Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oprichting van rattenmodellen die genderbevestigende hormoontherapieën nabootsen

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67470

⸱

10 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Gender-Specific Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 2Department of Biomedicine and Prevention, University of Rome “Tor Vergata”, 3Centre Animal Research and Walfare, Istituto Superiore di Sanità

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol beschrijft de ontwikkeling van twee knaagdiermodellen die genderbevestigende hormoontherapieën nabootsen door subcutane toediening van testosteron of oestradiol plus cyproteronacetaat (gebruikt in menselijke therapieën voor transgenders): instelling van de doses, identificatie van relevante biomarkers en evaluatie van de effecten.

Samenvatting

Transgender (TG) personen zijn personen van wie de genderidentiteit en het geslacht dat bij de geboorte is toegewezen niet overeenkomen. Ze ondergaan vaak genderbevestigende hormoontherapie (GAHT), een medische interventie die het mogelijk maakt secundaire geslachtskenmerken te verwerven die meer in overeenstemming zijn met hun individuele genderidentiteit, wat consistente resultaten oplevert bij de verbetering van tal van sociaal-psychologische variabelen. GAHT richt zich echter op verschillende lichaamssystemen en er zijn enkele bijwerkingen geregistreerd, hoewel nog niet volledig geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Daarom kunnen TG-mensen die GAHT ondergaan worden beschouwd als een vatbare subgroep van de bevolking en moet specifieke aandacht worden besteed in het kader van risicobeoordeling, bijvoorbeeld door het gebruik van gerichte diermodellen. Het huidige werk beschrijft de procedures die zijn ingesteld om twee rattenmodellen te implementeren die GAHT nabootsen: het demasculiniserende-feminiserende model (dMF) dat de GAHT nabootst voor TG-vrouwen en het defeminiserende-masculiniserende model (dFM) dat de GAHT nabootst voor TG-mannen. De modellen zijn geïmplementeerd door de toediening van dezelfde hormonen die worden gebruikt voor humaan GAHT, namelijk β-oestradiol plus cyproteronacetaat voor dMF en testosteron voor dFM, via dezelfde blootstellingsroutes gedurende een periode van 2 weken. Ratten worden tijdens de behandeling dagelijks gecontroleerd om de gezondheidstoestand en mogelijk agressief gedrag te evalueren. Bij het offeren zijn bloed en doelweefsels bemonsterd en opgeslagen voor biochemische, moleculaire en histopathologische analyse. Geslachtsspecifieke parameters, namelijk het aantal zaadcellen en de afmetingen van de clitoris, zijn ook geëvalueerd. Bovendien worden CYP450-isovormen, uitsluitend en/of bij voorkeur tot expressie gebracht in de lever van mannelijke en vrouwelijke ratten, geïdentificeerd en gekarakteriseerd als nieuwe biomarkers om het succes van GAHT te verifiëren en het model te bepalen. Betrokkenheid van de schildklier is ook onderzocht als een belangrijk doelwit in het endocriene systeem.

Inleiding

De psychologische perceptie van het individu om man, vrouw, geen van beide, beide of ergens tussen1 in te zijn, wordt genderidentiteit genoemd. Het kan overeenkomen met het biologische geslacht (cisgender) of kan anders zijn (transgender - TG). Een TG-man is een persoon die als vrouw is geboren, maar die zichzelf identificeert als een man. Een TG-vrouw wordt geboren als een man, maar identificeert zichzelf als een vrouw2. Naar schatting zijn er op dit moment wereldwijd 25 miljoen TG-mensen3, van wie de meesten lijden aan genderdysforie, een psychologische aandoening die wordt gekenmerkt door incongruentie tussen hun geslacht en het geslacht dat hen bij de geboorte is toegewezen4, wat kan leiden tot sociale discriminatie en moeilijkheden op het werk en in het gezin, vaak leidend tot depressie, angst en stress5. Om dergelijke redenen ondergaan TG-mensen vaak genderbevestigende hormoontherapie (GAHT) en/of genderbevestigende chirurgie. GAHT voor TG-mannen wordt gekenmerkt door de toediening van testosteron (T) (tabel 1) en voor TG-vrouwen door oestrogenen (E2) plus antiandrogenen (tabel 2)6.

GAHT gaat gewoonlijk het hele leven van het individu mee en werkt continu in op het endocriene systeem 7,8. Het is dus belangrijk om de impact van de GAHT op de gezondheid van TG-mensen en de mogelijke langdurige effecten ervan te analyseren. Bovendien worden TG-mensen, net als de algemene bevolking, blootgesteld aan chemische verontreinigingen - in het bijzonder de hormoonontregelaars (ED) - die zich richten op het endocriene systeem als de GAHT, wat resulteert in overstimulatie9.

ED is een groep chemicaliën die de organismen en/of hun nageslacht beïnvloeden door verschillende hormonale en metabolische processen te veranderen, zoals de afscheiding, activering, synthese, afgifte en binding van natuurlijke hormonen. Aangezien hormoonontregelende stoffen wijdverspreid zijn in het milieu, worden voedingsmiddelen en producten voor dagelijks gebruik (bijv. plastic flessen en containers, voeringen van metalen voedselblikken, wasmiddelen, vlamvertragers, voedsel, speelgoed, cosmetica en pesticiden, enz.) de algemene bevolking gedurende het hele leven continu blootgesteld10. Bovendien kan zelfs blootstelling aan ED's met een lage dosis leiden tot weefsel- en orgaanschade, en een veel voorkomend fenomeen dat verband houdt met blootstelling aan ED is het optreden van geslachtsspecifieke effecten zowel bij proefdieren als bij mensen11. Blootstelling aan het voedselcontactmateriaal, bisfenol A (BPA), wordt bijvoorbeeld in verband gebracht met gezondheidsrisico's zoals endometriose en polycysteus ovariumsyndroom bij vrouwen, evenals verminderde vruchtbaarheid, vanwege de oestrogene effecten12. Bij mannen kan BPA de niveaus verlagen en de kwaliteit van het sperma verminderen13. Bovendien worden pesticiden in verband gebracht met een hoger risico op borstkanker bij vrouwen en aanzienlijke vruchtbaarheidsproblemen bij mannen13. Tot nu toe zijn er geen specifieke instrumenten beschikbaar om de toxicologische effecten van milieuverontreinigende stoffen, waaronder ED, bij TG-mensen te bestuderen9.

