Methodenartikel

Detectie van gereguleerde moederkorenalkaloïden in voedselmatrices door middel van vloeistofchromatografie-ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie-time-of-flight massaspectrometrie

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67484

⸱

22 november 2024

 ,  ,  , 
1Department of Analytical Chemistry, Faculty of Sciences, University of Granada, 2Department of Preventive Medicine and Public Health, Food Science, Toxicology and Forensic Medicine, Faculty of Pharmacy and Food Science, University of Valencia

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een gevalideerde massaspectrometriemethode voor vloeistofchromatografie-ionenmobiliteit en hoge resolutie om de aanwezigheid van moederkorenalkaloïden in voedsel te bepalen in overeenstemming met de onlangs uitgebrachte Verordening (EU) 2023/915 van de Commissie.

Samenvatting

Massaspectrometrie (IMS) voor ionenmobiliteit fungeert als een extra scheidingsdimensie wanneer deze wordt geïntegreerd in workflows voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). LC-IMS-MS-methoden bieden een hogere piekresolutie, verbeterde scheiding van isobare en isomere verbindingen en een verbeterde signaal-ruisverhouding (S/N) in vergelijking met traditionele LC-MS-methoden. IMS biedt een andere moleculaire eigenschap voor de identificatie van analyten, namelijk de parameter collision cross section (CCS), waardoor vals-positieve resultaten worden verminderd. Daarom pakken LC-IMS-MS-methoden belangrijke analytische uitdagingen aan op het gebied van voedselveiligheid (d.w.z. detectie van verbindingen op sporenniveaus in complexe voedselmatrices en eenduidige identificatie van isobare en isomere moleculen).

Moederkorenalkaloïden (EA's) zijn een familie van mycotoxinen die worden geproduceerd door schimmels die een grote verscheidenheid aan grassoorten aanvallen, waaronder kleine granen zoals rogge, triticale, tarwe, gerst, gierst en haver. In verschillende levensmiddelen zijn maximumgehalten (ML's) van deze mycotoxinen vastgesteld, zoals beschreven in Verordening (EG) 2023/915 van de Commissie. Deze nieuwe wetgeving omvat zes belangrijke EA's en de bijbehorende epimeren, dus er is een efficiënte methodologie nodig om deze isomere moleculen goed te onderscheiden, rekening houdend met hun gelijktijdige voorkomen.

Daarom is het doel van dit protocol om aan te tonen hoe de integratie van IMS in LC-MS-workflows bijdraagt aan de scheiding van isomere EA's, waardoor de selectiviteit van de analytische methode wordt verbeterd. Bovendien illustreert het hoe het genereren van CCS-bibliotheken door de karakterisering van analytische standaarden een groter vertrouwen biedt voor de identificatie van mycotoxinen. Dit protocol is bedoeld om de voordelen van de toepassing van IMS op het gebied van voedselveiligheid duidelijk uit te leggen, waarbij bijvoorbeeld de bepaling van EA's in granen wordt genoemd. Een op QuEChERS gebaseerde extractie gevolgd door een LC-trapped ion mobility spectrometrie (TIMS)-MS-analyse leverde kwantificeringslimieten op van 0,65 tot 2,6 ng/g met een acceptabele nauwkeurigheid (hoewel laag herstel voor ergotaminine) bij 1,5x, 1x en 0,5x de ML en vertoonde een verwaarloosbaar matrixeffect.

Inleiding

Ionenmobiliteit massaspectrometrie (IMS) wordt een steeds meer gebruikte analytische techniek, vaak gepresenteerd als een extra scheidingsdimensie die is geïntegreerd in traditionele vloeistof-/gaschromatografie (LC/GC) gekoppeld aan MS-workflows. IMS bestaat uit de scheiding van moleculen langs een mobiliteitscel, gevuld met een buffergas, onder een elektrisch veld en bij atmosferische druk1. Afhankelijk van de massa-tot-ladingsverhouding (m/z) en de geometrische conformatie, zal een geïoniseerd molecuul interageren met het buffergas terwijl het door de mobiliteitscel beweegt, wat wordt weerspiegeld in de ionenmobiliteit (K) parameter2 en berekend door middel van de volgende vergelijking:

figure-introduction-1

waarbij D de totale driftlengte voorstelt, td de totale drifttijd en  E het elektrische veld. Daarom wordt K gemeten in m2 V−1 s−1, hoewel het om praktische redenen vaak wordt uitgedrukt als cm2 V−1 s−1. Het intrinsieke vermogen om door de mobiliteitscel te bewegen kan worden gemeten aan de hand van de drifttijd en later worden omgezet in de zogenaamde collision cross section (CCS)-waarde, een zeer reproduceerbare parameter voor elk molecuul, onafhankelijk van het IMS-instrument3. De CCS kan worden afgeleid uit de mobiliteit volgens de volgende vergelijking:

figure-introduction-2

q is de lading van het ion; N de dichtheid van het buffergasgetal; μ de verminderde massa van de buffergas-ion van de aanvaringspartners; kB de constante van Boltzmann; en T de buffergastemperatuur. Daarom biedt IMS aanvullende informatie ter aanvulling van de analytische gegevens die voortvloeien uit chromatografie- en MS-analyses.

Het is aangetoond dat de implementatie van IMS in LC-MS-platforms de betrouwbaarheid van analytische bepalingen verhoogt, vooral bij het werken met verbindingen die sporenconcentraties bevatten. Verschillende studies hebben gemeld dat LC-IMS-MS-methoden de kwaliteit van massaspectra verbeteren door achtergrondruis te verminderen, wat uiteindelijk de gevoeligheid van de methode beïnvloedt, en het aantal valse positieven en negatieven vermindert dat wordt geleverd door LC-MS-methodologieën met meerdere residuen 4,5,6. Verder maakt de reproduceerbaarheid van CCS-waarden het mogelijk om niet alleen verschillende instrumenten te vergelijken die dezelfde technologie gebruiken, maar ook tussen verschillende ionenmobiliteitstechnologieën, namelijk reizende golfionenmobiliteitsspectrometrie (TWIMS), ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie (TIMS) en driftbuisionenmobiliteitsspectrometrie (DTIMS)2,7, de meest gebruikte systemen1. Een opmerkelijk gevolg van het potentieel van CCS als identificatieparameter ligt dus in de mogelijkheid om CCS-bibliotheken op te bouwen, wat tot uiting komt in de toepasbaarheid ervan in metabolomics-studies8. Desalniettemin is een van de krachtigste kenmerken van IMS het vermogen om isomere en isobare verbindingen te scheiden die mogelijk niet voldoende worden opgelost door LC-MS-methoden. Dit kan het geval zijn bij het werken met grote sets analyten die van belang zijn in complexe matrices, wat een veel voorkomende situatie is in milieu- en voedselanalyse. In dit verband zijn LC-IMS-MS-methoden voorgesteld voor de monitoring van pesticiden en, in mindere mate, diergeneesmiddelen en mycotoxinen in voedsel9.

Vanwege hun hoge oplossend vermogen en selectiviteit komen LC/GC-IMS-MS-platforms naar voren als de nuttigste instrumenten om enkele van de huidige uitdagingen op het gebied van voedselveiligheid aan te pakken, met name die met betrekking tot isomere mengsels. Het gezondheidsrisico in verband met isomere mengsels als voedselcontaminanten komt tot uiting in de huidige Europese wetgeving, die bijvoorbeeld de maximale concentratie van zes belangrijke moederkorenalkaloïden (EA's) en de overeenkomstige zes epimeren in verschillende voedingsproducten beperkt10.

