Methodenartikel

Op elektroporatie gebaseerde CRISPR-Cas9-gemedieerde genknock-out in THP-1-cellen en isolatie van eencellige klonen

4.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67469

⸱

28 februari 2025

 , 
1INSERM, CEA, Center for Immunology of Viral, Auto-immune, Hematological and Bacterial diseases (IMVA-HB/IDMIT), Université Paris-Saclay

In dit artikel

Samenvatting

De THP-1-cellijn wordt veel gebruikt als model om de functies van menselijke monocyten/macrofagen in verschillende biologiegerelateerde onderzoeksgebieden te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering en isolatie van single-cell kloons, waardoor de productie van robuuste en reproduceerbare fenotypische gegevens mogelijk wordt.

Samenvatting

De THP-1-cellijn van menselijke acute monocytaire leukemie (AML) wordt veel gebruikt als model om de functies van van menselijke monocyten afgeleide macrofagen te bestuderen, inclusief hun wisselwerking met belangrijke menselijke pathogenen zoals het humaan immunodeficiëntievirus (HIV). Vergeleken met andere onsterfelijke cellijnen van myeloïde oorsprong, behouden THP-1-cellen veel intacte inflammatoire signaalroutes en vertonen ze fenotypische kenmerken die meer lijken op die van primaire monocyten, inclusief het vermogen om te differentiëren in macrofagen wanneer ze worden behandeld met phorbol-12-myristaat 13-acetaat (PMA). Het gebruik van CRISPR-Cas9-technologie om THP-1-cellen te manipuleren door middel van gerichte genknock-out (KO) biedt een krachtige benadering om immuungerelateerde mechanismen, waaronder virus-gastheerinteracties, beter te karakteriseren. Dit artikel beschrijft een protocol voor efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde engineering met behulp van elektroporatie om voorgemonteerde Cas9:sgRNA-ribonucleoproteïnen in de celkern te brengen. Het gebruik van meerdere sgRNA's die zich op dezelfde locus op enigszins verschillende posities richten, resulteert in de verwijdering van grote DNA-fragmenten, waardoor de bewerkingsefficiëntie wordt verhoogd, zoals beoordeeld door de T7 endonuclease I-test. CRISPR-Cas9-gemedieerde bewerking op genetisch niveau werd gevalideerd door Sanger-sequencing, gevolgd door Inference of CRISPR Edits (ICE)-analyse. Eiwitdepletie werd bevestigd door immunoblotting in combinatie met een functionele test. Met behulp van dit protocol werden tot 100% indels in de beoogde locus en een afname van meer dan 95% in eiwitexpressie bereikt. De hoge bewerkingsefficiëntie maakt het gemakkelijk om eencellige klonen te isoleren door verdunning te beperken.

Inleiding

THP-1 is een van menselijke monocyten afgeleide cellijn geïsoleerd uit een patiënt die lijdt aan acute leukemie (AML), die fenotypische kenmerken vertoont die sterk lijken op die van primaire monocyten1. In vergelijking met primaire monocyt-afgeleide macrofagen, die zich niet delen en zowel een beperkte levensduur als inter-/intra-donorvariabiliteit in fenotype vertonen, kunnen THP-1-cellen vrijwel voor altijd worden gekweekt en hebben ze een meer homogeen gedrag dat de reproduceerbaarheid van de resultaten bevordert 2,3,4,5,6 . Met name THP-1-cellen kunnen worden gedifferentieerd naar een macrofaagachtig fenotype met phorbol-12-myristaat 13-acetaat (PMA), waardoor ze een veelgebruikt in vitro model zijn om de reacties van monocyten/macrofagen op ontstekingssignalen 7,8,9,10,11,12,13 of infectie door klinisch relevante menselijke pathogenen, waaronder HIV 14 te onderzoeken,15,16. De mogelijkheid om THP-1-cellen genetisch te manipuleren is van belang in veel biologiegerelateerde onderzoeksgebieden.

Geclusterd regelmatig op afstand van elkaar geplaatste korte palindromale herhalingen-CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (CRISPR-Cas9) is een prokaryotisch adaptief immuunsysteem dat zich inzet op RNA-geleide nuclease om binnendringende virale genomen af te breken, dat is geherprogrammeerd als een hulpmiddel voor genetische manipulatie17. Het proces van genoombewerking verloopt in drie stappen: herkenning, splitsing en herstel. Een single-guide RNA (sgRNA) rekruteert de Cas9-nuclease naar een specifieke genomische locus door middel van basenparing met zijn 20-bp gidssequentie. De aanwezigheid van een Protospacer Adjacent Motif (PAM)-sequentie direct 3' van de 20-bp genomische doelsequentie triggert de Cas9-gemedieerde afwikkeling en splitsing op beide DNA-strengen tussen posities 17 en 18 (3-bp 5' van de PAM). De resulterende dubbelstrengsbreuk (DSB) wordt verwerkt via twee belangrijke reparatieroutes. Bij gebrek aan een reparatiesjabloon met homologie met de beschadigde locus, zal de foutgevoelige Non-Homologus End Joining (NHEJ)-route willekeurige nucleotide-inserties en/of deleties (indels) introduceren, wat mogelijk kan leiden tot frameshift-mutaties en/of de introductie van voortijdige terminatiecodons (PTC). PTC-bevattende mRNA's zijn op hun beurt het doelwit van afbraak door de nonsense-gemedieerde mRNA-vervalroute (NMD), waardoor uiteindelijk de expressie/functie van eiwitten wordt verstoord 18,19,20. Als alternatief kan de sjabloonafhankelijke Homology-Directed Repair (HDR)-route de DSB bedienen en getrouw repareren. Dit mechanisme is gebruikt om nauwkeurige genbewerking te bereiken, inclusief knock-ins en basenvervangingen. Het is vermeldenswaard dat de status van de celcyclus een belangrijke factor is die van invloed is op de keuze van de DSB-herstelroute. NHEJ is inderdaad actief in alle stadia van de celcyclus, terwijl HDR voornamelijk beperkt is tot de S/G2-fasen21.

