bloembladvorm te creëren.
  10. Maak het netvlies plat en monteer het op een microscoopglaasje en verwijder vervolgens het overtollige PB met een klein stukje absorberend papier. Houd de binnenkant van het netvlies naar boven gericht op het objectglaasje.
  11. Omcirkel het gemonteerde netvlies met een afstandsstuk en vul de opening met vers weefselopruimend reagens en een dekglaasje.

5. Beeldvorming en analyses

  1. Verkrijg de buitenaanzichten van het netvlies voor (na voltooiing van stap 4.6) en na de weefselopruimingsbehandeling.
  2. Scan de montageweergaven van het gelabelde netvlies met de scanner voor panoramische weefselplakjes. Gebruik een 2x objectievenlens met een NA van 0,08.
  3. Maak de beelden met een hogere vergroting door een confocaal beeldvormingssysteem dat is uitgerust met de volgende objectieven: 10x lens met NA van 0,40 en 40x lens met NA van 0,95. Stel het confocale gaatje in op 152 μm (10x objectieflens) en 105 μm (40x objectieflens). Stel de ruimtelijke resolutie van het vastleggen van afbeeldingen in op 1024 x 1024 pixels (10x objectieflens) en 640 x 640 pixels (40x objectieflens).
  4. Leg 50 beelden (Z-stack) vast in frames van 2 μm vanaf het gelabelde netvlies. Integreer alle afbeeldingen in één enkele in-focus onder de projectie-/topografiemodus. Klik voor de instelling op Beginbrandpuntsvlak instellen > Einde brandpuntsvlak instellen > Stapgrootte instellen > Dieptepatroon kiezen > Fotovastleggen > Z-serie.
  5. Leg beelden vast met behulp van de volgende excitatie- en emissiegolflengten voor verschillende fluorescentiesignalen: Groene fluorescentiesignalen bij 499 nm en 519 nm; rode fluorescentiesignalen bij 591 nm en 618 nm; en blauwe fluorescentiesignalen bij 401 nm en 421 nm.
  6. Reconstrueer de afbeeldingen in het driedimensionale patroon door confocale Z-stack-afbeeldingen te importeren in een analysesoftware door Nieuwe oppervlakken toevoegen > Volume-instellingen kiezen > Bronkanaal kiezen > Display aanpassen > Oppervlaktehoek aanpassen > Snapshot aanpassen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van buitenaf, aanzichten van het hele netvlies, werd de weefseltransparantie van het hele netvlies verhoogd met behulp van de weefselopruimingsbehandeling in vergelijking met die van het netvlies zonder weefselopruiming (Figuur 1).

Voor het histologisch onderzoek van het hele netvlies werd het retinale vaatstelsel in rood gelabeld met fluorescerend tomatenlectine door middel van de retro-orbitale injectie, en worden de retinale pericyten in groen weergegeven met PDGFR-β (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4). Hoewel deze labeling voor en na het opruimen van het weefsel op het monster kon worden waargenomen, werd ter vergelijking de achtergrondruis van het netvliesmonster verminderd door de weefselopruimingsbehandeling (Figuur 2). De behandeling maakte ook de gelabelde retinale pericyten en het vaatstelsel helderder onder de panoramische weefselplakscanner (Figuur 2) en de confocale laserscanmicroscoop (Figuur 3).

De gradationele verdeling van retinale pericyten wordt hier ook gedemonstreerd langs de retinale vasculaire boom (Figuur 3). Van het centrale deel van het netvliezen tot het perifere gebied bevinden de pericyten zich op het basaalmembraan van het retinale vaatstelsel, inclusief de vasculaire stam en takken en de haarvaten (Figuur 3).

Op basis van de bovenstaande observatie werd de ruimtelijke correlatie van pericyten en retinale vasculatuur verder beoordeeld met de hoger vergrote Z-stack-beelden van het geklaarde retinale monster (Figuur 4). Met behulp van het beeldverwerkingssysteem leverden we verder de 3D-weergaven om aan te tonen dat pericyten in verschillende diameters strak om het retinale vaatstelsel waren gewikkeld (Figuur 4). Figuur 4A0-D0 geeft de hiërarchische vertakking van retinale vaten weer van hoog naar laag. Aangezien pericyten overvloediger verdeeld zijn in haarvaten, vertoont de PDGFRβ-kleuring in Figuur 4D0 een sterkere intensiteit en signaal in vergelijking met Figuur 4A0-C0.