EA's vormen een familie van toxische secundaire metabolieten die worden geproduceerd door een breed scala aan schimmels, voornamelijk van de familie Clavicipitaceae (bijv. Claviceps purpurea, de belangrijkste EA-producent vanwege zijn brede gastheerbereik), maar ook Trichocomaceae, die de zaadkop van levende planten (zoals rogge, gerst, tarwe en haver) kan parasiteren op het moment van bloei11, 12. okt. Onder specifieke omstandigheden, met name temperatuur en wateractiviteit, kunnen Claviceps-schimmels EA's produceren die zich ophopen in vruchtlichamen, bekend als sclerotia of moederkoren, in het waardgewas. Tot op zekere hoogte zijn EA's bestand tegen de verwerking van de grondstof tot het eindproduct; Daarom doorbreken in de voedselketen. Inslikken van besmet voedsel kan leiden tot EA-intoxicatie, bekend als ergotisme, dat zich presenteert met acute symptomen zoals buikpijn, braken, branderig gevoel van de huid, slapeloosheid en hallucinaties13. Om de impact van EA's op de menselijke gezondheid te verminderen, heeft de Europese Commissie maximumgehalten (ML's) in verschillende levensmiddelen vastgesteld voor de som van de belangrijkste EA's: de R-epimeren ergometrine (Em), ergotamine (Et), ergosine (Es), ergocristine (Ecr), ergokryptine (Ekr) en ergocornine (Eco) en hun overeenkomstige S-epimeren: ergometrinine (Emn), ergosinine (Esn), ergotaminine (Etn), ergocorninine (Econ), ergokryptinine (Ekrn), en ergocristinine (Ecrn). Deze verbindingen kunnen epimeriëren van R- naar S-vormen en vice versa, vooral bij blootstelling aan sterk licht, langdurige opslag of contact met sommige oplosmiddelen bij hoge of lage pH 12. Hoewel het aandeel R- en S-formulieren onder verschillende omstandigheden kan variëren, meldde het Contam-panel van de EFSA dat R-formulieren vaker voorkomen dan S-formulieren na bestudering van de beschikbare literatuur over EA's in levensmiddelen14. Daarom variëren de ML's afhankelijk van verschillende factoren, zoals de gevoeligheid van het gewas, de mate van verwerking of de consumptiefrequentie. In het EU-kader zijn de ML's voor volwitte producten van gerst, tarwe, spelt en haver vastgesteld op 50 of 150 μg/kg (afhankelijk van het asgehalte lager of hoger dan respectievelijk 900 mg/100 g), terwijl voor granen die rechtstreeks voor menselijke consumptie zijn bestemd, een ML van 150 μg/kg geldt, met uitzondering van babyvoeding op basis van granen, waarbij de ML wordt verlaagd tot 20 μg/kg10.

Deze strenge wetgeving vereist analytische methodologieën die gevoelig genoeg zijn om de niveaus van sporenconcentraties (μg/kg) te bepalen, terwijl gereguleerde EA's en de bijbehorende epimeren correct worden geïdentificeerd, aangezien beide vormen, R- en S-isomeren, samen in besmette monsters kunnen worden aangetroffen. Deze taak vormt een grote uitdaging, aangezien elk toxine-epimeerpaar exact dezelfde massa en hetzelfde fragmentatiepatroon deelt. Bovendien kan een goede chromatografische scheiding tussen beide verbindingen complex zijn. Daarom zijn goed geoptimaliseerde LC-gradiënten nodig om verkeerde kwantificering te voorkomen wanneer EA-epimeren samen voorkomen in voedselmonsters. Hoewel verschillende studies LC-MS-methoden hebben gerapporteerd voor ondubbelzinnige bepaling van EA's 15,16,17,18, moet de chromatografische methode uitgebreid worden bestudeerd om een adequate scheiding van de chromatografische pieken te bereiken om EA's ondubbelzinnig te identificeren. Dit is echter meestal niet haalbaar voor multi-class methoden waarbij contaminanten die tot verschillende chemische families behoren tegelijkertijd worden bepaald. In deze context rapporteerde een recente studie uitgevoerd door Carbonell-Rozas, Hernández-Mesa, et al.19 een LC-IMS-MS-methode voor de kwantificering van EA's in tarwe- en gerstmonsters, waarbij gebruik werd gemaakt van twee verschillende TWIMS-instrumenten die reproduceerbare CCS-waarden en lage kwantificeringslimieten (LOQ's) leverden om niet-naleving op te sporen in overeenstemming met de huidige wetgeving. Daarom is het doel van dit protocol om aan te tonen hoe de integratie van IMS in LC-MS-workflows bijdraagt aan de scheiding van isomere EA's, waardoor de selectiviteit van de analytische methode wordt verbeterd. Bovendien illustreert het hoe het genereren van CCS-bibliotheken door de karakterisering van analytische standaarden een groter vertrouwen biedt voor de identificatie van mycotoxinen. Dit protocol is bedoeld om de voordelen van de toepassing van IMS bij de analyse van de voedselveiligheid duidelijk uit te leggen, waarbij bijvoorbeeld de bepaling van EA's in granen wordt genoemd. Dit protocol behandelt de monsterbehandeling op basis van een QuEChERS-procedure, monsteranalyse door LC-TIMS-MS en IMS-gegevensextractie en -interpretatie.

Protocol

1. Voorbereiding van voorraad-, tussen- en werkstandaardoplossingen

OPMERKING: Gebruik nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril.

  1. Bereid individuele voorraadoplossingen van de 12 EA's (zie materiaaltabel) met 10.000 ng/ml in amberkleurige glazen flesjes van 4 ml met acetonitril. De R-vormen (-ine) werden voorheen verdeeld in porties van 25.000 ng, terwijl de S-vormen (-inine) werden verdeeld in porties van 10.000 ng. Deze studie begon met deze aliquots, waarbij concentraties van 10.000 ng/ml werden bereikt door de R- en S-vorm te verdunnen in respectievelijk 2,5 en 1 ml acetonitril, gevolgd door vortexing gedurende 2 minuten.
  2. Bereid een tussenvoorraadoplossing van 1.000 ng/ml totale EA's (83,33 ng/ml van elk) in een amberkleurige glazen injectieflacon van 12 ml door 65 μl van elke afzonderlijke alkaloïde-oplossing en 7,02 ml acetonitril toe te voegen.
    OPMERKING: Zodra de tussenliggende voorraadoplossing is bereid, moeten de afzonderlijke voorraadoplossingen worden gedroogd en bewaard bij -20 °C, afgedekt met aluminiumfolie om epimerisatie te voorkomen.
  3. Bereid werkende standaardoplossingen voor uit de tussenliggende voorraadoplossing door 2,7, 1,8 en 0,9 ml te pipetteren in amberkleurige glazen buizen van 4 ml. Breng ze droog onder een zachte stikstofstroom en resuspendeer ze in 600 μL acetonitril.
    OPMERKING: De resulterende concentraties werden vastgesteld op 1.5, 1 en 0.5x de ml (150 ng/g) bij toevoeging van 50 μl aan 1 g van het monster. Deze worden geselecteerd als concentratieniveaus voor validatiestudies (d.w.z. terugwinning, herhaalbaarheid, enz.).
  4. Verdeel de 600 μl van elke werkende standaardoplossing in drie amberkleurige glazen flesjes van 2 ml door 200 μl te pipetteren en breng ze droog op.
    OPMERKING: Stap 1.2 tot en met 1.4 worden schematisch uitgelegd in Figuur 1. Door de standaardwerkoplossingen te verdelen en te drogen, is het mogelijk om op drie verschillende dagen in drievoud te versterken, zoals vereist door de validatiestudie, zonder de chemische integriteit van de EA's te verliezen.
  5. Resuspendeer op elke validatiedag een amberkleurige glazen injectieflacon van 2 ml van elk verrijkingsniveau in 200 μl acetonitril.
    OPMERKING: Elk verrijkingsniveau wordt in drievoud beoordeeld met behulp van 50 μL per monster; daarom zal in totaal 150 μL van de oplossing worden gebruikt.

2. Bereiding van reagentia en oplossingen

OPMERKING: Gebruik nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril.

  1. Bereid een ammoniumcarbonaatoplossing van 5 mM door 24,02 mg ammoniumcarbonaat af te wegen en op te lossen in 50 ml water. Weeg 24,02 mg ammoniumcarbonaat af in een bekerglas en voeg ongeveer 5 ml water toe. Los het ammoniumcarbonaat op door de oplossing voorzichtig met de hand te schudden en breng het vervolgens over in een maatkolf van 50 ml. Om het uiteindelijke volume van 50 ml te bereiken, spoelt u het bekerglas met extra water en brengt u het rijzend over naar de maatkolf.
  2. Bereid 250 ml van de extractieoplossing [acetonitril: 5 mM ammoniumcarbonaat (85:15, v/v)] door 212,5 ml acetonitril en 37,5 ml van de ammoniumoplossing bereid in stap 2.1 te mengen.
  3. Bereid 100 ml van een mengsel van methanol en water (1:1, v/v) om de monsterextracten opnieuw te suspenderen (stap 8.8.).
  4. Weeg voor elk monster 150 mg van een dispersief vastefasemateriaal C18:sorptiemiddel op basis van zirkoniumoxide (1:1, m/w) af in centrifugebuisjes van 15 ml voor dispersieve opruimfase (stap 8.5.).
  5. Bereid de oplosmiddelen voor op chromatografische scheiding in twee verschillende flessen, namelijk 1 L ultrapuur water (oplosmiddel A) en methanol (oplosmiddel B), die beide 0,3% (v/v) mierenzuur bevatten. Om deze concentratie te bereiken, werd 3,03 ml mierenzuur (99% zuiverheid) aan de flessen toegevoegd.
    OPMERKING: Oplosmiddelen voor de mobiele fase moeten vlak voor het uitvoeren van de LC-IMS-MS-analyses worden voorbereid.