THP-1-cellen groeien in suspensie en zijn notoir moeilijk te transfecteren met plasmide-DNA, een procedure die mogelijk ook hun levensvatbaarheid en/of differentiatiecapaciteit verandert22,23. Transductie met op HIV-1 gebaseerde lentivirale vectoren die coderen voor zowel Cas9 als het sgRNA wordt vaak gebruikt om een interessant gen uit te schakelen (KO)24. Integratie van de Cas9/sgRNA-cassette in het cellulaire genoom zorgt voor langdurige expressie en efficiënte KO, maar is ook een persistente bron van off-target effecten25. Als alternatief worden de voorgeassembleerde Cas9:sgRNA-ribonucleoproteïnen (RNP's) afgeleverd door elektroporatie, een methode waarbij tijdelijke poriën worden gevormd in zowel het plasma als de kernmembranen bij toepassing van elektrische impulsen. Het behoud van de levensvatbaarheid van cellen is een belangrijke uitdaging bij deze aanpak.

Hier werd een THP-1-cellijn geproduceerd die GFP (THP-1_GFP) stabiel tot expressie brengt om te dienen als hulpmiddel om een protocol op te stellen om efficiënte CRISPR-Cas9-gebaseerde bewerking te bereiken. Na het ontwerpen van een strategie om het EGFP-gen te inactiveren met behulp van drie sgRNA's tegelijk (multi-guide-benadering), werd de KO-efficiëntie onder verschillende elektroporatiecondities bepaald met behulp van GFP-expressie als uitlezing. De celproliferatie werd parallel gevolgd. Genbewerking werd bevestigd door zowel een T7 endonuclease I (T7EI) assay als Sanger-sequencing, gevolgd door analyse met het Inference of CRISPR Edits (ICE)-algoritme26. Parameters die tot 95% GFP-expressieafname opleverden, waarbij THP-1-cellen normale groeisnelheden herstelden na elektroporatie, werden met succes gebruikt om een endogeen gen (SAMHD1) te inactiveren en eencellige THP-1-klonen te produceren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Geleidingsontwerp met CRISPOR (Figuur 1.1)

OPMERKING: SnapGene Viewer-software kan in stap 4, 7 en 10 worden gebruikt om de bewerkingsdoellocatie en de locatie van de PCR-primerhybridisatie binnen het gen van interesse te annoteren.