In tegenstelling tot het netvlies van de muis zonder weefselopruimende behandeling (Figuur 1A, Figuur 2A, Figuur 3A0-D0), heeft de huidige aanpak de retinale achtergrondsignalen voor het aantonen van de ruimtelijke relatie tussen pericyten en bloedvaten van het hele netvlies effectief verminderd (Figuur 1B, Figuur 2B, Figuur 3A1-D1).

figure-results-1
Figuur 1: Vergelijking van de optische transparantie van het hele netvlies zonder en met weefselopruimingsbehandeling. (A, B) De buitenaanzichten van het hele netvlies voor (A) en na (B) weefselopruimingsbehandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vergelijking van labelkenmerken van retinale pericyten en vasculatuur van het hele netvlies zonder en met weefselopruimingsbehandeling. (A, B) Representatieve montagebeelden van het hele netvlies vóór (A) en na (B) weefselopruimingsbehandeling werden genomen onder het Virtual Slide System. Het vaatstelsel is rood (fluorescerend tomatenlectine), de pericyten zijn groen (PDGFR-β) en de celkern is blauw (DAPI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Vergelijking van de beeldvormingsresolutie van de retinale pericyten gradationeel langs de retinale vasculaire boom voor en na weefselopruimingsbehandeling. (A-D) De representatieve beelden van het gelabelde netvlies vóór de weefselopruimingsbehandeling (A0-D0) en na de weefselopruimingsbehandeling (A1-D1) tonen de verdeling van pericyten rond het retinale vaatstelsel in volgorde van vasculaire stam (A0, A1), de eerste-ordevertakkingen (B0, B1), de tweede-ordevertakkingen (C0, C1) en de capillaire (D0, D1). Het vaatstelsel is rood (fluorescerend tomatenlectine), de pericyten zijn groen (PDGFR-β) en de celkern is blauw (DAPI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Ruimtelijke correlatie van pericyten met retinale vasculatuur in verschillende diameters. (A-D) Representatieve beelden met hoge resolutie van het gelabelde netvlies langs de retinale vasculaire boom die de verdeling van pericyten rond het retinale vaatstelsel in verschillende diameters laten zien, waaronder de vasculaire stam (A0, A1), de eerste-ordetakken (B0, B1), de tweede-ordetakken (C0, C1) en het capillair (D0, D1). A1-D1: Overeenkomstige afbeeldingen van panelen A0-D0 werden gereconstrueerd om de ruimtelijke correlatie van pericyten met retinale vasculatuur in verschillende diameters in de driedimensionale weergaven te tonen en om de vergrote weergaven van lokale regio's in panelen A1-D1 (pijlen) met inzetstukken verder te demonstreren. Het vaatstelsel is rood (fluorescerend tomatenlectine), de pericyten zijn groen (PDGFR-β) en de celkern is blauw (DAPI). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we het technische proces beschreven voor het aantonen van de morfologie van pericyten in retinale vasculatuur met behulp van retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine, immunofluorescerend onderzoek met PDGFR-β en weefselklaring op basis van oplosmiddelen. De resultaten tonen aan dat deze technieken zeer compatibel zijn voor het markeren van pericyten in het hele netvlies. De combinatie van deze methodologieën biedt een effectieve aanpak voor het visualiseren van de morfologische kenmerken van pericyten in retinale vasculatuur vanuit een gedetailleerd 3D-perspectief.