3. Instrumentele parameters instellen

OPMERKING: Het instrument dat werd gebruikt om deze LC-IMS-MS-studie uit te voeren, was een UHPLC in combinatie met een IM-HRMS, uitgerust met een vacuümgeïsoleerde sonde verwarmde elektrospray-ionisatiebron (VIP-HESI). Het instrument werd in positieve modus bediend.

  1. Creëer een chromatografische methode met behulp van de acquisitiesoftware voor de scheiding van de analyten door de volgende elutiegradiënt in te stellen: 0 min, 10% B; 2 min, 10% B; 4,5 min, 40% B; 9 minuten, 45% B; 11 minuten, 95% B; 12 minuten, 95% B; 13 minuten, 10% B; 16 min, 10% B.
  2. Stel het mobiele fasedebiet in op 0.4 ml/min, de kolomtemperatuur op 35 °C en het injectievolume op 5 μl. Houd indien mogelijk een vaste temperatuur van 10 °C aan in de autosampler.
  3. Stel de IMS-parameters als volgt in: mobiliteitswaarden (1/K0), van 0,1 tot 1,5 V·s/cm2; aanlooptijd, 100 ms; nauwkeurigheidstijd, 10 ms; inschakelduur, 10%; en hellingssnelheid, 9,05 Hz.
  4. Stel de ionenbronparameters voor MS-detectie als volgt in: capillaire spanning, 2.500 V; vernevelingsdruk, 2,5 bar; droog gasdebiet, 8 l/min; temperatuur droog gas, 200 °C; temperatuur van het mantelgas, 450 °C; mantelgasdebiet, 4 l/min. Selecteer voor MS-acquisitie de volgende parameters, rekening houdend met twee scangebeurtenissen: volledige scan van het gehele massaspectrum met een m/z van 20 tot 1.300 gevolgd door bbCID (broadband collision-induced dissociation), die productionen genereert van elke voorloper met drie vaste botsingsenergie van 24, 36 en 50 eV. Voer ionisatie en gegevensverzameling uit in de positieve polariteitsmodus.
  5. Sla dit bestand met de acquisitiemethode op voor verder gebruik.

4. Gegevensverzameling uit de analytische standaarden van EA's

OPMERKING: Gebruik nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril alleen voor stap 4.1.

  1. Bereid twee amberkleurige injectieflacons van 1,5 ml met 500 μl tussenoplossing van 1.000 ng/ml en een andere injectieflacon met een mengsel van oplosmiddelen A en B (1:1, v/v) als wasoplossing.
  2. Kalibreer het timsTOF-instrument zoals aangegeven door de fabrikant en selecteer een positieve polariteit voor zowel IMS- als MS-acquisities.
  3. Plaats de C18-kolom (zie Materiaaltabel) in de LC-oven, met de temperatuur ingesteld op 35 °C zoals aangegeven in het bestand met de acquisitiemethode dat is opgeslagen in stap 3.5.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat beide uiteinden goed zijn vastgedraaid; Anders wordt lekkage van de mobiele fase waargenomen.
  4. Conditioneer de LC-kolom om een mobiel fasedebiet van 0.1 ml/min mogelijk te maken en selecteer een oplosmiddel A- en B-mengselverhouding van 90:10 (%) als de initiële samenstellingsverhouding van de mobiele fase.
  5. Wacht tot de kolomdruk stabiel is (~130 bar).
  6. Verhoog het mobiele fasedebiet tot 0.2 ml/min, wacht tot de druk stabiliseert en verhoog deze opnieuw tot 0.3 ml/min.
  7. Zodra de druk weer stabiliseert, stelt u het debiet in op 0.4 ml, wat het werkdebiet is zoals beschreven in het bestand met de acquisitiemethode dat is opgeslagen in stap 3.5, en wacht u tot de druk zich stabiliseert rond de 350 bar.
    OPMERKING: Het is belangrijk om het debiet niet direct te verhogen van 0,2 naar 0,4 ml/min. Een sterke verandering in de stroming veroorzaakt hogedrukpieken die de chromatografiekolom kunnen beschadigen.
  8. Terwijl de kolom wordt geconditioneerd, schrijft u de werklijst, inclusief twee monsters die overeenkomen met de twee injectieflacons met de EAs-tussenoplossing van 1.000 ng/ml, zoals aangegeven in stap 4.1, en de wasfles. Analyseer de wasflacon twee keer, aan het begin en einde van de monsterbatch.
  9. Laad in de kolom Methodebestand van de werklijst het bestand met de acquisitiemethode dat eerder is opgeslagen in stap 3.5.
  10. Maak een map om alle verkregen gegevensbestanden op te slaan en alle voorbeelden te routeren door de map te selecteren in de kolom Voorbeeldpad .
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u dezelfde map gebruikt om alle bestanden die tijdens het validatieonderzoek zijn gegenereerd, op te slaan voor verdere verwerking. Tijdens de kolomconditionering kunnen de waarden waarbij de druk stabiliseert enigszins variëren. Zorg er echter voor dat de druk stabiel is voordat u het debiet opnieuw verhoogt om de integriteit van de kolom te behouden. Bovendien moet de druk, wanneer het werkdebiet is bereikt, ook stabiel zijn om een reproduceerbare chromatografische scheiding te bereiken.
  11. Ga naar de bovenste werkbalk van de software en voer de werklijst uit.

5. Gegevensverwerking voor het creëren van een kwantificeringsmethode

  1. Zodra de werklijst is uitgevoerd, opent u de kwalitatieve software.
  2. Laad alle geanalyseerde monsters door te klikken op Bestand | Open werklijst.
  3. Klik met de rechtermuisknop op een monster dat overeenkomt met de EAs-tussenoplossing bij 1.000 ng/ml, ga naar Chromatogram bewerken en selecteer vervolgens Type | Geëxtraheerd ionchromatogram en voer de theoretische molecuulmassa van het geprotoneerde ion in met betrekking tot elke EA. Klik vervolgens op Toevoegen en ten slotte op OK. Aangezien de set analyten wordt gevormd door zes EA's en hun gerelateerde epimeren die exact dezelfde massa delen, verschijnen er zes geëxtraheerde ionenchromatogrammen.
    OPMERKING: De parameter Breedte wijzigt hoe smal het m/z-venster is. Het wordt aanbevolen om een voldoende breed m/z-venster te kiezen in geval van problemen bij het vinden van de chromatografische piek van de analyt van belang. Het is echter raadzaam om smalle m/z-vensters in te stellen om mogelijke interferentie te voorkomen (minder dan 0,05 eenheden).
  4. In elk geëxtraheerd ionchromatogram verschijnen twee chromatografische pieken die verband houden met de belangrijkste EA en zijn epimeer. Klik met de rechtermuisknop terwijl u het hele gebied van één piek selecteert. Bijgevolg zal het ionenmobiliteitsspectrum er direct onder verschijnen.
  5. Ga naar de x-as van het ionenmobiliteitsspectrum, klik met de rechtermuisknop en klik vervolgens op Collision Cross Section. Noteer de CCS-waarde.
    OPMERKING: Als de CCS-waarden niet automatisch verschijnen, gaat u naar Kalibreren in de bovenste werkbalk, vervolgens naar Mobiliteitscalculator en typt u handmatig de mobiliteitswaarde om de bijbehorende CCS te verkrijgen.
  6. Selecteer het gebied dat overeenkomt met de andere chromatografische piek binnen hetzelfde ionenchromatogram en herhaal stap 5.4. en 5.5.
  7. Op dezelfde manier verschijnt het fragmentatiepatroon ook na stap 5.4. Op basis van het fragmentatiepatroon dat in literatuur en databases wordt gerapporteerd, vergelijkt en kiest u het meest intense production als aanvullend identificatiepunt.
  8. Noteer de retentietijd, CCS-waarde en exacte massa van het hoofdionadduct (meestal het geprotoneerde ion) van elke EA om een kwantificeringsmethode te creëren.
  9. Herhaal stap 5.4 tot en met 5.8. voor de overige analyten.
  10. Selecteer alle molecuulmassa's die in stap 5.3 zijn gegenereerd door erop te klikken terwijl u op Ctrl drukt. Klik vervolgens met de rechtermuisknop en selecteer Kopiëren. Ga naar het andere voorbeeld dat overeenkomt met de tussenoplossing van EAs, klik er met de rechtermuisknop op en selecteer Plakken. De ionchromatogrammen en mobiliteitsspectra worden automatisch geëxtraheerd.
  11. Controleer de identificatieparameters voor alle analyten in dit tweede monster.