  1. Ga naar de website van Ensembl (www.ensembl.org). Selecteer in het zoekvak een soort en voer de naam van het gen in dat u interesseert. Klik op Ga. Selecteer het resultaat dat overeenkomt met het gen (geen transcript).
  2. Klik op Transcriptietabel weergeven en selecteer vervolgens de transcriptie-ID die overeenkomt met de met goud gelabelde eiwitcodering in de kolom Biotype . Eenmaal op de transcriptiepagina klikt u op Exons in het linkermenu.
  3. Scroll naar beneden en klik op Downloadvolgorde. Zorg ervoor dat de bestandsindeling FASTA is. In Instellingen - Opgenomen sequenties, deselecteer alles behalve Genomische sequentie.
    Voer het getal "500" in Flankerende volgorde aan beide uiteinden van het transcriptievak in. Klik op Voorbeeld, selecteer de hele sequentie (alleen de nucleotiden zonder de koptekst) en kopieer deze (Ctrl+C).
  4. Open SnapGene Viewer en klik op Nieuw > DNA-bestand. Plak de reeks (Ctrl+V) in het vak Een reeks maken . Schakel Gemeenschappelijke kenmerken detecteren uit en selecteer Lineair in Topologie.
    Hernoem het bestand en klik op Maken. Schakel in het linkermenu Enzymen weergeven (eerste pictogram) uit. Selecteer onder aan het venster het tabblad Sequentie .
    OPMERKING: Met deze stap kan de volledige gensequentie worden opgehaald, inclusief exonen, introns en flankerende sequenties van 500 bp (optioneel). Deze laatste informatie is nuttig voor het ontwerpen van PCR-primers voor de amplificatie van een doellocatie die zich in het eerste exon bevindt.
  5. Scroll terug op de Ensembl-website omhoog in het bestandsvoorbeeld en klik op Terug. Wijzig nu het bestandsformaat in RTF. In Instellingen - Inbegrepen sequenties, deselecteer alles behalve Exons. Selecteer bij Varianten weergeven de optie Nee. Klik op Downloaden bovenaan de pagina.
  6. Open het gedownloade bestand (met Word), dat de reeks exonen bevat en de coderingsvolgorde in blauw weergeeft, te beginnen met de initiële ATG. Kies het exon waarop de CRISPR-Cas9-gerichte bewerking zich richt (zie hieronder voor aanbevelingen), selecteer het en kopieer het (Ctrl+C).
    1. Het beoogde exon is ofwel een vroeg exon of een exon dat codeert voor een functioneel belangrijk domein van het eiwit. Het is vermeldenswaard dat de vestiging van een PTC in een laat exon dicht bij de 3' UTR waarschijnlijk geen NMD zal opwekken, wat leidt tot de expressie van een C-terminaal afgekapt eiwit. Omgekeerd gaat de introductie van een PTC in een vroeg exon proximaal van de native initiatieplaats gepaard met een risico op onwettige translatie (ITL, ook bekend als alternatieve translatie-initiatie (ATI)), wat de onverwachte expressie oplevert van een N-terminaal afgekapt eiwit dat begint op een in-frame translatie-initiatieplaats (TIS) stroomafwaarts van het eerste ATG-codon. Om dit laatste risico te beperken, wordt geadviseerd om het optreden van alternatieve TIS te beoordelen met behulp van ATGpr27 (atgpr.dbcls.jp) en/of NetStart 1.028 (services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/).
    2. Zorg ervoor dat het doelexon een coderende sequentie bevat. Het kan echter nuttig zijn om een sgRNA-gloeien te kiezen met het 5'UTR-gebied stroomopwaarts van de initiële ATG om het in het verwijderde fragment op te nemen.
    3. Idealiter zou het beoogde exon gemeenschappelijk moeten zijn voor alle eiwitcoderende transcriptvarianten van het gen. Controleer of dat het geval is op de Genome Data Viewer (www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/) van de NCBI door te zoeken op het gen van interesse.
      Als u op de gennaam (in het groen) in het venster klikt, worden de transcriptvarianten (in paars) weergegeven. Exonen worden weergegeven door een rechthoek.
  7. Druk in SnapGene Viewer op Ctrl+F, Ctrl+V en vervolgens op Enter om te zoeken naar de sequentie van het exon. Druk op Ctrl+T om een nieuwe functie toe te voegen, geef deze een naam, verander het type in "exon" en klik op OK.
  8. Ga naar de CRISPOR-website (http://crispor.gi.ucsc.edu/) en plak de exon-sequentie in stap 1. Selecteer eerst een referentiegenoom in stap 2 en vervolgens het type PAM dat u in stap 3 wilt targeten, meestal 20bp-NGG voor SpCas9. Klik op VERZENDEN.
  9. Selecteer twee sgRNA's zodat ze tot 150 bp van elkaar gescheiden zijn en selecteer vervolgens een derde sgRNA ertussenin. Hier zijn enkele richtlijnen voor sgRNA-selectie:
    1. De MIT-specificiteitsscore is gerelateerd aan off-target effecten. Een hogere score duidt op minder potentiële off-targets. De rechterkolom toont drie voorspelde off-target sites, gerangschikt van de meest naar de minst waarschijnlijke, samen met hun locaties (in een exon, een intron of een intergene regio). De volledige lijst met voorspelde off-target sites is toegankelijk door op alles weergeven te klikken. Selecteer indien mogelijk sgRNA's met een MIT-score >80, waarbij prioriteit wordt gegeven aan die zonder off-targets voor 0, 1 of 2 mismatches. Bovendien moeten sgRNA's met off-targets in een exon, die het grootste potentieel hebben om het fenotype te beïnvloeden, worden vermeden.
    2. Raadpleeg voor de voorspelde werkzaamheid de Doench '16-score. Merk op dat een hoge Doench '16-score simpelweg aangeeft dat het sgRNA meer kans heeft om effectief te zijn. De werkelijke werkzaamheid moet experimenteel worden bepaald. Om deze reden is het altijd nuttig om meerdere sgRNA's te selecteren, zelfs als ze niet bedoeld zijn om samen te worden gebruikt.
    3. Een GC-gehalte dat te hoog of te laag is, evenals bepaalde motieven, kunnen schadelijk zijn voor de efficiëntie van sgRNA en moeten worden vermeden. Deze parameters worden gemarkeerd door CRISPOR.
  10. Herhaal stap 1.7 om de sgRNA-sequentie en de bijbehorende PAM-sequentie toe te voegen aan de gensequentie in SnapGene Viewer. Plak tegelijkertijd de sgRNA-sequentie (zonder de PAM) in een tekst- of Excel-bestand om de 5'-3'-oriëntatie te behouden die nodig is bij het bestellen van de oligonucleotide.
  11. Voor op PCR gebaseerde amplificatie van de doellocatie, ontwerpt u een paar primers eromheen. De amplicongrootte moet tussen 800 en 1000 bp liggen. Voor het ontwerpen van de primers voor dit protocol is gebruik gemaakt van PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest). Als alternatief biedt CRISPOR een lijst met primers om zowel de beoogde genomische regio als de off-target sites te versterken. Nadat u de volledige lijst met potentiële off-target sites hebt weergegeven (stap 1.9.1), klikt u op Off-target primers in de rechterbenedenhoek.