De huidige studie heeft tot doel methoden en parameters te beschrijven die zijn geselecteerd voor de ontwikkeling van twee TG-diermodellen: een demasculiniserend-feminiserend model (dMF) en een defeminiserend-masculiniserend model (dFM). In het bijzonder worden de selectie van geschikte dosisniveaus, tijd en wijze van toediening van de hormonen op basis van de huidige humane therapieën beoordeeld14. Bovendien worden weefsel- en functionele biomarkers die de modellen uniek definiëren, geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Bovendien worden de werkzaamheid en verdraagbaarheid van de therapie bij dieren, evenals de selectie van de meest geschikte markers voor gebruik in langetermijnstudies, in detail beschreven, samen met de technieken die voor dergelijke doeleinden worden gebruikt.

Om de modellen te karakteriseren, worden de volgende eindpunten geanalyseerd: testosteron (T) serumspiegel (de beste biomarker om het succes van GAHT in beide modellen te evalueren 9,15); oestradiol (E2) serumspiegel (beide modellen); schildklierstimulerend hormoon (TSH) en thyroxine (T4) (dMF-model); aantal zaadcellen (dMF-model); clitorisdimensie (dFM-model); histopathologische analyse van voortplantingsorganen, lever en schildklier (voor beide modellen). Daarnaast wordt ook genexpressie van de volgende geslachtsspecifieke levercytochroom P450-isovormen (CYP450s, voor beide modellen) geanalyseerd16,17: CYP2C11 (specifiek tot expressie gebracht in de mannelijke lever), CYP3A18 (25 keer meer tot expressie gebracht in de mannelijke lever dan in vrouwelijke), CYP2C12 (specifiek tot expressie gebracht in de vrouwelijke lever) en CYP2C6 (voornamelijk tot expressie gebracht in vrouwelijke lever, maar aanwezig in lagere niveaus, ook bij de man).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studies worden uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU, het Italiaanse wetsbesluit nr. 26 van 4 maart 2014 en de OESO-beginselen van goede laboratoriumpraktijken (GLP). Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (autorisatienr. 806/2021-PR). Hier worden 16 jonge geslachtsrijpe Sprague-Dawley-ratten van beide geslachten (304 ± 13 g mannelijke ratten en 190 ± 7 g vrouwelijke ratten, 8-9 weken oud) gekocht en gehuisvest in twee kooien onder standaard laboratoriumomstandigheden (22 ± 0,5 °C, 50%-60% relatieve vochtigheid, 12 uur donker-licht afwisseling met 12-14 luchtverversingen per uur) met water en voedsel ad libitum beschikbaar. Plaats in alle kooien, voor de verrijking van de omgeving van elk dier, houten knaagblokken en vervang ze wekelijks.

OPMERKING: De dieren van 8-9 weken zijn gekozen omdat GAHT kan beginnen tijdens de adolescentie (Tanner-stadia 2 tot 3), wat overeenkomt met 8-9 weken bij knaagdieren, en het duurt lang, mogelijk gedurende het hele leven van TG-mensen9.

1. Groepsgrootte en dierenverzorging

  1. Gebruik jongvolwassen mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (8-9 weken oud) als model, aangezien ratten de voorkeurssoort is die wordt aangegeven door de OESO (bijv. Richtlijn 421 Reproductie-/ontwikkelingstoxiciteitsscreeningstest) en de enige knaagdiersoort die wordt voorgesteld en overwogen in OESO-richtlijn 407 (28-daags onderzoek naar orale toxiciteit bij een herhaalde dosis bij knaagdieren, bijgewerkt met de parameters voor de detectie van EI's).
  2. Gebruik de G*Power software voor de groepsgrootte. Selecteer voor zowel het dFM- als het dMF-model vier testgroepen: één controlegroep (C) en drie groepen dieren die met verschillende doses GAHT worden behandeld. Doe de dimensionering met verwijzing naar de vergelijking tussen twee groepen (behandelingsdosis versus C) met de Mann-Whitney-test, een tweezijdig significantieniveau alfa = 0,0167 (overeenkomend met alfa = 0,05 met Bonferroni-correctie toegepast op de 3 vergelijkingen tussen elke behandelingsdosis en de C), en 1-bètamacht = 0,80.
    1. Het berekende aantal ratten/groepen is als volgt:
      voor het dFM-model, dieren/groep n=4, volgens Kinnear et al.18 die na 2 weken behandeling de volgende niveaus aangeeft: in de controlegroep: 0,2 ± 0,3 ng/ml, in de hormoontherapiegroep: 16 ± 5 ng/ml (gemiddelde ± standaarddeviatie), overeenkomend met een effectdimensie gemeten met Cohen's d = 4,46 (zeer groot effect).
      voor dMF-model: dieren/groep n=3, volgens Gómez et al.19 die na 2 weken behandeling de volgende niveaus aangeeft: controlegroep: 1,901 ± 0,413 ng/ml en hormoontherapiegroep: 0,043 ± 0,023 ng/ml (gemiddelde ± standaardfout) overeenkomend met een effectdimensie gemeten met Cohen's d = 6,35 (zeer groot effect).
    2. Om de twee modellen op één lijn te brengen, kiest u n=4 dieren per geslacht/groep, voor een totaal van N = 32 dieren.
  3. Verdeel de ratten na 1 week acclimatisatie naar geslacht in twee experimentele groepen (dMF en dFM, 4 ratten/groep), elk samengesteld uit één C (controlemannetje, CM en controlevrouwtje, CF) en drie behandelingsgroepen van de geselecteerde GAHT.
  4. Controleer alle ratten 2x per dag (om 8.30 uur en 16.00 uur) om de algemene gezondheidstoestand en mogelijke agressiviteit als gevolg van GAHT-toediening te controleren. Registreer 2x per week lichaamsgewicht (bw) en voeropname met behulp van een analytische balans met de dynamische weegfunctie die optimaal is voor het gewicht van de proefdieren.
  5. Meet in het experimentele dFM-model de clitorisdiameter van alle ratten onmiddellijk voor het begin van de behandeling (punt 0) en aan het einde van de behandeling (punt 13), met behulp van een digitale meter voor nauwkeurige metingen.
  6. Weeg alle dieren vóór het offeren en, in het dMF-model, verwijder onmiddellijk na het offeren de bijbal om de zaadtelling uit te voeren.