Een van de belangrijkste technieken, retro-orbitale injectie bij muizen, is een bewezen eenvoudige en optimale methode te zijn voor het toedienen van vasculaire labelmiddelen, die beter presteren dan staartader- en intraperitoneale injectiemethoden voor het observeren van retinale vasculatuur bij muizen13,14. Hoewel het principe en het mechanisme achter vasculaire labeling door middel van retro-orbitale injectie niet volledig worden begrepen, is het duidelijk dat deze methode het retinale vaatstelsel robuust labelt met fluorescerend tomatenlectine. De fluorescerende labeling blijft stabiel door zowel histochemische verwerking als weefselopruiming. Daarom, naast het gebruik in in vivo beeldvorming, labelt retro-orbitale injectie met fluorescerend tomatenlectine effectief het bloedvatlumen en biedt het een duidelijk beeld van het retinale vaatstelsel voor in vitro en ex vivo histologisch onderzoek.

Om de retinale pericyten te labelen, gebruikten we immunofluorescerende kleuring met PDGFR-β15. Aangezien het gekleurde netvlies onder microscopisch morfologisch onderzoek verdere behandeling onderging met weefselopruimingsreagens om weefsellichtverstrooiing te verminderen, werd het netvlies gedurende langere tijd in de kleuringsoplossing geïncubeerd om de penetratie van antilichamen te verbeteren16,17.

Het netvlies van de hele berg is relatief transparant, waardoor een overzicht van het retinale vaatstelsel mogelijk is18. Vanwege de lichtverstrooiing met zijn dikte beperkt het echter de lichtpenetratie en beeldvorming met hoge resolutie19. Met behulp van weefselopruimingstechnieken is het mogelijk geworden om de pericyten in het hele netvlies te bekijken vanuit een perspectief met hoge resolutie19,20. Deze methoden zijn echter nog niet op grote schaal toegepast op het onderzoek naar retinale pericyten bij muizen. In deze studie heeft de op oplosmiddelen gebaseerde weefselopruimingsbenadering ons vermogen om pericyten in het retinale vaatstelsel te visualiseren aanzienlijk verbeterd, waardoor we Z-stack-beelden met een hoge resolutie kunnen verkrijgen met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.

Pericyten, verspreid over de microvasculaire boom, spelen een essentiële rol in de complexe ruimtelijke en temporele verdeling van bloed binnen het retinale capillaire netwerk22. Hun sterk plastische morfologie en adaptieve contractiele eigenschappen maken pericyten ideaal voor het reguleren van de capillaire bloedstroom als reactie op lokale neuronale activiteit onder fysiologische en pathologische omstandigheden23. Als een belangrijke speler van de bloed-retinabarrière of retinale neurovasculaire koppeling, worden retinale pericyten ook aandacht getrokken bij het behoud van de neovascularisatie, angiogenese en leukocytentransmigratie24.

Als technische beperking moet er rekening mee worden gehouden dat naast PDGFR-β ook andere markers zoals NG-2 en CD13 zijn gebruikt om pericyten te identificeren 22,24,25. Daarom is het nog steeds een uitdaging om een geschikte pericyt-specifieke marker te selecteren om de pericyten ondubbelzinnig aan te tonen. Deze studie levert verder bewijs dat PDGFR-β een betere kandidaat is voor het onthullen van de morfologische kenmerken van pericyten.

Samenvattend hebben we aangetoond dat de combinatie van retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine, immunofluorescerende kleuring en weefselopruiming het mogelijk maakte om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen, die de gedetailleerde morfologie van pericyten in het retinale vaatstelsel van muizen onder fysiologische omstandigheden onthulden. Deze bevindingen suggereren dat deze methode waardevol zou kunnen zijn voor toekomstig onderzoek naar de veranderingen van retinale pericyten onder pathologische omstandigheden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (nr. 7244480), het CACMS Innovation Fund (nr. CI2021A03407), de National Natural Science Foundation of China (nr. 82004492), en de Fundamentele Onderzoeksfondsen voor de Centrale onderzoeksinstituten voor het algemeen welzijn (nrs. ZZ-YQ2023008, ZZ14-YQ-032, ZZ-JQ2023008, ZZ-YC2023007).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificD3571Bescherm tegen licht
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (H+L)Thermo Fisher ScientificA-11055Bescherm tegen licht
C57BL/6 muisBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.SCXK (Jing) 2021-0006
Confocal beeldvormingssysteemOlympusFV1200
Geit anti-PDGFR-βResearch and DevelopmentAF104225 µg
Imaris softwareOxford Instrumentsv.9.0.1
Lycopersicon esculentum(Tomaatlecticine, DyLight594)Thermo Fisher ScientificL324711 mg
MicrocentrifugebuisjeAxygenMCT-150-C1,5 mL
Normaal ezelsserumJackson ImmunoResearch017-000-12110 mL
Panoramisch weefselsnijderOlympusVS120-S6-W
Photoshop en IllustratorAdobeCS6
RapiClear 1.52 OplossingSunJin LabRC15200110 mL
Zes-well plaatCostar3335
SpringschaarFine Science Tools15003-08
Superfrost Plus microscoopglasThermo Fisher Scientific4951PLUS-00125 mm x 75 mm x 1 mm

