Methodenartikel

Oprichting van een muismodel met hoestovergevoeligheid via inademing van citroenzuur

DOI:

10.3791/67462

⸱

10 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Respiratory Disease, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een muismodel met hoestovergevoeligheid, dat als ideaal model kan dienen voor het bestuderen van de mechanismen van chronische hoest.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoesten is een van de meest voorkomende symptomen van veel aandoeningen van de luchtwegen. Chronische hoest heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven en legt een aanzienlijke economische last met zich mee. Verhoogde hoestgevoeligheid is een pathofysilogisch kenmerk van chronische hoest. Er is waargenomen dat overgevoeligheid voor hoesten verband houdt met ontsteking van de luchtwegen, hermodellering van sensorische zenuwen van de luchtwegen en veranderingen in het centrale zenuwstelsel. De precieze moleculaire mechanismen blijven echter onduidelijk en vereisen verdere opheldering met behulp van geschikte diermodellen. Eerdere studies hebben cavia's gebruikt als modellen voor het bestuderen van hoest, maar deze modellen vertonen verschillende experimentele beperkingen, waaronder hoge kosten, een gebrek aan transgene hulpmiddelen en een schaarste aan commerciële reagentia. Bovendien vertonen cavia's doorgaans een slechte milieutolerantie en een hoge mortaliteit wanneer ze worden blootgesteld aan stimuli. Muizen daarentegen zijn kleiner, gemakkelijker te onderhouden, kosteneffectiever en vatbaar voor genetische manipulatie, waardoor ze geschikter zijn voor mechanistisch onderzoek. In deze studie hebben we een muismodel opgesteld met overgevoeligheid voor hoest via continue inhalatie van citroenzuur (CA). Dit model is eenvoudig te bedienen en levert reproduceerbare resultaten op, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor verder onderzoek naar de mechanismen en mogelijke nieuwe behandelingen voor chronische hoest.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoesten is een cruciale verdedigingsreflex die helpt bij het verwijderen van respiratoire secreties of vreemde materialen uit de luchtwegen. Het is echter ook een van de meest voorkomende symptomen van veel aandoeningen van de luchtwegen, waardoor patiënten vaak medische hulp inroepen1. Chronische hoest, gedefinieerd als een aanhoudende hoest die langer dan 8 weken aanhoudt bij volwassenen, heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van leven en veroorzaakt problemen zoals incontinentie, slapeloosheid, reflux en andere onaangename ervaringen, samen met een aanzienlijke economische last 2,3,4. Er wordt algemeen aangenomen dat een verhoogde hoestgevoeligheid een pathofysilogisch kenmerk is van chronische hoest, waarbij lage niveaus van thermische, mechanische en chemische irriterende stoffen hoesten kunnen veroorzaken5. Overgevoeligheid voor hoesten wordt in verband gebracht met luchtwegontsteking6, hermodellering van sensorische zenuwen in de luchtwegen7 en veranderingen in het centrale zenuwstelsel8, hoewel de precieze moleculaire mechanismen onduidelijk blijven en verdere opheldering vereisen door middel van geschikte diermodellen.

Verschillende dieren, waaronder cavia's, katten, konijnen, honden en varkens, zijn gebruikt om de mechanismen van hoestte bestuderen 9. Cavia's worden van oudsher erkend als het meest geschikte model voor het bestuderen van hoestmechanismen en de werkzaamheid van hoeststillers 9,10,11,12. Deze modellen hebben echter verschillende experimentele beperkingen, waaronder hoge kosten, een gebrek aan transgene instrumenten en een schaarste aan commerciële reagentia. Bovendien vertonen cavia's vaak een slechte omgevingstolerantie en een hoge mortaliteit wanneer ze worden blootgesteld aan prikkels. Muizen daarentegen zijn kleiner, gemakkelijker te onderhouden, kosteneffectiever en vatbaar voor genetische manipulatie, waardoor ze geschikter zijn voor mechanistisch onderzoek. Eerdere studies over hoestmodellen waren voornamelijk gericht op hoest veroorzaakt door luchtwegontsteking, voornamelijk gebruikt om de werkzaamheid van hoeststillers en perifere mechanismen te evalueren13,14. Er is momenteel een gebrek aan diermodellen voor overgevoeligheid voor hoest.