2. Dosisselectie en bereiding

  1. Gebruik de volgende drie doses hormonen die aan dFM-ratten moeten worden toegediend: 5, 10,5 en 22,5 mg/kg per week, gebruik voor het dMF-model de volgende drie geselecteerde dosisniveaus (DL): DL1 E2 0,045 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg, DL2 E2 0,09 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg en DL3 E2 0,18 mg/kg + CPA 0,2 mg/kg.
    OPMERKING: Bij de selectie van alle doses wordt rekening gehouden met de belangrijkste klinische richtlijnen bij mensen bij de mens die worden gebruikt voor TG-mensenvan 15 jaar en de beperkte gegevens die beschikbaar zijn in de literatuur.
  2. Bereid wekelijks alle voorraadoplossingen voor met behulp van een chemische veiligheidskap. Meng alle stoffen op de juiste manier in de sesamolie als een vehikel en zorg ervoor dat ze volledig oplosbaar zijn.
    OPMERKING: Gebruik voor beide modellen een dosisomrekeningscalculator (https://dosecal.cftri.res.in/) om de om te rekenen dosis in te voeren, de soort waarvoor de dosis is ingesteld, de diersoort en het gewicht waarvoor de dosis moet worden omgerekend. Voor het dFM-model (Tabel 3), menselijke hormoontherapie, een maximale dosis van 100 mg T per week20. De dosis berekend bij ratten is 10,5 mg/kg T per week. De tweede dosis is 22,5 mg/kg per week bij rattenvan 18 jaar. De derde dosis is 5 mg/kg per week, geïdentificeerd door de factor 2,1 tussen de twee berekende doses aan te houden. Voor het dMF-model zie Tabel 4 zijn de doseringen gebaseerd op aanbevolen regimes voor mensen21 en gegevens die beschikbaar zijn via in vivo onderzoeken 14,19,22.

3. Behandeling van dieren

  1. Voer subcutane toediening van T (voor het dFM-model) en E2 plus CPA (voor het dMF-model) uit door de huid op de injectieplaats samen te knijpen en op te tillen en zo een soort gordijn te vormen. Steek vervolgens de naald van een spuit van 1 ml evenwijdig aan de rug van het dier. Eenmaal binnen injecteert u langzaam het vereiste volume (100 μl voor T; 200 μl voor E2+CPA)23.
    1. Behandel de dieren als volgt: voor het dFM-model T enanthaat opgelost in sesamolie (vehiculum) 2x/week gedurende 2 weken toedienen (100 μL voor elke subcutane injectie van T). Voor het dMF-model wordt E2 plus CPA-acetaat opgelost in sesamolie (vehiculum) 5x/week gedurende 2 weken toegediend (200 μL voor elke subcutane injectie). Behandel de ratten van groep C op dezelfde manier met alleen het voertuig (sesamolie).