2. Reagens en celpreparatie voor elektroporatie (figuur 1.2)

  1. Bereid een kweekplaat met 24 putjes voor om cellen na elektroporatie te recupereren door de putjes te vullen met 500 μL RPMI 1640 medium aangevuld met 20% door warmte geïnactiveerd (56 °C, 30 min), gefilterd (0,20 μm) foetaal runderserum (FBS). Voeg geen antibiotica toe. Bewaar de plaat in een bevochtigde broedmachine gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2 tot elektroporatie.
  2. Als de sgRNA's droog worden verzonden, rehydrateer ze dan met TE-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) tot een uiteindelijke concentratie van 100 μM (d.w.z. 10 μL TE-buffer per 1 nmol sgRNA). Vortex gedurende 30 s, incubeer een nacht bij 4 °C om volledige rehydratatie mogelijk te maken en, na een korte pipethomogenisatie, bewaar de sgRNA-stockoplossing bij -20 °C. Maak afhankelijk van het uiteindelijke volume aliquots om meerdere vries-dooicycli te vermijden.
  3. Bereid een werkende sgRNA-oplossing met een eindconcentratie van 30 μM door de 100 μM stockoplossing te verdunnen in nucleasevrij water. Vortex gedurende 30 s en incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur.
  4. Monteer de Cas9:sgRNA RNP's in een molaire verhouding van 1:9 door gelijktijdig 1 μL van elk van de drie 30 μM sgRNA's en 0,5 μL 20 μM Cas9 oplossingen te verdunnen in 3,5 μL resuspensiebuffer R, inbegrepen in de elektroporatiekit (eindvolume van 7 μL, voor één experimentele toestand; schaal dienovereenkomstig). Draai kort en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Bereid intussen een onbewerkte controle voor door 0,5 μl 20 μM Cas9 toe te voegen aan 6,5 μl resuspensiebuffer R. Vortex kort en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Voeg 5 μl resuspensiebuffer R toe aan alle monsters voor een eindvolume van 12 μl per elektroporatietoestand.
  7. Bereid de THP-1-cellen voor op elektroporatie.
    1. Om de concentratie en levensvatbaarheid te beoordelen door middel van de Trypan blue-exclusietest. Verdun de cellen 1:2 in een 0,4% trypanblauwe kleuringsoplossing. Homogeniseer na 30 s incubatie goed en voeg 10 μL toe in een wand van een telkamer met een door Neubauer verbeterde rasterstijl. Tel drie grote vierkanten en deel de telling door 100 om de celconcentratie te verkrijgen (x106 cellen/ml).
      OPMERKING: De gezondheid van de cellen beïnvloedt hun gevoeligheid voor elektroporatie. Er moet voor worden gezorgd dat de celcultuur onder optimale omstandigheden wordt uitgevoerd. De tijd buiten de incubator moet worden beperkt en alle reagentia en oplossingen moeten van tevoren worden voorbereid en opgewarmd.
    2. Verzamel voor elke toestand een volume dat overeenkomt met 0,2 x 106 cellen en centrifugeer (336 x g, 5 min, 20 °C).
    3. Zuig het bovenstaande op met behulp van een pipet en suspendeer de pellet in 500 μl PBS. Centrifugeer opnieuw (336 x g, 5 min, 20 °C).
    4. Zuig het bovenstaande voorzichtig op met een pipet en resusinfecteer de THP-1-celpellet met de 12 μl RNP-oplossing (stap 2.6).

3. Opstelling en nucleofectie van het elektroporatiesysteem (figuur 1.3)

  1. Plaats het pipetstation onder een bioveiligheidskast, plaats een elektroporatiebuis in de steun en voeg 3 ml buffer E toe, inbegrepen in de elektroporatiekit.
  2. Na het inschakelen van het elektroporatieapparaat stelt u via het touchscreen de volgende elektroporatieparameters in: Spanning = 1 500 V, Duur = 10 ms, Getal = 3.
  3. Rust de elektroporatiepipet uit met een tip en zuig 10 μl van de RNP/THP-1-oplossing aan (stap 2.7.4). Steek de pipet in de elektroporatiebuis en druk op Start op het scherm van het elektroporatieapparaat. Wacht tot het bericht Voltooid verschijnt en haal de pipet uit het buisje.
  4. Breng de cellen over naar een kuiltje van de voorverwarmde plaat met 24 putjes en homogeniseren voorzichtig. Plaats de plaat terug in de bevochtigde broedmachine en laat ze 72 uur ongestoord rusten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan bij het pipetteren van de RNP/THP-1-suspensie, omdat deze de elektroporatieprocedure zullen verstoren. Als er een foutmelding verschijnt als er geen zichtbare elektrische boog is, verwijdert u de elektroporatiepipet uit de buis en drukt u opnieuw op Start . Als echter een elektrische boog in de vorm van een korte heldere vonk wordt waargenomen, kan dit duiden op de aanwezigheid van bubbels. De elektroporatieprocedure zal waarschijnlijk mislukken, zelfs als er geen foutmelding is.