Als reactie hierop introduceren we een methode voor het opstellen van een muismodel van overgevoeligheid voor hoest via continue inhalatie van citroenzuur (CA). Dit model is eenvoudiger, gemakkelijker te construeren en haalbaarder in vergelijking met andere diermodellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures voor dierproeven zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie Proefdieren van het First Affiliated Hospital van de Guangzhou Medical University (20230656). In deze studie werden volwassen mannelijke specifiek-pathogeenvrije C57BL/6-muizen gebruikt, in de leeftijd van 8-10 weken en met een gewicht van 20-25 g. De details van de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Preparaat van chemische reagentia

  1. Bereiding van citroenzuur (CA) oplossing
    1. Bereid voor hoestbeoordeling een oplossing van 0,4 M door 3,84 g citroenzuurpoeder in normale zoutoplossing op te lossen tot een eindvolume van 50 ml.
    2. Bereid voor de behandeling van dieren een oplossing van 0,1 M door 9,6 g citroenzuurpoeder in een normale zoutoplossing op te lossen tot een eindvolume van 500 ml.
  2. Bereiding van capsaïcineoplossing
    1. Los 30,5 mg capsaïcinepoeder op in PBS met 10% ethanol en 10% Tween-80 om een stockoplossing van 10 mM te maken.
    2. Verdun de stockoplossing 1:100 in een normale zoutoplossing tot een werkoplossing van 100 μM.
  3. Bereiding van methacholineoplossing
    1. Los 100 mg methacholinepoeder op in PBS tot een eindvolume van 2 ml om een oplossing van 50 mg/ml te maken.
    2. Verdun deze oplossing met PBS om concentraties van 25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 6,25 mg/ml en 3,125 mg/ml te verkrijgen.

2. Voorbereiding van dieren

  1. Huisvesting voorwaarden
    1. Huismuizen in kooien met vrije toegang tot voedsel en water, op een temperatuur van 22 ± 1 °C met een standaard licht/donkercyclus van 12 uur. Experimentele manipulaties werden uitgevoerd na 1 week acclimatisatie aan de voedingsomgeving.
  2. Acclimatisering
    1. Laat muizen 1 week wennen aan de voedingsomgeving voordat u experimentele manipulaties uitvoert.

3. Ontwikkeling van het model

  1. Groepsopdracht
    1. Verdeel de muizen willekeurig in een modelgroep en een controlegroep, met 8 muizen in elke groep.
  2. Belichting instellen
    1. Plaats de muizen in twee onafhankelijke kamers (zoals weergegeven in afbeelding 1), elk aangesloten op een ultrasone vernevelaar.
    2. Stel de modelgroep bloot aan 0,1 M citroenzuur (CA) aerosol en de controlegroep aan 0,9% normale zoutoplossing (NS) aerosol met een vernevelingssnelheid van 3 ml/min gedurende 2 uur per dag gedurende 2 weken (zoals weergegeven in figuur 2). Breng de muizen na elke blootstelling terug naar hun kooien.
  3. Beoordeling van de hoestgevoeligheid
    1. Beoordeel na de laatste blootstelling de hoestgevoeligheid door reflexieve hoest (uitgedaagd met NS, CA (0,4 M) en capsaïcine (100 μM)) en spontane hoest (zonder enige uitdaging) te evalueren.
      OPMERKING: Om dynamische veranderingen in hoestgevoeligheid tijdens de modelontwikkeling te volgen, beoordeelt u de hoestgevoeligheid op dag 0, 3, 7 en 10 met behulp van een CA (0,4 M) challenge.

4. Beoordeling van de hoestgevoeligheid

  1. Voorbereiding van instrumenten
    1. Gebruik een niet-invasief plethysmografiesysteem voor het hele lichaam (WBP) om hoestgevoeligheid te meten. Sluit de kamers, stroomtransducers, biasstroom en andere componenten aan volgens de toepassingshandleiding (zie materiaaltabel).
    2. Voer een kalibratieproces uit om nauwkeurige metingen te garanderen door op de knop Kalibreren te klikken. Een statusscherm geeft de voortgang weer en zodra de statusbalk 100% bereikt, is de kalibratie voltooid.
  2. Hoest detectie
    1. Maak een hoestonderzoek voor muizen en configureer de parameters voor 1 minuut acclimatisatie, 10 minuten responstijd en 10 minuten afgifte van chemische oplossing.
    2. Plaats de bewuste muizen in afzonderlijke kamers en zorg ervoor dat er slechts één muis per kamer is.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de muis zich volledig in de kamer bevindt voordat u het deksel sluit om beschadiging van de staart en cijfers te voorkomen.
    3. Voeg 1 ml van de chemische oplossingen (NS, CA of capsaïcine) toe aan de vernevelaar.
      OPMERKING: Het aantal hoestbuien - elk bestaande uit drie fasen: inspiratoire, compressieve en expulsieve15 (zoals weergegeven in figuur 3) - wordt geregistreerd zodra het onderzoek begint. Na 10 minuten opnemen is de hoestdetectie voltooid. Reinig de kamer na het detecteren van elk dier om kruisbesmetting te voorkomen.

