Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67479

⸱

7 februari 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

In dit artikel

Samenvatting

Hier stellen we een eenvoudig protocol voor dat metabole oligosacharide-engineering, klikchemie en expansiemicroscopie combineert en dat bioimaging van intracellulaire gesialyleerde N-glycoproteïnen met verbeterde resolutie mogelijk maakt met behulp van routinematige microscopieapparatuur.

Samenvatting

Metabole labeltechnieken maken de opname van bioorthogonale reporters in glycanen mogelijk, waardoor de gerichte bioconjugatie van moleculaire kleurstoffen in cellen mogelijk wordt door middel van klik en bioorthogonale chemie. Metabole oligosacharide-engineering (MOE) heeft veel belangstelling getrokken vanwege de essentiële rol van glycosylering in tal van biologische processen die moleculaire herkenning met zich meebrengen en de impact ervan op pathologieën, variërend van kanker tot genetische aandoeningen tot virale en bacteriële infecties.

Hoewel MOE beter bekend is voor de detectie van glycoconjugaten op het celoppervlak, is het ook een zeer belangrijke methodologie voor de studie van intracellulaire glycanen in fysiologische en pathologische contexten. Dergelijke studies hebben veel baat bij een hoge ruimtelijke resolutie. Superresolutiemicroscopie is echter niet direct beschikbaar in de meeste laboratoria en vormt een uitdaging voor de dagelijkse implementatie. Expansiemicroscopie is een recent alternatief dat de resolutie van microscopie verbetert door biologische monsters die zijn gelabeld met fluorescerende markers fysiek te vergroten. Door het monster in te bedden in een zwellende gel en het isotroop uit te zetten door middel van chemische behandeling, kunnen subcellulaire structuren met verbeterde precisie en resolutie worden gevisualiseerd zonder dat er superresolutietechnieken nodig zijn.

In dit werk illustreren we het vermogen van expansiemicroscopie om intracellulaire gesialyleerde glycanen te visualiseren door het gecombineerde gebruik van MOE en klikchemie. Concreet stellen we een procedure voor bioorthogonale labeling en expansiemicroscopie voor waarbij een reporter wordt ingezet die zich richt op sialylering, die kan worden geassocieerd met immunofluorescentie voor co-lokalisatiestudies. Dit protocol maakt lokalisatiestudies mogelijk van sialoconjugaatbiosynthese, intracellulair transport en recycling.

Inleiding

Fluorescentiemicroscopie, hoewel veel gebruikt voor het labelen en visualiseren van specifieke moleculen in cellen, wordt inherent beperkt in resolutie door Abbe's diffractielimiet van licht1, die het vermogen beperkt om onderscheid te maken tussen objecten dichterbij dan ongeveer 200-250 nm. Deze beperking komt voort uit de golfaard van het licht en de numerieke apertuur van de objectieflens van de microscoop, wat een uitdaging vormt bij het afbeelden van subcellulaire structuren. Het overwinnen van deze beperkingen zorgt voor een beter inzicht in bepaalde biologische processen op nanometrische schaal.

Om de diffractielimiet van licht te overschrijden, zijn superresolutiemicroscopietechnieken zoals STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) en STED (Stimulated Emission Depletion) ontwikkeld 2,3. STORM is gebaseerd op de stochastische activering van fluoroforen, waardoor op een bepaald moment slechts een schaarse subset kan worden afgebeeld. Dit maakt de nauwkeurige lokalisatie van individuele fluoroforen mogelijk, waardoor een beeld met een hoge resolutie kan worden gereconstrueerd. STED, aan de andere kant, verbetert de resolutie door een uitputtingslaser te gebruiken om de fluorescentie rond de omtrek van de excitatieplek selectief te doven, waardoor de puntspreidingsfunctie effectief wordt verkleind.

Deze benaderingen staan in contrast met breedveld- of confocale microscopie, waarbij alle fluoroforen tegelijkertijd worden gedetecteerd, wat resulteert in een beeld dat alle diffractiepatronen combineert en het onderscheid tussen nabijgelegen individuele fluoroforen voorkomt, wat leidt tot verlies van resolutie. Deze superresolutiemethoden vereisen echter zeer specifieke lichtbronnen, apparatuur, monstervoorbereiding en/of fluoroforen, waardoor deze technologieën kostbaar zijn, moeilijk toegankelijk in de meeste laboratoria en moeilijk te implementeren in routinematige experimenten. Deze beperkingen hebben ertoe geleid dat de wetenschappelijke gemeenschap op zoek is gegaan naar alternatieve oplossingen om een hogere resolutie te bereiken, die compatibel zouden zijn met direct beschikbare microscopieapparatuur en routinematige kleuringsprotocollen. In 2015 ontwikkelden Boyden en collega's een methode om de beperkingen van optische microscopie te omzeilen door het monster fysiek uit te breiden, genaamd Expansion Microscopy (ExM)4.