6. Invoering van een gegevensverwerkingsmethode voor de routinematige bepaling van moederkorenalkaloïden

  1. Open de software en klik op het tabblad Methodebeheer .
  2. Klik op Analyte-instellingen en voer de naam van elke EA in, naast de retentietijd, de CCS-waarde en de massa van de geprotoneerde adducten die in stap 5.4 zijn verzameld. tot 5.9. Wijzig de tolerantie van elk identificatiepunt indien nodig, hoewel de standaardinstellingen worden aanbevolen voor de toepassing van dit protocol.
    OPMERKING: Hoe hoger de ingestelde tolerantiewaarden, hoe groter de kans om met valse positieven om te gaan, aangezien een grotere afwijking van de theoretische waarden wordt geaccepteerd. Evenzo kunnen te strenge tolerantiewaarden leiden tot vals-negatieven. Dit gebeurt wanneer de afwijking van de theoretische waarde uitsluitend wordt veroorzaakt door de prestaties van het instrument.
  3. Bewaar de kwantificeringsmethode voor verder gebruik.

7. Bemonstering

  1. Koop monsters van tarwe en haver in supermarkten, bij voorkeur in containers van 1 kg, volgens de richtlijnen voor bemonstering die zijn opgesteld door de Europese Commissie20. Als er geen verpakkingen van 1 kg beschikbaar zijn, zorg er dan voor dat u ten minste 50 g monsters bij de hand heeft om de hele analyse te voltooien.
  2. Maal de monsters met behulp van een molen. In dit onderzoek werd een messenslijper gebruikt om de volledige inhoud van de verpakkingen te malen, die vervolgens werden teruggebracht naar hun oorspronkelijke verpakkingen voor homogenisatie.
    NOTITIE: Reinig de molen grondig tussen de monsters om kruisbesmetting te voorkomen. Gebruik een laboratoriumjas.
  3. Verdeel de gehomogeniseerde monsters in centrifugebuisjes van 50 ml en bewaar ze op koele en droge omstandigheden.

8. Voorbereiding van het monster

  1. Bereid een schema voor om het validatieonderzoek gedurende drie niet-opeenvolgende dagen uit te voeren (om de interne reproduceerbaarheid te beoordelen). Test voor elke dag drie concentratieniveaus door monsters te versterken bij 225 ng/g (1,5 ml), 150 ng/g (ML) en 75 ng/g (0,5 ml). Bestudeer elk niveau in drievoud, wat neerkomt op negen steekproeven met spikes plus nog eens drie blanco monsters per dag.
    OPMERKING: Rekening houdend met de 3 validatiedagen, zijn er in totaal 36 monsters nodig naast nog eens 8 blanco monsters die bedoeld zijn voor het voorbereiden van de matrix-gematchte kalibratiecurve. Gebruik nitrilhandschoenen, laboratoriumjas en veiligheidsbril voor dit hele deel van het protocol.
  2. Weeg 1 g monster af in een centrifugebuis van 50 ml.
    OPMERKING: Versterk bij het uitvoeren van het validatieonderzoek de monsters net na het wegen met 50 μL van de overeenkomstige werkende standaardoplossing zoals beschreven in stap 1.3. en 1.5.
  3. Voeg 4 ml van de extractieoplossing toe [acetonitril:5 mM ammoniumcarbonaat waterige oplossing (85:15, v/v)]. Vortex het monster gedurende 1 min.
  4. Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 9.750 × g en 4 °C.
    OPMERKING: De capaciteit van de centrifuge kan een beperkende factor zijn in de procedure, dus het wordt aanbevolen om tegelijkertijd alleen het exacte aantal monsters te extraheren dat in de centrifuge past.
  5. Breng het hele bovenstaande over in de centrifugebuis van 15 ml die 150 mg van het mengsel van opruimsorptiemiddelen (1:1, m/m) bevat. Vortex het monster gedurende 1 min.
  6. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 9.750 × g en 4 °C.
  7. Verzamel het bovenstaande en doe het in een amberkleurig glazen flesje van 4 ml. Verdamp het extract onder een zachte stroom stikstof.
    OPMERKING: Monsters moeten gedroogd worden bewaard bij -20 °C als ze niet op dezelfde dag worden geanalyseerd.
  8. Reconstitueer het monster in 750 μl van het mengsel methanol:water (1:1, v/v).
  9. Breng het extract over in een spuit van 2 ml en filtreer het door een nylonfilter van 0,22 μm in een amberchromatografische injectieflacon van 1,5 ml.
  10. Verzamel de gereconstitueerde extracten van de acht blanco monsters die bestemd zijn voor de matrix-afgestemde kalibratiecurve in een amberkleurige glazen injectieflacon van 12 ml (elk monster wordt geresuspendeerd in 750 μl, wat een totaal volume van 6 ml vertegenwoordigt).
  11. Pipetteer 1 ml van de tussenoplossing bij 1.000 ng/ml (83,33 ng/ml voor elke ergot-alkaloïde) (stap 1.2) in een amberkleurige glazen injectieflacon van 2 ml, droog het oplosmiddel onder een zachte stikstofstraal en suspendeer in 1 ml van het eerder verzamelde blanco monsterextract.
    OPMERKING: Dit mengsel in een concentratie van 1.000 ng/ml (83,33 ng/ml voor elke EA) zal worden gebruikt om de matrix-gematchte kalibratiecurve voor te bereiden.
  12. Bereid tien amberkleurige glazen flesjes van 2 ml voor en doe in elk flesje 450 μl blanco monsterextract (stap 8.10) en markeer ze met nummers van 1 tot 10. Elke injectieflacon is een punt van de kalibratiecurve.
    OPMERKING: In dit protocol werd 450 μL gebruikt, omdat dit de laagste waarde was die het LC-apparaat in de injectieflacon kon bereiken zonder inserts te gebruiken. Als de naald niet zo ver in de injectieflacon komt, verhoog dan het volume en bereken dus hoeveel extra blanco monsters moeten worden geëxtraheerd, rekening houdend met het feit dat elk monster wordt geresuspendeerd in 750 μL methanol:water (1/1, v:v) mengsel.
  13. Bouw de kalibratiecurve op door middel van seriële verdunning. Breng 450 μl van het in stap 8.11 bereide mengsel over. in injectieflacon 1, die al 450 μl blanco monsterextract bevat, om een concentratie van 41,67 ng/ml (het hoogste kalibratiepunt) te bereiken. Draai de injectieflacon gedurende 2 minuten.
    OPMERKING: Het volume van het mengsel moet overeenkomen met het volume van het blanco monsterextract om in elke stap twee keer te verdunnen.
  14. Breng 450 μl over van injectieflacon 1 naar injectieflacon 2, die al 450 μl blanco monsterextract bevat, om een concentratie van 20,83 ng/ml te bereiken (het op één na hoogste kalibratiepunt).
  15. Herhaal stap 8.14 (d.w.z. van injectieflacon 2 naar injectieflacon 3, enzovoort) en ga vervolgens door totdat de tien kalibratiepunten zijn verkregen. Het concentratiebereik voor elke EA is dan: 41.67, 20.83, 10.42, 5.21, 2.60, 1.30, 0.65, 0.33, 0.16 en 0.08 ng/ml.
  16. Bereid een standaardmengsel van 1.000 ng/ml (83,33 ng/ml voor elke EA) zoals beschreven in stap 8.11, maar gebruik een mengsel van 1 ml methanol:water (1:1, v/v).
  17. Bereid een standaardkalibratiecurve voor zoals beschreven in de stappen 8.13 tot en met 8.15, maar gebruik een mengsel van 450 μl methanol:water (1:1, v/v) voor de seriële verdunningen. Deze kalibratiecurve wordt gebruikt om het matrixeffect te evalueren door het te vergelijken met de matrix-gematchte kalibratiecurve.