4. THP-1 herstel 72 uur na elektroporatie (Figuur 1.4)

  1. Tel de cellen om de concentratie te beoordelen (stap 2.7.1) 72 uur na de elektroporatie.
  2. Als er voldoende cellen zijn (d.w.z. ≥0,6 x 106 cellen/ml), verdun ze dan minimaal een factor 2 met RPMI aangevuld met 20% FBS en 1% penicilline-streptomycine en breng de concentratie tussen 0,3-0,5 x 106 cellen per ml. Laat de cel anders nog 72 uur herstellen.
  3. Passage en amplificeer de cellen totdat er genoeg is voor KO-validatie. In de tussentijd kan worden begonnen met het isoleren van eencellige klonen (stap 7).

5. Validatie van genbewerking door middel van T7EI mismatch-assay (Figuur 1.5)

OPMERKING: De test zou de bewerkingsefficiëntie kunnen onderschatten, aangezien T7EI mismatches groter dan 1 bp herkent. De T7EI-test is dus niet bruikbaar voor het screenen van homozygote celpopulaties (d.w.z. eencellige klonen), tenzij deze op de juiste manier wordt aangepast (stap 5.7).

  1. Beoordeel de celconcentratie (stap 2.7.1) en neem een volume op dat overeenkomt met 0,1 x 106 cellen in een buisje van 1,5 ml. Centrifugeer (336 x g, 5 min, 20 °C), zuig het supernatant op en suspendeer de pellet in 500 μL PBS. Centrifugeer opnieuw en zuig met behulp van een pipet zoveel mogelijk supernatans op zonder de pellet te verstoren. Vries het monster in en bewaar het bij -20 °C.
  2. Extraheer het genomische DNA om te dienen als matrix voor PCR-amplificatie.
    1. Resuspendeer de pellet met 50 μL DNA-extractieoplossing, homogeniseer en breng het volledige volume over in een PCR-buisje van 0,2 ml. Vortex en centrifugeer kort (pulseer gedurende 3 s).
    2. Plaats de buis in een thermische cycler en verwarm deze gedurende 15 minuten op 65 °C, gevolgd door 98 °C gedurende 10 minuten.
    3. Verdun het geëxtraheerde DNA met 90 μL ultrapuur water. Vortex en centrifugeer kort (5.000 x g, 3 s).
  3. Verdun de PCR-primer (zie Materiaaltabel) in ultrapuur water voor een eindconcentratie van 10 μM (d.w.z. 10 pmol/μL).
  4. Bereid het PCR-mengsel (volgens de opmerking hieronder) in een PCR-buisje van 0,2 ml (eindvolume = 50 μl, voor één aandoening). Meestal zijn er ten minste twee voorwaarden: de KO en de onbewerkte besturing met alleen Cas9.
    OPMERKING: Gezuiverd genoom DNA: 10 μL; Voorwaartse en achterwaartse primer (10 μM): elk 2,5 μL, de uiteindelijke concentratie van 500 nM; Reactiebuffer (5x): 10 μL. Vortex goed voor het toevoegen. Meng dNTP (25 mM van elk): 0,6 μL, eindconcentratie van 0,3 mM voor elke dNTP. DNA-polymerase: 0,5 μL; Ultrapuur water: 23,9 μL. Vortex en centrifugeer kort (pulseer gedurende 3 s).
  5. Plaats de buisjes in de thermische cycler en voer het PCR-programma uit met de volgende instellingen:
    OPMERKING: Een cyclus bij 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door 30 cycli [98 °C gedurende 20 s (denaturatiestap), X °C gedurende 15 s (gloeistap), 72 °C gedurende 45 s (rekstap)], dan een laatste cyclus bij 72 °C gedurende 2 min. Verwijder aan het einde van de versterking de buizen, vortex en centrifugeer kort (pulseer gedurende 3 s). De gloeitemperatuur (X) is de smelttemperatuur (Tm) van de primers min 5 °C.
  6. Voor een polyklonaal bewerkte populatie: voeg in een nieuwe buis van 0,2 ml 17,5 μl van het PCR-amplicon en 2 μl NEBuffer 2 (10x) toe voor een eindvolume van 19,5 μl. Vortex en centrifugeer kort (pulseer gedurende 3 s). Om eencellige klonen te screenen, mengt u ook 1:1 van de PCR-producten van zowel de bewerkte als de onbewerkte controlecellen (stap 5.6) (aanvullende figuur 1).
  7. Voor de heteroduplexvorming plaatst u de buizen in de thermische cycler en voert u het volgende programma uit: één cyclus bij 95 °C gedurende 10 minuten, één met een helling van -2 °C/s van 95 tot 85 °C, één met een helling van -0,3 °C/s van 85 tot 25 °C en één laatste afkoelcyclus bij 10 °C in HOLD.
  8. Voeg na de heteroduplexvorming 0,5 μL T7EI-oplossing toe aan de buis. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  9. Bereid een 1,2% agarose gel voor:
    1. Weeg de agarose af in een glazen fles en voeg de juiste hoeveelheid 1x TAE-buffer toe (40 mM Tris-acetaat, 1 mM EDTA, pH 8,3). Plaats het in een magnetron en let erop dat u de dop niet stevig vastdraait. Verwarm meerdere keren totdat de agarosekristallen volledig zijn opgelost.
      OPMERKING: Meng indien nodig de oplossing. Laat het niet koken, anders neemt het volume af, waardoor de agaroseconcentratie verandert.
    2. Voeg de DNA-gelkleuring verdund tot 1/20.000 toe en meng goed.
    3. Giet de agarose-oplossing in een vorm, voeg een kam toe en laat stollen bij kamertemperatuur.
  10. Bereid monsters voor op gelelektroforese door 5 μL van de T7EI-digestieproducten (stap 5.9) of het onverteerde PCR-product te mengen met 5 μL water en 2 μL 6x DNA-ladende kleurstof. Laad de monsters en de grootteladder en migreer gedurende 45 minuten op 80 V (de tijd kan worden aangepast afhankelijk van de verwachte grootte van de DNA-fragmenten). Zodra de migratie voorbij is, maakt u een beeld van de gel met een geschikt beeldvormingssysteem.

