Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Samenvatting

Deze studie beschrijft een methode voor het produceren van chondrocytische sferoïden door cellen samen te voegen tot sferoïden onder omstandigheden met een lage adhesie met behulp van zwaartekracht, gevolgd door het kweken van de resulterende sferoïden in mini-bioreactoren.

Samenvatting

Kraakbeenherstel bij chronische gewrichtsaandoeningen vereist geavanceerde celgebaseerde therapieën om beschadigde weefsels effectief te regenereren. Dit protocol biedt een stapsgewijze methode voor het differentiëren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in op chondrocyten gebaseerde sferoïden, ter ondersteuning van weefselmanipulatie en celtherapietoepassingen. Het differentiatieproces is zorgvuldig gestructureerd om de betrokkenheid van chondrogene afstamming te bevorderen, te beginnen met iPSC's die in specifieke media zijn gekweekt en die cellen achtereenvolgens door kritieke stadia van differentiatie leiden. Aanvankelijk worden iPSC's geëxpandeerd om een optimale confluentie te bereiken voordat ze worden geïnduceerd in de richting van chondrogene afstamming met behulp van een reeks gedefinieerde mediaveranderingen. Tegen dag 10 worden cellen overgezet naar een chondrogenese-bevorderend medium dat de vorming van chondrocytachtige cellen bevordert die belangrijke markers van rijpe chondrocyten tot expressie brengen. Verdere aggregatie in met agarose beklede platen met 96 putjes leidt tot de vorming van driedimensionale sferoïden, die vervolgens worden gekweekt in op maat gemaakte mini-bioreactoren die zijn ontworpen om een micro-omgeving te simuleren die de afzetting van extracellulaire matrix (ECM) stimuleert. Door schaalbare productie van chondrocytensferoïden mogelijk te maken die natuurlijke kraakbeenkenmerken nabootsen, biedt deze aanpak een veelbelovende, reproduceerbare oplossing voor het ontwikkelen van celgebaseerde behandelingen voor kraakbeendefecten, die een breed nut biedt voor klinische en onderzoekstoepassingen in musculoskeletale regeneratieve geneeskunde.

Inleiding

De prevalentie van gewrichtsaandoeningen leidt tot aanzienlijke economische lasten als gevolg van het toenemende aantal gehandicapte patiënten en de kosten die aan hun zorg zijn verbonden. Hyalien kraakbeen is een bindweefsel met een beperkt regeneratief potentieel¹. Langdurig gebruik van bepaalde niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's), glucocorticoïden en chemotherapie of radiotherapie kan het regeneratieve vermogen van kraakbeen verder verminderen, waardoor het vermogen om te genezen bijna wordt geëlimineerd². Dit maakt het een uitdaging om autologe kraakbeencellen te verkrijgen voor cellulaire therapie.

De technologie van driedimensionale (3D) celcultivatie, inclusief chondrocyten, wordt al lang erkend als een opkomend onderzoeksgebied met een aanzienlijk potentieel. Deze 3D-structuren worden bestudeerd voor toepassingen in zowel fundamenteel biologisch onderzoek als regeneratieve geneeskunde. Spheroïden afgeleid van autologe chondrocyten zijn therapeutisch veelbelovend voor het aanpakken van degeneratie van kraakbeenweefsel, een aandoening die momenteel wereldwijd veel aandacht krijgt³.

Spheroïden afgeleid van chondrocyten gedifferentieerd van iPSC's vormen een veelbelovend alternatief voor primaire chondrocyten en bieden aanzienlijke voordelen voor kraakbeenherstel. iPSC's bieden een bijna onbeperkte capaciteit voor zelfvernieuwing en bezitten een breed differentiatiepotentieel, waardoor chondrocyten kunnen worden geproduceerd in hoeveelheden die voldoende zijn voor klinische toepassingen zonder invasieve procedures voor celverzameling⁴. Bovendien verbetert de overgang van traditionele tweedimensionale (2D) chondrocytenculturen naar 3D-kweeksystemen, zoals chondrosferen, de levensvatbaarheid en functionaliteit van deze cellen verder door een meer fysiologisch relevante omgeving te creëren. Studies tonen aan dat chondrocyten gekweekt in 3D-sferoïden hun fenotype beter behouden, met lagere dedifferentiatiesnelheden en hogere expressieniveaus van belangrijke hyaliene kraakbeenmarkers, zoals collageen type II en aggrecan⁵.