4. Bloedafname, opoffering en weefselafname

  1. Gebruik na 2 weken behandeling, net voor het offeren, een gasvormig anesthesiesysteem en verdoof alle dieren. Induceer anesthesie door een dosis variërend van 2% tot 3,5% isofluraan in 100% zuurstof met een snelheid van 1,5 l/min tot verlies van de reflexen in een heldere inductiekamer van polystyreen. Plaats de rat in buikligging op het verwarmingskussen en regel de dosis isofluraan in een onderhoudsdosis variërend van 1,5% tot 3,5%, toegediend door een standaard neusmasker van de rat tijdens de intracardiale bloedafnameprocedure.
  2. Bereid een spuit van 5 ml voor met een naald van 21 G, waardoor het vacuüm wordt geëlimineerd. Onderzoek het hart met de vingers en steek de naald voorzichtig in de laterale thoracale wand loodrecht op het lichaam op ongeveer het punt van gebogen ellebogen, tussen ribben 5 en 6. Eenmaal in de hartventrikel komt het bloed via capillaire middelen de spuit binnen. Trek de zuiger van de spuit langzaam en continu terug totdat er bloed vloeit.
  3. Plaats de ratten na de bloedafname in de CO2 -kamer om euthanasie uit te voeren met behulp van CO2 -verstikking met een vulsnelheid van 30%-70% verplaatsing van het kamervolume per minuut. Controleer na 2-3 minuten de dood van de dieren door de ademhaling en hartslag24 te controleren.
  4. Plaats na het offer elk dier op de snijtafel in rugligging, met de voorpoten naar boven en de achterpoten naar beneden, en zet ze vast met pinnen. Bestrooi de buik van het dier met een desinfecterende oplossing.
  5. Snijd de volgende organen weg: teelballen, bijbal, baarmoeder, eierstokken, lever en schildklier. Weeg ze af en bewaar ze in buisjes van 50 ml met 35 ml 10% gebufferde formaline (alle organen) of Bouin-oplossing (alleen testis) of verzamel ze in cryogene buisjes (een orgaan/buisje) en vries ze onmiddellijk in vloeibare stikstof in (voor opslag bij -80 °C).
    1. Knip eerst de huid met een schaar op de middellijn, van het schaambeen tot de bovenbuik. Maak twee zijwaartse sneden in de ribbenkast en reflecteer de huid aan beide zijden van de incisie om de thoracale ingewanden bloot te leggen.
    2. Verwijder eerst de voortplantingsorganen; Verwijder bij mannelijke ratten de teelballen, ovaalvormige gepaarde organen in de buikholte, in de intra-abdominale positie (scrotumzak). Knip en druk op de scrotumzak om ervoor te zorgen dat de teelballen uitsteken en pak ze vervolgens voorzichtig vast. Houd het viscerale vet vast met een tang en snijd vervolgens de teelballen weg van de ingewanden. Weeg na de excisie de teelballen en bewaar ze in de oplossing van Bouin voor histopathologische analyse.
    3. Bij vrouwelijke ratten pak je eerst voorzichtig de baarmoeder vast en snijd je vervolgens de eierstokken (die zich aan het einde van beide baarmoederhoorns bevinden) uit het viscerale vetweefsel. Weeg na de excisie de eierstokken.
    4. Ga bij zowel vrouwelijke als mannelijke ratten naar de rechterkant van de buikholte, waar de lever zich bevindt. De lever is een meerlobbig orgaan en het is mogelijk om veel delen te identificeren: linker mediaal (kleiner), linker lateraal (major), rechter mediaal (kleiner), rechter lateraal (major), caudaat en vierkante kwab25. Pak de lever vast met een tang en zorg ervoor dat deze niet breekt. Pak het xiphoid-proces vast met een tang en knip het middenrif volledig door met een schaar.
    5. Gebruik een tang om het xiphoid-proces op te tillen en de lever uit de buikholte te halen. Scheid de lever van het middenrif met een schaar. Weeg daarna de lever en bewaar.
    6. Knip voor schildklierextractie met behulp van een schaar loodrecht langs de nek van het dier, verwijder de huid en het spierstelsel en knip voorzichtig de uiteinden van de luchtpijp af, waarin de schildklier zich bevindt. Bewaar de schildklier voor verder onderzoek26.
  6. Voer het aantal zaadcellen uit zoals hieronder beschreven.
    1. Pak na het verwijderen van de testis de bijbal vast, die aan de achterrand van de respectieve testis is bevestigd en in het scrotum zit.
    2. In dit experiment worden spermamonsters genomen uit de staart van de rechter bijbal. Maak op het moment van verzamelen de staart schoon van vet en bindweefsel met een schaar, scheid deze van het resterende deel en plaats deze in een petrischaal (35 mm x 10 mm) met 1 ml DMEM. Knip met een schaar en vloei met een pasteurpipet om het vrijgeven van de inhoud te vergemakkelijken.
    3. Breng alle verkregen vloeistof over in een buis van 15 ml en breng het volume op 10 ml met DMEM (verdunningsfactor 1:10=0,1). Pipetteer de inhoud om te homogeniseren en een suspensie te creëren. Neem na licht schudden 10 μL van de suspensie om de Neubauer-kamer te laden. Laad de camera en begin na 3 minuten laden van de camera met tellen.

5. Enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA)-test

  1. Verzamel bloedmonsters (ongeveer 2-5 ml per dier) in buisjes van 2 ml en laat ze 1 uur stollen bij kamertemperatuur. Draai alle bloedmonsters 2x in een centrifuge gedurende 15 minuten bij 4 °C en 3000 x g.
  2. Gecentrifugeerd bloed heeft een meerlagig uiterlijk met drie lagen van verschillende kleuren. De bovenste laag bestaat uit plasma (meestal geel of transparant), het vloeibare deel van het bloed; de laag onder het plasma kan een witachtige of grijze kleur hebben en is de Buffy-jas. De onderste laag bevat rode bloedcellen en de kleur kan donkerrood of felrood lijken. Om de geslachtshormoonspiegels te bepalen, verzamelt u het serum van alle monsters met een pipet (zonder de buffy-vacht of de erytrocytlagen aan te raken), verdeelt u ze in aliquots (500 μL) en bewaart u ze bij -80 °C.
  3. Voer in beide modellen een ELISA-test uit om de aanwezigheid van eiwitten, antilichamen of antigenen in het monster te detecteren en/of te meten voor de bepaling van geslachtshormonen. Gebruik de directe methode en volg de instructies van elke ELISA-kit. In deze studie werden de serumspiegels van de volgende hormonen bij ratten bepaald: E2, Rat Estradiol ELISA; T, Muis/Rat Testosteron Elisa; TSH, Rat ELISA Kit en T4, Rat ELISA Kit.

