Methodenartikel

Translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen onder hittestress

DOI:

10.3791/67445

⸱

11 oktober 2024

 , 
1Department of Biochemical Science and Technology, National Taiwan University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hier gepresenteerde protocol omvat polysomale profilering om translatom, mRNA's geassocieerd met ribosomen, te isoleren in niet-polysomale en polysomale RNA's van Arabidopsis door middel van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie. Deze methode toont de translatie-efficiëntie van hitte-gestreste Arabidopsis.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translationele controle van verschillende genen onder hittestress is een cruciale stap voor de aanpassing van planten aan de omgeving. Het beoordelen van de translationele activiteiten van verschillende genen kan ons helpen de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de veerkracht van planten, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van gewassen met een verhoogde stresstolerantie in het licht van de wereldwijde klimaatverandering. Dit artikel presenteert een gedetailleerde methodologie voor het beoordelen van de translatie-efficiëntie door middel van polysoomprofilering in planten die worden blootgesteld aan hittestress. De procedure is verdeeld in drie delen: hittestressbehandeling voor Arabidopsis, translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofielen en berekening van translatie-efficiëntie door niet-polysomaal en polysomaal RNA te isoleren op basis van het profiel. In het eerste deel worden Arabidopsis-planten onderworpen aan gecontroleerde hittestressomstandigheden om milieu-uitdagingen na te bootsen. De behandeling omvat het blootstellen van de planten aan hoge temperaturen gedurende een bepaalde duur, waardoor een consistente en reproduceerbare stressinductie wordt gegarandeerd. Deze stap is cruciaal voor het bestuderen van de fysiologische en moleculaire reacties van de plant op hittestress. Het tweede deel omvat de translatie-efficiëntietest met behulp van polysoomprofilering. Polysomen worden geëxtraheerd door middel van sucrosegradiëntcentrifugatie, waarbij mRNA's worden gescheiden op basis van ribosomale belasting. Dit maakt het mogelijk om de bezetting van ribosoomen op mRNA's te onderzoeken, wat inzicht geeft in de translationele controlemechanismen onder stressomstandigheden. In het derde deel wordt RNA geïsoleerd uit zowel polysomale als niet-polysomale fracties. Spike-in RNA wordt gebruikt om de hoeveelheid RNA in elke fractie nauwkeurig te meten. De berekening van de translatie-efficiëntie wordt uitgevoerd door de verdeling van mRNA's over deze fracties te vergelijken onder normale omstandigheden en onder hittestressomstandigheden. De translatieactiviteiten van specifieke genen worden verder beoordeeld door kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR) uit te voeren met ribosoom-geassocieerd RNA en totaal RNA. Deze methodologie richt zich uitsluitend op de effecten van hittestress en biedt een gedetailleerd protocol voor het analyseren van translationele regulatie in planten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Translatie is cruciaal voor organismen om functionele eiwitten uit mRNA te synthetiseren, ter ondersteuning van essentiële cellulaire functies en biologische processen zoals metabolisme en signalering en het mogelijk maken van stressreacties. Zonder translatie kunnen cellen geen vitale eiwitten produceren, wat hun structuur, functie en regulatie beïnvloedt, waardoor het leven in stand wordt gehouden en de biologische diversiteit wordt bevorderd 1,2. Daarom is het bestuderen van de translationele efficiëntie van planten cruciaal. Vertalen omvat een aantal essentiële stappen. Ten eerste vindt initiatie plaats wanneer mRNA bindt aan een ribosoom, gefaciliteerd door initiatiefactoren zoals eIF's in eukaryoten, die het startcodon identificeren, meestal AUG. Vervolgens verloopt de verlenging doordat transfer-RNA (tRNA) moleculen, die elk specifieke aminozuren dragen, achtereenvolgens aan het ribosoom binden. Peptidebindingen vormen zich tussen aangrenzende aminozuren, waardoor de polypeptideketen wordt verlengd volgens de mRNA-sequentie. Ten slotte wordt beëindiging geïnitieerd bij het tegenkomen van een stopcodon (UAA, UAG of UGA), herkend door afgiftefactoren die het ribosoom ertoe aanzetten het nieuw gesynthetiseerde eiwit vrij te geven. Tijdens de translatie werken verschillende eukaryote initiatiefasefactoren (eIF's), verlengingsfactoren en ribosomale RNA's samen om nauwkeurigheid en efficiëntie te garanderen 3,4.

Eerdere studies hebben aangetoond dat posttranslationele modificaties een cruciale rol spelen bij het reguleren van interacties tussen eIF's en daardoor de vertaalefficiëntie beïnvloeden. In vitro onderzoek heeft aangetoond dat CASEÏNE KINASE 2 (CK2) kinase eIF3c, eIF5 en eIF2β fosforyleert om hun interacties met elkaar en met eIF1 te vergroten 5,6. In het donker onderdrukt de E3-ligase CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1 (COP1) de translatie door de TOR-gemedieerde fosforylering van S6K-RPS6 te remmen. Het niet-gefosforyleerde RPS6 is niet in staat functionele ribosomen te vormen, waardoor de translatie wordt gestopt7. Omgekeerd fosforyleert de SUPPRESSOR OF PHYA 105 (SPA1)-kinase onder lichte omstandigheden eIF2α om de assemblage van het eIF2-complex te vergemakkelijken en translatie-initiatie te bevorderen8. Deze bevindingen benadrukken de complexe controlemechanismen die de vertaling reguleren als reactie op omgevingssignalen.