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dreisig, K., Blixt, F. W., Warfvinge, K. Retinal cryo-sections, whole-mounts, and hypotonic isolated vasculature preparations for immunohistochemical visualization of microvascular pericytes. J Vis Exp. (140), e57733(2018).
  2. Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. J Vis Exp. (77), e50546(2013).
  3. Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nat Commun. 8, 15296(2017).
  4. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  5. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: New experimental approach/new insights. Prog Retin Eye Res. 31 (3), 258-270 (2012).
  6. Hutter-Schmid, B., Humpel, C. Platelet-derived growth factor receptor-beta is differentially regulated in primary mouse pericytes and brain slices. Curr Neurovasc Res. 13 (2), 127-134 (2016).
  7. Wang, X., et al. Demonstrating hairy and glabrous skin innervation in a 3d pattern using multiple fluorescent staining and tissue clearing approaches. J Vis Exp. (183), e63807(2022).
  8. Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. J Vis Exp. (167), e61742(2021).
  9. Batista, A., et al. Normative mice retinal thickness: 16-month longitudinal characterization of wild-type mice and changes in a model of Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 15, 1161847(2023).
  10. Huang, H. Pericyte-endothelial interactions in the retinal microvasculature. Int J Mol Sci. 21 (19), 7413(2020).
  11. Dong, X., et al. Exosome-mediated delivery of an anti-angiogenic peptide inhibits pathological retinal angiogenesis. Theranostics. 11 (11), 5107-5126 (2021).
  12. Li, S., et al. Retro-orbital injection of fitc-dextran is an effective and economical method for observing mouse retinal vessels. Mol Vis. 17, 3566-3573 (2011).
  13. Riew, T. R., Jin, X., Kim, S., Kim, H. L., Lee, M. Y. Temporal dynamics of cells expressing ng2 and platelet-derived growth factor receptor-β in the fibrotic scar formation after 3-nitropropionic acid-induced acute brain injury. Cell Tissue Res. 385 (3), 539-555 (2021).
  14. Susaki, E. A., et al. Advanced cubic protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  15. Liang, H., et al. Cubic protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. J Vis Exp. (114), e54401(2016).
  16. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annu Rev Vis Sci. 7, 129-153 (2021).
  17. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced clarity for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  18. Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nat Neurosci. 22 (2), 317-327 (2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  20. Alarcon-Martinez, L., Yemisci, M., Dalkara, T. Pericyte morphology and function. Histol Histopathol. 36 (6), 633-643 (2021).
  21. Dessalles, C. A., Babataheri, A., Barakat, A. I. Pericyte mechanics and mechanobiology. J Cell Sci. 134 (6), jcs240226(2021).
  22. Alarcon-Martinez, L., et al. Neurovascular dysfunction in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 97, 101217(2023).
  23. Uemura, M. T., Maki, T., Ihara, M., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. Brain microvascular pericytes in vascular cognitive impairment and dementia. Front Aging Neurosci. 12, 80(2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Retinale pericytenretinale vasculatuurimmunofluorescentiekleuringweefselklaringconfocale microscopiedriedimensionale beeldvorminglabelen met tomatolectinePDGFR beta kleuringwhole mount retinamorfologische analyse

Gerelateerde artikelen