ExM is een methode in drie stappen die details op nanoschaal van biologische monsters biedt zonder de diffractielimiet van licht te overschrijden (Figuur 1). In plaats daarvan gebruikt het conventionele diffractie-beperkte microscopen om monsters af te beelden die fysiek op een isotrope manier zijn vergroot. De eerste stap, geleervorming genaamd, bestaat uit het inbedden van het biologische monster, meestal gefixeerde cellen of weefsels, in een zwellende polyelektrolythydrogel op basis van natriumacrylaat en acrylamide. Het biologische monster ondergaat vervolgens een enzymatische behandeling om bepaalde componenten, zoals eiwitten of membranen, gedeeltelijk af te breken en dichte cellulaire structuren af te breken om ervoor te zorgen dat cellen gelijkmatig kunnen uitzetten. Deze stap, digestie genaamd, helpt dit te bereiken door de structurele componenten van het monster te homogeniseren met betrekking tot mechanische eigenschappen, waardoor differentiële uitzetting wordt voorkomen die zou kunnen leiden tot vervorming van het monster. Ten slotte, in de laatste stap, expansie genaamd, wordt het in hydrogel ingebedde en verteerde monster in gedeïoniseerd water geplaatst, waardoor het opzwelt. Deze technologie resulteert in een uitbreiding van het monster met een lineaire vergrotingsfactor van ongeveer 4-5x in elke dimensie, waardoor de visualisatie van fijne cellulaire details mogelijk is met behulp van standaard microscopietechnieken. Gezien de isotrope aard van de expansie, behoudt het biologische monster dat binnen de gelmatrix is vergroot zijn driedimensionale geometrische details en de ruimtelijke relaties tussen de verschillende structurele componenten. Ruimtelijke informatie blijft dus behouden bij zwelling, terwijl de afstand tussen de gel-verankerde fluorescerende labels of biomoleculen in alle richtingen gelijkmatig toeneemt. Dit zorgt voor een betere scheiding van signalen, wat resulteert in een verbeterde resolutie.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van het ExM-protocol. (a) Geleer: Het biologische monster wordt verankerd en ingebed in een opzwelbare polyelektrolythydrogel. (b) Spijsvertering: De mechanische eigenschappen van het monster worden gehomogeniseerd door het gebruik van enzymen en detergenten, waarbij eiwitten en lipidemembranen worden afgebroken die anders de expansie zouden beperken en vervormingen zouden veroorzaken. (c) Uitzetting: De hydrogel wordt ondergedompeld in gedeïoniseerd water, waardoor het isotroop uitzet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Sinds 2015 heeft ExM aanzienlijke technologische verbeteringen gezien in het bewaren van ruimtelijke informatie. In het bijzonder zijn er verschillende moleculaire ankers ontworpen om biomoleculen covalent rechtstreeks aan de zwellende hydrogelte hechten 5,6. In dit protocol gebruikten we N-acryloxysuccinimide (NAS), dat reageert met de vrije aminegroepen van biomoleculen (meestal lysineresiduen of N-terminale posities van eiwitten) om een acryloylgroep te bioconjugeren met de eiwitten van de cel, inclusief glycoproteïnen. Deze acryloylgroep reageert vervolgens met andere monomeren door middel van verknopingsreacties tijdens geleervorming, waardoor deze biomoleculen rechtstreeks aan het polymeer worden verankerd.

ExM is compatibel met een breed scala aan etiketteringsmethoden, waaronder Metabolic Oligosaccharide Engineering (MOE). MOE is een krachtig hulpmiddel dat de etikettering van glycanen mogelijk maakt door analogen van metabole precursoren op te nemen die zijn uitgerust met een bioorthogonaal chemisch handvat7. Deze analogen, bekend als chemische reporters, integreren in metabole routes zonder toxiciteit te veroorzaken. In de MOE-benadering worden reporter-monosacchariden metabolisch verwerkt tot geactiveerde nucleotidesuikers en vervolgens overgebracht naar ontluikende glycoconjugaten. Onze primaire focus ligt op de studie van sialylering, met name de intracellulaire dynamiek en het transport van gesialyleerde N-glycoproteïnen, die cruciaal is in de context van gezondheid en ziekte vanwege zijn rol in cel-celinteracties, immuunregulatie en ontwikkeling. Abnormale sialylering is betrokken bij ziekten zoals kanker 8,9,10,11, infectieziekten 12 en genetische aandoeningen 13,14,15, waardoor het een belangrijk doelwit is voor therapeutische ontwikkeling en ontdekking van biomarkers. Inzicht in sialylering verbetert het inzicht in glycobiologie en ziektemechanismen.

Sialylering kan worden onderzocht met behulp van MOE met analogen van N-acetylneuraminezuur (Neu5Ac), het meest voorkomende siaalzuur bij mensen, of met analogen van N-acetylmannosamine (ManNAc), een metabole voorloper van Neu5Ac, met een bioorthogonaal handvat 8,16. ManNAc wordt in het cytosol omgezet in Neu5Ac en vervolgens geactiveerd in cytidine-5′-monofosfo-N-neuraminezuur (CMP-Neu5Ac) in de kern. Eenmaal geactiveerd tot een nucleotidesuiker, brengen sialyltransferasen in het Golgi-apparaat Neu5Ac-eenheden over naar de terminale posities van groeiende glycaanketens (Figuur 2). Na de metabolische incorporatie van onnatuurlijke ManNAc-derivaten kunnen de gelabelde gesialyleerde glycanen covalent worden gekoppeld aan een fluorofoor met een reactieve groep die complementair is aan de reporterhandle door middel van bioorthogonale klikchemie. Dit maakt de directe waarneming van glycoconjugaten in vivo of ex vivo mogelijk.

