Methodenartikel

Enzymatische isolatie van interstitiële extracellulaire blaasjes van skeletspieren

DOI:

10.3791/67439

⸱

7 februari 2025

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol heeft tot doel interstitiële extracellulaire blaasjes (SkM-EV's) van skeletspieren te isoleren en te zuiveren uit spierweefsel van knaagdieren door middel van mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Het toont consistentie en betrouwbaarheid. De geïsoleerde SkM-EV's geven inzicht in spierhomeostase en -ziekten, met mogelijke toepassingen als diagnostische biomarkers of therapeutische voertuigen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire vesikels (EV's) zijn lipide-dubbellaagse nanodeeltjes die door cellen worden vrijgegeven om bioactieve lading, zoals eiwitten, RNA's en DNA's, te transporteren voor intercellulaire communicatie. Onderzoek naar EV-gemedieerde overspraak tussen cellen bij spierhomeostase en -ziekten biedt een aanzienlijk potentieel om ons begrip van spierontwikkeling, regeneratie en atrofie te vergroten. De huidige protocollen voor het isoleren van van skeletspieren afgeleide EV's (SkM-EV's) staan echter voor uitdagingen bij het bereiken van een hoge zuiverheid en opbrengst, voornamelijk vanwege moeilijkheden bij het vrijmaken van EV's uit spierweefsel zonder de celmembranen in gevaar te brengen. Dit artikel presenteert een efficiënt protocol voor SkM-EV-isolatie, bestaande uit mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en ultracentrifugatie. Deze stappen zijn geoptimaliseerd om de afgifte van EV uit spierweefsel te verbeteren, wat zeer zuivere SkM-EV's oplevert. Vervolgens worden nano-flowcytometrie, BCA-test en Western blot-test uitgevoerd om de kwantiteit en kwaliteit van de geïsoleerde SkM-EV's te karakteriseren. Dit protocol is veelbelovend voor het opzetten van een betrouwbaar platform voor het verkrijgen van weefselafgeleide EV's voor het bevorderen van fundamenteel onderzoek, ziektediagnose en medicijnafgifte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire vesikels (EV's) zijn membraangebonden deeltjes van nanoformaat die door cellen in de extracellulaire omgeving worden afgegeven. Deze EV's dragen nucleïnezuren, eiwitten en lipiden over om meerdere signaalroutes te moduleren bij opname door ontvangende cellen. In het bijzonder zijn EV's geïsoleerd uit skeletspieren (SkM-EV's) betrokken bij spierdegeneratie, regeneratie en groei door overdracht van myogene regulerende microRNA's of transcriptiefactoren 1,2,3,4. Naarmate ons begrip van SkM-EV-subpopulaties en -kenmerken blijft evolueren, zijn deze blaasjes veelbelovend als biomarkers voor vroege diagnostiek 5,6 en als therapeutische doelen voor neuromusculaire aandoeningen. Dit groeiende veld biedt opwindende mogelijkheden voor zowel pathologisch onderzoek als klinische toepassingen.

Het huidige onderzoek naar SkM-EV's richt zich voornamelijk op die verkregen uit celcultuursupernatanten na ex vivo cultuur 2,7,8, wat aanleiding geeft tot bezorgdheid over de getrouwheid van doelcellijnen na opeenvolgende passages en de gevoeligheid van EV-kenmerken voor verandering in kunstmatige omgevingen. Dit benadrukt de noodzaak om SkM-EV's rechtstreeks uit spierweefsel te isoleren om ex vivo cultuurinvloeden te vermijden en in vivo omstandigheden beter weer te geven. Hoewel er verschillende benaderingen zijn ontwikkeld voor het isoleren van EV's uit spierweefsel 9,10, variëren studies nog steeds aanzienlijk in protocoldetails, wat van invloed is op de consistentie en vergelijkbaarheid. Er is dringend behoefte aan een gestandaardiseerd protocol voor SkM-EV-isolatie en -karakterisering om de betrouwbaarheid van gerelateerde onderzoeken te garanderen.