6. Histopathologische analyse

  1. Bereid histologische dia's van weefsels voor volgens de volgende procedures.
  2. Fixeer de monsters van de baarmoeder, eierstok, schildklier en lever op het moment van extractie gedurende ten minste 48 uur in 10% gebufferde formaline.
    LET OP: Werk onder een chemische kap. Adem de stof/het mengsel niet in. Vermijd het genereren van damp/aerosolen.
  3. Was de monsters gedurende 1 uur onder stromend water en bewaar ze vervolgens in 80% ethylalcohol (C2H5OH) tot verwerking, om de protoplasmastructuur te beschermen tegen veranderingen als gevolg van celdood.
  4. Fixeer de testis in de oplossing van Bouin, bestaande uit 15 ml verzadigde oplossing van picrinezuur, 5 ml geconcentreerde formaline (33%-40%) en 1 ml ijsazijn gedurende 48 uur. Was monsters met 80% ethylalcohol.
    LET OP: Werk onder een chemische kap.
  5. Voer de opname in vaste paraffine uit met behulp van een automatische weefselverwerker. Plaats aan het einde van het insluitingsproces de monsters in kleine metalen recipiënten waarin gesmolten paraffine is gegoten en koel af op een bevroren plaat, zodat u de blokken voor de snede vormt. Oriënteer ze afhankelijk van het gewenste snijgedeelte.
  6. Snijd daarna de monsters met behulp van een roterende microtoom. Verzamel secties van 5-6 μm met behulp van kleine borstels, verdeel ze enkele seconden in water van 37 °C en plaats ze op glasplaatjes van de microscoop. Laat de glaasjes enkele minuten loodrecht uitlekken en droog ze minstens 1 uur in de oven op 36 °C.
  7. Voer hematoxyline- en eosinekleuring uit zoals hieronder beschreven.
    1. Deparaffiniseer de objectglaasjes door ze 5 minuten in klaringsmiddel van terpeen (xyleenvervanger) te dompelen.
    2. Rehydrateer de objectglaasjes door ze door de volgende reeks graduele ethanol te dompelen. Voor elke oplossing, 2 minuten per dip: 100% ethanol, 95% ethanol, 80% ethanol, 50% ethanol en gedestilleerd water.
      OPMERKING: Het kan een stoppunt zijn voor het protocol en de dia's kunnen enkele uren in het water op RT worden achtergelaten. Optioneel kunnen de glijbanen ook bij 4 °C in water worden bewaard.
    3. Plaats de glaasjes 5 minuten in de hematoxyline van Mayer. Breng ze onmiddellijk terug naar de container met kraanwater gedurende 5 minuten. Laat kraanwater in de achterste hoek van de container lopen die het verst van de secties verwijderd is. Leeg de container regelmatig totdat de paarse kleur in het water niet meer aanwezig is.
      OPMERKING: Om te voorkomen dat secties van de glijbanen loskomen, mag u geen water rechtstreeks op de glijbanen laten lopen.
    4. Plaats de glaasjes gedurende 2 minuten in de eosine Y 1% waterige oplossing. Breng de dia's gedurende 15 s over in gedestilleerd water. Dehydrateer de dia's door ze door de volgende reeks graduele ethanol te dompelen. Voor elke oplossing, 15 s per dip: 50% ethanol, 80% ethanol, 95% ethanol.
    5. Plaats de glaasjes 1 minuut in 100% ethanol en verander deze nog 1 minuut in verse 100% ethanol. Plaats de glaasjes 2 minuten in een klaringsmiddel van terpeen (xyleenvervanger) en vervang het nog 2 minuten door een vers klaringsmiddel van terpeenoorsprong (xyleenvervanger). Verwijder één dia per keer en plaats een dekglaasje.
    6. Bedek de secties met montagemedium en plaats een dekglaasje op de bodem van de dia.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het montagemedium de schuif op zijn plaats trekt. Als het dekglaasje niet plat is, tikt u het voorzichtig op zijn plaats. Dep overtollig montagemedium af met keukenpapier.
    7. Dompel een reinigingsdoekje in het klaringsmiddel van terpeenoorsprong (xyleenvervanger) en veeg de achterkant van het glaasje af om eventueel gedruppeld medium te verwijderen. Plaats de dia plat op een mobiele stevige ondergrond, zoals een stuk karton. Voeg een dekglaasje toe aan alle resterende dia's zoals beschreven in stap 6.7.6. Laat de geleiders drogen en het montagemedium uitharden bij RT in de kap.
      LET OP: Werk onder een chemische kap.
  8. Bedek de monsters na de kleuring met een dekglaasje en evalueer ze met een optische microscoop. Histopathologische veranderingen zijn beschreven op basis van verspreiding, ernst en morfologische kenmerken.
  9. Voer blessurescores semi-kwantitatief uit, met behulp van een 5-punts beoordelingsschaal (0 tot 4), rekening houdend met de ernst van de veranderingen op basis van criteria uitgelegd door Shackelford et al.27 en als volgt samengevat:
    Graad 0: geen verandering
    Graad 1: minimale verandering. Het effect is nauwelijks zichtbaar op het weefsel; klein en zeldzaam. Beïnvloedt een deel van het weefsel kleiner dan of gelijk aan 10%.
    Graad 2: lichtverandering. Vertegenwoordigt een kleine histologische verandering. Deze graad wordt gebruikt wanneer het weefsel, of de structuur ervan, een volumeverandering tussen 11% en 20% heeft laten zien.
    Graad 3: matige verandering. De verandering is duidelijk in het weefsel. De graad geeft de aanwezigheid aan van variaties tussen 21%-40% van het weefsel of de structuur ervan
    Graad 4: duidelijke verandering. Overweldigende histologische verandering van weefsel of de structuur ervan. Variaties beïnvloeden 41%-100% van het weefsel.
  10. Voer kwantitatieve histomorfometrische analyse uit op baarmoeder, eierstok, testis en schildklier. Onderzoek weefselcoupes met behulp van een beeldanalysesysteem dat is toegepast op een optische microscoop en volg de onderstaande stappen.
    1. Baarmoeder: Meet met een 2x objectief de totale oppervlakte van elke dwarsdoorsnede van de rechter baarmoederhoorn, het uitwendige en inwendige myometrium en het baarmoederlumen. Bereken de oppervlakte van het baarmoederslijmvlies en het myometrium en de verhouding tussen het gebied van het baarmoederslijmvlies en het myometrium28.
    2. Eierstok: Gebruik een van de hele doorsnede in de centrale positie van de eierstok om follikels in verschillende stadia van ontwikkeling te onthullen; tel de primaire, secundaire, corpus luteum-, Graaf- en atresische follikels met behulp van een 4x objectief. Voer classificatie van follikels uit volgens Fortune29. Meet daarnaast het gebied van de eierstok voor elk monster en de folliculaire dichtheid (aantal follikels/eierstokgebied x 100)30.
    3. Testis: Meet met behulp van het 10x-objectief 20 buisjes/monster; Meet daarnaast het totale lumenoppervlak, de totale oppervlakte, de lengtediameter en de dwarsdiameter28.
    4. Schildklier: Meet de volgende parameters: folliculaire dichtheid (verhouding tussen het aantal follikels en een bepaald gebied, 10x objectief); indirecte folliculaire celhoogte (gemiddelde verhouding van follikelgebied en colloïdgebied in vijf willekeurig geselecteerde follikels/monster 40x objectief); de gemiddelde verhouding van het folliculaire epitheelgebied en het aantal kernen (in dezelfde follikel om de folliculaire rijping vast te stellen); folliculaire celhoogte (gemiddelde van vijf celhoogte in vijf willekeurig geselecteerde follikels/monster, 64x objectief)31.