Ondanks het potentieel van iPSC-afgeleide chondrospheres, blijven gestandaardiseerde protocollen voor het genereren van hoogwaardige chondrospheres beperkt. Variabiliteit in protocollen in verschillende onderzoeken leidt vaak tot inconsistenties in de kwaliteit van chondrocyten en de samenstelling van de extracellulaire matrix, wat van invloed is op hun effectiviteit voor therapeutisch gebruik⁶. Hier wordt een verfijnd protocol gepresenteerd dat de generatie van sferoïden uit iPSC-afgeleide chondrocyten standaardiseert met behulp van betaalbare, op maat gemaakte mini-bioreactoren. De kweekfase van de mini-bioreactor is essentieel, omdat deze een gecontroleerde instelling met lage hechting biedt die de verdeling van voedingsstoffen, de ECM-rijping en de sferoïde verdichting optimaliseert⁷. Deze fase bevordert een robuuste expressie van essentiële chondrocytmarkers, waaronder collageen type II, aggrecan en SOX9, samen met een ECM-samenstelling die sterk lijkt op natuurlijk kraakbeen. Regelmatige mediawisselingen en zorgvuldige controle van de omgevingsomstandigheden - temperatuur, CO₂ en rotatiesnelheid - zorgen verder voor de levensvatbaarheid en rijping van de chondrocytensferoïden. Dit protocol is geoptimaliseerd om op een kosteneffectieve en schaalbare manier hoogwaardige chondrosferen te creëren met een sterke expressie van hyaliene kraakbeenmarkers, geschikt voor onderzoek en klinische toepassingen bij kraakbeenherstel.

Protocol

De studie werd beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de LOPUKHIN FRCC PCM (protocol nr. 2019/02 van 9 april 2019). Alle donormonsters werden verkregen in overeenstemming met de principes van de Verklaring van Helsinki. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle deelnemers en/of hun wettelijke voogden.

OPMERKING: Handhaaf de steriele techniek gedurende het hele protocol. Verwarm alle kweekmedia en -oplossingen tot 37 °C voordat u ze op cellen of sferoïden aanbrengt. Cellen kweken in een CO₂ -incubator bij 37 °C, met 5% CO₂ op 80% luchtvochtigheid. Het protocolschema wordt weergegeven in figuur 1.

Figuur 1: Protocol voor het produceren van chondrosferen uit iPSC-lijn IPSRG4S. (A) In eerste instantie worden iPSC's gekweekt in pluripotente stamcelmedia totdat 80% confluentie is bereikt. (B) Om differentiatie naar de chondrocytaire afstamming te induceren, worden iPSC's vervolgens gedurende 2 dagen in medium A gekweekt. Het medium wordt vervolgens vervangen door een formulering zonder Chir 99021 en Rho-kinaseremmer, en de cellen worden nog eens 6 dagen gekweekt met mediumwisselingen om de 2 dagen. (C) De cellen worden vervolgens overgebracht naar medium B om de chondrogenese gedurende de volgende 10 dagen te bevorderen. (D) Zodra een voldoende celaantal is bereikt, gaat het proces verder naar de productiefase van de sferoïden. (E) De cellen worden onder zwaartekracht geaggregeerd tot sferoïden in omstandigheden met een lage kleefkracht. (F) De resulterende sferoïden worden gekweekt in mini-bioreactoren met medium B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Transformatie van petrischaaltjes in mini-bioreactoren

OPMERKING: Details in een vorig artikel⁵.

1. Snijd centrifugebuisjes in ringen van 7-8 mm hoog met behulp van een steriele autoclaafschaar (autoclaafinstellingen: 121 °C (250 °F) bij 15 psi, 30 minuten en drogen na de autoclaaf gedurende 20 minuten).
2. Plet onbehandelde of microbiologische petrischaaltjes met een lage hechting in kleine stukjes. Los een nacht ongeveer 1 g plastic deeltjes op in 10 ml chloroform om een vloeibare plastic oplossing te creëren. Voer deze procedure uit in een zuurkast.
3. Controleer of het vloeibare plastic voldoende stroperig is om te pipetteren. Zorg ervoor dat druppels een bolvorm behouden in plaats van zich over het oppervlak te verspreiden. Als de oplossing te dun is, voeg dan meer plastic deeltjes toe, meestal 1-3 g. Als het te dik is, voeg dan extra chloroform toe, meestal tot 5 ml.
4. Vorm een plastic knop in het midden van een steriele, ultralage hechting 60 mm petrischaal met behulp van een van de twee effectieve methoden die hieronder worden beschreven.
   1. Optie 1: Plaats de geautoclaveerde plastic ring in het midden van de petrischaal en breng vervolgens vloeibaar plastic aan in de ring; voor één druppel zijn ongeveer 100-200 μL druppels vloeibaar plastic nodig.
   2. Optie 2: Breng hetzelfde aantal druppels vloeibaar plastic rechtstreeks in het midden van de petrischaal aan zonder de plastic ring te gebruiken.
5. Laat de vaat 2-3 uur onafgedekt drogen in een laminaire afzuigkap. Stel de vaat na het drogen 20-30 minuten bloot aan ultraviolette straling.