Voor de meeste monosacharidereporters is een geperacetyleerde vorm nodig om het plasmamembraan via passieve diffusie te passeren. Er is echter aangetoond dat zowel geperacetyleerde als onbeschermde melders sialylatie16 efficiënt onderzoeken. Onbeschermde sialyleringsreporters kunnen cellen binnendringen via actieve transportmechanismen, namelijk pinocytose voor Neu5Ac-analogen en een nog niet geïdentificeerde transporter voor ManNAc. Hoewel onbeschermde suikers een hogere concentratie nodig hebben (meestal 100-500 μM) om vergelijkbare effecten te bereiken, kunnen ze, eenmaal in de cel, direct de stofwisselingsroute van siaalzuur binnendringen. Daarentegen moeten geperacetyleerde suikers volledig worden gedeacetyleerd door intracellulaire niet-specifieke esterasen voordat ze metabolisch actief worden. Hoewel ze in lagere concentraties kunnen worden gebruikt (meestal 10-50 μM), kan onvolledige deacetylering de enzymactiviteit verstoren of leiden tot de opname van gedeeltelijk geacetyleerde siaalzuuranalogen, waardoor de stroomafwaartse analyse mogelijk wordt scheefgetrokken. Bovendien kan de afgifte van azijnzuur de pH lokaal beïnvloeden, wat mogelijk de cellulaire functie kan beïnvloeden. Chen en collega's hebben ook aangetoond dat per-O-geacetyleerde suikers reageren met vrije cysteïneresiduen in eiwitten via een niet-enzymatisch mechanisme, wat leidt tot off-target opname en een verhoogd niet-specifiek signaal17,18. In het voorliggende protocol maken we daarom gebruik van onbeschermde ManNAc-melders.

figure-introduction-2
Figuur 2: Metabole oligosacharide engineering en labeling van siaalzuren. UDP-GlcNAc wordt geconverteerd naar ManNAc door UDP-GlcNAc 2-epimerasedomein van GNE/MNK in het cytosol. ManNAc wordt vervolgens in het cytosol gefosforyleerd door het ManNAc 6-kinasedomein van GNE/MNK om ManNAc-6-fosfaat te vormen. N-acetylneuraminaatsynthase katalyseert de condensatie van ManNAc-6-P met fosfoenolpyruvaat om Neu5Ac-9-fosfaat te produceren, dat vervolgens wordt gedefosforyleerd door siaalzuurfosfatase om Neu5Ac. Neu5Ac kan ook worden gevoed via de bergingsroute via endocytose en lysosomale recycling8. Na transport naar de kern wordt het omgezet in CMP-Neu5Ac door CMP-siaalzuursynthetase. In het Golgi-apparaat is CMP-NeuAc het substraat van sialyltransferasen die een Neu5Ac-groep introduceren op de terminale posities van glycanen op rijpende glycoconjugaten, die uiteindelijk tot expressie worden gebracht in het celmembraan of worden uitgescheiden. ManNAz chemische reporters met een bioorthogonaal handvat kunnen de cel binnendringen via een niet-geïdentificeerde actieve transporter en de metabole route binnendringen. De gelabelde Neu5Az-eenheden die na biosynthese in glycanen zijn opgenomen, worden vervolgens gelabeld door middel van CuAAC-gemedieerde conjugatie van een fluorescerende sonde. Afkortingen: NAc = N-acetyl; UDP-GlcNAc = Uridinedifosfaat N-acetylglucosamine; ManNAc = N-acetylmannosamine; GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerase; MNK = ManNAc 6-kinase; ManNAc-6-P = ManNAc-6-fosfaat; NANS = N-acetylneuraminaat synthase; PEP = fosfoenolpyruvaat; Neu5Ac = N-acetylneuraminezuur; Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-fosfaat; NANP = siaalzuurfosfatase; CMP = cytidine-5′-monofosfaat; CMAS = CMP-siaalzuursynthetase; ST's = sialyltransferasen; ManNAz = N-azidoacetylmannosamine; Neu5Az = N-azidoacetylneuraminezuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Van de mogelijke bioorthogonale reacties hebben we onze interesse gericht op de door koper gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie (CuAAC)16,19. Volgens onze ervaring is CuAAC de beste optie voor het labelen van intracellulaire glycanen in vaste cellen. Deze reactie is goed ingeburgerd, grondig bestudeerd in de bioorthogonale chemie en is gestandaardiseerd voor gebruik in complexe biologische omgevingen, waardoor een solide basis van kennis en geoptimaliseerde protocollen wordt geboden. De snelle kinetiek biedt inderdaad een hoge reactie-efficiëntie en specificiteit, en het omvat azide- en alkynegroepen die gemakkelijk te synthetiseren, stabiel zijn, afwezig zijn in levende systemen en inert zijn ten opzichte van inheemse biomoleculen, waardoor het ideaal is voor toepassingen met vaste cellen waar kopertoxiciteit geen probleem is. Door spanning gepromote alkyne-azide cycloadditie (SPAAC)20,21 vermijdt weliswaar kopertoxiciteit, maar heeft een langzamere kinetiek en omvangrijkere sondes, wat doorgaans leidt tot een hoger achtergrondsignaal en een verminderde signaal-ruisverhouding voor intracellulaire toepassingen als gevolg van hydrofobe insluiting, terwijl Inverse Electron Demand Diels-Alder (IEDDA)22,23, hoewel snel en kopervrij, omvat complexere sondesynthese en vereist omvangrijkere reportergroepen die nog niet volledig zijn gekarakteriseerd in MOE-toepassingen. Aangezien ExM uitsluitend vaste cellen vereist, biedt CuAAC een robuuste en efficiënte oplossing voor bioorthogonale etikettering.