7. Genexpressie

  1. Voer voor beide modellen de genexpressieanalyse uit met behulp van levermonsters die bij -80 °C zijn bewaard. Volg het protocol van totale RNA-zuivering met behulp van een kit, beginnend met een lysaat van dierlijk weefsel.
    1. Om het leverlysaat te verkrijgen, maalt u het weefselmonster (10 mg) met een minipinner, voegt u 600 μL RL BUFFER (meegeleverd met de kit) toe aan het weefselmonster en blijft u malen totdat het monster is gehomogeniseerd.
  2. Kwantificeer onmiddellijk na de extractie het verkregen RNA en evalueer de kwaliteit ervan (op denaturatie of de aanwezigheid van eiwitresiduen) met behulp van een fluorspectrometer. Voer spectrofotometrische absorptiemetingen uit bij golflengten van 260 nm en 280 nm, waarbij respectievelijk nucleïnezuren en eiwitten worden geabsorbeerd.
  3. Na evaluatie van de totale RNA-concentratie, met behulp van een cDNA-synthesekit volgens de instructies van de fabrikant, wordt het juiste volume met 1 μg totaal RNA van elk monster omgekeerd getranscribeerd naar cDNA.
  4. Analyseer het verkregen cDNA door RT-PCR.
    1. Om genexpressies van interessante genen te analyseren, zijn specifieke voorwaartse en achterwaartse primers ontworpen voor elk doelgen, evenals voor het referentiegen dat constitutief tot expressie wordt gebracht glyceraldehydefosfaatdehydrogenase (GAPDH). Gebruik de webapplicatie Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) om de beste primers te kiezen die de specificiteit van de koppeling alleen aan het gen van interesse garanderen en de oligonucleotiden te verkrijgen die door een commerciële leverancier worden gesynthetiseerd. De sequenties van de gebruikte primerparen worden weergegeven in Tabel 5.
    2. Resuspendeer de gelyofiliseerde primers met RNA-vrij gedestilleerd water in een eindconcentratie van 100 mM. Gebruik een speciale kit om qPCR-analyse uit te voeren. Voer de reacties uit in een eindvolume van 20 μL en verdun het gegloeide cDNA 1:40. Laad elk monster in tweevoud in PCR-platen met 96 putjes.
    3. Voer qPCR-runs uit op de thermische cycler volgens dit programma: 1 cyclus bij 95 °C gedurende 10 minuten; 40 cycli bij 95 °C gedurende 15 s, 58 °C gedurende 30 s en 72 °C gedurende 1 min. Voer aan het einde een dissociatiecyclus uit van 55° C tot 95° C (30 s/°C) om de specificiteit van het versterkte product te verifiëren. Verkrijg met behulp van de speciale software van de machine drempelcycluswaarden (cyclusdrempel, Ct) voor elk monster. Druk de resultaten uit als ΔΔ Ct (delta delta Ct) volgens de Pfaffl-formule32:
      ΔCt Doelgen = Ct Control - Ct Behandeld
      ΔCt Referentiegen = Ct Control - Ct Behandeld
      ΔCt = ΔCt Doelwitgen - ΔCt Referentiegen

