Methodenartikel

Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67477

⸱

18 april 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie schetst een raamwerk voor het ontwikkelen van een geaggregeerde polymicrobiële biofilmmodel en het optimaliseren van een RNA-extractieprotocol om de Pseudomonas aeruginosa genexpressie te beoordelen die representatief is voor de longomgeving bij cystische fibrose. Toepassingen omvatten het evalueren van antimicrobiële effecten en het bestuderen van alternatieve antibiotica onder omstandigheden die relevant zijn voor cystische fibrose.

Samenvatting

Standaard pre-klinische testmethoden voor nieuwe antimicrobiële therapieën die worden gebruikt om chronische longinfecties bij mensen met cystische fibrose te behandelen, weerspiegelen niet de omgevingscondities van de vijandige longniche. Huidige reductionistische testcondities kunnen ertoe leiden dat verbindingen een preklinische pijplijn doorlopen zonder bewijs van hun activiteit onder voor cystische fibrose geschikte longniche-condities. Verschillende benaderingen die worden gebruikt om traditionele antibiotica te bestuderen, zijn mogelijk niet geschikt voor antibioticumalternatieven, inclusief anti-virulentie therapieën zoals anti-quorum sensing agentia en siderofoorremmers. Dit protocol documenteert een aggregaat biofilmmodel van Pseudomonas aeruginosa om resistentie en infectie-relevante genexpressie te vergelijken in eencellig en meercellig kweekmedium (Staphylococcus aureus en Candida albicans), waarbij kolonievormende eenheden (CFU) reducties en veranderingen in genexpressie worden onderzocht, met algD als voorbeeld. Het model werd geoptimaliseerd voor kleine, statische volumes van bacteriële culturen om de studie van nieuwe verbindingen in de ontdekkingsfase van de geneesmiddelontwikkelingspipeline mogelijk te maken, waarbij de hoeveelheden verbindingen mogelijk beperkt zijn. Enkele P. aeruginosa biofilms werden gevormd in Synthetisch Cystic Fibrosis Medium 2 (SCFM2) gedurende 24 uur voordat ze werden behandeld met meropenem in verschillende concentraties (1, 16 en 256 µg/mL) voor een verdere 24 uur. Polymicrobiële biofilms werden gevormd door Staphylococcus aureus en Candida albicans samen te laten groeien in SCFM2, vervolgens te inoculeren met P. aeruginosa voor een extra 24 uur en te behandelen met meropenem. Het ontbreken van een directe verbinding tussen de maten van verbindingseffectiviteit in pre-klinische testen en klinische trialresultaten heeft twijfel gewekt over de toepasbaarheid van huidige laboratoriumscreeningstools. Dit model stelt ons in staat om de impact van relevante factoren op P. aeruginosa genexpressie te begrijpen, inclusief genen die bijdragen aan resistentie en virulentie, waardoor deze kloof wordt overbrugd.

Inleiding

Cystische fibrose (CF) is de meest voorkomende autosomaal recessieve aandoening binnen blanke populaties1. Mutaties in het Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR)-gen resulteren in een reeks klinische symptomen, waaronder de overproductie van slijm in de luchtwegen. Verminderde ionentransport resulteert in dat dit slijm uitgedroogd raakt, waardoor het niet adequaat wordt opgeruimd door het mucociliair systeem, waardoor de gevoeligheid voor chronische longinfecties toeneemt1. De microbiologie van de CF-long bestaat uit een specifieke groep opportunistische pathogenen, waarbij Haemophilus influenzae en Staphylococcus aureus worden beschouwd als primaire organismen die de longen infecteren van baby's en kinderen met CF, gevolgd door een afname van deze organismen en daaropvolgende kolonisatie met Burkholderia spp., of Pseudomonas aeruginosa tijdens de volwassenheid1,2,3,4. Naast bacteriesoorten zijn schimmelmicro-organismen ook gebruikelijk in de CF-longomgeving, waarbij Candida spp en Aspergillus spp behoren tot de meest geïsoleerde schimmelsoorten3,4,5. Hoewel deze organismen een belangrijke rol spelen in CF-longinfecties, hebben ontwikkelingen in kweektechnieken en kweek-onafhankelijke methoden aangetoond dat CF-longinfecties zelden beperkt zijn tot een enkele bacteriesoort, waardoor de complexe, polymicrobiële aard van de CF-long wordt benadrukt1,6.