6. Validatie van genbewerking door Sanger-sequencinganalyse (Figuur 1.6)

  1. Om de genetische modificatie te karakteriseren, zuivert u de PCR-producten (stap 5.4) en analyseert u, na Sanger-sequencing, de resultaten met de ICE-tool (https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis).
  2. Controleer of een eiwit ondanks de aanpassingen kan worden geproduceerd.
    1. Download de ICE-resultaten en open het contribs.txt bestand.
    2. Vergelijk de bewerkte sequenties met de WT-tegenhanger. Breng de indels in kaart en controleer of ze zijn ontstaan in het beoogde genomische gebied. Beoordeel hun grootte. Als de indellengte geen veelvoud van drie is, zal er een frameshift optreden en zal mogelijk een PTC worden geïntroduceerd. Het gemuteerde mRNA zal naar verwachting NMD-gemedieerde degradatie ondergaan.

7. Isolatie van eencellige klonen door beperking van de verdunning (figuur 1.7)

OPMERKING: Isolatie van eencellige klonen is niet verplicht. Als u ervoor kiest om dit te doen, is het echter belangrijk om meerdere klonen te karakteriseren en hun fenotype te vergelijken met de oorspronkelijke polyklonale populatie.

  1. Neem een monster van de celsuspensie, verdun het 1/2 met kweekmedium en beoordeel de concentratie (stap 2.7.1). Verdunning verhoogt de telnauwkeurigheid.
  2. Voer 2 tot 3 seriële verdunningsstappen uit om een concentratie van 7 cellen/ml te bereiken. Doseer 100 μL van de celsuspensie per putje in een plaat met 96 putjes met ronde bodem (d.w.z. 0,7 cellen per putje). Laat de cel een paar uur decanteren voordat u de platen bij de microscoop observeert om putjes met één cel te identificeren.
  3. Controleer regelmatig de vorming en groei van kolonies en breng cellen indien nodig over naar een grotere kweekplaat of kolf.