2. Behandeling van kweekgerechten met gelatine

1. Bereid een oplossing van 0,1% gelatine door gelatine in poedervorm op te lossen in gedestilleerd water bij 95 °C. Laat de oplossing achtereenvolgens door de membraanfilters 0,45 μm en 0,25 μm lopen en bewaar het filtraat vervolgens bij 4 °C.
2. Breng onmiddellijk vóór het opnieuw inzaaien van de chondrocyten de 3 ml gelatineoplossing aan op de 25 cm^2-kolf (maximaal 15 g kraakbeenweefsel per T25-kolf wordt aanbevolen). Incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur (RT), verwijder de gelatine, spoel tweemaal met PBS en ga verder met het zaaien van cellen.

3. Isolatie en cultivatie van chondrocyten

OPMERKING: Chondrocyten worden geïsoleerd uit niet-dragende kraakbeengebieden van patiënten die een totale knievervanging ondergaan. Oogst alle monsters onder steriele omstandigheden en bewaar ze in steriele buisjes gevuld met DMEM die 200 E/ml penicilline/streptomycine-oplossing bevatten. Bewaar kraakbeenweefsel in de koelkast bij 2-8 °C.

1. Begin met enzymatische behandeling binnen 2 dagen na de kraakbeenoogst. Was kraakbeenstukjes in de oplossing van Hanks met behulp van petrischaaltjes van 60 mm en snijd vervolgens het kraakbeen in fragmenten met een diameter van ongeveer 1-2 mm met een autoclaveerschaar.
2. Breng de kraakbeenstukjes over in buisjes van 15 ml en verteer ze in 0,01% collagenase type II-oplossing in DMEM, ongeveer 1 ml per 1 g kraakbeen, binnen 8-12 uur in een CO₂ -incubator die is ingesteld op 37 °C met 5% CO₂, 100% vochtigheid, onder continu roeren op een orbitale schudder bij 150-200 tpm.
3. Was na de vertering de kraakbeenfragmenten door DMEM toe te voegen aan een buis van 15 ml en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten op 300 × g . Resuspendeer de fragmenten in een chondrocytenkweekmedium (aanvullende tabel 1) en zaai ze op een zelfklevende T25-kolf die is voorgecoat met 0,1% gelatineoplossing.
4. Passage chondrocyten wanneer een confluente dichtheid van 80% wordt bereikt.
   1. Was voor het passeren chondrocyten met de oplossing van Hanks en incubeer vervolgens de cellen met 0,25% trypsineoplossing bij 37 °C gedurende 5 minuten.
   2. Om trypsine te inactiveren, voegt u een gelijk volume DMEM + 10% FBS toe. Resuspendeer chondrocyten in vers kweekmedium en verdeel ze vervolgens in een verhouding van 1:3, waarbij 20.000-30.000 cellen per 1 cm² worden gezaaid.
   3. Plaats de kweekkolf in een broedmachine bij 37 °C met 5% CO₂ en 100% vochtigheid.

4. Kweek van pluripotente stamcellen

OPMERKING: In samenwerking met het Stamcellaboratorium van de Molecular Brain Research Group, Department of Neurobiology, A.I. Virtanen Institute, University of Eastern Finland, Kuopio, Finland, werd in een eerdere studie met succes een iPSCs-lijn IPSRG4S gegenereerd⁸.

1. Kweek iPSC's in platen met 6 putjes die vooraf zijn gecoat met een matrix die extracellulaire eiwitten bevat ( Figuur 1A). Gebruik een medium voor pluripotente stamcellen (aanvullende tabel 1).
2. Passagecellen met 80% confluentie, met behoud van een verhouding van 1:4 (50.000-75.000 cellen per 1 cm²). Breng ongeveer 2-3 uur vóór de loslating iPSC's over naar het medium voor pluripotente stamcellen die Rho-kinaseremmer Y27632 bevatten in een eindconcentratie van 1 μM gedurende 1 dag.
3. Was iPSC's met Hanks-oplossing en incubeer bij 37 °C met 0,05% trypsine-oplossing. Om trypsine te inactiveren, voegt u een gelijk volume DMEM + 10% FBS toe. Centrifugeer de celsuspensie bij 200 x g gedurende 5 minuten in buisjes van 15 ml.
4. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen in een vers medium voor pluripotente stamcellen. Om de levensvatbaarheid van de cellen te verbeteren, voegt u Rho-kinaseremmer Y27632 toe aan het medium in een eindconcentratie van 1 μM gedurende 1 dag. Plaats de kweekplaat in een CO₂ -incubator die is ingesteld op 37 °C met 5% CO₂ en 100% vochtigheid.