Ondanks deze kennis, ontbreekt het huidige in vitro en in vivo methoden voor de ontwikkeling en het testen van antibiotica voor gebruik bij chronische longinfecties aan volledige gelijkenis met de CF-longniche7, met de nadruk op het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) van het medicijn tegen monosoort-culturen. Dit biedt beperkte overweging van het infectieuze micro-omgeving, wat een belangrijk onderdeel is van de CF-longpathologie8. Als zodanig omvatten methoden doorgaans de groei van bacteriën als planktonische culturen, een groeistaat die waarschijnlijk niet die van bacteriën in de CF-long weerspiegelt. Dit is vooral belangrijk voor P. aeruginosa, die zich meestal presenteert als biofilmaggregaten die vaak extra andere bacteriële en schimmelsoorten bevatten9. Dergelijke factoren vormen uitdagingen bij het testen van antibiotica voor chronische longinfecties en benadrukken een discrepantie tussen methoden voor antischimmeltesten en antimicrobiële activiteit binnen de CF-longomgeving9,10. Deze uitdagingen worden verergerd bij het screenen op alternatieve antibiotica, zoals anti-virulentie therapieën, waarbij MIC-assays geen indicator van activiteit zijn en geen inzicht geven in gastheer-pathogeen-interacties11.

Alginaat, een extracellulair polysacharide, is een belangrijk onderdeel van P. aeruginosa biofilms binnen de longniche en verhoogt de bacteriële tolerantie voor antibiotica en immuunagentia, evenals het verbeteren van oppervlakteadhesie12. Alginaat is een aantrekkelijk doelwit voor de ontwikkeling van anti-virulentie therapie, en verschillende therapieën die zich richten op alginaatbiosynthese zijn ontwikkeld, zoals die welke zich richten op algD, een belangrijk gen in alginaatbiosynthese13,14. Dergelijke therapieën kunnen worden gebruikt in combinatie met antibioticatherapieën bij mensen met CF om P. aeruginosa biofilms te verstoren, waardoor bacteriën in een planktonische toestand worden getransformeerd. Dit verhoogt de antibiotica-effectiviteit, aangezien verstoring van de extracellulaire matrix van de biofilm een verhoogde mogelijkheid geeft voor het antibioticum om het bacteriële doelwit te bereiken15. Echter, ondanks bewijs van in vitro activiteit, blijft de actie van deze therapieën binnen de CF-longniche onduidelijk.

Het aggregaatbiofilmmodel dat hier wordt gepresenteerd, tracht deze problemen aan te pakken door de toevoeging van S. aureus en C. albicans, die veelvuldig co-kolonisatoren zijn met P. aeruginosa binnen de CF-long. Het stelt P. aeruginosa ook in staat om te groeien in biofilmaggregaten, zoals gezien in de respiratoire omgeving. Het gebruik van het sputum-imiterende media Synthetische Cystische Fibrose Media 2 (SCFM2) als voedingsomgeving voor groei, staat de toevoeging toe van gastheerinvloeden, waaronder mucine, extracellulair (e)DNA, en een aminozuurprofiel dat dat weergeven dat gezien wordt binnen de CF-long16.

Om de omstandigheden van de CF-long verder te vangen, worden biofilms blootgesteld aan meropenem, een antibioticum dat vaak wordt voorgeschreven aan mensen met CF tijdens perioden van pulmonaire exacerbatie. Het gebruik van een antibioticum binnen dit model wordt aanbevolen als een middel om de klinische omstandigheden te repliceren waarin een anti-virulentie-agens kan worden voorgeschreven, bijvoorbeeld als een combinatietherapie gekoppeld aan antibioticabehandeling om respiratoire symptomen tijdens exacerbatie te behandelen. Verder, de opname van meropenem staat de beoordeling toe van de P. aeruginosa transcriptionele respons op antibioticumblootstelling onder infectie-relevante omstandigheden. Dit model zou kunnen worden gebruikt om informatie te verstrekken over welke factoren geschikte doelwitten voor medicijnen zouden zijn binnen de CF-long. Het model zou ook kunnen worden gewijzigd om andere relevante antibiotica op te nemen, zoals tobramycine, en om de expressie van andere genen van belang te beoordelen.

Protocol

1. Bereiding van monospecifieke biofilms

  1. Herstel P. aeruginosa PAO1 van bevroren kralenvoorraadculturen door een enkele kraal uit te strekken op Lysogeny Broth (LB) agar en 24 uur bij 37 °C te incuberen.
  2. Bereid overnachtsculturen van PAO1 voor door een enkele kolonie van de streekkolonie te nemen en deze toe te voegen aan 5 mL LB-medium. Overnacht (18 uur) incuberen en vervolgens verdunnen tot OD600 van 0,05 (gelijk aan 1 x 108 CFU/mL), en verder verdunnen 1:100 in SCFM2 bereid volgens Palmer, et al.16.
  3. Voeg 180 µL van het inoculum toe aan putjes van een 96-well microtiterplaat met ronde bodem. Bereid biofilms in biologische triplicate voor enumeratie door kolonievormende eenheden (CFUs). Een totaal van 3 replica's per biologische replica wordt alleen uitgevoerd voor qPCR. Voeg aan 3 afzonderlijke putjes 180 µL steriel SCFM2 toe om te worden gebruikt voor de mediacontroles.
    OPMERKING: Ronde bodemplaten werden geselecteerd in plaats van traditionele vlakbodemplaten vanwege hun superioriteit in het mogelijk maken van homogene blootstelling van de volledige biofilm aan de omringende groeimedia17.
  4. Laat de biofilms gedurende 24 uur vormen, incuberen bij 37 °C en schudden bij 75 rpm.