Rekening houdend met de fysiologische kenmerken van skeletspieren, hebben we een protocol ontwikkeld om SkM-EV's te isoleren en te zuiveren uit skeletspiermonsters van knaagdieren met behulp van mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Door uitgebreide analyse met behulp van nano-flowcytometrie, BCA-test en Western blot-assay, ontdekten we dat dit protocol binnen een beperkt tijdsbestek consequent SkM-EV's met een hoge zuiverheid en hoeveelheid oplevert. Het kan worden toegepast op skeletspiermonsters onder verschillende omstandigheden, waaronder acuut en chronisch spierletsel. Bovendien kan deze methode, met de juiste aanpassingen, op maat worden gemaakt voor spierweefsel van menselijke patiënten of andere diermodellen. Het standaardiseren van het SkM-EV-isolatieproces is essentieel voor het waarborgen van consistentie in SkM-EV-kwaliteit, het vergemakkelijken van vergelijkingen van EV-kenmerken - zoals opbrengst, grootte, ladingsamenstelling en functie - en het bevorderen van hun potentiële toepassingen als diagnostische biomarkers, evenals het verbeteren van ons begrip van hun rol in verschillende fysiologische en pathologische processen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol isoleert extracellulaire vesikels (EV's) uit skeletspierweefsel met behulp van mechanische onthechting, enzymatische dissociatie, filtratie en differentiële ultracentrifugatie. Het maakt de isolatie van EV's mogelijk uit individuele of gecombineerde spiergroepen van knaagdierledematen, waaronder de tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL), soleus (SOL), gastrocnemius (GAS) en quadriceps (QUA). Het gebruik van dieren werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Georgia en de studie voldeed aan de National Institutes of Health Guidelines voor de zorg en het gebruik van dieren in onderzoek. De dieren werden gehuisvest in de dierenfaciliteiten binnen het Department of Animal and Dairy Science van de Universiteit van Georgia. Wildtype (C57BL/6J) volwassen mannelijke muizen werden in deze studie gebruikt, waarbij weefsel werd geoogst van muizen die op de leeftijd van 3 maanden werden geofferd. Details van de gebruikte reagentia en apparatuur zijn te vinden in de Tabel met materialen.

1. Mechanische loslating van spiergroepen van de muis

  1. Euthanaseer de muizen met CO2, gevolgd door cervicale dislocatie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Scheer beide achterpoten.
  2. Zet de muispoot vast in een steriele plaat met de voorkant van het been naar boven gericht (Figuur 1A).
  3. Maak met een dissectieschaar een kleine incisie (5 mm) in de huid aan de laterale zijde van de muisenkel.
  4. Steek een mes van de schaar voorzichtig in de incisie en plaats het onder de huid, maar niet in het onderliggende spierweefsel. Snijd vervolgens de huid omhoog in de richting van de knie om de incisielengte te verlengen.
  5. Pak de huid langs de incisie vast met een ruw pincet en breid de opening uit totdat de spier zichtbaar is.
  6. Lokaliseer de TA-spier, die van de knie naar de enkel loopt aan de laterale zijde van het scheenbeen11, en gebruik een pincet met een scherp uiteinde om de dunne laag bindweefsel die de spier bedekt vast te pakken en af te pellen (Figuur 1B).
  7. Identificeer in de buurt van de enkel de twee pezen aan het einde van de TA, de ene direct verbonden met de TA-spier en de andere, de EDL-pees, die kleiner is en zich naast de TA-pees aan de laterale zijde bevindt. Snijd beide pezen door met een dissectieschaar.
  8. Pak beide pezen vast met een ruw pincet. Gebruik vervolgens een ander pincet met ruw of scherp uiteinde om de pezen te scheiden, waardoor de TA van de EDL wordt gescheiden (Figuur 1C).
  9. Til de TA op aan de pas doorgesneden pees met een ruw pincet. Knip vervolgens de TA-pees bij de knie af met een dissectieschaar en verwijder zo de spier. Herhaal dit proces om de EDL te verwijderen en bewaar beide spieren in PBS op ijs.
  10. Laat het been los en draai de muis om zodat het achterste vlak naar boven wijst.
  11. Nu de huid op het been gedeeltelijk is verwijderd, knipt u de huid bij de enkel af met een dissectieschaar. Gebruik vervolgens een pincet met een ruw uiteinde om de huid vast te pakken en af te pellen naar de achterkant van de knie, waardoor de GAS bloot komt te liggen.
  12. Snijd de GAS-pees bij de enkel door met een dissectieschaar (Figuur 1D).
  13. Pak de GAS-pees vast met een ruw pincet en til deze omhoog om de onderkant van de GAS bloot te leggen.
  14. Zoek de kleine SOL-pees aan de onderkant van de GAS dicht bij de knie (waar de GAS nog steeds is aangesloten). Snijd de SOL-pees door met een dissectieschaar, waardoor de SOL naar boven samentrekt (Figuur 1E).
  15. Pak de doorgesneden SOL-pees vast met een pincet met een scherp uiteinde en til deze voorzichtig op, waardoor de SOL loskomt van de onderkant van de GAS.
  16. Snijd het uiteinde van de SOL af waar het vastzit aan het afgehakte uiteinde van de GAS met behulp van een dissectieschaar, waardoor de twee spieren worden gescheiden. Bewaar de SOL in PBS op ijs.
  17. Snijd het uiteinde van de GAS bij de knie af en plaats deze in PBS op ijs.
  18. Nadat u de vier genoemde spieren onder de knie hebt verwijderd, draait u de muis om zodat het voorste gezicht naar boven is.
  19. Trek indien nodig de huid verder af met een ruw pincet om de QUA bloot te leggen. Plaats de muispoot in een hoek van 90° om de QUA te dwingen te buigen. Snijd de pees die zich het dichtst bij de knie bevindt door met een dissectieschaar.
    1. Scheid de QUA van het dijbeen door tussen de spier en het bot te snijden totdat de QUA alleen nog verbonden is door de proximale pees (Figuur 1E). Snijd vervolgens de proximale pees door en verwijder de QUA. Plaats de QUA in PBS op ijs.
  20. Zorg ervoor dat na spierloslating het scheenbeen en het kuitbeen duidelijk zichtbaar zijn (Figuur 1F).
  21. Spoel de spieren meerdere keren met PBS om verontreinigingen zoals vacht en bloed te verwijderen (Figuur 1G). Droog de spieren vervolgens voorzichtig af met keukenpapier. Gebruik een analytische balans om het spiergewicht te meten, die later zal worden gebruikt om de EV te berekenen die per gram spier wordt verzameld.