5. Chondrogene differentiatie van iPSC's

1. Start differentiatie naar de chondrocytaire lijn door cellen te kweken in Medium A (aanvullende tabel 1) gedurende de eerste 2 dagen. Vervang op dag 3 Medium A door een oplossing die Chir 99021 en Rho-kinaseremmer uitsluit, terwijl alle andere componenten ongewijzigd blijven. Vervang het medium elke 2 dagen van dag 3 tot 9 (Figuur 1B).
2. Breng op dag 10 chondrocytachtige cellen over naar medium B (aanvullende tabel 1), geformuleerd om chondrogenese te vergemakkelijken. Vervang het medium elke 2 dagen gedurende 10 dagen (Figuur 1C).
3. Bereid van tevoren een celsuspensiecultuurplaat met 96 putjes voor door elk putje te bedekken met 1,5% agarose in gedestilleerd water. Smelt de agarose in een magnetron tot het kookt (ongeveer 60-90 s bij 700 W). Zodra agarose vloeibaar is gemaakt, voegt u 75 μL agarose toe aan elk putje en laat u het uitharden bij RT (ongeveer 15 minuten).
4. Voeg 150 μl DMEM-medium toe aan elk putje en incubeer de plaat gedurende ten minste 12 uur in een CO₂ -incubator.
   OPMERKING: Geprepareerde platen kunnen maximaal 1 maand worden bewaard in een CO₂ -incubator bij 37 °C als het medium in elke put wordt bijgevuld om de verdamping te compenseren.
5. Op dag 12, na het observeren van fenotypische veranderingen geassocieerd met chondrogenese, start u de vorming van sferoïden met behulp van de gegenereerde chondrocytachtige cellen.
   OPMERKING: In dit stadium is het raadzaam om de expressie van belangrijke chondrocytaire markers te analyseren met immunocytochemie (ICC) en kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) met behulp van de ^{2-ΔΔCT-methode 9} om succesvolle chondrogene differentiatie van iPSC's te bevestigen. Tijdens het passeren van een plaat met 6 putjes naar een⁷⁵ cm 2-celkweekkolf kan een klein deel van de cellen worden gezaaid in een plaat met 48 putjes, overeenkomend met het aantal te analyseren markers. Voer ICC-analyse uit op deze monsters om genexpressie te verifiëren.

6. Vorming van sferoïden uit chondrocyt-achtige iPSC-afgeleide cellen

1. Na het verkrijgen van chondrocyt-achtige derivaten, passagecellen met 80% confluentie. Maak cellen los van de platen met 6 putjes met een 0,05% trypsine-oplossing. Om trypsine te inactiveren, voegt u een gelijk volume DMEM + 10% FBS toe, brengt u de cellen vervolgens over naar een buis van 15 ml en centrifugeert u gedurende 5 minuten op 200 x g .
2. Verwijder het supernatant, suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml medium B en breng ze over naar een kweekkolf van 75 cm^{met 2} cellen die is voorgecoat met een 0,1% gelatineoplossing (figuur 1D). Zodra cellen 80% confluentie als monolaag hebben bereikt, maakt u de cellen opnieuw los met trypsine en suspendeert u ze opnieuw in Medium B zoals beschreven.
3. Breng de cellen over in een plaat met 96 putjes bedekt met 1,5% agarose met een dichtheid van 100.000 cellen per putje. Kweek in Medium B en voeg 150 μL volledig medium per putje toe (Figuur 1D, 3A).
4. Bewaar de cellen in de plaat met 96 putjes bedekt met 1,5% agarose gedurende minimaal 1 dag en maximaal 3 dagen totdat sferoïden zijn gevormd (Figuur 2B). Breng de sferoïden over uit de putjes met behulp van een pipetpunt van 1 ml met een bijgesneden uiteinde en breng ze vervolgens over naar een buis van 15 ml. Laat de sferoïden 2-3 minuten bezinken en verwijder de supernatant.
5. Dompel de sferoïden onder in een vers ontdooide, onverdunde oplossing van de basaalmembraanmatrix die op 4 °C wordt gehouden. Verzamel na 30 minuten sferoïden door passieve bezinking in een buis van 15 ml of door zachte centrifugatie op 100 x g gedurende 1 min.
   OPMERKING: Matrix moet een nacht worden ontdooid op ijs in een koelkast van 2-8 °C. Na de eerste dooi worden aliquots voor eenmalig gebruik van de matrix gemaakt om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Polypropyleen of andere vriezercompatibele buizen worden gebruikt en bewaard bij -70 °C of -20 °C. Houd rekening met de houdbaarheidsdatum van de batch/partij, die 2 jaar is vanaf de fabricagedatum.
6. Breng de sferoïden over in mini-bioreactoren en voeg 6 ml Medium B toe. Plaats de mini-bioreactor op een orbitale schudder in een CO₂ -incubator die is ingesteld op 37 °C met 5% CO₂ en 100% vochtigheid en een roersnelheid van 70-75 tpm (Figuur 1F).
7. Verander het medium wekelijks of indien vereist bij mediumdepletie of kleurverandering van de zuur-base-indicator. Om dit te doen, laat u de sferoïden door de zwaartekracht bezinken in een buis van 15 ml en verwijdert u vervolgens voorzichtig het supernatant. Voeg vers medium B toe aan de buis en breng de sferoïden terug naar de mini-bioreactoren.