9. Kwantitatieve gegevensverwerking

  1. Initialiseer en voer het instrument uit volgens de instructies beschreven in stap 4.1. tot 4.11. Zie Figuur 2 voor de werklijst die in dit protocol wordt gebruikt.
    OPMERKING: Wanneer u de werklijst voor kalibratiecurven schrijft, injecteert u deze vóór de verrijkte monsters, te beginnen met de standaard kalibratiecurve van de laagste naar de hoogste concentratie, een wasflacon met methanol:water (1:1, v/v) en de matrix-afgestemde kalibratiecurve van de laagste naar de hoogste concentratie.
  2. Open de kwantitatieve software en navigeer naar TASQ Snel tabblad | Importbatch linksonder.
  3. Selecteer de map die in stap 4.10 is gemaakt. met alle ruwe gegevens (bestanden met betrekking tot de informatie die is verkregen na de LC-IMS-MS-analyse voor alle monsters die in de werklijst zijn opgenomen).
  4. Eenmaal geïmporteerd in de software, ga je naar Batch verwerken, direct onder Batch importeren.
  5. Kies de monsters die u wilt verwerken (d.w.z. de 27 steekproeven, 9 blanco's en beide kalibratiecurves) en de gegevensverwerkingsmethode die eerder in stap 6.1 is gemaakt. tot 6.3. Er verschijnt een venster met verschillende parameters die moeten worden ingesteld (d.w.z. het type integrator om de chromatografische pieken te beoordelen of het type analytisch signaal waarmee rekening moet worden gehouden). Wijzig die parameters naar wens, hoewel de standaardwaarden geschikt zijn voor de uitvoering van dit protocol.
  6. Ga naar Screening beoordelen nadat de gegevensverwerking is voltooid en controleer of er problemen zijn met de automatische integratie, zoals de selectie van onjuiste chromatografische pieken die mogelijk te dicht bij elkaar liggen. Als dit het geval is, beperk dan de waarden die verwijzen naar retentietijdtolerantie, CCS-waardentolerantie en/of massafout die oorspronkelijk in het kwantitatieve methodebestand zijn vastgesteld en verwerk de gegevens opnieuw. Als automatische piekintegratie nog steeds onjuiste pieken selecteert, integreert u de piek handmatig door het gebied in het chromatogram te selecteren dat wordt weergegeven in het venster Review Screening (houd hiervoor rekening met de analytische parameters die zijn verkregen voor de EA-standaarden in sectie 5).
    OPMERKING: Het is erg belangrijk om elk monster te bekijken, aangezien sommige belangrijke EA-epimeerparen zeer vergelijkbare retentietijden hebben en verkeerd kunnen worden geïdentificeerd door de software.
  7. Wanneer alle pieken voor alle monsters met succes zijn geïntegreerd, klikt u op het tabblad Batchbeheer in de linkerbovenhoek en geeft u het type monster aan dat bij elke analyse hoort: oplosmiddel, blanco, kwaliteitscontrole, monster of kalibratiepunt. Wijs in het laatste geval elk kalibratiepunt op een niveau toe met een nummer.
  8. Navigeer op hetzelfde tabblad Batchbeheer naar het onderste venster met de naam Batchconcentratie en geef een concentratiewaarde op voor elk niveau dat in de vorige stap is vastgesteld. Zodra dit is gebeurd, klikt u op Concentraties opslaan.
  9. Klik op Batch kwantificeren en wijzig de parameters naar wens (d.w.z. het model dat past bij de kalibratiegegevens, weging, of het model gedwongen wordt nul te overschrijden, enz.). De standaardwaarden zijn geschikt voor de uitvoering van dit protocol, met uitzondering van de weging van de kalibratiecurves, die is overgeschakeld naar 1/x.
    OPMERKING: Aangezien de software slechts één kalibratiecurve tegelijk kan beschouwen, is het noodzakelijk om stap 9.9 twee keer te herhalen om informatie te krijgen over standaard- en matrix-gematchte kalibratiecurves. In dit protocol werden matrix-gematchte kalibratiecurven gebruikt voor de kwantificering van analyten, dus de kalibratiecurves van het oplosmiddel werden eerst beoordeeld, kalibratiegegevens werden geëxtraheerd zoals later uitgelegd in stap 9.13, en ten slotte werden de matrix-gematchte kalibratiecurven geselecteerd om de kwantificering van monsters uit te voeren.
  10. Zodra de kwantificering van moederkorenalkaloïden is uitgevoerd volgens het bestand met de kwantificeringsmethode, klikt u op het tabblad Kwantificering in het bovenste gedeelte van het scherm.
  11. Als de standaardparameters die in stap 9.9 zijn ingesteld geen goede lineariteit en precisie bieden, pas dan de kalibratiecurves aan door de fitting en het gewicht te wijzigen door met de rechtermuisknop op de grafiek te klikken met als doel een goed lineair model (R2 > 0,99) te hebben met voldoende precisie op elk kalibratieniveau (afwijking minder dan 20%).
    OPMERKING: De software markeert de cellen van de kalibratieniveaus die niet de juiste precisie bieden, rood.
  12. Als u klaar bent, klikt u met de rechtermuisknop op de batchmap uiterst links in het scherm en selecteert u Rapport genereren. Selecteer vervolgens Kwantificering van analyten om het rapport naar het gewenste formaat te exporteren.

Resultaten

Eerst werden werkende standaardoplossingen in het LC-IMS-MS-instrument geïnjecteerd om alle identificatiekenmerken (d.w.z. retentietijd, CCS en massaspectra) van elke EA die hier werd geanalyseerd, te verkrijgen. Omdat de identificatieparameters, behalve de exacte massa, aanvankelijk onbekend waren, was de acquisitiemethode gebaseerd op een gebeurtenis met twee scans, te beginnen met een volledige scan van het volledige massaspectrum gevolgd door een bbCID. De retrospectieve manier om dit onderzoek te benaderen wordt mogelijk gemaakt door de Q-TOF massaspectrometer met hoge resolutie, die gegevens verwerft en genereert zonder enige input of voorafgaande informatie over de analyten. De exacte massa van elk paar hoofd-EA-epimeer werd doorzocht in de verkregen gegevens om ook hun andere identificatiekenmerken te verkrijgen (d.w.z. retentietijden en CCS-waarden), die zullen worden gebruikt om een kwantitatieve methode voor de verwerking van monstergegevens te creëren. De experimentele parameters die na de analyse zijn verkregen, worden gedetailleerd beschreven in tabel 1.

Chromatografische scheiding leverde duidelijke en goed opgeloste pieken op voor elk hoofdpaar EA-epimeer, behalve Et en Etn (Figuur 3). De overeenkomsten tussen de retentietijden van de chromatografische pieken van Et (6,85 min) en Etn (6,98 min) zorgden voor een ontoereikende resolutie tussen beide, wat een lichte overlapping vertoont en bijgevolg kan leiden tot verkeerde kwantificering, aangezien retentietijden tijdens de runs kunnen afwijken. Niettemin wordt een basisscheiding van hetzelfde paar moleculen waargenomen in de ionenmobiliteitsspectra (Figuur 4), waardoor voor elke analyt te onderscheiden CCS-waarden worden verkregen; daarom worden de voordelen aangetoond van het implementeren van IMS bij het werken met een reeks structureel vergelijkbare verbindingen.

Nadat de identificatieparameters voor elke EA waren vastgesteld, werd de set monsters opgesteld in overeenstemming met de huidige Europese wetgeving voor de validatie van analysemethoden20. Op basis van de door de Europese autoriteiten vastgestelde ML werden drie kalibratieniveaus geselecteerd: de limiet zelf (150 μg/kg), 1,5x de ML (225 μg/kg) en 0,5x de ML (75 μg/kg). Het is erg belangrijk om in gedachten te houden dat deze ML overeenkomt met de totale som van de 12 EA's. Voor validatiedoeleinden werd gekeken naar een gelijke bijdrage voor de ML; dus de geteste concentratieniveaus correleerden met respectievelijk 12,50, 18,75 en 6,25 μg/kg voor elke EA. Bovendien werd een set van acht blanco monsters en twee kalibratiecurves bereid in een puur oplosmiddel (standaard kalibratiecurve) samen met een matrix-gematchte kalibratiecurve, en werden deze geanalyseerd binnen dezelfde analytische batch. Het lineaire bereik werd geëvalueerd op zeven punten in het concentratiebereik van 0,08 tot 41,6 ng/L (instrumentele concentratieniveaus voor elke EA). De prestaties van de methode worden weergegeven in tabel 2.