2. Enzymatische dissociatie van losgemaakte spierbrokken

  1. Verwijder voorzichtig de spierpezen van het spiermonster met behulp van een pincet met een scherp uiteinde, een splinterpincet, een scalpel of een schaar (Figuur 2A).
  2. Snijd na het verwijderen van de pees de spier in de lengterichting langs de spiervezels (van pees tot pees) in 1 mm dikke spierbrokken met een schaar of een scalpel om de verhouding tussen oppervlakte en volume te vergroten (Figuur 2B,C).
    OPMERKING: Probeer schade aan myofiber tijdens het snijden te beperken. Voor grotere spieren zoals de TA, GAS en QUA, maak extra sneden in vergelijking met kleinere spieren zoals de EDL en SOL om een ongeveer gelijke oppervlakte-tot-volumeverhouding te garanderen voor alle spiermonsters (Figuur 2D).
  3. Bereid 10 ml verse spijsverteringsenzymbuffer (DEB) voor elke muis en bewaar deze op ijs tot gebruik.
    1. Om DEB te bereiden, mengt u 2 mg collagenase II-enzym per 1 ml Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) met 1% penicilline-streptomycine-oplossing. Filtreer de oplossing na het mengen door een filter van 0,2 μm.
    2. Zorg ervoor dat de DEB een enzymatische activiteit heeft van meer dan 250 eenheden. Draai de DEB totdat de oplossing grondig is gemengd en het collagenase II-enzympoeder niet meer zichtbaar is.
  4. Verdeel het spierweefsel in aliquots, die elk 20 mg spierweefsel bevatten. Voeg vervolgens 1 ml DEB toe aan elke aliquot voor enzymatische dissociatie.
  5. Incubeer het DEB en spiermengsel op een shaker in de incubator bij 37 °C gedurende 12 uur met een schudsnelheid van 100 omwentelingen per minuut (rpm) (figuur 2E).

3. Filtratie en centrifugeren met lage snelheid om SkM-EV te verrijken

NOTITIE: Stel de gekoelde centrifuge in op 4 °C en laat deze draaien totdat deze de ingestelde temperatuur heeft bereikt. Bewaar alle benodigde buisjes en monsters op ijs tot ze klaar zijn voor gebruik.