Resultaten

Het geschetste protocol wordt geïllustreerd in figuur 1. Deze methodologie maakt gebruik van twee verschillende kweekmedia om de differentiatie van iPSC's in chondrocytensferoïden te stimuleren gedurende een minimale duur van 1 maand (Figuur 2). Het differentiatieproces wordt gestart wanneer iPSC's een samenvloeiing van 75%-90% bereiken (Figuur 1B). Vroege indicatore...

Discussie

iPSC's vertegenwoordigen een transformatief hulpmiddel in de regeneratieve geneeskunde en bieden het potentieel om patiëntspecifieke chondrocyten te genereren voor kraakbeenherstel. De huidige protocollen maken gebruik van gerichte differentiatie via mesodermale routes, waarbij belangrijke signaalmoleculen zoals TGF-β en BMP-2 de betrokkenheid van chondrocytische afstamming bevorderen. Deze methoden zijn gericht op het nabootsen van de ontwikkeling van embryonaal kraakbeen, waardoor de p...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.05% Trypsine-oplossing	Thermo Fisher Scientific	25300-062
0.25% Trypsine-oplossing	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Advanced DMEM/F12 Eagle's medium	Thermo Fisher Scientific	12634028
Aggrecan monoklonaal antilichaam	Invitrogen	AHP0022	Gastheer: Muis; Verdunning: 1/500
Ascorbinezuur	Sigma	A4544	50 μg/mL
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	1x of 2%
Beta-mercaptoethanol	Serva	28625	90 mM
BMP2	Miltenyi biotec	130-110-922	10 ng/mL
Chir 99021	Miltenyi biotec	130-103-926	10 μM
COL1A1 (E6A8E) monoklonaal antilichaam	CellSignalling	39952	Gastheer: Konijn; Verdunning: 1/800
COL2A1 (M2139) monoklonaal antilichaam	Santa Cruz	sc-52658	Gastheer: Muis; Verdunning: 1/50
Collageenase type II-oplossing	PanEco	P011-2	0.01%
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindole)	Sigma-Aldrich	D9542-5MG	1 μg/mL
DMEM medium zonder glutamine	PanEco	?420?
Foetaal bovien serum	Thermo Fisher Scientific	10270106	10%
Hanks' oplossing	PanEco	?020?
Hybris 8 medium	PanEco	?780?/?780
Insulin-Transferrine-Selenium oplossing	PanEco	?065	1x oplossing heeft de volgende concentraties: Insuline: 10 µg/mL; Transferrine: 5,5 µg/mL; Selenium 5 ng/mL
L-alanyl-L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	35050038	2 mM
Matrigel Matrix	BD	354277	300 μg/mL
Penicilline-Streptomycine oplossing	PanEco	?063?	100 U/mL
Retinoïnezuur	Miltenyi biotec	130-117-339	10 nM
Rho kinase-remmer Y27632	Miltenyi biotec	130-103-922	10 mM
Secundair Antilichaam Geit anti-Muis IgG (H+L) Kruis-Geadsorbeerd, Alexa Fluor 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	Gastheer: Geit; Verdunning: 1/500
Secundair Antilichaam Geit anti-Konijn IgG (H+L) Hoog Kruis-Geadsorbeerd, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	?32732	Gastheer: Geit; Verdunning: 1/500
Sox9 (D8G8H) monoklonaal antilichaam	CellSignalling	82630	Gastheer: Rb; Verdunning: 1/400
TeSR-1 medium	STEMCELL technologies	85850
TGF-β1	Miltenyi biotec	130-095-067	10 ng/mL