Eerst werden de kalibratiecurven voor elke verbinding gebouwd in de kwantitatieve software en werd het lineaire bereik geëvalueerd met behulp van het piekgebied als functie van de analytconcentratie. Het is belangrijk om een goede lineaire pasvorm te bereiken (R2 > 0,99) en tegelijkertijd te zorgen voor een relatieve standaarddeviatie van minder dan 20% in termen van precisie voor elk concentratieniveau. Om dat te doen, kan de weging van de curve worden omgeschakeld naar "1/x". Een goede lineariteit werd waargenomen voor alle analyten in het lineaire bereik van 2,6-41,3 ng/ml (1,95-31,2 g/kg in monsters); hoewel voor sommige analyten het lineaire bereik zelfs nog groter was met een ondergrens van 0,65 ng/ml, terwijl een signaal-ruisverhouding van meer dan 10 behouden bleef. Figuur 5 toont een voorbeeld van de (a) standaard en (b) matrix-gematchte kalibratiecurve voor Econ.

Vergelijking tussen de hellingen van standaard- en matrix-gematchte kalibratiecurven geeft informatie over hoe de potentiële co-elutanten van de matrix de analyse kunnen beïnvloeden. Deze storing staat bekend als het signaalonderdrukkings-/versterkingseffect (SSE) en kan worden beoordeeld door de hellingen van beide kalibratiecurven te vergelijken en de volgende vergelijking toe te passen:

figure-results-1

Zoals te zien is in tabel 2, varieerde de SSE van -23 tot 18%, wat aangeeft dat de aanwezigheid van de matrix bijna geen invloed heeft op de ionisatie van de analyten; Daarom kan hun kwantificering worden uitgevoerd met behulp van de standaard kalibratiecurve.

Vervolgens, de invloed van de matrix kennende, bestaat de volgende stap uit de kwantificering van de spiked monsters op de drie eerder genoemde concentratieniveaus, met behulp van de kalibratiecurves, om te evalueren hoeveel van de initiële EA wordt teruggewonnen na het extractieproces. Vanwege de getoonde lage SSE werden de in oplosmiddel voorbereide kalibratiecurves in de kwantitatieve software gebruikt om automatisch de concentratie van de spiked monsters te bepalen. Om het herstel te berekenen, werd de gemeten concentratie vervolgens vergeleken met de theoretische concentratie volgens de volgende vergelijking:

figure-results-2

Alle analyten vertoonden herstelwaarden binnen het bereik van 72-117% voor alle concentratieniveaus. Dit betekent dat de methode metingen van de concentratie in de gespikete monsters opleverde die dicht genoeg bij de theoretische waarden lagen, waardoor de juiste juistheid werd aangetoond. Niettemin vertoonde de methode een beperkte waarheidsgetrouwheid voor Etn, waarvan de concentratiewaarden varieerden van 43% tot 45%, verwijzend naar de theoretische versterkingsniveaus. De precisie van de metingen werd bepaald door de relatieve standaarddeviatie (RSD) van de terugvorderingen te berekenen voor elk verrijkingsniveau dat op dezelfde dag werd verkregen (RSDr, n = 3) en gedurende het hele onderzoek (RSDWR, n = 9). Een acceptabele precisie werd waargenomen, aangezien alle waarden onder de 20% varieerden.

Om de gevoeligheid van de voorgestelde methode te evalueren, werden ten slotte LOQ's geschat op basis van de matrix-gematchte kalibratiecurve. In dit protocol werden deze waarden bepaald als de laagste concentratie binnen het lineaire bereik van de curve die een afwijking van minder dan 20% van de theoretische waarde en een signaal-ruisverhouding van meer dan 10 vertoonde. Zoals te zien is in tabel 2, varieerden de LOQ's van 0,65 tot 2,60 ng/ml (0,49 tot 1,95 μg/kg in monsters).

figure-results-3
Figuur 1: Schematische workflow voor het opstellen van tussen- en werkende standaardoplossingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 2: Werklijst ontworpen voor LC-IMS-MS-analyse in de validatiestudie van gepoolde graanmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 3: Overlappende geëxtraheerde ionenchromatogrammen van de geanalyseerde EA's. Afkortingen: EAs = moederkorenalkaloïden; Eco = Ergocornine; Econ = Ergocorninine; Ecr = Ergocristine; Ecrn = Ergocristinine; Ekr = Ergokryptine; Ekrn = Ergokryptinine; Emn = Ergometrinine; Es = Ergosine; Esn = Ergosinine; Et = Ergotamine; Etn = Ergotaminine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 4: Geëxtraheerd ionenchromatogram (boven) en ionenmobiliteitsspectra (onder) van Et en Etn. Afkortingen: Et = Ergotamine; Etn = Ergotaminine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 5: Kalibratiecurven van Econ. (A) Puur oplosmiddel en (B) matrix-gematcht. Afkorting: Econ = Ergocorninine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

AnalytenRt (min)CCS (Å2)[M+H]+ (m/z)
Eco6.95231.67562.3029
Econ8.21229.96562.3029
Ecr8.61237.74610.3029
Ercn9.85235.56610.3029
Ekr8.15233.61576.3185
Ekrn9.38229.93576.3185
Em3.57179.35326.1668
Emn4.48179.01326.1668
Es6.41229.29548.2872
Esn6.54226.65548.2872
Et6.85230.33582.2716
Etn6.98228.3582.2716

Tabel 1: Gekarakteriseerde LC-IMS-MS-parameters voor eenduidige identificatie van moederkorenalkaloïden met toepassing van de methode die in dit protocol wordt beschreven. Afkortingen: Rt = Retentietijd; CCS = Botsingsdoorsnede; LC-IMS-MS = vloeistofchromatografie-ionenmobiliteit-massaspectrometrie.

Herstel (%)Precisie (%) [RSDr, (RSDWR)]
AnalytenLineariteit (V2)SSE (%)0,5 mlML1,5 ml0,5 mlML1,5 mlLOQ in monster (μg/kg)
Eco0.9937-231141111006 (15)4 (19)13 (17)0.49
Econ0.9915-121051171246 (10)7 (18)8 (14)0.49
Ecr0.9965187910711013 (19)13 (18)6 (18)0.49
Ercn0.9906-209911010410 (15)11 (10)12 (10)0.49
Ekr0.992-10106101936 (9)7 (7)10 (9)0.49
Ekrn0.9925-16971181145 (11)7 (4)9 (9)0.98
Em0.9947-97279747 (8)6 (5)9 (9)0.98
Emn0.9909-328387846 (5)11 (10)7 (9)1.95
Es0.9953-16891121115 (7)8 (5)15 (8)0.98
Esn0.9971-138690813 (6)14 (12)10 (10)0.49
Et0.9953-1679888112 (15)19 (18)11 (20)0.98
Etn0.9997-14543449 (12)5 (13)12 (17)0.98

Tabel 2: Methodeprestaties van EA's in termen van lineariteit, matrixeffect, herstel, precisie en kwantificeringslimieten. Afkortingen: Eco = Ergocornine; Econ = Ergocorninine; Ecr = Ergocristine; Ecrn = Ergocristinine; Ergokryptine = Ekr; Ergokryptinine = Ekrn; Emn = Ergometrinine; Es = Ergosine; Esn = Ergosinine; Et = Ergotamine; Etn = Ergotaminine; LOQ = Limiet van de bepaalbaarheid; ML = Maximaal niveau; RSDr = herhaalbaarheid relatieve standaarddeviatie; RSDWR = binnen de relatieve standaarddeviatie van het laboratorium; SEE = onderdrukking/versterkend effect.