Dit artikel presenteert een protocol voor de visualisatie van intracellulaire gesialyleerde glycoproteïnen in cellen, waarbij metabole labeling, bioorthogonale klikchemie en expansiemicroscopie worden gecombineerd. In de experimentele procedures die in dit artikel worden beschreven, gebruiken we N-azidoacetylmannosamine (ManNAz) als de chemische reporter, en CuAAC-ligatie van kleine organische fluoroforen wordt uitgevoerd voorafgaand aan de expansieprocedure. Glycoproteïnen worden verankerd aan de hydrogel met NAS voorafgaand aan gelering, vertering en expansie. De MOE-labeling van siaalzuren kan worden geassocieerd met immunofluorescentiebenaderingen voor co-lokalisatiebeoordeling, zoals hier wordt geïllustreerd met een anti-GM130 primair antilichaam van de muis gelokaliseerd in het cis-Golgi-apparaat. Dit protocol kan worden toegepast op cellen in hun fysiologische toestand, of op cellen die een chemische behandeling hebben ondergaan. Om dit te illustreren, werd chloroquine gebruikt om de lysosomale functie te remmen, die de verwerking en het transport van glycoproteïnen in cellen beïnvloedt. Nucleaire kleuring wordt gebruikt als een herkenningspunt, niet alleen om cellen te lokaliseren, maar ook als een indicator van de kwaliteit van het ExM-proces. De expansiefactor kan inderdaad worden gemeten door de grootte van de kern vóór de expansie (preExM) en de post-expansie (postExM) te vergelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Cellen zaaien

OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden onder een laminaire stromingskap. Deze methode kan worden toegepast op elk van de cellijnen die in dit werk worden gebruikt (HeLa, MCF7, primaire fibroblasten), of op de meeste aanhangende cellijnmodellen die vaak worden gebruikt in onderzoek 20,24,25.

  1. Kweekcellen in DMEM hoog glucosemedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) in een T75-kolf bij 37 °C onder een atmosfeer van 5% CO2 .
  2. Zodra de cellen volledige samenvloeiing hebben bereikt, verwijdert u het celkweekmedium en wast u de cellen met 4 ml PBS.
    OPMERKING: PBS-oplossingen die in deze stap en alle volgende wasstappen worden gebruikt, moeten vóór gebruik steriel worden gemaakt door filtratie door een PTFE-membraan van 0.2 μm.
  3. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C in 2 ml 1x trypsine-EDTA-oplossing die 0,5 g/l trypsine bevat, zodat ze van de bodem van de kolf worden losgemaakt.
  4. Voeg 8 ml DMEM-medium met een hoog glucosegehalte van 10% FBS toe en meng grondig om ervoor te zorgen dat elke cel loskomt van de bodem van de kolf.
  5. Breng de cellen over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 × g. Voeg intussen een dekglaasje (diameter 12 mm, dikte 130-160 μm) toe aan elk putje van een plaat met 12 putjes.
    OPMERKING: De dikte van het dekglaasje moet worden aangepast aan de vereisten van de microscoop die in de volgende beeldvormingsstappen wordt gebruikt.
  6. Verwijder het bovenstaande na het centrifugeren en suspendeer de pellet opnieuw in 1 ml celkweekmedium.
  7. Bepaal het gemiddelde aantal cellen/ml door middel van hemocytometrie over ten minste twee metingen.
  8. Verdun de celsuspensie tot een concentratie van 300.000 cellen per ml in celkweekmedium en zaai 1 ml van de suspensie in elk putje.
  9. Laat de cellen 24 uur bezinken in een DMEM-medium met een hoog glucosegehalte van 10% FBS bij 37 °C onder een atmosfeer van 5% CO2 voordat u de volgende stappen zet.

2. Chloroquine-behandeling (optioneel)

OPMERKING: Stappen 2.1-2.8 illustreren hoe het protocol moet worden gebruikt op cellen die worden behandeld met een extern reagens (remmer, effector, medicijn), met chloroquine als voorbeeld. Sla deze stappen over voor cellen die niet zijn behandeld met externe reagentia.

  1. Weeg de juiste hoeveelheid chloroquinedifosfaatzout (CQ) af om een voldoende volume van een stockoplossing van 10 mM te bereiden.
    OPMERKING: Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden onder een laminaire stromingskap.
  2. Solubiliseren van de vaste CQ in de gewenste hoeveelheid gedeïoniseerd water voor een uiteindelijke concentratie van 10 mM.
  3. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm.
  4. Verdeel 1 ml van de 10 mM stockoplossing in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml en bewaar deze bij -20 °C.
  5. Was het celmonster dat in stap 1.9 is bereid met 1 ml PBS.
  6. Voeg 100 μL 10 mM CQ toe in 9,9 ml DMEM high glucose medium met 10% FBS, voor een uiteindelijke concentratie van 100 μM CQ.
  7. Incubeer de cellen gedurende 8 uur in 1 ml van een medium aangevuld met 100 μM CQ bij 37 °C onder een atmosfeer van 5 % CO2 .
  8. Was de cellen 3x met 1 ml PBS.