2. Bereiding van multispecifieke biofilms

  1. Herstel P. aeruginosa PAO1 en S. aureus SH1000 van bevroren kralenvoorraadculturen zoals hierboven beschreven. Herstel C. albicans CAF2.1 van bevroren kralenvoorraadculturen door een enkele kraal uit te strekken op Sabouraud dextrose agar en 24 uur bij 37 °C te incuberen.
  2. Bereid overnachtsculturen van SH1000 en CAF2.1 voor door een enkele kolonie van de streekkolonie te nemen en 5 mL LB toe te voegen (aparte overnachtsculturen voor elk organisme). 18 uur overnacht incuberen. Standaardiseren van overnachtsculturen van S. aureus SH1000 en C. albicans CAF2.1 in LB tot OD600 waarden van 0,1, wat gelijk is aan 1 x 109 en 1,2 x 107 CFU/mL, respectievelijk17,18.
  3. Verdun de S. aureus en C. albicans om een enkel inoculum te vormen dat beide soorten bevat in concentraties van 1 x 106 en 1 x 105 CFU/mL, respectievelijk, in SCFM2.
  4. Voeg 162 µL van het inoculum toe aan putjes van een 96-well microtiterplaat. Inoculeer biofilms in biologische triplicate voor enumeratie door kolonievormende eenheden (CFUs). Een totaal van 3 replica's per biologische replica wordt alleen uitgevoerd voor qPCR. Voeg aan 3 afzonderlijke putjes 180 µL steriel SCFM2 toe om te worden gebruikt voor de mediacontroles.
  5. Laat de biofilms gedurende 24 uur vormen, incuberen bij 37 °C en schudden bij 75 rpm.
  6. Bereid een overnachtscultuur van PAO1 voor door een enkele kolonie van de streekkolonie te nemen en deze toe te voegen aan 5 mL LB-medium. Overnacht (18 uur) incuberen, vervolgens toevoegen bij OD600 van 0,05 (gelijk aan 1 x 108 CFU/mL), en verder verdunnen tot 1 x 105 CFU/mL in SCFM2.
  7. Voeg 14,2 µL van het PAO1-inoculum toe aan putjes van de 96-well microtiterplaat, resulterend in het uiteindelijke inoculum van de PAO1 van 1 x 104 CFU/mL.
    OPMERKING: Deze variatie in de concentratie van het inoculaat tussen de verschillende soorten is om ervoor te zorgen dat de S. aureus en C. albicans niet worden overtroffen door de P. aeruginosa en dat ze allemaal herstelbaar zijn door spotplaten van de 24 uurs biofilm waar geen antibiotica aanwezig zijn.
  8. Laat de polymicrobiële biofilms gedurende 24 uur vormen, incuberen bij 37 °C en schudden bij 75 rpm.

3. DNase en antibioticabehandeling van monospecifieke en multispecifieke biofilms

  1. Voeg 2 µL DNase I rechtstreeks toe aan de putjes met de biofilms op een uiteindelijke concentratie van 50 µg/mL, incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C en schud bij 75 rpm.
    OPMERKING: Dit wordt toegevoegd om de viskeuze biofilms dunner te maken om betere penetratie van antimicrobiële middelen mogelijk te maken, wat de dosering van rhDNase (recombinant human DNase) weerspiegelt die door veel mensen met cystische fibrose wordt ingenomen als een behandelingsstrategie voor pulmonaire exacerbaties.
  2. Bereid een antibioticumvoorraad van meropenem tot 2,56 mg/mL, met gebruikmaking van gedistilleerd water als verdunningsmiddel. Verdun stap voor stap met een factor 2 om concentraties van 0,01 mg/mL - 2,56 mg/mL te bereiken.
  3. Voeg 20 µL van elke meropenem-verdunning toe aan de biofilms om een doseringsbereik van 1 µg/mL - 256 µg/mL te bereiken. Voeg 20 µL gedistilleerd water toe aan negatieve controlebiofilms in plaats van het antibioticum.

Resultaten

De resultaten getoond in Figuur 1A benadrukken de veerkracht van de enkelsoortige Pseudomonas-biofilms bij behandeling met meropenem, aangezien er bij geen enkele geteste dosis een significante afname werd waargenomen. De negatieve controle, die niet werd blootgesteld aan meropenem, vertoonde een herstel van 8,31 ± 0,07 Log10CFU/mL, terwijl de grootste reductie van levensvatbare cellen optrad bij 16 µg/mL, wat resulteerde in een herstel van 8,06 ± 0,10 Log10CFU/mL. Dit niveau van resistentie is echter verwacht, aangezien in de literatuur wordt aangetoond dat P. aeruginosa-biofilms veel resistenter zijn tegen meropenem dan hun planktonische tegenhangers, waarbij een concentratie van >256 µg/mL vereist is om bactericide te werken tegen de biofilms25,26, vergeleken met de planktonische cellen, die een MIC van 2 µg/mL hebben.