  1. Zorg er volgens de enzymatische verteringsprocedures voor dat er geen waarneembare spierbrokken zichtbaar zijn (Figuur 3A). Vóór het gekoeld centrifugeren 10 μl oplossing uit het DEB-spiermengsel extraheren en indien nodig overbrengen in een buisje van 0,2 ml voor het testen van de levensvatbaarheid van de cellen.
  2. Bereid nieuwe, lege microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor en label ze. Plaats een filter van 0,45 μm en een spuit van 5 ml door de zuiger te verwijderen (niet weggooien) en de naaf in het bovenste uiteinde van het filter van 0,45 μm te schroeven. Plaats het filter zo dat het onderste uiteinde in een nieuw gelabelde lege buis wordt geplaatst (Figuur 3D). Filter de 1x PBS door een filter van 0,2 μm.
  3. Centrifugeer het mengsel gedurende 10 minuten bij 1.000 x g en 4 °C om eventueel vuil te pelleteren (Figuur 3B). Breng het supernatans (ongeveer 1 ml) over in de spuit met behulp van een P200 micropipet (figuur 3C,E).
  4. Plaats de zuiger van de spuit terug en duw het supernatmiddel langzaam door het filter, zodat het erdoorheen kan gaan en zich kan verzamelen in de nieuw geëtiketteerde microcentrifugebuis van 1,5 ml (Figuur 3F).
  5. Verwijder de zuiger weer en pipetteer ongeveer 200 μl 1x PBS in de spuit.
  6. Plaats de zuiger terug en duw langzaam de 200 μL 1x PBS door het filter (Figuur 3G) om eventueel achtergebleven supernatans uit het filter en in de gelabelde microcentrifugebuis van 1.5 ml te verwijderen.
  7. Herhaal het filtratieproces voor andere buisjes en gebruik voor elk weefselmonster een nieuw filter.
  8. Zorg er na filtratie voor dat de oplossing transparant is en vrij van resterende spierbrokken (Figuur 3H).

4. Differentiële ultracentrifugatie voor SkM-EV-zuivering

NOTITIE: Stel de gekoelde centrifuge in op 4 °C en laat deze draaien totdat deze de ingestelde temperatuur heeft bereikt. Bewaar alle benodigde buisjes en monsters op ijs en klaar voor gebruik.