Discussie

Het succesvolle gebruik van dit protocol is gebaseerd op de optimalisatie van de extractieprocedure, eerder uitgevoerd door Carbonell-Rozas et al.17, die het gebruik van een extractieoplosmiddel implementeerden dat effectief genoeg is om EA's te extraheren uit complexe voedselmatrices zoals gerst en tarwe, en een opschoning die relatief lage SSE-waarden opleverde. De keuze van het extractieoplosmiddel is een cruciale stap, gezien de chemische eigenschappen van de analyten en de labiliteit van EA's voor ontleding en epimerisatie, maar tegelijkertijd de samenstelling van de matrix die wordt geanalyseerd. In dit geval bieden EA's (en mycotoxinen in het algemeen) een zeer goede efficiëntie wanneer acetonitril (een niet-protisch oplosmiddel dat epimerisatie zou kunnen voorkomen) het geselecteerde oplosmiddel is 21,22,23,24. Bovendien verhoogt de toevoeging van ammoniumcarbonaat in het geval van EA's de extractie-efficiëntie door een basische pHvan 25 te verkrijgen. Bovendien is de verhouding tussen oplosmiddel en monster iets om rekening mee te houden, aangezien het gebruik van kleine hoeveelheden oplosmiddel verzadiging26 kan veroorzaken, wat tot uiting komt in slechte herstelwaarden. Bovendien impliceren hoge oplosmiddelvolumes een grotere verdunning van de analytoplossingen, wat de detectie ervan belemmert en/of de extractie van matrixverbindingen bevordert die de bepaling ervan kunnen verstoren. De volgende stap in deze extractiemethodologie - de opruimstap - moet worden ontworpen vanuit een geschikt perspectief, rekening houdend met de samenstelling van de matrix. Dit zal uiteindelijk bepalen hoe schoon de extracten zijn en hoe sterk de matrix de analytische bepaling beïnvloedt. In dit protocol werd een C18:Z-Sep+ mengsel (1:1, w/w) met succes gebruikt als een dispersief vastefase-sorptiemiddel, zoals blijkt uit de relatief lage SSE die wordt gerapporteerd. Rekening houdend met het feit dat EA's goed worden geëxtraheerd met acetonitril, kunnen ook andere zwakke of niet-polaire co-elutanten in het extract worden verwacht. In deze context is C18 een reinigend sorptiemiddel dat traditioneel wordt gebruikt voor algemene doeleinden, waarbij niet-polaire verbindingen uit de matrix worden behouden, terwijl Z-Sep+ meestal wordt aanbevolen voor matrices die een hoog percentage vet of pigmenten bevatten27. Het is belangrijk op te merken dat de meeste sorptiemiddelen, ook het veelgebruikte primair-secundaire amine (PSA) of grafitized carbon black (GCB), kunnen interageren met de analyten, waardoor ze in de vaste fase blijven en ze verloren gaan voor een latere analytische bepaling28. Mogelijke interacties tussen analyten en sorptiemiddelen kunnen ook een kwestie van studie zijn bij het optimaliseren van de opruimstap, dus het veranderen van de typologie of, nog belangrijker, de hoeveelheid sorptiemiddel kan een goed startpunt zijn voor optimalisatie. In dit protocol werd een eerder ontwikkelde extractiemethode toegepast, ondanks dat de hier waargenomen waarheid voor Etn sterk verschilde van de waarden die in de vorige studie waren verkregen. Hoewel het paar Et/Etn als chemisch stabiel is gerapporteerd29, zijn er eerder inconsistenties waargenomen na langdurige opslag30. Dit protocol is ontworpen om de integriteit van de analytische standaarden te behouden door te drogen, op te slaan en vervolgens opnieuw te suspenderen op dezelfde dag van analyse; niettemin moet de integriteit van de analytische standaarden van EA's worden gecontroleerd voordat met het experimentele deel wordt begonnen.

Dit protocol kiest LC-IMS-MS als analytisch platform om de toepasbaarheid en verbeterde prestaties aan te tonen in vergelijking met traditionele LC-MS-benaderingen waarbij dezelfde EA's worden bepaald. Zoals te zien is in figuur 3, is de chromatografische scheiding van de onderzochte EA's optimaal voor vijf van de zes belangrijkste EA-epimeerparen, wat betekent dat een nog meer geoptimaliseerde chromatografische methode kan resulteren in een volledige scheiding van de pieken. Desalniettemin was er geen extra inspanning nodig om de chromatografische scheiding te verbeteren, aangezien de IMS-dimensie in staat was om de slechte resolutie te herstellen die in LC werd getoond. Het nadeel van verminderde optimalisatie in chromatografische scheiding is de toegenomen complexiteit van de gegevensverwerking, als gevolg van de introductie van een extra scheidingsfase die een extra dimensie toevoegt. Hoewel dit protocol theoretisch is ontworpen als een gerichte methode voor de specifieke bepaling van EA's, werd gegevensverzameling in massaspectrometrie met hoge resolutie (HRMS) uitgevoerd als een niet-gerichte screening. Dit betekent dat het instrument voortdurend elk kenmerk van de steekproef scande en dat EA's achteraf werden geïdentificeerd en gekwantificeerd. Het is bekend dat deze aanpak de gevoeligheid van de methode vermindert, maar integendeel de identificatie van onbekende verbindingen mogelijk maakt. Niettemin zijn de LOQ's gerapporteerd in tabel 2 [0,65 - 2,6 ng/ml (0,49 - 1,95 μg/kg in monsters)] vergelijkbaar met die gerapporteerd door traditionele LC-MS-methoden voor de bepaling van EA's, die werken door middel van gerichte acquisities31. Dat kan betekenen dat de implementatie van IMS een verbeterd analytisch signaal oplevert dat een betere discriminatie van het achtergrondgeluid mogelijk maakt, wat een directe invloed heeft op de gevoeligheid van de methode. Een cruciale factor die ook van invloed is op de intensiteit van het analytische signaal, is de efficiëntie van de ionisatie in de bron. Als de bron geen optimale omstandigheden biedt op het gebied van voornamelijk, spanning, gascondities en temperatuur, zullen niet alle analytmoleculen worden geïoniseerd en gedetecteerd; Dit resulteert dus in een verlies van absolute intensiteit. Daarom wordt aanbevolen om de ionenbronparameters te onderzoeken voor een verbeterd analytisch signaal.

Het doel van dit protocol is om de voordelen van het gebruik van LC-IMS-MS bij voedselveiligheidsanalyse aan te tonen, met EA-bepaling als casestudy. De integratie van ionenmobiliteitsspectrometrie in workflows voor vloeistofchromatografie en massaspectrometrie zorgt voor een verhoogde gevoeligheid en een betere resolutie om deze verbindingen te scheiden, wat bijzonder complex kan worden gezien het isomerisme van gereguleerde moederkorenalkaloïden. Zoals aangetoond, heeft dit analytische platform met succes de chromatografische uitdagingen overwonnen die werden veroorzaakt door de gedeeltelijke scheiding van de chromatografische pieken van epimeren, terwijl de niet-gerichte acquisitie tegelijkertijd LOQ's opleverde die vergelijkbaar waren met die gerapporteerd met gerichte methoden. Op basis van de aangetoonde prestaties blijkt LC-IMS-MS een krachtig analytisch platform te zijn voor het ontwikkelen van multi-residumethodologieën voor voedselcontaminanten met behulp van niet-gerichte benaderingen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Consejería de Universidad, Investigación e Innovación - Junta de Andalucía (PROYEXCEL_00195) en de postdoctorale beurs van de Generalitat Valenciana en het Europees Sociaal Fonds+ (CIAPOS/2022/049). De auteurs danken het "Centro de Instrumentación Científica (CIC)" van de Universiteit van Granada voor het verlenen van toegang tot de analytische instrumenten die in dit protocol worden gebruikt.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetonitrileVWR83640.32
Bernstein glasbuizen 4 mLVWR548-0052
Bernstein glasbuizen 12 mLVWR548-0903
Bernstein vials 1.5 mLAgilent5190-9063
Ammonium carbonaatFluka9716
Analytische weegschaal BAS 31 Boeco4400519
Weegschaal CP 323 S Sartorius23-84182
C18Supelco52604-U
Centrifugebuizen, 15 mLVWR525-1082
Centrifugebuizen, 50 mLVWR525-0155
Centrifuge Universal 320 RHettich1406
Compass HyStar BrukerAcquisitiesoftware
DataAnalysisBrukerKwalitatieve software
Elute PLUS UHPLCBruker
EVA EC-S verdamperVLMV830.012.12
Mierenzuur GR voor analyse ACS, Reag. Ph EurMerck100264
Grinder TitanMill300Cecotec1559
MethanolVWR83638.32
Milli-Q waterzuiveringssysteem (18.2 MΩ cm)MilliporeZD5211584
Pipetpunten 1- 5 mLLabortecnic162005
Pipetpunten 100 - 1000 µLLabortecnic1622222
Pipetpunten 5 - 200 µLLabortecnic162001
Pipet Transferpette S variabel, DE-M 10 - 100 µLBRAND704774
Pipet Transferpette S variabel, DE-M 100 - 1000 µLBRAND704780
Pipet Transferpette S variabel, DE-M 500 - 5000 µLBRAND704782
Spuit 2 mLVWR613-2003
Spuitfilter 13 mm, 0.22µmPhenomenexAF-8-7707-12
TASQBrukerKwantitatieve software
timsTOFPro2 IM-HRMSBruker
Vortex Genie 2Scientific Industries15547335
Zorbax Eclipse Plus RRHD C18 kolom (50 x 2.1 mm, 1.8 µm deeltjesgrootte)Agilent 959757-902
Z-Sep+Supelco55299-UZirconium-gebaseerd sorptiemiddel
Ergot alkaloïdenCAS-register sorptiemiddel
Ergocornine (Eco)Techno SpecE178564-36-3
Ergocorninine (Econ)Techno SpecE130564-37-4
Ergocristine (Ecr)Techno SpecE180511-08-0
Ergocristinine (Ecrn)Techno SpecE188511-07-9
Ergokryptine (Ekr)Techno SpecE198511-09-1
Ergopkryptinine (Ekrn)Techno SpecE190511-10-4
Ergometrine (Em)Romer Labs"002067"60-79-7
Ergometrinine (Emn)Romer LabsLMY-090-5ML479-00-5
Ergosine (Es)Techno SpecE184561-94-4
Ergosinine (Esn)Techno SpecE194596-88-3
Ergotamine (Et)Romer Labs"002069"113-15-5
Ergotaminine (Etn)Romer Labs"002075"639-81-6