5. Meting van hyperreactiviteit van de luchtwegen (AHR)

  1. Voorbereiding van instrumenten
    1. Bereid de instrumenten voor zoals beschreven in stap 4.1.
  2. AHR-meting
    1. Maak een dosis-responsonderzoek voor muizen en configureer de meettypen, parameters en takenreeks: 1 minuut voor acclimatisatie, 30 minuten voor toediening van methacholineoplossing, 3 minuten voor responstijd en 1 minuut voor herstel.
    2. Plaats de bewuste muizen in afzonderlijke kamers en zorg ervoor dat er slechts één muis per kamer is.
    3. Voeg 50 μL van de chemische oplossingen (PBS of methacholine) toe aan de vernevelaar en start het onderzoek.
    4. Noteer de waarde van Penh, een indicator van bronchoconstrictie, als reactie op verschillende concentraties methacholine (0 mg/ml, 3,125 mg/ml, 6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml).

6. Bronchoalveolaire lavage collectie

  1. Offer
    1. Offer de muizen met behulp van hyperanesthesie met pentobarbital-natrium (50 mg/kg) toegediend via intraperitoneale injectie (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
  2. Stalen collectie
    1. Verzamel bloed uit de orbitale sinus van de muis in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml en plaats de buis vervolgens op ijs. Centrifugeer het bloed op 3000 x g gedurende 10 minuten bij 4°C. Gebruik een pipet om het bovenstaande op te vangen, vul het aan en bewaar het bij -80 °C.
    2. Verzamel bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) door de kist te openen om de luchtpijp bloot te leggen, een verblijfsnaald van 22 G in de luchtpijp te steken, vervolgens drie keer te lavaën met 0,5 ml voorgekoelde PBS en de vloeistof op te vangen.
    3. Centrifugeer de BALF na verzameling 10 minuten bij 500 x g bij 4 °C. Verzamel het bovengrondse, verdeel het en bewaar het bij -80 °C. Resuspendeer de pellet in 100 μL PBS en bereid celuitstrijkjes voor voor verdere analyse.
    4. Verzamel longweefsel door de borstkas te openen om de longen bloot te leggen, het longweefsel te verwijderen en in cryogene flesjes te plaatsen. Bewaar de injectieflacons bij -80 °C voor toekomstig onderzoek.

7. Kwantitatieve RT-PCR

  1. Extraheer totaal RNA uit longweefsel met behulp van TRIzol-reagens. Voer cDNA-synthese uit met behulp van een eerstestrengs cDNA-synthesekit, volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
  2. Voer PCR uit in een real-time kwantitatief PCR-detectiesysteem met behulp van SYBR groene fluorescentie. Normaliseer de kwantificering van relatieve SP- en CGRP-mRNA-expressie naar de expressie van β-actine9.

8. Statistische analyse

  1. Presenteer gegevens als het gemiddelde ± SEM. Gebruik een t-toets om gegevens tussen twee groepen te vergelijken, waarbij P < 0,05 als statistisch significant wordt beschouwd. Voer alle statistische analyses uit met behulp van statistische en grafische software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals te zien is in figuur 4A, nam de hoestgevoeligheid in de modelgroep (CA-groep) significant toe na 1 week blootstelling in vergelijking met de controlegroep (NS-groep), en deze verhoogde gevoeligheid hield aan gedurende de blootstellingsperiode. Noch de controlegroep, noch de muizen van de modelgroep ervoeren sterfte tijdens het modelleringsproces (Figuur 4B). Figuur 4C en Figuur 4D laten zi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie heeft met succes een muismodel met overgevoeligheid voor hoest vastgesteld door continue inademing van citroenzuur (CA). Dit model toonde een betrouwbare toename van de hoestgevoeligheid voor zowel spontane hoest als reflexieve hoest opgewekt door citroenzuur en capsaïcine. Citroenzuur en capsaïcine worden veel gebruikt om de gevoeligheid voor hoestreflexen te beoordelen16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC 82100034), Guangzhou Science and Technology Planning Project (202102010168).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,9% normale zoutoplossingBiosharpBL158A
CapsaïcineCayman chemical92350
CitroenzuurSigma-AldrichC2404
EthanolGuangzhou chemical reagent factoryGSHB15-AR-0,5L
First-strand cDNA-synthesekitTransGen BiotechAT341
MethacholineSigma-AldrichA2251
Niet-invasieve hele-lichaamsplethysmografie (WBP) systeemDSI601-1400-001
PentobarbitalnatriumMerkP3761
PerfectStart Green qPCR SuperMixTransGen BiotechAQ601
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)MeilunbioMA0015
Real-time kwantitatieve PCR detectiesysteemBio-radCFX Connect
TRIzol reagensInvitrogen15596026CN
Tween-80SolarbioT8360-100
Ultrasoon vernevelaarYuwell402AI