8. Gegevensanalyse

  1. Voer gegevensbeheer uit met behulp van een spreadsheet. Voer analyses uit met behulp van statistische analysesoftware. Ontwerp afbeeldingen met behulp van specifieke software.
  2. Geef de toename van lichaamsgewicht, voerconsumptie, absoluut en relatief orgaangewicht, hormoonserumspiegels, weefselmorfometrische gegevens en genexpressiegegevens weer als gemiddelde ± standaarddeviatie. Voer een niet-parametrische Kruskal-Wallis-analyse uit, gevolgd door post-hoc paarsgewijze vergelijkingen (Mann-Whitney-test).
  3. Analyseer histologische gegevens met behulp van een 2-weg Fisher Exact-test om significante verschillen met de controlegroep te identificeren, inclusief monsters die zijn toegewezen aan een categorie zonder enige verwijzing naar ernstgradaties (totale incidentie van bevindingen). Gebruik de Cochran-Armitage Trendtest om de dosis-responstrend te identificeren. Beschouw verschillen tussen groepen als significant als de p-waarde < 0,05 is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Zoals aangetoond door Tassinari et al.14 en door Tammaro et al.33, toonden de volgende resultaten het succes van GAHT op ratten en de geschiktheid van de modellen.

Er wordt geen mortaliteit of abnormaal gedrag, zoals agressiviteit, geregistreerd en er worden geen klinische tekenen van toxiciteit of lijden (bijv. verminderde activiteit, pilo-erectie en een onverzorgd uiterlijk) waargenomen14

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De implementatie van knaagdiermodellen die GAHT nabootsen, is cruciaal voor het bestuderen van de potentiële specifieke gevoeligheid en kwetsbaarheid van TG-mensen en de langetermijnresultaten van de therapieën, die meestal hun hele leven duren.

Gezien het schaarse aantal vergelijkbare studies in de literatuur, is het kritieke punt van dit experiment de selectie van de doses om de modellen in te stellen; Dergelijke doses moeten laag genoeg zijn om verenigbaar ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die mogelijk een belangenconflict zouden kunnen veroorzaken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Analytical balance ABJ 320-4NMKernZ741091
BouinBiooptica05-M01008
Centrifuge 5415 REppendorfVoor eppendorf
Cyproterone AcetateSigma-AldrichC3412
D-MEM mediumGibco
ExcelTaq 2X Fast Q-PCR Master Mix (SYBR, ROX), 200 RXNSmobio TQ1210
Formalin solution, neutral buffered, 10%Sigma-AldrichHT501128
GraphPad Prism software versie 5.0  voor WindowsGraphPad Software
HematoxylineBiooptica05-06002/L
HeosinBiooptica05-10007/L
Imaging SoftwareNikonNIS-BR
JMP 10 statistische softwareSAS Institute 
MicromThermo ScientificHM 325
MicroscopieNikon Microphot FX
Mouse/Rat Testosterone ELISABiovendorRTC001R96T
NanoDrop 1000 SpectrofotometerThermo ScientificND-1000
ParaffinaBiooptica087910
Portable Balances SCOUT STX2202OHAUS
30253064
PrimersLife TechnologiesOntworpen door PrimerBlast
Rat Estradiol ELISABiovendorRTC009R96T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
Rat TSH(Thyroid Stimulating Hormone) ELISA KitELK BiotechnologyELK228396T
SensiFASTcDNA Synthesis KitBiolineBIO-6505350 reactie
Sesam OilACROSAC241000010
Sprague Dawley ratten mannetjes en vrouwtjesEnvigo8/9 weken oud
Standard diëtenMucedola4RF18
T4(Thyroxine) ELISA KitELK BiotechnologyELK871696T
Testosterone enanthateSigma-AldrichT3006
Thermal Cycler LineGene 9600 Plus BioerAurogene
WeefselprocessorShandon Excelsior ES, Thermo Scientific)
Total RNA purification KITNorgen1720050 kolom
Victor 3 Multilabel reader Perkin Elmer
β-Estradiol 17-valerateSigma-AldrichE1631