Figuur 1B toont de gemiddelde procentuele afname van de metabole activiteit van de monocultuur P. aeruginosa-biofilms bij elke antibioticaconcentratie vergeleken met de controlebiofilm, die niet was blootgesteld aan meropenem. Een afname in fluorescentie vertaalt zich naar minder metabole activiteit, wat wordt beschouwd als een maatstaf voor een afname in levensvatbare cellen. Met meropenem behandelde culturen vertoonden een toegenomen metabole activiteit (aangegeven door een negatieve procentuele afname), wat wijst op geen (of zeer beperkte) bactericide activiteit.

De verhoogde metabole activiteit zonder toename in de CFU-terugwinning kan wijzen op de metabole respons van de bacteriën op blootstelling aan antibiotica. Tussen de enkelsoortige en meersoortige biofilms (Figuur 2) verschilde de totale groei van P. aeruginosa slechts gering; de terugwinning van levensvatbare cellen uit de enkelsoortige biofilm was 0,74 ± 0,17 Log10CFU/mL hoger dan waargenomen in de polymicrobiële biofilm in afwezigheid van antibiotica. S. aureus werd teruggewonnen uit de polymicrobiële biofilm bij 6,95 ± 0,11 Log10CFU/mL, en C. albicans werd teruggewonnen bij 1,66 ± 2,88 Log10CFU/mL. C. albicans is echter alleen aanwezig waar geen meropenem is toegevoegd en werd niet teruggewonnen uit biofilms waarin het antibioticum was toegediend. Aangezien meropenem geen direct effect heeft op Candida — wat is aangetoond in eerdere MIC-assays die in het laboratorium zijn uitgevoerd op C. albicans-monoculturen waarbij de MIC-waarde van meropenem >256 µg/mL was — is het waarschijnlijk dat de bacteriële stressrespons van de andere cohabiterende soorten, S. aureus en P. aeruginosa, op de antibioticablootstelling leidt tot vijandige omstandigheden voor de schimmel.

Aangezien P. aeruginosa biofilms, zowel in monocultuur als met co-koloniserende pathogenen, geen afname vertonen in het herstel van levensvatbare cellen bij meropenem-concentraties tot 256 µg/mL, benadrukt dit de noodzaak van alternatieve therapeutische middelen, zoals anti-virulentietherapieën, om dergelijke chronische infecties in de kliniek te bestrijden, die in combinatie met antimicrobiële middelen kunnen werken om de bacteriële belasting effectief te verminderen.

algD expressie in P. aeruginosa PAO1 enkelsoortige biofilms
De expressie van algD in P. aeruginosa PAO1 die was blootgesteld aan verschillende concentraties meropenem (1, 16 en 256 µg/mL) en gegroeid in SCFM2, werd beoordeeld met behulp van SYBR-Green RT-qPCR. De expressie werd vervolgens geanalyseerd met de 2-ΔΔCt-methode, waarbij 16S als controlegen werd gebruikt (Figuur 3). De expressie van algD verschilde niet significant tussen de gebruikte concentraties meropenem, wat suggereert dat wanneer PAO1 als een enkelsoortig biofilm groeit, de algD -expressie niet sterk wordt beïnvloed door de aanwezigheid van meropenem.

algD expressie in P. aeruginosa PAO1 multi-species biofilms
De expressie van algD werd ook beoordeeld in P. aeruginosa PAO1 gekweekt in biofilms bestaande uit S. aureus SH100 en C. albicans CAF2.1 om te beoordelen of de aanwezigheid van co-koloniserende organismen de expressie van beïnvloedde algD of de respons op meropenem in PAO1. Geen significante verschillen in algD expressie werd waargenomen tussen 0-16 µg/mL blootstelling aan meropenem. Echter, bij 256 µg/mL, de expressie van algD was significant hoger in vergelijking met de andere antibioticaconcentraties (0 µg/mL tegenover 256 µg/mLp = 0.0075, 1 µg/mL tegenover 256 µg/mL p = 0,035, 16 µg/mL tegenover 256 µg/mL p = 0,0048) ongeveer 7 keer hoger dan bij de controleconditie (Figuur 4). Dit benadrukt dat, wanneer ze worden gekweekt in de aanwezigheid van S. aureus en C. albicans, er is sprake van een verhoogde expressie van algD bij de hoogste concentratie meropenem, in vergelijking met wanneer P. aeruginosa wordt alleen gekweekt, wat wijst op een toename van de alginaatproductie in een polymicrobiële setting. Ondanks het aantonen van verschillen in algD expressie tussen de enkel- en multispeciesbiofilms, is het onduidelijk of deze toename in expressie wordt gedreven door de aanwezigheid van een specifieke soort (S. aureus of C. albicans) of dat interacties waarbij beide micro-organismen betrokken zijn deze verandering in genexpressie aansturen.

Deze resultaten benadrukken het belang van het begrijpen van de impact van therapeutica en de omgeving op genexpressie, met name in de context van toekomstige tests van therapeutica die zich richten op virulentie.