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morice, A. H. Epidemiology of cough. Pulm Pharmacol Ther. 15 (3), 253-259 (2002).
  2. Lai, K., Long, L. Current status and future directions of chronic cough in China. Lung. 198 (1), 23-29 (2020).
  3. Zeiger, R. S., et al. Patient-reported burden of chronic cough in a managed care organization. J Allergy Clin Immunol Pract. 9 (4), 1624-1637.e10 (2021).
  4. Chamberlain, S. A., et al. The impact of chronic cough: A cross-sectional European survey. Lung. 193 (3), 401-408 (2015).
  5. Morice, A. H., et al. Expert opinion on the cough hypersensitivity syndrome in respiratory medicine. Eur Respir J. 44 (5), 1132-1148 (2014).
  6. Mazzone, S. B., Undem, B. J. Vagal afferent innervation of the airways in health and disease. Physiol Rev. 96 (3), 975-1024 (2016).
  7. Shapiro, C. O., et al. Airway sensory nerve density is increased in chronic cough. Am J Respir Crit Care Med. 203 (3), 348-355 (2021).
  8. Ando, A., et al. Neural correlates of cough hypersensitivity in humans: Evidence for central sensitization and dysfunctional inhibitory control. Thorax. 71 (4), 323-329 (2016).
  9. Plevkova, J., et al. Animal models of cough. Respir Physiol Neurobiol. 290, 103656(2021).
  10. Smith, J. A., Hilton, E. C. Y., Saulsberry, L., Canning, B. J. Antitussive effects of memantine in guinea pigs. Chest. 141 (4), 996-1002 (2012).
  11. Hewitt, M. M., et al. Pharmacology of bradykinin-evoked coughing in guinea pigs. J Pharmacol Exp Ther. 357 (3), 620-628 (2016).
  12. Zhong, S., et al. Antitussive activity of the Schisandra chinensis fruit polysaccharide (SCFP-1) in guinea pigs models. J Ethnopharmacol. 194, 378-385 (2016).
  13. Zhong, S., et al. Effects of Schisandra chinensis extracts on cough and pulmonary inflammation in a cough hypersensitivity guinea pig model induced by cigarette smoke exposure. J Ethnopharmacol. 165, 73-82 (2015).
  14. Wei, L., et al. Effects of Shiwei longdanhua formula on LPS-induced airway mucus hypersecretion, cough hypersensitivity, oxidative stress and pulmonary inflammation. Biomed Pharmacother. 163, 114793(2023).
  15. Chen, L., Lai, K., Lomask, J. M., Jiang, B., Zhong, N. Detection of mouse cough based on sound monitoring and respiratory airflow waveforms. PLoS One. 8 (3), e59263(2013).
  16. Gibson, P., et al. Treatment of unexplained chronic cough: Chest guideline and expert panel report. Chest. 149 (1), 27-44 (2016).
  17. Nakaji, H., et al. Airway remodeling associated with cough hypersensitivity as a consequence of persistent cough: An experimental study. Respir Investig. 54 (6), 419-427 (2016).
  18. Xu, X., et al. Association of cough hypersensitivity with tracheal trpv1 activation and neurogenic inflammation in a novel guinea pig model of citric acid-induced chronic cough. J Int Med Res. 46 (7), 2913-2924 (2018).
  19. Iwata, T., et al. Mechanical stimulation by postnasal drip evokes cough. PLoS One. 10 (11), e0141823(2015).
  20. Chen, L., et al. Establishment of a mouse model with all four clinical features of eosinophilic bronchitis. Sci Rep. 10 (1), 10557(2020).
  21. Zhang, C., Lin, R. L., Hong, J., Khosravi, M., Lee, L. Y. Cough and expiration reflexes elicited by inhaled irritant gases are intensified in ovalbumin-sensitized mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 312 (5), R718-R726 (2017).
  22. Amato, A., Becci, A., Beolchini, F. Citric acid bioproduction: The technological innovation change. Crit Rev Biotechnol. 40 (2), 199-212 (2020).
  23. Hu, W., Li, W. J., Yang, H. Q., Chen, J. H. Current strategies and future prospects for enhancing microbial production of citric acid. Appl Microbiol Biotechnol. 103 (1), 201-209 (2019).
  24. Morice, A. H., Kastelik, J. A., Thompson, R. Cough challenge in the assessment of cough reflex. Br J Clin Pharmacol. 52 (4), 365-375 (2001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Inhalatie van citroenzuurchronische hoestluchtwegontstekingsensorische zenuwen van de luchtwegenwhole body plethysmografiebronchoalveolaire lavageluchtweghyperreactiviteitmethacholine provocatietest

Gerelateerde artikelen