Matige omgevingsstimuli kunnen translationele processen om groei te vergemakkelijken, zoals fotomorfogenese, effectief bevorderen 8,9. Wanneer de omgevingsfactoren echter buitensporig zijn, moeten immobiele installaties geschikte regulerende mechanismen ontwikkelen om de schade veroorzaakt door milieustress te beperken10. In eerdere studies met betrekking tot stressreacties bij planten, richtte de meerderheid zich op regulatie op metabole, hormonale en transcriptionele niveaus 11,12,13,14. Recent onderzoek is echter begonnen met het benadrukken van de invloed van translationele regulatie op de stresstolerantie van planten 15,16,17. Planten kunnen hun stresstolerantie verhogen door de translatie-efficiëntie te verminderen, waardoor onnodig energieverbruik wordt geminimaliseerd. Door de vorming van niet-membraneuze stresskorrels in plantencellen, aggregeren onvertaald mRNA en geassocieerde eiwitten erin om de translationele efficiëntie te verminderen18. Een van de meest voorkomende omgevingsstress waarmee planten vaak te maken krijgen, is hittestress, waarvan is gemeld dat het de vorming van stresskorrels in plantencellen induceert19,20. De wereldwijde stijging van de gemiddelde temperatuur als gevolg van de opwarming van de aarde heeft ernstige gevolgen voor de gewasopbrengsten21. Daarom is het bestuderen van de fysiologische regulatie van planten onder hittestress cruciaal. Een eerdere studie heeft aangetoond dat warmtebehandeling van tarwe resulteerde in een afname van polysoomgebonden mRNA. MRNA's die in stresskorrels waren opgeslagen, werden echter vrijgegeven en opnieuw gebonden aan ribosomen, waardoor de translatie na herstel werd vergemakkelijkt22. Bovendien heeft eerder onderzoek de genexpressie tussen totaal mRNA en polysoomgebonden mRNA in ondergedompelde plantenvergeleken16. De resultaten gaven aan dat de steady-state niveaus van mRNA geassocieerd met abscisinezuur en abiotische stressreacties licht toenamen na onderdompeling. Bovendien nam de hoeveelheid polysoomgebonden mRNA's aanzienlijk toe. Deze resultaten suggereren dat translatieregulatie een belangrijkere rol zou kunnen spelen bij het beheersen van stresstolerantie bij planten. Daarom is een effectieve polysomale RNA-isolatiemethode cruciaal voor het bestuderen van het translatoom van met stress behandelde monsters.

In dit protocol hebben we de RNA-isolatiemethode aangepast van de risicovolle en volumineuze fenol/chloroform-extractie met LiCl-precipitatiemethode naar de kleinschalige fenol/guanidiniumthiocyanaat-extractiemethode, die minder volume vereist. Bij de eerste methode wordt direct gemengd met polysomale fracties, wat resulteert in een groter experimenteel afval 9,15,23. Daarentegen maakt deze gewijzigde benadering gebruik van differentiële dichtheidsprincipes: polysomaal RNA wordt eerst gemengd met een zoutrijke, suikervrije oplossing en vervolgens neergeslagen door ultracentrifugatie. Vervolgens wordt RNA-extractie uitgevoerd met behulp van een kleine hoeveelheid fenol/guanidiniumthiocyanaatreagens. Deze methode vermindert effectief de productie van organisch afval, waardoor ons experiment milieuvriendelijker wordt. Bovendien hebben de gebruikte organische oplosmiddelen een lagere toxiciteit. Deze redenen hebben ons ertoe gebracht de experimentele procedures dienovereenkomstig aan te passen en te verbeteren. Bovendien boden eerdere methoden geen alomvattend protocol voor het berekenen van vertaalefficiëntie met behulp van spike-in-normalisatie, wat essentieel is voor meer diepgaande translatomische analyses.

Hier beschrijven we polysoomprofilering en het polysomale RNA-isolatieprotocol voor het onderzoeken van translatie-efficiëntie en translatomische analyses in Arabidopsis onder hitteschokstress. Dit protocol werd gebruikt om de translatie-efficiëntie in het Col-0 wildtype te beoordelen onder normale, hitteschok- en after-herstelomstandigheden. De resultaten van polysoomprofilering en het percentage polysomaal RNA onthulden veranderingen in de translatie-efficiëntie na behandeling met hittestress in Arabidopsis-zaailingen .

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Monstervoorbereiding van Arabidopsis-zaailingen met hittestress