8. Functionele karakterisering van THP-1 KO SAMHD1-cellen door middel van HIV-1-restrictietest

  1. Zaad THP-1 in een kweekplaat met 24 putjes met 0,25 x 106 cellen per putje in 300 μL RPMI aangevuld met 10% FBS, 1% Penicilline-Streptomycine (compleet RPMI) en bevattende 300 ng/ml PMA voor differentiatie. Bewaar de plaat 24 uur in een bevochtigde broedmachine (37 °C, 5% CO2).
  2. Vervang het medium door een PMA-vrij compleet RPMI-medium en plaats de plaat nog 24 uur terug in de broedmachine.
  3. Zuig met behulp van een vacuümpomp al het kweekmedium op. Voeg 250 μL VSVg-pseudogetypeerde HIV-1-GFP virale voorraadbevattende oplossing toe (MOI = 0,5 IFU/cel). Voeg een niet-geïnfecteerde controle toe. Plaats de plaat gedurende 2 uur op 4 °C om de infectie te synchroniseren.
  4. Was de cellen een keer met RPMI. Voeg 500 μL volledige RPMI toe aan elk putje en incubeer gedurende 48 uur onder standaardomstandigheden (tijd kan worden aangepast).
  5. Was de cellen na het verwijderen van het kweekmedium eenmaal met koude 1x PBS. Voeg vervolgens 100 μL 0,05% trypsine-EDTA toe aan elk putje. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C tot de cellen volledig zijn losgemaakt (5 minuten zou voldoende moeten zijn) alvorens 200 μL volledige RPMI toe te voegen om het enzym te inactiveren. Breng 250 μL van elk putje over in een plaat met ronde bodem met 96 putjes (zorg ervoor dat de flowcytometer kweekplaten accepteert).
  6. Centrifugeer de plaat (757 x g, 3 min, vertraging = 6, 20 °C) en zuig het bovenstaande op met behulp van een meerkanaalspipet. Resuspendeer de pellet met 100 μL 4% PFA en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Voeg 100 μL koude 1X PBS toe.
  7. Analyseer het infectiepercentage, weergegeven door GFP-positieve cellen, door middel van flowcytometrie (zie aanvullende figuur 2 voor een voorgestelde poortstrategie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werd een THP-1-cellijn gegenereerd die het GFP-reportereiwit (THP-1_GFP) tot expressie brengt (Figuur 2A) en werd gebruikt als hulpmiddel om een protocol op te stellen voor een efficiënte CRISPR-Cas9-gemedieerde geneditie. Daartoe werd 3 sgRNA gericht op het EGFP-gen ontworpen met de CRISPOR-webtool29 (Figuur 2B), die gelijktijdig werden gecomplexeerd met Cas9 in een molaire verhouding van 9:1...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier wordt een protocol beschreven om een succesvolle CRISPR-gemedieerde bewerking van de THP-1-cellijn te verkrijgen. De aanpak is gebaseerd op de overdracht van voorgeassembleerde sgRNA/Cas9 RNP's door elektroporatie/nucleofectie. Deze strategie werd gekozen om de off-target effecten te beperken die mogelijk optreden bij lentivirale-gemedieerde integratie van de sgRNA/Cas9-cassette, wat resulteert in aanhoudende expressie van het nuclease. Meerdere sgRNA's gericht op het gen van intere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs hebben geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We zijn JP Concordet (MNHN, U1154/UMR7196, Parijs), G. Bossis (IGMM, Montpellier) en D. Schlüter (Hannover Medical School, Duitsland) dankbaar voor het delen van protocollen en voor discussie. Dit project heeft financiering ontvangen van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 101017572 aan AZ) en ANRS (subsidie ECTZ162721 aan AZ). De onderzoeksinfrastructuur van het Infectious Disease Model and Innovative Therapies (IDMIT) wordt ondersteund door het "programme investissement d'avenir (PIA)" onder verwijzing ANR_11_INSB_0008.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm spuitfilterClearLine146560_
0.4 % trypanblauwBeckman Coulter383200_
1.5 mL buisEppendorf3810X_
24-well plateCorning353047_
6x TriTrack DNA Loading DyeThermo scientificR1161_
75 cm² Cultuurfles met geventileerde dopCorning353136_
8-Strip PCR Tubes met doppenLife technologiesAM12230_
96-well platen Platte bodemCorning353072_
96-well platen Ronde bodemCorning353077_
AgaroseEuromedexD5_
ATGpr__https://atgpr.dbcls.jp/
ChemiDoc Imaging SystemBIO-RAD12003153_
Tellende glijbaanNanoEntekDHC-N04_
CRISPOR__http://crispor.gi.ucsc.edu/
DPBSGibco14190094_
EnsemblEMBL-EBI_https://www.ensembl.org/index.html
Fetal bovien serumSigma-AldrichF7524_
FlowJoBD Life Sciencesv10.10_
GeneRuler 100 bp Plus DNA LadderThermo scientificSM0323_
Genome Data ViewerNCBI_https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/
GraphPad PrismDotmatics_Versie 9.3.1
Herculase II Fusion DNA PolymerasesAgilent600679_
ICE CRISPR Analyse ToolSynthego_https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis
Image Lab TouchBIO-RAD_Versie 2.4.0.03
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SInbegrepen bij T7EI M0302S
Neon Kit, 10 µLInvitrogenMPK1025KElectroporatie kit met tips, buizen, buffer R en E
Neon Transfectie SysteemInvitrogenMPK5000_
NetStart 1.0__https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/
Nuclease-vrij WaterSynthego__
PCR primer (EGFP)Eurofins_Fw : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ; Rev : CACCTTGATGCCGTTCTTCT
PCR primer (SAMHD1)Eurofins_Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ; Rev : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA
Penicilline-streptomycine (10.000 U/mL)Gibco15140122_
PFAElectron Microscopy Sciences15714_
PMASigma-AldrichP8139_
PrimerQuestIDT_https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest
QIAquick PCR Zuivering KitQiagen28104_
QuickExtract DNA Extractie OplossingBiosearch TechnologiesQE09050_
RPMI 1640, GlutaMAXGibco61870010_
SnapGene ViewerDotmatics_Versie 7
SpCas9 2NLS NucleaseSynthego__
SYBR Safe DNA Gel StainInvitrogenS33102_
Synthetische sgRNA (EGFP)Synthego_#1 : CGCGCCGAGGUGAAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCCG
Synthetische sgRNA (SAMHD1)Synthego_#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU
Spuit Plastipak Luer LockBD301229_
T100 Thermische CyclerBIO-RAD1861096_
T7 endonuclease INew England BiolabsM0302S_
TAE buffer UltraPure, 10xInvitrogen15558026400 mM Tris-Acetaat, 10 mM EDTA
THP-1 cellenATCCTIB-202_
Trypsine-EDTA (0,05 %)Gibco25300054_
ZE5 Cell AnalyzerBIO-RAD12014135_