3. Metabole oligosacharide engineering

  1. Bereid een 5 mM stockoplossing van ManNAz (of ManNAc voor de negatieve controletoestand) in een DMEM-medium met een hoog glucosegehalte dat 10% FBS bevat.
    OPMERKING: Deze voorraadoplossing moet voldoende groot zijn zodat elk putje kan worden behandeld met 1 ml analoge suikeroplossing. Voer de volgende stappen uit onder steriele omstandigheden onder een laminaire stromingskap.
  2. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm en bewaar in porties van 1 ml bij -20 °C tot het nodig is.
  3. Bereid een medium aangevuld met 500 μM ManNAz of ManNAc door een in stap 3.2 bereide stockoplossing van 1 ml te verdunnen met 9 ml DMEM-medium met een hoog glucosegehalte dat 10% FBS bevat.
  4. Incubeer de cellen die zijn bereid in stap 1.9 (voor experimenten met onbehandelde cellen) of in stap 2.8 (voor experimenten met CQ-behandelde cellen) in 1 ml van het medium aangevuld met 500 μM ManNAz (of 500 μM ManNAc voor de controlegroep) gedurende 24 uur bij 37 °C onder een atmosfeer van 5 % CO2 .

4. Fixatie en permeabilisatie

OPMERKING: Al deze stappen worden uitgevoerd onder een zuurkast.

  1. Was de monsters met 1 ml PBS.
  2. Bevestig de cellen op elk dekglaasje door 500 μL 5% paraformaldehyde toe te voegen. Laat het 15 minuten rusten op kamertemperatuur.
  3. Was 3x met 1 ml PBS.
  4. Bereid een op maat gemaakte vochtige kamer voor met behulp van een voldoende grote ondoorzichtige doos (bijv. een polystyreendoos) met een deksel. Leg een nat stuk vloeipapier op de bodem van de doos en leg er een laag parafilm op.
    NOTITIE: De vochtige kamer moet het monster in gesloten toestand volledig beschermen tegen lichtbronnen van buitenaf.
  5. Plaats de dekglaasjes op de parafilm met de cellen naar boven.
    OPMERKING: Label de parafilm vooraf met de naam of referentie van de monsters.
  6. Voer celpermeabilisatie uit met 200 μL 0,5% (v/v) Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Was 3x met 200 μL PBS.

5. Fluorescentie etikettering

  1. CuAAC-etikettering van gelabelde gesialyseerde glycanen
    OPMERKING: De CuAAC-reactiebuffer moet vóór gebruik vers worden bereid en de reactanten moeten in de aangegeven volgorde worden toegevoegd, waarbij natriumascorbaat als laatste wordt toegevoegd. In zuurstofrijke waterige oplossingen zullen Cu(I)-ionen gevormd door de reductie van Cu(II) met ascorbaat geleidelijk opnieuw oxideren tot Cu(II), wat leidt tot een afname van de ascorbaatconcentratie in de loop van de tijd. Om de reproduceerbaarheid van het resultaat te behouden, mag de buffer niet langer dan enkele dagen bij 4 °C worden bewaard en wordt deze bij voorkeur op dezelfde dag gebruikt.
    1. Voor het etiketteren van de azide-gemodificeerde gesialyleerde glycanen die in sectie 3 zijn gemanipuleerd, wordt een CuAAC-reactiebuffer bereid die bestaat uit 5 μM AlexaFluor 488-alkyn (AF488Alk), 150 μM CuSO4, 300 μM 2-(4-(bis((1-(tert-butyl)-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl)amino)methyl)-1H-1,2,3-triazool-1-yl)azijnzuur (BTTAA), 0,1 M K2HPO4 en 2,5 mM natriumascorbaat in gedeïoniseerd water. Bereid voldoende oplossing voor om 200 μL op elk dekglaasje aan te brengen.
    2. Voeg 200 μL CuAAC-buffer toe op elk dekglaasje om de reactie op gang te brengen. Zorg ervoor dat het monster homogeen bedekt is met de druppel en laat het 45 minuten reageren bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht.
    3. Spoel 3x met 200 μL PBS om de reactie te stoppen en overtollige sonde en reagentia te verwijderen.
  2. Kern kleuring
    1. Voor nucleaire etikettering met Hoechst 33342, verdun een stockoplossing van 10 mg/ml bij 1:2000 in PBS.
      OPMERKING: Equivalente nucleaire tegenkleuringen zoals 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) kunnen voor hetzelfde effect worden gebruikt.
    2. Bedek de cellen met 200 μL van deze oplossing en incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen het licht.
    3. Was 3x met 200 μL PBS.
  3. Immunofluorescentie kleuring
    1. Bereid een runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer voor met 0,1 g gelatine, 1 g BSA, 1 ml FBS en 49 ml PBS voor 50 ml buffer.
    2. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij 4 °C in 200 μL BSA-blokkeerbuffer. Bescherm het monster tegen licht.
    3. Voor immunofluorescentiekleuring van het Golgi-apparaat met behulp van een gezuiverd anti-GM130-antilichaam bij muizen (epitoop herkend: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142), verdun het primaire antilichaam bij 1:100 in de voorbereide BSA-blokkeerbuffer.
      OPMERKING: Deze stap kan worden aangepast aan immunofluorescentiekleuring gericht op andere organellen door een relevant primair antilichaam te gebruiken, in welk geval de verdunningsfactor moet worden aangepast volgens de richtlijnen van de fabrikant.
    4. Voeg 70 μl van de oplossing met het antilichaam toe aan de dekglaasjes en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C, beschermd tegen licht.
    5. Was 3x met 200 μL PBS.
    6. Verdun het fluorescerende secundaire antilichaam (Alexa Fluor 546 anti-muis IgG) bij 1:600 in BSA-blokkeerbuffer en voeg 100 μL toe op elk dekglaasje.
    7. Incubeer de monsters gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
    8. Was 3x met 200 μL PBS.
    9. Leg de dekglaasjes op een bord met 6 putjes. Bewaar de monsters enkele dagen in 2 ml PBS bij 4 °C, beschermd tegen licht.
      OPMERKING: het wordt aangeraden om een replicaat altijd uitsluitend voor visualisatie preExM voor te bereiden als referentie voor vergelijkingsdoeleinden voor en na uitbreiding en om ervoor te zorgen dat het labelpatroon na uitbreiding niet is vervormd.