  1. Plaat 250 zaden voor elke replicatie en elke conditie met een druppelaar op het filtreerpapier geplaatst op de Murashige en Skoog (MS) basale media agarplaat zonder sucrose (pH 5,6) aangevuld met 1,2% fytoagar.
    OPMERKING: Om zaailingen op MS-platen te planten, wordt steriel filterpapier op de plaat geplaatst om te voorkomen dat de wortels van de zaailingen diep in het medium doordringen, waardoor de bemonstering gemakkelijker wordt. Vervolgens worden de zaden op het filtreerpapier geplant. Om de invloed van suikers op de plantengroei en experimentele resultaten uit te sluiten, wordt aanbevolen om voor de teelt een MS-medium te gebruiken dat geen sucrose bevat.
  2. Wikkel de MS-plaat met geplante zaden in aluminiumfolie om het licht te blokkeren en incubeer het gedurende 2 dagen bij 4 °C om vernalisatie op te wekken.
  3. Breng de vernaliseerde zaden over naar een groeikamer om te worden gekweekt onder een licht-donker fotoperiode van 16 uur: 8 uur bij 22 °C met een lichtintensiteit van 100 μmol/m2/s.
  4. Voor hittestressmonsters verzegelt u de MS medium-platen met zaailingen van 5 dagen oud met waterdicht plakband en plaatst u ze gedurende 1 uur in een waterbad van 40 °C.
  5. Voor monsters die na warmtebehandeling herstellen, koelt u de platen onmiddellijk na de warmtebehandeling af. Plaats ze vervolgens gedurende 2 uur in een groeikamer bij 22 °C.
  6. Oogst 250 zaailingen, behandeld of onbehandeld, in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor elke replica en vries de monsters onmiddellijk in vloeibare stikstof in.
    OPMERKING: Voor elke aandoening werden twee groepen monsters bereid. De ene is voor de analyses van polysoomprofilering en de andere is voor de niet-polysomale en polysomale RNA-extractie.

2. Voorbereiding op de sucrosegradiënt

  1. Bereid de gradiëntoplossing met de volgende concentraties sacharose: 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% en 60%. De samenstelling van de oplossing omvat 50 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2, 100 μg/ml heparine en 50 μg/ml cycloheximide (CHX).
  2. Laad de gradiëntoplossingen van hoge naar lage concentratie, beginnend vanaf de bodem en naar boven. Na het toevoegen van elke concentratie gradiëntoplossing, vriest u de oplossing in tot een vaste toestand voordat u de volgende concentratie toevoegt. Voeg voor elke concentratie sucrosegradiënt 2,2 ml toe. Dit proces zal resulteren in een discontinue sucrosedichtheidsgradiënt.
  3. Bewaar de bereide sucrosegradiënt tijdelijk bij -80 °C en ontdooi voor gebruik een nacht bij 4 °C.

3. Voorbereiding van polysoomprofilering

  1. Maal 250 5 dagen oude Col-0 zaailingen, al dan niet met hittestress, die eerder zijn ingevroren tot poeder met behulp van een homogenisator met een frequentie van 30 cycli/s gedurende 1 minuut.
    OPMERKING: Wanneer het aantal planten met dezelfde achtergrond gelijk is, hebben ze dezelfde RNA-extractieopbrengst. Bij het vergelijken van transgene of mutante planten met verschillende achtergronden die tot overexpressie komen, moet de hoeveelheid planten die wordt gebruikt echter worden aangepast aan de plantomstandigheden.
  2. Om een extractieoplossing te verkrijgen die niet-polysomaal en polysomaal RNA bevat, voegt u 500 μL polysoomextractiebuffer (200 mM Tris-HCl, pH 8,0, 50 mM KCl, 25 mM MgCl2, 50 μg/ml cycloheximide, 100 μg/ml heparine, 2% PTE, 10% DOC, 400 E/ml Ribonuclease-remmer) toe aan elke buis en mengt u de monsters door omkering en vortex. Zorg ervoor dat de monsters gedurende het hele proces op 4 °C worden gehouden.
  3. Centrifugeer de extractieoplossing bij 4 °C, 12.000 x g gedurende 10 min. Filtreer het supernatans vervolgens door een celzeef van 100 μm om een heldere en deeltjesvrije extractieoplossing te verkrijgen.
    OPMERKING: De deeltjes die in de extractieoplossing aanwezig zijn, kunnen tijdens ultracentrifugatie bezinken, waardoor mogelijk een pellet wordt gevormd die de nauwkeurigheid van polysoomprofileringsmetingen kan beïnvloeden.
  4. Laad het gefilterde supernatans op een vooraf voorbereide sucrosegradiënt en zorg ervoor dat deze in evenwicht is.
    NOTITIE: Vanwege het hoge toerental van de ultracentrifuge is het essentieel om zowel de veiligheid als de goede werking van de ultracentrifuge te garanderen. Om dit te bereiken, is het noodzakelijk om vóór rotatie te bevestigen dat de monstergewichten identiek zijn. Daarom gebruiken we een bovenweger om te controleren of de gewichten van de hellingen volledig uniform zijn.
  5. Centrifugeer de sucrosegradiënt geladen met monsters bij 4 °C, 210.000 x g gedurende 3,5 uur met behulp van een ultracentrifuge-zwenkbare emmerrotor. Stel de acceleratie- en vertragingssnelheden in op het maximum. Na ultracentrifugatie worden niet-polysomaal en polysomaal RNA verdeeld op basis van hun dichtheid in de overeenkomstige sucrosegradiëntoplossing.
    OPMERKING: In de sucrosegradiënt verdeelt niet-polysomaal RNA met een lagere dichtheid zich in de bovenste laag, terwijl polysomaal RNA, gekenmerkt door een hogere dichtheid vanwege de aanwezigheid van talrijke ribosomen die betrokken zijn bij actieve translatie op mRNA, zich verdeelt in de onderste laag. Vervolgens kan polysoomprofilering worden gemeten met behulp van een fractionator met dichtheidsgradiënt.

4. Analyse van polysoomprofilering

OPMERKING: Een dichtheidsgradiëntfractionator met een spuitpomp met microvolume wordt gebruikt om polysoomprofilering te meten.