  1. Breng de gefilterde oplossing over in nieuwe microbuisjes van 1,5 ml (geschikt voor maximaal 200.000 x g). Balanceer alle microbuisjes met een extra 1x PBS om een gelijk volume te garanderen voordat u ze in de micro-ultracentrifuge plaatst.
  2. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat het volume van alle buizen gelijk is, sluit u de buizen en plaatst u ze in de rotor van de micro-ultracentrifuge om te worden gebalanceerd (Figuur 4A).
  3. Zet de micro-ultracentrifuge aan en stel deze in op 1 uur op 100.000 x g en 4 °C (Figuur 4B).
  4. Plaats de rotor geladen met de buisjes in de micro-ultracentrifuge, sluit het deksel en zet het vacuüm aan (Figuur 4C).
  5. Zodra het vacuüm niveau 2 bereikt, drukt u op de startknop en wacht u tot het centrifugeerproces is voltooid (Figuur 4D).
  6. Nadat de micro-ultracentrifugecyclus is voltooid, klikt u op de vacuümknop om de kamer opnieuw onder druk te zetten voordat u de rotor en buizen verwijdert. Houd de buizen op ijs en zet ze rechtop om te voorkomen dat de pellet wordt verstoord.
  7. Verwijder het supernatans voorzichtig met een P200-micropipet en vermijd verstoring van de pellet (Figuur 4E).
  8. Werp de punt uit en voeg vervolgens 50 μL 1x PBS toe aan de buis na het verwijderen van het supernatans met behulp van een P200-micropipet. Voeg voor GAS- en QUA-monsters tot 500 μL 1x PBS toe om het oplossen te bevorderen (Figuur 4F).
  9. Resuspendeer de pellet door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een P20-micropipet (of P200-micropipet als 500 μl is toegevoegd) totdat deze volledig is afgebroken en niet langer zichtbaar is.
  10. Sluit de buis en bewaar deze bij 4 °C voor kortstondige opslag (minder dan een week), -80 °C voor langdurige opslag, of plaats de buis terug op ijs als het monster onmiddellijk wordt gekarakteriseerd met behulp van nanoflowcytometrie, Western blot of andere tests.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens dit protocol werden extracellulaire blaasjes van skeletspieren (SkM-EV's) met succes geëxtraheerd uit verschillende spiergroepen, waaronder de tibialis anterior (TA), extensor digitorum longus (EDL), soleus (SOL), gastrocnemius (GAS) en quadriceps (QUA) van wildtype muizen. De daaropvolgende karakterisering van deze SkM-EV's werd uitgevoerd door middel van nano-flowcytometrie, waarbij hun verschillende kenmerken werden opgehelderd zoals samengevat in tabel 1. Opm...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol begint met het ontleden van spiergroepen van de achterpoten van muizen of het verkrijgen van postmortaal menselijk spierweefsel op basis van beschikbare protocollen16. De volgende isolatieprocedures voor extracellulaire blaasjes van skeletspieren (SkM-EV's) bestaan uit drie primaire secties: milde enzymatische vertering van het weefsel om interstitiële SkM-EV's vrij te maken, filtratie en centrifugatie met lage snelheid, en ultracentrifugatie. Tot slo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie W81XWH2210261 (naar Yao Yao).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.6 mL microcentrifuge tubesThermoFisher Scientific05-408-120
1.5 mL micro tube (C) Eppendorf5720411009
1.5 mL microcentrifuge tubesThermoFisher Scientific3448Helder, gegradueerd, niet-sterieel
BD 5 mL SyringeBecton Dickinson14-827-52 luer-lok tip
Cell Counting Slides, Dual Chamber for Cell CounterBio-Rad145-0011
Centrifuge 5430REppendorf22620667
Cleaning solutionNanoFCM Inc.
Collagenase IIWorthington Biochemical CorporationLS004176
DPBS (10x) Liquid (-calcium,-magnesium)CytivaSH30378.02De uiteindelijke gebruikte verdunning is 1x
DPBS/Modified (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure Water Remote DispenserMillipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 Microcentrifuge RotorEppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 General Protocol OvenThermoFisher Scientific51028112Zwaartekrachtconvectie, 2,3 cu.ft. 120 V
MemGlow-488 ProbeCytoskeleton Inc.MG01-02
Millipak Special MilliporeMillipore SigmaTANKMPK02
Penicillin-StreptomycinGibco15070063
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Rainin17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Rainin17014392
Pipette tips ER LTS 1000µL F 768G/8Rainin30808038
Pipette tips ER LTS 20µL F 960G/10Rainin30807966
Pipette tips ER LTS 200µL F 960G/10Rainin30807967
Quality Control beadsNanoFCM Inc.
S110-AT Fixed Angle RotorThermoFisher Scientific455391,10,000 rpm
S16 exo 65-155nm beadsNanoFCM Inc.
ScissorsSPI, USA
Sorvall mX 150+ Micro-UltracentrifugeThermoFisher Scientific50135641
TC 20 automated cell counterBio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
TweezersSPI, USA
VWR 15mL centrifuge tubesAvantor89039-668
Whatman Puradisc 13 FiltersCytiva6782-13040,45 µm poriegrootte
Wild-type C57BL/6J miceJackson Laboratorystock #000664

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, A., et al. Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level. Elife. 12, 89512(2023).
  2. Yamaguchi, A., et al. Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages. Front Immunol. 14, 1099799(2023).
  3. Takada, Y., et al. Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells. Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).
  4. Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques. Alcohol. 108, 1-9 (2023).
  5. Kargl, C. K., et al. Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice. Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).
  6. Vann, C. G., et al. Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle. Front Physiol. 13, 937899(2022).
  7. Anakor, E., et al. The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes. Cells. 11 (5), 845(2022).
  8. Mendhe, B., et al. Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury. Cells. 12 (4), 557(2023).
  9. Madison, R. D., Robinson, G. A. Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy. Neuroscience. 419, 46-59 (2019).
  10. Hanson, B., et al. EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).
  11. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. 190, e64557(2022).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  14. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  15. Baietti, M. F., et al. Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes. Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).
  16. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique. J Vis Exp. (91), e51812(2014).
  17. Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury. Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells. Regen Ther. 7, 1-7 (2017).
  20. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. J Vis Exp. (86), e50846(2014).
  21. Mozzetta, C. Isolation and culture of muscle stem cells. Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).
  22. Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers. Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).
  23. Ma, S., et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

EV s uit skeletspierweefselenzymatische dissociatieultracentrifugatieisolatie van spierweefselnano flowcytometrieWestern blotBCA assayintercellulaire communicatiediagnostische biomarkers

Gerelateerde artikelen