Referenties

  1. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  2. Danis, V. A., Millington, M., Hyland, V. J., Grennan, D. Cytokine production by normal human monocytes: inter-subject variation and relationship to an IL-1 receptor antagonist (IL-lRa) gene polymorphism. Clin Exp Immunol. 99, https://academic.oup.com/cei/article/99/2/303/6484286 (1995).
  3. Bol, S. M., et al. Donor variation in in vitro HIV-1 susceptibility of monocyte-derived macrophages. Virology. 390 (2), 205-211 (2009).
  4. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunol Lett. 152 (1), 32-41 (2013).
  5. O'Neill, M. B., et al. Single-cell and bulk RNA-sequencing reveal differences in monocyte susceptibility to Influenza A virus infection between Africans and Europeans. Front Immunol. 12, 768189(2021).
  6. Wen, Y., et al. Comparability study of monocyte-derived dendritic cells, primary monocytes, and THP1 cells for innate immune responses. J Immunol Methods. 498, 113147(2021).
  7. Inagaki, Y., et al. Interferon-g-induced apoptosis and activation of THP-1 macrophages. Life Sci. 71 (21), 2499-2508 (2002).
  8. Boonkaewwan, C., Toskulkao, C., Vongsakul, M. Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of stevioside and its metabolite steviol on THP-1 cells. J Agric Food Chem. 54 (3), 785-789 (2006).
  9. Chanput, W., et al. β-Glucans are involved in immune-modulation of THP-1 macrophages. Mol Nutr Food Res. 56 (5), 822-833 (2012).
  10. Cui, J., et al. USP3 inhibits type I interferon signaling by deubiquitinating RIG-I-like receptors. Cell Res. 24 (4), 400-416 (2014).
  11. Chen, S., et al. SAMHD1 suppresses innate immune responses to viral infections and inflammatory stimuli by inhibiting the NF-κB and interferon pathways. Proc Natl Acad Sci USA. 115 (16), E3798-E3807 (2018).
  12. Pradhananga, S., Spalinskas, R., Poujade, F. A., Eriksson, P., Sahlén, P. Promoter anchored interaction landscape of THP-1 macrophages captures early immune response processes. Cell Immunol. 355, 104148(2020).
  13. Mezzasoma, L., Talesa, V. N., Romani, R., Bellezza, I. Anp and BNP exert anti-inflammatory action via npr-1/cgmp axis by interfering with canonical, non-canonical, and alternative routes of inflammasome activation in human THP1 cells. Int J Mol Sci. 22 (1), 1-17 (2021).
  14. Martinat, C., et al. SUMOylation of SAMHD1 at Lysine 595 is required for HIV-1 restriction in non-cycling cells. Nat Commun. 12 (1), 4582(2021).
  15. Rensen, E., et al. Clustering and reverse transcription of HIV-1 genomes in nuclear niches of macrophages. EMBO J. 40 (1), e105247(2021).
  16. Ikeda, T., et al. APOBEC3 degradation is the primary function of HIV-1 Vif determining virion infectivity in the myeloid cell line THP-1. mBio. 14 (4), e0078223(2023).
  17. Jinek, M., et al. A programmable dual RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
  18. Kurosaki, T., Maquat, L. E. Nonsense-mediated mRNA decay in humans at a glance. J Cell Sci. 129 (3), 461-467 (2016).
  19. Tuladhar, R., et al. CRISPR-Cas9-based mutagenesis frequently provokes on-target mRNA misregulation. Nat Commun. 10 (1), 4056(2019).
  20. Embree, C. M., Abu-Alhasan, R., Singh, G. Features and factors that dictate if terminating ribosomes cause or counteract nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 298 (11), 102592(2022).
  21. Xue, C., Greene, E. C. DNA repair pathway choices in CRISPR-Cas9-mediated genome editing. Trends Genet. 37 (7), 639-656 (2021).
  22. Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).
  23. Tang, X., et al. A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment. Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).
  24. Ji, W., Zhang, L., Liu, X. Protocol using lentivirus to establish THP-1 suspension cell lines for immunostaining and confocal microscopy. STAR Protoc. 4 (1), 102032(2023).
  25. Guo, C., Ma, X., Gao, F., Guo, Y. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing. Front Bioeng Biotechnol. 11, (2023).
  26. Synthego Performance Analysis, ICE Analysis. 3.0, Synthego. https://www.synthego.com/help/citing-ice (2019).
  27. Salamov, A. A., Nishikawa, T., Swindells, M. B. Assessing protein coding region integrity in cDNA sequencing projects. Bioinformatics. 14, 384-390 (1998).
  28. Pedersen, A. G., Nielsen, H. Neural network prediction of translation initiation sites in eukaryotes: Perspectives for EST and genome analysis. Proc Int Conf Intell Syst Mol Biol. 5, 226-233 (1997).
  29. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  30. Laguette, N., et al. SAMHD1 is the dendritic- and myeloid-cell-specific HIV-1 restriction factor counteracted by Vpx. Nature. 474 (7353), 654-657 (2011).
  31. Hrecka, K., et al. Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein. Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).
  32. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRI SPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  33. Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. Cell death due to electroporation - A review. Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).
  34. Perretta-Tejedor, N., Freke, G., Seda, M., Long, D. A., Jenkins, D. Generating mutant renal cell lines using CRISPR technologies. Methods Mol Biol. 2067, 323-340 (2020).
  35. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  36. Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9. Sci Rep. 6, 39608(2016).
  37. Bowling, A., et al. Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination. J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).
  38. Inácios, Â, et al. Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay. J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).
  39. Li, J., et al. Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9. J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).
  40. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162 (4), 900-910 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ElectroporatieprotocolSingle cell cloningRibonucleoprote ne afgifteT7 endonuclease assaySanger sequencingImmunoblotting assayMonocytendifferentiatie

Gerelateerde artikelen