  1. Bereid de chase-oplossing (70% sucrose, 10% glycerol en 0,02% broomfenolblauw) voor de microvolumespuitpomp.
  2. Gebruik software om de fractionator van de dichtheidsgradiënt te regelen. Kalibreer de machine met gedeïoniseerd water. Gebruik het na kalibratie om polysoomprofilering uit te voeren.
    1. Om de basislijnaanpassing uit te voeren, zet u de UV/VISDetector aan totdat het licht van rood naar groen verandert. Pas de Recorder Offset-knop aan om de markeringslijn uit te lijnen en draai vervolgens de Baseline Adjust-knop naar de minimale open positie. Zet de gevoeligheidsknop op de UV/VISDETECTOR op niveau 2.0 en druk op de Auto Baseline-knop . Gebruik ten slotte de Recorder Offset-knop om de gewenste basislijn aan te passen aan 20. Het gekalibreerde proces is afhankelijk van het merk mechanisme en de verschillende monsters.
  3. Plaats na ultracentrifugatie de buisjes met de monsters op de dichtheidsgradiëntfractionator met behulp van het buisdoorsteeksysteem, zodat de buis kan worden aangesloten op de spuitpomp met de achtervolgingsoplossing en de UV-detector.
  4. Zet de dichtheidsgradiëntfractionator in de softwarebesturingsmodus (REMOTE) en stel het injectiedebiet van de spuitpomp met microvolume in op 3 ml/min.
  5. Start de software-instellingen om te beginnen en verkrijg de polysoomprofielgrafiek met behulp van de fractionator door OD254 te meten.

5. Isolatie van niet-polysomaal en polysomaal RNA

OPMERKING: Voor dit deel van het protocol werd een andere groep monsters uit dezelfde batch gebruikt na het uitvoeren van ultracentrifugatie volgens dezelfde stappen als eerder beschreven.

  1. Verzamel op basis van de meetresultaten van het polysoomprofiel de niet-polysomale en de polysomale RNA-fracties afzonderlijk. Bereken de hoeveelheden oplossing voor zowel niet-polysomale als polysomale fracties en verzamel de niet-polysomale fractie (bovenste deel).
    OPMERKING: Volgens de profielen wordt de fractie met meer dan twee ribosomen gedefinieerd als een polysomale fractie, terwijl de fractie met de 40S, 60S en 80S rRNA-pieken wordt gedefinieerd als een niet-polysomale fractie.
  2. Meng de doelfracties van RNA grondig met 2x een oplossing met een hoog zoutgehalte (400 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM KCl, 50 mM MgCl2).
  3. Voeg 8 μL verdunde voorraad Eukaryotic Poly-A RNA Control uit de kit toe.
    OPMERKING: Voor de spike-in-normalisatie die vereist is voor de zevende stap. De Eukaryote Poly-A RNA Control Kit bevat B. subtilis-genen , zoals het DAP-gen die niet aanwezig zijn in planten, als referentiegenen. Om het aandeel van het verlies van referentiegen tijdens de reactie na extractie te bepalen, voegt u vóór extractie een gelijke hoeveelheid van het reagensbevattende RNA-monster van het DAP-gen toe aan verschillende buisjes met niet-polysomaal of polysomaal RNA. Dit maakt het mogelijk om het aandeel van het verlies van referentiegenen tijdens de reactie na extractie te bepalen en kan worden gebruikt voor normalisatiedoeleinden.
  4. Centrifugeer het met een hoog zoutgehalte gemengde RNA bij 4 °C, 450.000 x g, gedurende 5 uur met behulp van een ultracentrifuge-rotor met zwaaiende emmer.
  5. Na ultracentrifugatie zal RNA neerslaan op de bodem van de centrifugebuis. Giet het supernatans voorzichtig van bovenaf af om de RNA-pellet aan de onderkant te behouden.
  6. Was de RNA-pellet snel met 500 μL voorkoud met diethylpyrocarbonaat (DEPC) behandeld water en herhaal deze stap 3x.
    OPMERKING: Om te voorkomen dat met DEPC behandeld water het RNA tijdens het wasproces opnieuw oplost, is het noodzakelijk om het met DEPC behandelde water voor gebruik voor te koelen om de oplosbaarheid te verminderen. Bovendien moet de contacttijd tussen het met DEPC behandelde water en de RNA-pellet tijdens het wassen tot een minimum worden beperkt.

6. Niet-polysomale en polysomale RNA-extractie

  1. Voeg 500 μL RNA-extractiereagens toe en meng met het te extraheren RNA-monster. Incubeer gedurende 10 min.
  2. Voeg 100 μL chloroform toe, meng grondig en incubeer gedurende 10 minuten voor fasescheiding.
  3. Centrifugeer het reactiemengsel bij 4 °C, 12.000 x g gedurende 10 min. Breng de bovenste heldere waterige laag met RNA over in een nieuwe buis, meng deze voorzichtig met een gelijk volume isopropanol en incubeer bij -20 °C gedurende 2 uur voor RNA-precipitatie.
  4. Centrifugeer na precipitatie gedurende 10 minuten bij 4 °C, 12.000 x g . Gooi het supernatans voorzichtig weg en bewaar de RNA-pellet op de bodem.
  5. Was de RNA-pellet met 1 ml voorkoude 75% ethanol. Centrifugeer bij 4 °C, 12.000 x g gedurende 10 minuten, gooi het supernatant weg en laat de RNA-pellet aan de lucht drogen.
  6. Zodra de RNA-pellet is gedroogd, resuspendeert u de RNA-pellet in 30 μL DEPC-behandeld water en meet u de RNA-concentratie (OD260) met behulp van een spectrofotometer met volledig spectrum (220 nm-750 nm).