Referenties

  1. Rokach, A., Patel, K. Human sexuality: Function, dysfunction, paraphilias, and relationships. , Academic Press. (2021).
  2. American Psychological Association. Guidelines for psychological practice with transgender and gender nonconforming people. Am Psychol. 70 (9), 832-864 (2015).
  3. Ammari, T., Sluiter, E. C., Gast, K., Kuzon, W. M. Female-to-male gender-affirming chest reconstruction surgery. Aesthet Surg J. 39 (2), 150-163 (2019).
  4. Garg, G., Elshimy, G., Marwaha, R. Gender Dysphoria. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2023).
  5. Chan, A. S. W., Wu, D., Lo, I. P. Y., Ho, J. M. C., Yan, E. Diversity and inclusion: Impacts on psychological wellbeing among lesbian, gay, bisexual, transgender, and queer communities. Front Psychol. 13, 726343(2022).
  6. Unger, C. A. Hormone therapy for transgender patients. Transla Androl Urol. 5 (6), 877(2016).
  7. Sofer, Y., et al. Gender‐affirming hormone therapy effect on cortisol levels in trans males and trans females. Clin Endocrinol. 100 (2), 164-169 (2024).
  8. Pirtea, P., Ayoubi, J. M., Desmedt, S. T. ’, Sjoen, G. Ovarian, breast, and metabolic changes induced by androgen treatment in transgender men. Fertil Steril. 116 (4), 936-942 (2021).
  9. Tassinari, R., Maranghi, F. Rodent model of gender-affirming hormone therapies as specific tool for identifying susceptibility and vulnerability of transgender people and future applications for risk assessment. Int J Environ Res Public Health. 18 (23), 12640(2021).
  10. Schug, T. T., Janesick, A., Blumberg, B., Heindel, J. J. Endocrine disrupting chemicals and disease susceptibility. J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (3-5), 204-215 (2011).
  11. van Larebeke, N., Fucic, A. Challenges in endocrine disruptor toxicology and risk assessment. , The Royal Society of Chemistry. (2020).
  12. You, H. H., Song, G. Review of endocrine disruptors on male and female reproductive systems. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 244, 109002(2021).
  13. Sifakis, S., Androutsopoulos, V. P., Tsatsakis, A. M., Spandidos, D. A. Human exposure to endocrine disrupting chemicals: effects on the male and female reproductive systems. Environ Toxicol Pharmacol. 51, 56-70 (2017).
  14. Tassinari, R., et al. Risk assessment of transgender people: Development of rodent models mimicking gender-affirming hormone therapies and identification of sex-dimorphic liver genes as novel biomarkers of sex transition. Cells. 12 (3), 474(2023).
  15. T’Sjoen, G., Arcelus, J., Gooren, L., Klink, D. T., Tangpricha, V. Endocrinology of transgender medicine. Endo Rev. 40 (1), 97-117 (2019).
  16. Dhir, R. N., Shapiro, B. H. Interpulse growth hormone secretion in the episodic plasma profile causes the sex reversal of cytochrome P450s in senescent male rats. Proc Natl Acad Sci. 100 (25), 15224-15228 (2003).
  17. Robertson, G. R., Farrell, G. C., Liddle, C. Sexually dimorphic expression of rat CYP3A9 and CYP3A18 genes is regulated by growth hormone. Biochem Biophys Res Comm. 242 (1), 57-60 (1998).
  18. Kinnear, H., et al. A mouse model to investigate the impact of testosterone therapy on reproduction in transgender men. Human Reprod. 34 (10), 2009-2017 (2019).
  19. Gómez, Á, et al. Effects of adult male rat feminization treatments on brain morphology and metabolomic profile. Hormones Behav. 125, 104839(2020).
  20. T'Sjoen, G., et al. European society for sexual medicine position statement "Assessment and hormonal management in adolescent and adult trans people, with attention for sexual function and satisfaction". J Sex Med. 17 (4), 570-584 (2020).
  21. Coleman, E., et al. Standards of care for the health of transgender and gender diverse people, version 8. Int J Transgender Health. 23 (sup 1), S1-S259 (2022).
  22. Sudhakar, D., Huang, Z., Zietkowski, M., Powell, N., Fisher, A. R. Feminizing gender‐affirming hormone therapy for the transgender and gender diverse population: An overview of treatment modality, monitoring, and risks. Neurourol Urodynamics. 42 (5), 903-920 (2023).
  23. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  24. Hickman, D. L. Minimal exposure times for irreversible euthanasia with carbon dioxide in mice and rats. J Am Assoc Laboratory Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  25. Vdoviaková, K., et al. Importance rat liver morphology and vasculature in surgical research. Med Sci Monit. 22, 4716(2016).
  26. Fiette, L., Slaoui, M. Necropsy and sampling procedures in rodents. Methods Mol Biol. 691, 39-67 (2011).
  27. Shackelford, C., Long, G., Wolf, J., Okerberg, C., Herbert, R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicol Pathol. 30 (1), 93-96 (2002).
  28. Tassinari, R., et al. short-term exposure to titanium dioxide nanoparticles in Sprague-Dawley rat: focus on reproductive and endocrine systems and spleen. Nanotoxicology. 8 (6), 654-662 (2014).
  29. Fortune, J. The early stages of follicular development: activation of primordial follicles and growth of preantral follicles. Animal Reprod Sci. 78 (3-4), 135-163 (2003).
  30. Maranghi, F., et al. Effects of the food contaminant semicarbazide following oral administration in juvenile Sprague-Dawley rats. Food Chem Toxicol. 47 (2), 472-479 (2009).
  31. Rasinger, J., et al. Low dose exposure to HBCD, CB-153 or TCDD induces histopathological and hormonal effects and changes in brain protein and gene expression in juvenile female BALB/c mice. Reprod Toxicol. 80, 105-116 (2018).
  32. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29 (9), e45(2001).
  33. Tammaro, A., et al. Risk assessment of transgender people: implementation of a demasculinizing–feminizing rodent model including the evaluation of thyroid homeostasis. Biology Direct. 19 (1), 5(2024).
  34. Falvo, R. E., Kaltenbach, C. C., Pancoe, W. L. Determination of testosterone concentration in the plasma of normal and androgen-sterilized female rats, using a competitive protein binding technique. Neuroendocrinology. 10 (4), 229-234 (1972).
  35. Gibbs, R. B. Testosterone and estradiol produce different effects on cognitive performance in male rats. Horm Behav. 48 (3), 268-277 (2005).
  36. Ström, J. O., Theodorsson, A., Ingberg, E., Isaksson, I. M., Theodorsson, E. Ovariectomy and 17β-estradiol replacement in rats and mice: a visual demonstration. J Vis Exp. (64), e4013(2012).
  37. Cooke, P. S., Nanjappa, M. K., Ko, C., Prins, G. S., Hess, R. A. Estrogens in male physiology. Physiol Rev. 97 (3), 995-1043 (2017).
  38. Raja, N. S., Rubin, E. S., Moravek, M. B. A Review of animal models investigating the reproductive effects of gender-affirming hormone therapy. J Clin Med. 13 (4), 1183(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Genderbevestigende hormoontherapietransgendergezondheidtoediening van testosteronestradiolcyproteronacetaatsekse specifieke biomarkersvatbaarheid voor omgevingschemische stoffenhistopathologische analysespermacountschildklier
Oprichting van rattenmodellen die genderbevestigende hormoontherapieën nabootsen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.