Staafdiagrammen van bacteriële groeiremming voor P. aeruginosa, S. aureus en C. albicans t.o.v. de concentratie.
Figuur 1: Biofilms van enkelvoudige soorten bestaande uit Pseudomonas aeruginosa PAO1. De biofilms werden 24 h gekweekt in SCFM2, gedurende 1 h behandeld met 50 µg/mL DNase I en vervolgens 24 h behandeld met meropenem in verschillende concentraties. (A) Gemiddelde Log10CFU/mL. De stippellijn geeft een 2-log reductie aan (equivalent aan 99 % reductie) in het herstel van P. aeruginosa ten opzichte van de negatieve controle. (B) Percentage reductie in relatieve fluorescentie-eenheden. De stippellijn geeft een reductie van 50% in fluorescentie aan, waarbij het eerste punt daarboven wordt beschouwd als de MIC50-waarde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Grafieken van meropenemconcentratie versus bacteriële groei (A) en fluorescentiereductie (B).
Figuur 2: Multi-species biofilms bestaande uit Pseudomonas aeruginosa PAO1, Staphylococcus aureus SH1000 en Candida albicans CAF2.1. De biofilms werden 24 u gekweekt in SCFM2, gedurende 1 u behandeld met 50 µg/mL DNase I en vervolgens gedurende nog eens 24 u behandeld met meropenem in verschillende concentraties. De stippellijn geeft een 2-log reductie aan (equivalent aan 99 % reductie) in de terugwinning van P. aeruginosa ten opzichte van de negatieve controle. Significantie is bepaald via twee-weg ANOVA waarbij **** p < 0.0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram van relatieve expressie versus concentratie (µg/ml), met resultaat van statistische analyse (ns).
Figuur 3: Expressie van algD geëxtraheerd uit een enkele soort bestaande uit P. aeruginosa PAO1. De biofilms werden gedurende 24 u gekweekt in SCFM2, behandeld met 50 µg/mL DNase I gedurende 1 u, en blootgesteld aan variërende concentraties meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL). Genexpressie werd geanalyseerd met de 2-ΔΔCt methode. Het housekeeping-gen 16S werd in de analyse gebruikt. Significantie werd bepaald met Tukey's multiple comparison test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram van relatieve expressie versus concentratie; statistische significantie; genexpressieanalyse.
Figuur 4: Expressie van algD geëxtraheerd uit multi-species biofilms bestaande uit P. aeruginosa PAO1, S. aureus SH1000 en C. albicans CAF2.1. De biofilms werden gekweekt in SCFM2, behandeld met 50 µg/mL DNase I gedurende 1 h, en vervolgens behandeld met meropenem in verschillende concentraties (0, 1, 16, 256 µg/mL) gedurende een verdere 24 h. De genexpressie werd geanalyseerd met de 2-ΔΔCt methode. Het housekeeping-gen 16S werd in de analyse gebruikt. **p < 0,01 zoals bepaald met de multiple comparison test van Tukey. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Volume per cDNA-reactie (μL)
5X iScript-reactiemix4
iScript Reverse Transcriptase1
DNase/RNase-vrij water14
2,5 ng RNA1
Totaal reactievolume 20

Tabel 1: Werkoplossingen van de cDNA master mix. Componenten en volumes vereist per cDNA-reactie.

GenForward-primerReverse primer
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

Tabel 2: algD en 16S forward en reverse qPCR-primers.

Volume per reactie (µL)algD werkvolume (µL)16S werkvolume (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
Voorwaartse primer1444
Reverse-primer1444
DNase/RNase-vrij water626424
Totaal 1879272

Tabel 3: Werkoplossingen van de qPCR-mastermix. Componenten en volumes die nodig zijn voor de algD en 16S qPCR-mastermixoplossingen.

Aanvullende Figuur 1: Multi-species biofilms bestaande uit Pseudomonas aeruginosa LESB58, Staphylococcus aureus SH1000 en Candida albicans CAF2.1. De biofilms werden 24 u (n = 3) gekweekt in SCFM2, 1 u behandeld met 50 µg/mL DNase I, en vervolgens nogmaals 24 u behandeld met meropenem in verschillende concentraties. De stippellijn geeft een 2-log reductie aan (gelijkend aan een reductie van 99%) in het herstel van P. aeruginsoa ten opzichte van de negatieve controle. De statistische analyse werd uitgevoerd via two-way ANOVA. *p=0,0242, ** p=0,0013, **** p <0,0001. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Discussie