7. Piek-in normalisatie

  1. Gebruik 1000 ng geëxtraheerd RNA voor omgekeerde transcriptie met behulp van een qPCR-kit volgens de instructies van de fabrikant. Zowel niet-polysomaal als polysomaal RNA moeten omgekeerd worden getranscribeerd in cDNA.
  2. Meng 1 μL cDNA met DAP-genprimers en gebruik SYBR-buffer om het expressieniveau van het doelgen te meten volgens de instructies van de fabrikant. Gebruik vervolgens real-time PCR om DAP-genexpressie te detecteren.
    OPMERKING: Sequenties van de primers van het DAP-gen zijn als volgt:
    Voorwaartse primer = 5'-ATA AAA GAA TTC AGC TAA CGC TTC C-3'
    Omgekeerde primer = 5'-TTG TTT CTT TGC CTC TAT TGT ATC C-3'
  3. Vergelijk de expressieniveaus van DAP-genen in de gemeten niet-polysomale en polysomale RNA-groepen en schat het RNA-gehalte onder omstandigheden van proportioneel verlies. Bereken met behulp van het genormaliseerde RNA-gehalte de verhouding van RNA in polysomen.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het wilde type Arabidopsis, Col-0, werd gekweekt op MS medium onder een 16 h:8 h licht fotoperiode. Voor de controle werden zaailingen van 5 dagen oud gebruikt zonder behandeling tegen hittestress. De hittestressgroep onderging 1 uur warmtebehandeling bij 40 °C in een voorverwarmd waterbad, terwijl de herstelgroep onmiddellijk na de warmtebehandeling gedurende 22 uur op 22 °C werd geplaatst. Door gebruik te maken van verschillende warmtebehandelings- en herstelomstandigheden, kunnen we volgende stappen gebruiken om hun translationele efficiëntie te meten.

Vóór RNA-extractie moet eerst de sucrosegradiënt worden voorbereid. Om het niet-polysomale en polysomale RNA te scheiden op basis van hun dichtheidsverschil, hebben we een gradiëntoplossing bereid met sucroseconcentraties van 12,5%, 24,4%, 36,3%, 48,1% en 60%. Vervolgens hebben we de gradiëntoplossingen geladen van hoge naar lage concentratie, beginnend aan de onderkant (Figuur 1A). Vervolgens kunnen we deze gradiënt gebruiken om het niet-polysomale RNA met een lagere dichtheid in de bovenste laag te scheiden, terwijl het polysomale RNA met een hogere dichtheid in de onderste laag wordt verdeeld met hogere sucroseconcentraties. Het niet-polysomale en polysomale RNA werden geëxtraheerd uit het behandelde of onbehandelde Col-0. Om te voorkomen dat deeltjes in de oplossing de resultaten van de analyse van polysoomprofilering beïnvloeden, moet de RNA-bevattende oplossing door een celzeef worden gefilterd om een deeltjesvrije extractieoplossing te verkrijgen. Het gefilterde supernatans werd op een vooraf bereide sucrosegradiënt geladen en in evenwicht gebracht. Na de ultracentrifugatie van met sucrose gradiënt beladen monsters, werden het niet-polysomale en polysomale RNA verdeeld volgens dichtheid binnen de sucrosegradiënt. Vervolgens werd polysoomprofilering uitgevoerd met behulp van een dichtheidsgradiëntfractionator (Figuur 1B). De fractionator voor dichtheidsgradiënt wordt bestuurd met behulp van software die aanvankelijk is gekalibreerd met gedeïoniseerd water. Na kalibratie worden de monsters na de ultracentrifugatie op de fractionator geladen. De spuitpomp met microvolumespuit werkt in de softwarebesturingsmodus en injecteert sucroseoplossing met concentraties hoger dan de sucrosegradiënt in de gradiënt, waardoor het monster wordt geduwd. Hierdoor kan de meting beginnen vanaf de bovenkant van de sucrosegradiënt, waar de dichtheid lager is, en naar beneden gaan, waar de dichtheid hoger is. Vervolgens worden software-instellingen geactiveerd om te beginnen met het verzamelen van gegevens, waarbij de polysoomprofielgrafiek wordt gegenereerd door middel van OD254-meting (Figuur 1B). Wanneer we een hogere signaalintensiteit waarnemen in de polysomale fractie, geeft dit aan dat het monster een hogere translatie-efficiëntie vertoont.

De percelen van polysoomprofilering voor 5 dagen oude Col-0 zaailingen onder verschillende behandelingen zijn weergegeven in figuur 2. De resultaten van de controlegroep laten een duidelijke scheiding zien tussen de niet-polysomale fractie en de polysomale fractie (figuur 2A). Na 1 uur hittestress bij 40 °C nam de signaalintensiteit van de polysomale fractie echter significant af (figuur 2B). Wanneer de warmtebehandelde zaailingen gedurende 2 uur bij 22 °C konden herstellen, herstelde de signaalintensiteit van de polysomale fractie zich tot een niveau dat vergelijkbaar was met dat van de controlegroep (figuur 2C). Onze resultaten toonden aan dat een behandeling met hittestress gedurende 1 uur de translatie-efficiëntie van Arabidopsis-zaailingen aanzienlijk verminderde. Planten hadden echter 2 uur herstel nodig om de translatie-efficiëntie te herstellen tot niveaus die vergelijkbaar zijn met die van zaailingen die geen last hebben van hittestress.