Referenties

  1. Kanu, A. B., Dwivedi, P., Tam, M., Matz, L., Hill, H. H. Jr Ion mobility-mass spectrometry. J Mass Spectrom. 43 (1), 1-22 (2008).
  2. Gabelica, V., et al. Recommendations for reporting ion mobility Mass spectrometry measurements. Mass Spectrom Rev. 38 (3), 291-320 (2019).
  3. Feuerstein, M. L., et al. Comparability of steroid collision cross sections using three different IM-HRMS technologies: An interplatform study. J Am Soc Mass Spectrom. 33 (10), 1951-1959 (2022).
  4. Regueiro, J., Negreira, N., Berntssen, M. H. G. Ion-mobility-derived collision cross section as an additional identification point for multiresidue screening of pesticides in fish feed. Anal Chem. 88 (22), 11169-11177 (2016).
  5. Regueiro, J., Negreira, N., Hannisdal, R., Berntssen, M. H. G. Targeted approach for qualitative screening of pesticides in salmon feed by liquid chromatography coupled to traveling-wave ion mobility/quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Food Control. 78, 116-125 (2017).
  6. Hernández-Mesa, M., Monteau, F., Le Bizec, B., Dervilly-Pinel, G. Potential of ion mobility-mass spectrometry for both targeted and non-targeted analysis of phase II steroid metabolites in urine. Anal Chim Acta: X. 1, 100006(2019).
  7. George, A. C., et al. Interplatform comparison between three ion mobility techniques for human plasma lipid collision cross sections. Anal Chim Acta. 1304, 342535(2024).
  8. Mairinger, T., Causon, T. J., Hann, S. The potential of ion mobility-mass spectrometry for non-targeted metabolomics. Curr Opin Chem Biol. 42, 9-15 (2018).
  9. Hernández-Mesa, M., Escourrou, A., Monteau, F., Le Bizec, B., Dervilly-Pinel, G. Current applications and perspectives of ion mobility spectrometry to answer chemical food safety issues. TrAC Trend Anal Chem. 94, 39-53 (2017).
  10. European, C. Commission Regulation (EU) 2023/915 of 25 April 2023 on maximum levels for certain contaminants in food and repealing Regulation (EC) No 1881/2006. Off J Eur Union. 119, 103-157 (2023).
  11. Carbonell-Rozas, L., et al. Occurrence of egot alkaloids in major and minor cereals from Northern Italy: A three harvesting years scenario. J Agricl Food Chem. 71 (42), 15821-15828 (2023).
  12. Arroyo-Manzanares, N., Gámiz-Gracia, L., García-Campaña, A. M., Diana Di Mavungu, J., De Saeger, S. Fungal Metabolites. Jean-Michel Mérillon, J. -M., Ramawat, K. G. , Springer International Publishing. (2016).
  13. van Dongen, P., de Groot, A. History of ergot alkaloids from ergotism to ergometrine. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 60 (2), 109-116 (1995).
  14. European Food Safety Authority. Human and animal dietary exposure to ergot alkaloids. EFSA J. 15 (7), e04902(2017).
  15. Nam, M., Kim, D., Kim, M. -S. Simultaneous determination of total ergot alkaloids in wheat flour by Orbitrap mass spectrometry. Food Chem. 441, 138363(2024).
  16. García-Juan, A., León, N., Armenta, S., Pardo, O. Development and validation of an analytical method for the simultaneous determination of 12 ergot, 2 tropane, and 28 pyrrolizidine alkaloids in cereal-based food by LC-MS/MS. Food Res Int. 174 (Pt 1), 113614(2023).
  17. Carbonell-Rozas, L., Mahdjoubi, C. K., Arroyo-Manzanares, N., García-Campaña, A. M., Gámiz-Gracia, L. Occurrence of ergot alkaloids in barley and wheat from Algeria. Toxins. 13 (5), 316(2021).
  18. Carbonell-Rozas, L., Gámiz-Gracia, L., Lara, F. J., García-Campaña, A. M. Determination of the main ergot alkaloids and their epimers in oat-based functional foods by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. Molecules. 26 (12), 3717(2021).
  19. Carbonell-Rozas, L., et al. Ion mobility-mass spectrometry to extend analytical performance in the determination of ergot alkaloids in cereal samples. J Chromatogr A. 1682, 463502(2022).
  20. European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2023/2782 of 14 December 2023 laying down the methods of sampling and analysis for the control of the levels of mycotoxins in food and repealing Regulation (EC) No 401/2006. Off J Eur Union. , (2023).
  21. Carbonell-Rozas, L., Vander Cruyssen, L., Dall'Asta, C., Leggieri, M. C., Battilani, P. Fit-for-purpose method development to determine co-occurring multiclass mycotoxins in apple and apple puree samples. Food Anal Methods. 16 (8), 1403-1412 (2023).
  22. Laouni, C., et al. Emerging mycotoxin occurrence in chicken feed and eggs from Algeria. Mycotoxin Res. 40, 447-456 (2024).
  23. Ben Hassouna, K., et al. Mycotoxin occurrence in milk and durum wheat samples from Tunisia using dispersive liquid-liquid microextraction and liquid chromatography with fluorescence detection. Toxins. 15 (11), 633(2023).
  24. Narváez, A., et al. Occurrence and exposure assessment of mycotoxins in ready-to-eat tree nut products through ultra-high performance liquid chromatography coupled with high resolution Q-orbitrap mass spectrometry. Metabolites. 10 (9), 344(2020).
  25. Arroyo-Manzanares, N., Rodríguez-Estévez, V., García-Campaña, A. M., Castellón-Rendón, E., Gámiz-Gracia, L. Determination of principal ergot alkaloids in swine feeding. J Sci Food Agric. 101 (12), 5214-5224 (2021).
  26. Pereira, V. L., Fernandes, J. O., Cunha, S. C. Comparative assessment of three cleanup procedures after QuEChERS extraction for determination of trichothecenes (type A and type B) in processed cereal-based baby foods by GC-MS. Food Chem. 182, 143-149 (2015).
  27. Tuzimski, T., Szubartowski, S. Method development for selected bisphenols analysis in sweetened condensed milk from a can and breast milk samples by HPLC-DAD and HPLC-QqQ-MS: Comparison of sorbents (Z-SEP, Z-SEP Plus, PSA, C18, chitin and EMR-lipid) for clean-up of QuEChERS extract. Molecules. 24 (11), 2093(2019).
  28. Łozowicka, B., Rutkowska, E., Jankowska, M. Influence of QuEChERS modifications on recovery and matrix effect during the multi-residue pesticide analysis in soil by GC/MS/MS and GC/ECD/NPD. Environ Sci Pollut Res. 24 (8), 7124-7138 (2017).
  29. Schummer, C., Xandonella, I., van Nieuwenhuyse, A., Moris, G. Epimerization of ergot alkaloids in feed. Heliyon. 6 (6), e04336(2020).
  30. Cherewyk, J. E., Grusie-Ogilvie, T. J., Parker, S. E., Blakley, B. R., Al-Dissi, A. M. The impact of storage temperature and time on ergot alkaloid concentrations. Toxins. 15 (8), 497(2023).
  31. Silva, Â, Mateus, A. R., Barros, S. C., Silva, A. S. Ergot alkaloids on cereals and seeds: Analytical methods, occurrence, and future perspectives. Molecules. 28 (20), 7233(2023).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Detectie van ergotalkalo denvloeistofchromatografie massaspectrometrievoedselveiligheidsanalysekwantificering van mycotoxinenbotsingsdoorsnedechromatografische scheidingmatrix gematchte kalibratieQuEChERS extractieepimeerscheiding
Detectie van gereguleerde moederkorenalkaloïden in voedselmatrices door middel van vloeistofchromatografie-ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie-time-of-flight massaspectrometrie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.