Deze resultaten laten zien dat ondanks het frequente gebruik van meropenem bij het behandelen van pulmonaire exacerbaties bij mensen met CF, dit niet significant van invloed was op de groei van P. aeruginosa in het biofilmmodel met één soort of meerdere soorten. Een lichte toename in de herstel van P. aeruginosa werd waargenomen in beide modellen na behandeling met 128 µg/mL en 256 µg/mL meropenem, zoals ook werd gezien voor S. aureus in het biofilm met meerdere soorten; deze toenames waren echter niet significant. De afname van C. albicans bij blootstelling aan meropenem kan te wijten zijn aan vijandige omstandigheden voor de schimmel die door de bacteriën worden gecreëerd als reactie op de stress van het antimicrobiële middel. Er werden geen significante verschillen waargenomen in de algD expressie tussen de meropenemconcentraties toen P. aeruginosa werd gekweekt als een biofilm met één soort. De algD expressie was echter significant hoger in biofilms met meerdere soorten wanneer behandeld met 256 µg/mL meropenem, wat suggereert dat de productie van alginaat mogelijk onder deze omstandigheden toeneemt. De verschillen in de algD expressie die werden waargenomen tussen biofilmsamenstellingen en meropenemconcentraties laten zien hoe de aanwezigheid van relevante factoren de expressie van infectierelevante genen kan beïnvloeden en benadrukt de belangrijkheid van het overwegen van het gebruik van antimicrobiële middelen en de status van polymicrobiële infecties bij het ontwikkelen en testen van alternatieve antibiotica.

Ondanks de bruikbaarheid van de modellen, zijn er verschillende overwegingen om een succesvolle toepassing te garanderen. De vestiging van S. aureus en C. albicans binnen de biofilms is essentieel vóór infectie met P. aeruginosa, vanwege de risico's dat S. aureus en C. albicans worden overtroffen door de Gram-negatieve bacteriën. In dit biofilmmodel lijkt C. albicans een slechte partner te zijn vanwege de significant lagere overlevingssnelheid in vergelijking met S. aureus en P. aeruginosa, zelfs in afwezigheid van antibiotica. Dit suggereert dat de gist ofwel om resources wordt beconcurreerd ofwel negatief wordt beïnvloed door interacties tussen soorten binnen het biofilm27,28. De afwezigheid van C. albicans in aanwezigheid van meropenem, ondanks het feit dat het antibioticum geen directe antischimmelwerking heeft, ondersteunt het idee dat de stressrespons van S. aureus op meropenem een omgeving kan creëren die ongastvrij is voor C. albicans29,30. Het is echter belangrijk op te merken dat de keuze van de stam een effect kan hebben op de hoeveelheid C. albicans die kan worden teruggevonden uit het polymicrobiële biofilmmodel. Er worden verschillende trends waargenomen bij het gebruik van P. aeruginosa LESB58 in plaats van PAO1 (Aanvullende Figuur 1). Met LESB58 is C. albicans herstelbaar bij alle concentraties van meropenem en vertoont het zelfs een lichte toename naarmate de concentratie P. aeruginosa daalt als gevolg van het antimicrobiële middel, waardoor de gemeenschapssamenstelling kan veranderen. Ondanks deze verschillen wordt PAO1 in dit model gebruikt omdat het een laboratoriumreferentiestam is, die een consistente en goed gekarakteriseerde baseline biedt voor vergelijkende studies. Deze consistentie is cruciaal voor reproduceerbaarheid en voor het trekken van betrouwbare conclusies over de interacties binnen het biofilm.

Het kan een uitdaging zijn om grote hoeveelheden RNA te extraheren uit bacteriën die zijn gekweekt in SCFM2, vanwege de stroperige aard van het medium. Daarom is de vernietiging van het biofilm met naalden van 0,2 mm vóór RNA-extractie een belangrijke stap om de RNA-opbrengst te verhogen en te garanderen dat voldoende concentraties (≥10 ng/µL) worden geëxtraheerd voor RT-qPCR. RNA is zeer vatbaar voor degradatie31, daarom moet na extractie worden gezorgd dat alle downstream-activiteiten die RNA gebruiken, op ijs worden uitgevoerd. Regelmatig bevriezen en ontdooien van RNA, cDNA en qPCR-primers kan de kans op productdegradatie vergroten. Daarom moet dit zoveel mogelijk worden beperkt. Een andere veelvoorkomende uitdaging bij de toepassing van deze modellen is het risico op besmetting tijdens de RNA-extractie of qPCR-assay. Dit risico kan worden geminimaliseerd door apparatuur te besproeien met DNA-degradatieoplossing vóór RNA-extractie en door gedurende de hele procedure DNase/RNase-vrije pipettenpunten te gebruiken. Regelmatige vervanging van DNase/RNase-vrij water zal ook helpen het risico op besmetting binnen de qPCR-assay te verminderen.