Om verder bewijs te verzamelen dat de translatie-efficiëntie van Col-0-zaailingen onder verschillende behandelingsomstandigheden vergelijkt, hebben we de niet-polysomale en polysomale RNA-fracties geïsoleerd en geëxtraheerd. De verzameling van niet-polysomale en polysomale RNA-fracties werd geleid door de resultaten van polysoomprofielmetingen. Voor niet-polysomale en polysomale RNA-extractie gebruiken we het fenol/guanidiniumthiocyanaatreagens om de geïsoleerde niet-polysomale en polysomale RNA-monsters te extraheren. Met de RNA-extractiemethode die we hebben gebruikt, kunnen we stabiel en hoogwaardig RNA krijgen voor onze volgende analyse (Tabel 1). Normaliseer vervolgens het geëxtraheerde RNA met de GeneChip Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit om fouten te verminderen die worden veroorzaakt door variërende extractieverliezen. Vervolgens werd real-time PCR gebruikt om de expressie van DAP-genen te kwantificeren, die zijn opgenomen in de B. subtilis-genen die aan de kit zijn toegevoegd. Vergelijkende analyse van DAP-genexpressieniveaus tussen niet-polysomale en polysomale RNA-groepen werd uitgevoerd om het RNA-gehalte te schatten onder omstandigheden van proportioneel verlies (Figuur 3A). We berekenden de verhouding tussen genormaliseerd polysomaal RNA en totaal RNA om de translatie-efficiëntie tussen hen te verduidelijken (Figuur 3B). Ten slotte werd de verhouding van RNA in polysomen berekend met behulp van het genormaliseerde RNA-gehalte (Figuur 3C). De resultaten van de RNA-verhouding in polysomen onder verschillende behandelingen van Col-0 vertoonden een patroon dat consistent was met de resultaten van het polysoomprofiel in figuur 2A. Beide resultaten geven aan dat hittestress de RNA-verhouding in de polysomale fractie aanzienlijk vermindert, en dit effect kan worden omgekeerd na een herstel van 2 uur bij 22 °C (tabel 1).

Met deze methode kunnen we de volledige niet-polysomale of polysomale RNA-fractie van hoge kwaliteit verkrijgen in plaats van het RNA te scheiden in extra fracties23. Onze resultaten tonen ook aan dat zowel polysoomprofielen als het percentage RNA in polysomen de translatie-efficiëntie in Arabidopsis met verschillende behandelde aandoeningen effectief kunnen weerspiegelen.

figure-results-1
Figuur 1: Workflowdiagram voor polysoomprofilering. (A) Schematische illustratie van de bereiding van de sucrosegradiënt in een centrifugebuis van 13 ml. (B) Het stroomdiagram illustreert het experimentele proces van polysoomprofilering. Eerst wordt het translatoom geëxtraheerd. Vervolgens worden niet-polysomaal en polysomaal RNA gescheiden op basis van hun dichtheidsverschillen met behulp van ultracentrifugatie in sucrosegradiënten van verschillende dichtheden. OD254 wordt gemeten met behulp van een dichtheidsgradiëntfractionator om de onderstaande grafiek met polysoomprofileringsresultaten te verkrijgen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Polysoomprofilering van Col-0 onder verschillende omstandigheden. (A, B, C) De resultaten van polysoomprofilering van Col-0 onder omstandigheden van (A) geen warmtebehandeling (controle), (B) warmtebehandeling bij 40 °C gedurende 1 uur en (C) herstel bij 22 °C gedurende 1 uur na warmtebehandeling. Het niet-polysomale en polysomale RNA werden gefractioneerd met behulp van een sucrosegradiënt van 12,5%-60%. De posities van niet-polysomaal (NP) en polysomaal (PL) RNA zijn aangegeven op de profielen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Werkstroomdiagram voor niet-polysomale en polysomale RNA-extractie. (A) Een illustratie van RNA-normalisatie door spike-in. (B) Een illustratie van de scheiding van niet-polysomaal en polysomaal RNA en de berekening van het percentage polysomaal RNA. (C) Het percentage polysomaal RNA in Col-0 behandeld met verschillende aandoeningen. Foutbalken geven het gemiddelde ± SD aan (n=3 biologische herhalingen). *p-waarde < 0,01, Student's t toets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Inhoud (ng)260/280260/230
BeheersenRNANP758.32.192.16
RNAPL302.32.212.13
HittestressRNANP821.52.22.15
RNAPL174.32.192.21
TerugwinningRNANP797.22.172.16
RNAPL300.92.192.18

Tabel 1: Niet-polysomale en polysomale RNA-inhoud en -kwaliteiten. Deze tabel toonde de RNA-inhoud en -kwaliteiten die werden geanalyseerd. Het RNA-gehalte werd genormaliseerd na extractie met behulp van gewijzigde methoden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol schetst een eenvoudige en gestandaardiseerde methode voor het meten van de translatie-efficiëntie van Arabidopsis-zaailingen. De kritieke stappen van dit protocol zijn het waarborgen van RNA-stabiliteit met secundaire centrifugatie en RNA-extractie van reagensextractie, evenals een nauwgezette voorbereiding van de sucrosegradiënt. Bovendien bieden we cruciale stappen voor het normaliseren en kwantificeren van het niet-polysomale en polysomale RNA met de spike-in normalisatiemethode. Het is van groot belang dat alle procedures op ijs worden uitgevoerd met behulp van RNasevrije buffers en hulpmiddelen. Zorg bovendien voor een nauwkeurige bereiding van de sucroseconcentratie en minimaliseer schudden om de impact op de gradiënt te verminderen. In eerdere studies 24,25,26 heeft het onderzoek naar stressreacties zich voornamelijk gericht op transcriptionele en fenotypische analyses. Met polysoomprofielanalyses kunnen we de regulatie van translationele processen in planten onder stress of andere omgevingsprikkels verder onderzoeken.