6. Beeldvorming vóór uitbreiding van monsters

NOTITIE: De volgende stappen zijn afhankelijk van de gebruikte bioimaging-apparatuur en moeten mogelijk worden aangepast aan de vereisten van de machine. Volg de regels van het lokale laboratorium of bioimaging-platform. De stappen 6.1-6.13 worden hier uitgevoerd met een confocale laserscanmicroscoop.

  1. Zet de microscoop aan en zorg ervoor dat lichtbronnen (lasers) zijn opgewarmd. Open de software voor het verwerven van bioimaging.
  2. Selecteer de golflengten van de laserexcitatie die overeenkomen met de fluoroforen om de kanalen te creëren (bijv. 405 nm voor nucleaire kleuring, 488 nm voor AF488Alk-gelabelde gesialyleerde glycanen en 546 nm voor immunofluorescentielabeling). Activeer de lasers dienovereenkomstig.
  3. Plaats en bevestig een dekglaasje met een diameter van 32 mm (dikte 130-170 μm) in een houder die is aangepast aan de microscoop.
  4. Breng het in stap 5.3.9 voorbereide monster met de cellen naar beneden op het dekglaasje van 32 mm aan. Voeg een druppel gedeïoniseerd water toe om te voorkomen dat het monster uitdroogt.
  5. Kies een geschikte objectieflens, hier een 63x olie-immersie-objectief met een 1.4 numeriek diafragma of gelijkwaardig.
    OPMERKING: Het hoogste numerieke diafragma biedt de beste resolutie. Wanneer u een olie-dompelobjectief gebruikt, vergeet dan niet om een druppel olie toe te voegen tussen het objectief en het dekglaasje.
  6. Plaats de houder op de microscooptafel boven het objectief.
  7. Gebruik de fluorescentiemodus voor helderveld of lage laserintensiteit om een interessegebied in het monster te lokaliseren.
  8. Stel de focus in.
  9. Visualiseer de cellen in de software in live fluorescentiemodus . Stel de laserintensiteit voor elk kanaal in. Begin met een laag laservermogen om fotobleken te voorkomen. Verhoog langzaam het laservermogen en pas de versterking en offset van de detector aan om het signaal te versterken zonder overmatige ruis te introduceren om de fluorescentie duidelijk te visualiseren zonder overbelichting.
    OPMERKING: Parameters moeten worden aangepast om zowel achtergrondruis te minimaliseren als signaalverzadiging te voorkomen. Het is van cruciaal belang om consistente instellingen te behouden in alle monsters in een reeks experimenten, inclusief negatieve controles.
  10. Stel beeldparameters in zoals de grootte van het gaatje (bijv. 1 Airy Unit), scansnelheid (bijv. 8), zoomfactor (bijv. 1), bereik van helderheidswaarden (bijv. 16 bits) en gemiddeld getal (bijv. 2), modus (bijv. lijn) en methode (bijv. gemiddelde) zoals nodig om de gewenste waarneming te bereiken.
    OPMERKING: Deze waarden zijn systeem- en steekproefafhankelijk en moeten vóór de aanschaf worden geoptimaliseerd. De grootte van de gaatjes is afhankelijk van het numerieke diafragma, de vergroting en de golflengte: het verkleinen ervan kan de resolutie verbeteren ten koste van de signaal-ruisverhouding. Het wordt aangeraden om de scansnelheid in te stellen op snelle waarden (overeenkomend met een korte verblijftijd per pixel) om fotobleken te voorkomen.
  11. Voer de acquisitie uit en sla gegevens op in het gewenste formaat met de juiste metadata voor toekomstig gebruik.
  12. Zodra de acquisitie voorbij is, plaatst u het monster terug in de plaat met 6 putjes door een kleine hoeveelheid gedeïoniseerd water toe te voegen om de overdracht met een pincet te vergemakkelijken.
    OPMERKING: Stap 6.12 wordt alleen uitgevoerd als uitbreiding van dit specifieke monster nodig is. Gooi anders het monster weg en gebruik andere replica's voor de volgende stappen.