Dit protocol koos om zich te concentreren op algD als gen van belang vanwege zijn noodzakelijkheid in de productie van alginaat, dat wordt beschreven als een belangrijk virulentiefactor van P. aeruginosa tijdens zowel acute als chronische infecties32. Alginaat wordt daarom steeds meer bestudeerd als doelwit voor anti-virulentie therapieën33,34. Hoewel dit model is gebruikt om de expressie van algD te beoordelen, kan het worden toegepast om de expressie van andere genen van P. aeruginosa te beoordelen voor verschillende doelen voor anti-virulentie geneesmiddelen. Meropenem werd in dit onderzoek gebruikt vanwege bewijs dat het antibioticum de expressie van genen voor alginaatbiosynthese beïnvloedt, vooral wanneer P. aeruginosa wordt gekweekt in de aanwezigheid van C. albicans35. Bovendien wordt meropenem vaak klinisch voorgeschreven om

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

HL, DN en JF ontvingen subsidieondersteuning voor het Strategic Research Centre (SRC) Een op bewijzen gebaseerd preklinisch kader voor de ontwikkeling van antimicrobiële therapieën bij cystische fibrose (PIPE-CF; Projectnr. SRC 022) van de UK Cystic Fibrosis Trust en de US Cystic Fibrosis Foundation. TH wordt ondersteund door een MRC Discovery Medicine North Doctoral Training Partnership PhD-beurs. We danken de CF Trust en CF Foundation (SRC022) en het MRC DiMEN DTP-schema voor de financiering

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Breathe-easy sealing membrane for multiwell plates Sigma Aldrich Z763624
Bunsen-brander
Cellulase (100 mg/mL)Cambridge Bioscience HY-B2220-5g
CN-supplement Sigma Aldrich 1.07624
Direct-zol RNA Miniprep kitZymo ResearchR2050
Dnase I Thermo Fisher ScientificEN0521
DNase/Rnase-vrij waterVWRJ60610.XC
Gentamicinesulfaat (30 µg/mL)Sigma Aldrich G3632
Glycerol (1 %)Thermo Fisher Scientific15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6101
iScript Cdna Synthese Kit Bio-Rad1708890
Penicilline (250 U/mL)Scientfic Laboratory SuppliesP3032-10MU
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Assay Kit Thermo Fisher ScientificQ10210
Qubit buizenThermo Fisher ScientificQ32856
Resazurin-oplossing (0,02 %)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Streptomycine (250 µg/mL)Sigma Aldrich S9137
Thermische cycler (we gebruikten de T100 Thermal Cycler)Biorad1861096
TRIzol Reagent Invitrogen15596026
Vancomycine (3 µg/mL)Sigma Aldrich 1709007