Het begrijpen van translationele processen omvat niet alleen het uitvoeren van polysoomprofileringsexperimenten, maar ook het aanvullen ervan met Azidohomoalanine (AHA) labelexperimenten. AHA-etikettering wordt gebruikt om eiwitsynthese en translationele activiteit te onderzoeken27. De methode vervangt methionineresiduen in nieuw gesynthetiseerde eiwitten door AHA, een methionine-analoog die een azidegroep bevat. Cellen integreren AHA in nieuw gesynthetiseerde eiwitten tijdens de translatie. Vervolgens kunnen met behulp van op azidechemie gebaseerde technieken zoals klikchemie eiwitten die AHA bevatten selectief worden geëtiketteerd en gedetecteerd, waardoor kwantitatieve analyse en visualisatie van actief translerende eiwitten mogelijk wordt. Door AHA-labeling te combineren met polysoomprofilering, kunnen onderzoekers dieper inzicht krijgen in de dynamiek van eiwitsynthese in plantencellen8.

Met deze polysomale RNA-isolatie en spike-in normalisatiemethode kunnen we het geëxtraheerde RNA ook gebruiken voor RNA-sequencinganalyse. Door polysoomgebonden mRNA te analyseren, kunnen we bepalen welke mRNA's actief translatie ondergaan. Bovendien stelt het vergelijken van steady-state mRNA met polysoomgebonden mRNA ons in staat om genen te identificeren die tot overexpressie worden gebracht op translatie- of transcriptieniveau. Het expressieniveau van steady-state mRNA weerspiegelt de transcriptionele activiteit, terwijl polysoomgebonden mRNA genen aangeeft die actief translatie ondergaan. De translatie-efficiëntie wordt beïnvloed door stimuli uit de omgeving en posttranslationele modificaties 7,8,9,16. Daarom biedt deze methode een uitgebreid inzicht in de vraag of het doeleiwit van belang effectief wordt vertaald. De limiet van deze methode is echter dat er nog steeds een verlies van RNA zal zijn tijdens het extractieproces. Relatieve expressie van spike-in RNA verkregen via qRT-PCR kan ook leiden tot kleine meetfouten. Verder onderzoek en validatie met behulp van proteomics of Western blot is nodig om de functionele aspecten van het doeleiwit te onderzoeken.