7. Protocol voor uitbreidingsmicroscopie

LET OP: De monsters worden zoveel mogelijk beschermd tegen het licht om fotobleken te voorkomen. De verankerings- en geleringsstappen worden uitgevoerd onder een zuurkast.

  1. Verankering
    1. Incubeer de monsters met N-acryloylsuccinimide (NAS) in een concentratie van 3,2 mg/ml in PBS op een mechanische schudder gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bereid een voldoende hoeveelheid oplossing voor om 500 μL oplossing per putje toe te voegen (voorraadoplossing: 16 mg/ml NAS in DMSO).
      OPMERKING: NAS reageert met de lysineresiduen en N-termini van eiwitten om een acryloylgroep te transplanteren, waardoor de eiwitten zich in volgende stappen aan de hydrogel kunnen verankeren.
    2. Was 3x met 1 ml PBS.
  2. Geling
    1. Bereid een monomeeroplossing die als volgt is samengesteld: voeg in 50 ml 1x PBS (pH 7,4) 5,843 g NaCl, 1,25 g acrylamide, 0,075 g bis-acrylamide en 4,313 g natriumacrylaat toe. Bereid voldoende oplossing voor om 70 μL op elk dekglaasje aan te brengen. Vries 1 ml aliquots ten minste 24 uur voor de gelering in.
      LET OP: De monomeren zijn giftig; Ze moeten met zorg worden behandeld met de juiste beschermingsmiddelen en onder een zuurkast worden gewogen.
    2. Op een stuk parafilm wordt een druppel van 70 μL monomeeroplossing geplaatst, gevolgd door de toevoeging van 1,4 μL 10% (v/v) N,N,N',N'-tetramethylethyleendiamine (TMEDA), vervolgens 1,4 μL 10% (w/v) Ammoniumpersulfaat (APS), die in de druppel worden gemengd.
      OPMERKING: De crosslinkerreagentia moeten in deze specifieke volgorde worden toegevoegd, eerst TMEDA, dan APS.
    3. Plaats het dekglaasje snel voorzichtig op de oplossing met de cellen naar beneden.
    4. Laat de oplossing 1 uur polymeriseren bij kamertemperatuur in een vochtige kamer.
  3. Spijsvertering
    1. Bereid een digestiebufferoplossing voor die bestaat uit 1x TAE-buffer, 0,5% (v/v) Triton X-100, 0,8 M guanidine HCl en 8 E/ml proteïnase K.
      OPMERKING: De digestiebuffer moet voor gebruik vers worden bereid en gedurende 30 minuten bij 37 °C worden voorgebroed.
    2. Voeg 1 ml digestiebuffer toe aan de hydrogel die in stap 7.2 is gevormd. Laat de vergisting 3 uur voortduren bij 37 °C op een mechanische schudder.
    3. Verwijder de spijsverteringsbuffer en was de gel voorzichtig 3x met 2 ml gedeïoniseerd water.
      OPMERKING: De hydrogel zal iets uitzetten en loskomen van het dekglaasje.
  4. Expansie
    1. Laat de hydrogel 2 uur uitzetten in 3 ml gedeïoniseerd water. Ververs het water elke 30 minuten.

8. Beeldvorming van monsters na uitbreiding

  1. Plaats een dekglaasje met een diameter van 32 mm (130-170 μm dikte) en bevestig het op een houder.
  2. Knip een stukje van de hydrogel uit en leg deze op het dekglaasje, met de cellen aan de onderkant van de gel.
    OPMERKING: De uitgesneden stukken moeten groot genoeg zijn om voldoende oppervlak voor observatie te bieden, maar niet te groot, omdat dit het hanteren van de gel kan bemoeilijken en het risico op breuk kan vergroten (aanbevolen maat: 5 tot 8 mm). Plaats voldoende hydrogelstukken om het hele oppervlak van het dekglaasje te bedekken; Dit helpt de stukken op hun plaats te houden en voorkomt drift tijdens de beeldvorming. In het geval van afdrijvende problemen kan het voorcoaten van de dekglaasjes met poly-D-lysine voordelig zijn6.
  3. Plaats de houder op de microscooptafel boven het objectief.
  4. Voer de beeldacquisitie uit op een confocale lasermicroscoop met een olie-immersie-objectief zoals beschreven in stap 6.