Referenties

  1. Blanchard, A. C., Waters, V. J. Opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis: Epidemiology and pathogenesis of lung infection. J Pediatric Infect Dis Societ. 11 (Supplement_2), S3-S12 (2022).
  2. Kordes, A., et al. Genetically diverse Pseudomonas aeruginosa populations display similar transcriptomic profiles in a cystic fibrosis explanted lung. Nat Comm. 10 (1), 3397(2019).
  3. Chotirmall, S. H., Greene, C. M., McElvaney, N. G. Candida species in cystic fibrosis: A road less travelled. Med Mycol. 48 (Supplement_1), S114-S124 (2010).
  4. Françoise, A., Héry-Arnaud, G. The microbiome in Cystic fibrosis pulmonary disease. Genes (Basel). 11 (5), 536(2020).
  5. Haiko, J., Saeedi, B., Bagger, G., Karpati, F., Özenci, V. Coexistence of Candida species and bacteria in patients with cystic fibrosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 38 (6), 1071-1077 (2019).
  6. Filkins, L. M., O’Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS pathogens. 11 (12), e1005258(2015).
  7. Barton, T. E., Frost, F., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Challenges and opportunities in the development of novel antimicrobial therapeutics for cystic fibrosis. J Med Microbiol. 71 (12), (2022).
  8. Akkerman-Nijland, A. M., et al. The pharmacokinetics of antibiotics in cystic fibrosis. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 17 (1), 53-68 (2021).
  9. Lindgren, N. R., McDaniel, M. S., Novak, L., Swords, W. E. Acute polymicrobial airway infections: analysis in cystic fibrosis mice. Microbiology (Reading). 169 (1), 001290(2023).
  10. Hurley, M. N., Ariff, A. H. A., Bertenshaw, C., Bhatt, J., Smyth, A. R. Results of antibiotic susceptibility testing do not influence clinical outcome in children with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (4), 288-292 (2012).
  11. Totsika, M. Benefits and challenges of antivirulence antimicrobials at the dawn of the post-antibiotic era. Curr Med Chem. 6 (1), 30-37 (2016).
  12. Davarzani, F., et al. Evaluation of antibiotic resistance pattern, alginate and biofilm production in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Iran J Public Health. 50 (2), 341-349 (2021).
  13. Ambutsi, M., Okoth, P. Comparative genomic analysis of gene clusters of Pseudomonas aeruginosa that define specific biofilm formation in deciphering target regions for novel treatment options. Sci African. 13, e00910(2021).
  14. Dai, J., Luo, W., Hu, F., Li, S. In vitro inhibition of Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm formation by DZ2002 through regulation of extracellular DNA and alginate production. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1333773(2024).
  15. Olson, M. E., Ceri, H., Morck, D. W., Buret, A. G., Read, R. R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 66 (2), 86-92 (2002).
  16. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. J Bacteriol. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  17. Pascoe, B., et al. Dormant cells of Staphylococcus aureus are resuscitated by spent culture supernatant. PLoS One. 9 (2), e85998(2014).
  18. Caldeira, J., Almeida, G., Macedo, A. L., Silva, J. P. M., Albergaria, H. Saccharomycin, a biocide from S. cerevisiae that kill-off other yeasts. Ann Med. 51 (Suppl 1), 94-95 (2019).
  19. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing biofilm dispersal in murine wounds. J Vis Exp. (174), e62136(2021).
  20. Zhang, J., et al. Cellulase promotes mycobacterial biofilm dispersal in response to a decrease in the bacterial metabolite gamma-aminobutyric acid. Int J Mol Sci. 25 (2), 1051(2024).
  21. Kamali, E., Jamali, A., Izanloo, A., Ardebili, A. In vitro activities of cellulase and ceftazidime, alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa biofilms. BMC Microbiol. 21 (1), 347(2021).
  22. Cao, P., et al. A Pseudomonas aeruginosa small RNA regulates chronic and acute infection. Nature. 618 (7964), 358-364 (2023).
  23. Tremblay, J., Déziel, E. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa swarming motility. BMC Genom. 11 (1), 587(2010).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Aaron, S. D., et al. Single and combination antibiotic susceptibilities of planktonic, adherent, and biofilm-grown Pseudomonas aeruginosa isolates cultured from sputa of adults with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 40 (11), 4172-4179 (2002).
  26. Haagensen, J., et al. Spatiotemporal pharmacodynamics of meropenem- and tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Antimicrob Chemother. 72 (12), 3357-3365 (2017).
  27. Jing, Q., et al. Staphylococcus aureus wraps around Candida albicans and synergistically escapes from Neutrophil extracellular traps. Front Immunol. 15, 1422440(2024).
  28. Wu, Y. M., et al. Enhanced virulence of Candida albicans by Staphylococcus aureus: Evidence in clinical bloodstream infections and infected Zebrafish embryos. J Fungi. 7 (12), 1099(2021).
  29. Ruiz-Sorribas, A., Poilvache, H., Van Bambeke, F. Pharmacodynamics of Moxifloxacin, Meropenem, Caspofungin, and their combinations against in vitro polymicrobial interkingdom biofilms. Antimicro Agents Chemother. 66 (2), e02149-e02121 (2022).
  30. Pohl, C. H. Recent advances and opportunities in the study of Candida albicans polymicrobial biofilms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 836379(2022).
  31. Aburayyan, W. S. High-throughput RNA extraction method for P. aeruginosa and S. pyogenes biofilms. J Appl Pharma Sci. 13 (3), 97-105 (2023).
  32. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Mol Microbiol. 56 (2), 309-322 (2005).
  33. Kim, S. K., et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis by Ebselen oxide and its analogues. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1713-1726 (2021).
  34. Gao, F., et al. Protective effects of anti-alginate monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa infection of HeLa cells. Micro Pathogen. 145, 104240(2020).
  35. Alam, F., Blair, J. M. A., Hall, R. A. Transcriptional profiling of Pseudomonas aeruginosa mature single- and dual-species biofilms in response to meropenem. Microbiology (Reading). 169 (1), 001271(2023).
  36. Farrington, N., et al. Molecular pharmacodynamics of meropenem for nosocomial pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa. mBio. 15 (2), e03165-e03123 (2024).
  37. Meletis, G., Exindari, M., Vavatsi, N., Sofianou, D., Diza, E. Mechanisms responsible for the emergence of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Hippokratia. 16 (4), 303-307 (2012).
  38. O'Brien, T. J., Hassan, M. M., Harrison, F., Welch, M. An in vitro model for the cultivation of polymicrobial biofilms under continuous-flow conditions. F1000Res. 10, 801(2021).
  39. Guss, A. M., et al. Phylogenetic and metabolic diversity of bacteria associated with cystic fibrosis. ISME J. 5 (1), 20-29 (2011).
  40. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  41. Hibbert, T. M., Whiteley, M., Renshaw, S. A., Neill, D. R., Fothergill, J. L. Emerging strategies to target virulence in Pseudomonas aeruginosa respiratory infections. Crit Rev Microbiol. , 1-16 (2023).
  42. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  43. Ruhluel, D., O'Brien, S., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Development of liquid culture media mimicking the conditions of sinuses and lungs in cystic fibrosis and health. F1000Res. 11, 1007(2022).
  44. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Front Microbiol. 13, 955286(2022).
  45. Ledger, E. L., et al. Impact of CFTR modulation on Pseudomonas aeruginosa infection in people with Cystic Fibrosis. J Infect Dis. 230 (3), e536-e547 (2024).
  46. Armbruster, C. R., et al. Persistence and evolution of Pseudomonas aeruginosa following initiation of highly effective modulator therapy in cystic fibrosis. mBio. 15 (5), e00519-e00524 (2024).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Pseudomonas aeruginosapolymicrobiële biofilmantimicrobiële testsmeropenem-behandelingRNA-extractiecolony-forming unitsanti-virulentietherapieën
Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.