Samenvattend vertegenwoordigt dit protocol een eenvoudige methode die een rechttoe rechtaan aanpak biedt met duidelijke resultaten voor het evalueren van vertaalefficiëntie. Belangrijk is dat de toepasbaarheid ervan verder gaat dan met hittestress behandelde zaailingen en ook zaailingen omvat die zijn blootgesteld aan verschillende andere omgevingsstimuli.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We erkennen de technische onderzoeksdiensten voor ultracentrifuges van Technology Commons in College of Life Science en het Instrumentation Center, gesponsord door het Ministerie van Wetenschap en Technologie, National Taiwan University (Taiwan). We bedanken ook Yu-Ling Liang voor de technische ondersteuning en de leden van het Cheng-lab voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Young Scholar Fellowship Einstein-programma van de National Science and Technology Council in Taiwan onder subsidienrs. NSTC 113-2636-B-002-007 naar M.-C.C. M.-C.C. erkent de financiële steun van de National Taiwan University.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL eppendorf tubeLabcon3012-870-000-9RNA-extractie
13.2 mL centrifuge tubeBeckman Coulter331372ultracentrifugatie
Bromofenol blauwHoneywell32712Polysoomprofiel
ChloroformHoneywell32211RNA-extractie
Cycloheximide (CHX)Sigma-AldrichSI-C7698Polysoomprofiel
Diethylpyrocarbonaat (DEPC)Sigma-AldrichD5758RNA-extractie
EthanolSigma-Aldrich32221RNA-extractie
GeneChip Eukaryotische Poly-A RNA Control KitInvitrogen900433Normalisatie
GlycerolHoneywell15523Normalisatie
HeparineSigma-AldrichSI-H3149Polysoomprofiel
HiScript III RT SuperMix for qPCR kitVazymeR323-01Normalisatie
KClJ.T.Baker 3040-01Polysoomprofiel
MgCl2Sigma-AldrichSI-M8266Polysoomprofiel
MS basaal mediumPhytoM524Plantencultuur
Peak Chart SpuitpompBrandelSYN4007LSPolysoomprofiel
Polyoxyethyleen-10-tridecyl-ether (PTE)Sigma-AldrichP2393Polysoomprofiel
RNasinPromegaN251BPolysoomprofiel
Natriumdeoxycholaat (DOC) Sigma-AldrichSI-D6750Polysoomprofiel
SucroseSigma-AldrichS5391Polysoomprofiel
SYBR Green SupermixBio-RadBP170-8882Normalisatie
TRI reagentMRCTR118RNA-extractie
Tris-HClJ.T.Baker 4109-06Polysoomprofiel
UltracentrifugeBeckman CoulterOptima L-100Kultracentrifugatie
UV/VISDETECTORBrandelUA-6Polysoomprofiel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Picard, F., Loubière, P., Girbal, L., Cocaign-Bousquet, M. The significance of translation regulation in the stress response. BMC genomics. 14, 1-11 (2013).
  2. Yuan, S., Zhou, G., Xu, G. Translation machinery: the basis of translational control. J Genet Genom. 51 (4), 367-378 (2024).
  3. Dever, T. E., Green, R. The elongation, termination, and recycling phases of translation in eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (7), a013706(2012).
  4. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
  5. Dennis, M. D., Browning, K. S. Differential phosphorylation of plant translation initiation factors by Arabidopsis thaliana CK2 holoenzymes. J Biol Chem. 284 (31), 20602-20614 (2009).
  6. Dennis, M. D., Person, M. D., Browning, K. S. Phosphorylation of plant translation initiation factors by CK2 enhances the in vitro interaction of multifactor complex components. J Biol Chem. 284 (31), 20615-20628 (2009).
  7. Chen, G. H., Liu, M. J., Xiong, Y., Sheen, J., Wu, S. H. TOR and RPS6 transmit light signals to enhance protein translation in deetiolating Arabidopsis seedlings. Proc Natl Acad Sci. 115 (50), 12823-12828 (2018).
  8. Chang, H. H., Huang, L. C., Browning, K. S., Huq, E., Cheng, M. C. The phosphorylation of carboxyl-terminal eIF2α by SPA kinases contributes to enhanced translation efficiency during photomorphogenesis. Nat Comm. 15 (1), 3467(2024).
  9. Liu, M. J., Wu, S. H., Chen, H. M., Wu, S. H. Widespread translational control contributes to the regulation of Arabidopsis photomorphogenesis. Mol Sys Biol. 8 (1), 566(2012).
  10. Des Marais, D. L., Juenger, T. E. Pleiotropy, plasticity, and the evolution of plant abiotic stress tolerance. Ann New York Acad Sci. 1206 (1), 56-79 (2010).
  11. Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (10), 663-679 (2022).
  12. Shulaev, V., Cortes, D., Miller, G., Mittler, R. Metabolomics for plant stress response. Physio Plantarum. 132 (2), 199-208 (2008).
  13. Sun, M., et al. Transcriptome analysis of heat stress and drought stress in pearl millet based on Pacbio full-length transcriptome sequencing. BMC Plant Biology. 20, 1-15 (2020).
  14. Wasternack, C. Action of jasmonates in plant stress responses and development-applied aspects. Biotechnol Adv. 32, 31-39 (2014).
  15. Chen, T., et al. Global translational induction during NLR-mediated immunity in plants is dynamically regulated by CDC123, an ATP-sensitive protein. Cell Host Microbe. 31 (3), 334-342 (2023).
  16. Cho, H. Y., Chou, M. Y., Ho, H. Y., Chen, W. C., Shih, M. C. Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2. Sci Adv. 8 (22), eabm7863(2022).
  17. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  18. Maruri-López, I., Figueroa, N. E., Hernández-Sánchez, I. E., Chodasiewicz, M. Plant stress granules: trends and beyond. Front Plant Sci. 12, 722643(2021).
  19. Hamada, T., et al. Stress granule formation is induced by a threshold temperature rather than a temperature difference in Arabidopsis. J Cell Sci. 131 (16), jcs216051(2018).
  20. Jang, G. J., Jang, J. C., Wu, S. H. Dynamics and functions of stress granules and processing bodies in plants. Plants. 9 (9), 1122(2020).
  21. Ostberg, S., Schewe, J., Childers, K., Frieler, K. Changes in crop yields and their variability at different levels of global warming. Earth Sys Dyn. 9 (2), 479-496 (2018).
  22. Wen, J., et al. Alternative splicing of TaHSFA6e modulates heat shock protein-mediated translational regulation in response to heat stress in wheat. New Phytol. 239 (6), 2235-2247 (2023).
  23. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. J Vis Exp. (87), e51164(2014).
  24. Hsieh, E. J., Cheng, M. C., Lin, T. P. Functional characterization of an abiotic stress-inducible transcription factor AtERF53 in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 82, 223-237 (2013).
  25. Cheng, M. C., Liao, P. M., Kuo, W. W., Lin, T. P. The Arabidopsis ETHYLENE RESPONSE FACTOR1 regulates abiotic stress-responsive gene expression by binding to different cis-acting elements in response to different stress signals. Plant Physiol. 162 (3), 1566-1582 (2013).
  26. Van den Broeck, L., et al. From network to phenotype: the dynamic wiring of an Arabidopsis transcriptional network induced by osmotic stress. Mol Sys Biol. 13 (12), 961(2017).
  27. Dieterich, D. C., et al. detection and identification of newly synthesized proteomes with bioorthogonal non-canonical amino-acid tagging. Nat Protoc. 2 (3), 532-540 (2007).
  28. Zhang, J., et al. Proteomic profiling of de novo protein synthesis in starvation-induced autophagy using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging. Acad Press. 588, 41-59 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Polysome ProfilingArabidopsis PlantsTranslational RegulationSucrose GradientRNA IsolationSpike In NormalizationRibosome OccupancyqRT PCR

Gerelateerde artikelen