9. Berekening van de expansiefactor (EF) in ImageJ

  1. Open de beeldgegevens in de ImageJ freeware of gelijkwaardig.
  2. Als u aan een afbeelding met meerdere kanalen werkt, splitst u de kanalen en werkt u alleen aan het kernkanaal door naar Afbeelding selecteren | Kleur | Gesplitste kanalen.
  3. Om de diameter van de kern te meten, markeert u het signaal dat overeenkomt met de kern door een drempel te bepalen door op Afbeelding selecteren | Aanpassen | Drempel.... Kies een methode in het standaard vervolgkeuzemenu die het beste bij de afbeelding past (bijv. Otsu) en pas de drempel aan totdat de vorm van de kern duidelijk uit de achtergrond is gesneden.
    OPMERKING: De drempelinstelling moet voor elke afbeelding worden aangepast, omdat één instelling mogelijk niet op alle afbeeldingen of elk voorbeeld past.
  4. Stel de meting in om de Feret-diameter te bepalen door te klikken op Selecteren Analyseren | Afmetingen instellen.... Selecteer in het menu Feret-diameter en pas indien nodig de decimaal aan.
  5. Om de analyse van de afbeelding te starten, klikt u op Selecteren Analyseren | Analyseer deeltjes om de grootte van de deeltjes in te stellen; Kies voor de kern 5-oneindig μm² | Resultaten weergeven | Toevoegen aan manager | Uitsluiten op randen & Overlay. Start de analyse.
  6. Naarmate de analyse begint, verschijnen er meerdere vensters. Zoek in de vensterresultaten naar de maximale Feret-diameter van elke kern in de kolom Feret. Kopieer en plak de onbewerkte gegevens in een spreadsheet en bereken de gemiddelde kerngrootte voor vooraf geëxpandeerde en geëxpandeerde monsters.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de interessegebieden (ROI's) die overeenkomen met elke kern de hele periferie van de kern volgen.
  7. Bereken de expansiefactor (EF) als volgt:
    EF = figure-protocol-1
    OPMERKING: De EF-factor bepaalt hoeveel het monster is uitgebreid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hieronder wordt de toepassing van het protocol getoond om gesialyseerde glycoproteïnen in HeLa-cellen (Figuur 3A) en MCF7-cellen (Figuur 3B) te visualiseren, waarbij CQ-behandeling (protocolsectie 2) en immunofluorescentie co-lokalisatiekleuring (protocolstap 5.3) wordt weggelaten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige CuAAC-etiketteringsprotocol bevat geen aminoguanidine in de reactiebuffer. Omdat het gericht is op het visualiseren van intracellulaire glycoconjugaten, wordt het uitgevoerd op cellen die na de metabole opnamestap worden gefixeerd, om cytotoxiciteitsproblemen te voorkomen en de opname van het katalytische systeem te verbeteren. Het gebruik van aminoguanidine wordt doorgaans aanbevolen voor de etikettering van levende cellen op het celoppervlak om nevenreacties tussen dehydroa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

We danken de TisBio-faciliteiten en het PLBS-platform voor het bieden van de technische omgeving die bevorderlijk is voor het bereiken van dit werk. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het CNRS en het Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. We willen graag Dr. François Foulquier, Dr. Zoé Durin, mevrouw Dorothée Vicogne en mevrouw Céline Schulz bedanken voor het stimuleren van discussies en voor het verstrekken van de Fibroblast 533T-cellijn en het primaire antilichaam GM130.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(+) Sodium L-ascorbateSigma Aldrich11140
12 well cell culture plateCorning3513
AcrylamideSigma AldrichA8887
Acrylic acid N-hydroxysuccinimide ester Sigma AldrichA8060
Alexa Fluor 488 alkyne Jena BioscienceCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgGInvitrogenA11003
Amonium persulfateSigma Aldrich9913
Bis-AcrylamideSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
Centrifugation tube 2 mLEPPENDORF30120094
Chloroquine diphosphate saltSigma AldrichC6628
Conical tube 15 mLFalcon352097
cover slips 12 mm #1eprediaCB00120RA120MNZ0
cover slips 32 mm #1eprediaCB00320RA140MNZ0
CuSO4Sigma Aldrich209198
DMEM high glucose medium DutscherL0104-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) DutscherL0615-500
Fetal Bovine SerumbiowestS1810-500
Fibroblast 533T--Verzameld van een gezond individu
FIJI ImageJ 2.9.0--
GelatinBio-RAD170-6537
Guanidine HClSigma Aldrich50950
HeLa cellsATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2--
K2HPO4EuromedexPB0447-BWatervrij
LSM 780 Confocal Microscopy Zeiss-
MCF7ATCCHTB-22
N-acetylmannosamine (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
NaClCarlo Erba479687
N-azidoacetylmannosamine (ManNAz)BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x/1,4 Oil DIC M27Zeiss420782-9900-799 
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinase KSigma AldrichP2308from Tritirachium album
purified mouse GM130 antibodyBD Bioscience61082250 µg
Sodium acrylate Sigma Aldrich408220
T75 FlaskCorning430641
TEMEDSigma AldrichT9281
tris Acetate EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BlueDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherL0930-100

Referenties

  1. De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
  2. Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
  3. Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
  5. Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
  6. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
  7. Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
  8. Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
  9. Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
  10. Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  14. Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
  16. Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
  17. Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
  18. Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
  19. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
  20. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  21. Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
  22. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
  23. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
  24. Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
  25. Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
  26. Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
  27. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
  28. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  29. Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
  30. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
  31. Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
  32. Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
  33. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  34. Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
  35. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Metabole LabelingBio orthogonale LabelingGesialyleerde GlycanenGlycaanvisualisatieImmunofluorescentiemicroscopieSialoconjugaatbiosyntheseSubcellulaire Resolutie
Visualisatie van intracellulaire sialylering met klikchemie en expansiemicroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.