Methodenartikel

Een snelle, eenvoudige workflow voor het kwantificeren van externe volwassen Drosophila-structuren

DOI:

10.3791/67485

⸱

8 november 2024

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, San José State University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een snelle, goedkope workflow voor beeldvorming met hoge resolutie van volwassen Drosophila-ogen om patronen en groeidefecten te kwantificeren. We beschrijven ons protocol voor monstervoorbereiding door middel van puntmontage, beeldacquisitie met hoge resolutie en beeldanalyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Drosophila-samengestelde oog is een nauwkeurig gevormd weefsel dat moleculaire mechanismen en biologische processen heeft onthuld die morfogenese aandrijven. Het is een eenvoudige structuur van herhalende eenheidsogen, ommatidie genaamd, die wordt gebruikt om genetische interacties en genfuncties te karakteriseren. Mutaties die de oogarchitectuur beïnvloeden, kunnen gemakkelijk worden gedetecteerd en geanalyseerd; Daarom wordt dit systeem vaak gebruikt in instellingen met te weinig middelen. Verdere fenotypische analyse omvat vaak een scanning-elektronenmicroscoop (SEM) om sterk vergrote beelden te genereren die geschikt zijn voor kwantitatieve analyse. SEM's zijn echter duur en vereisen dure reagentia; De monstervoorbereiding duurt dagen; En vaak hebben ze fulltime personeel nodig voor de monstervoorbereiding en het onderhoud van instrumenten. Dit beperkt hun bruikbaarheid bij instellingen met te weinig middelen of tijdens bezuinigingen. In de entomologie is het gebruik van digitale beeldvormingstechnologie met hoge resolutie een gangbare praktijk voor de identificatie en karakterisering van soorten. Dit artikel beschrijft een methode die strategieën combineert en digitale beeldvorming met hoge resolutie van volwassen Drosophila-structuren en kwantitatieve analyse mogelijk maakt met behulp van de open software ImageJ. De workflow is een snel en studentvriendelijk alternatief dat de beperkingen van ondergefinancierde en ondergefinancierde onderzoeksfaciliteiten verhelpt met een kosteneffectieve en snelle benadering van kwantitatieve fenotypische analyse.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila melanogaster is een krachtig genetisch modelorganisme dat al tientallen jaren wordt gebruikt om moleculaire signaalroutes en cellulair gedrag op te helderen. Veel van de evolutionair geconserveerde signaalroutes die essentieel zijn voor de ontwikkeling van meercellige cellen werden voor het eerst geïdentificeerd en hun werkingsmechanisme werd gedefinieerd in Drosophila. Ongeveer 65-75% van alle met menselijke ziekten geassocieerde genen hebben orthologen in Drosophila 1,2. Het volwassen Drosophila-oog is een belangrijk model dat onbevooroordeelde genetische screenings mogelijk heeft gemaakt die de ontdekking van belangrijke geconserveerde genen die betrokken zijn bij menselijke ziekten, waaronder kanker 3,4, neurodegeneratie5 en stofwisselingsstoornissen6, mogelijk hebben gemaakt.

Het Drosophila-oog bestaat uit ~800 eenheidsogen, ommatidia genaamd, die precies in een zeshoekig patroon over het oppervlak van het volwassen oog zijn gerangschikt7. Elk ommatidium is samengesteld uit acht fotoreceptorneuronen die een aparte locatie innemen binnen een asymmetrisch trapezium. Deze worden ondersteund door vier niet-neurale kegelcellen en twee primaire pigmentcellen die lens en pseudo-kegel afscheiden om licht te concentreren op de lichtgevoelige rhabdomeres van de fotoreceptorneuronen. Naburige ommatidia worden gescheiden door een enkele rij interommatidiale roostercellen, bestaande uit secundaire pigmentcellen, tertiaire pigmentcellen en mechanosensorische borstelcomplexen 8,9,10.

Verstoringen in de ontwikkeling van het oog zijn zichtbaar in volwassen ogen als een grotere of kleinere ooggrootte, abnormale overvloed of structuur van lenzen of borstelharen, of als een "ruw oog" waarbij het normaal invariante zeshoekige patroon zodanig is verstoord dat een rij ommatidia niet langer over het oogoppervlak kan worden gevolgd. Deze fenotypes kunnen met behulp van ontleedmicroscopen op grof weefselniveau worden gescoord. Gedetailleerde analyse van fenotypes omvat traditioneel scanning-elektronenmicroscopie, gevolgd door kwantitatieve beeldanalyse11. Scanning-elektronenmicroscopie vereist echter dure instrumenten, dure reagentia, monstervoorbereiding die dagen in beslag neemt en vaak fulltime personeel om te onderhouden.

figure-introduction-1
Figuur 1: Workflow voor het in beeld brengen van volwassen Drosophila-structuren . (A) Verzamel en fixeer volwassen Drosophila in 70% ethanol. (B) Bereid monsters voor op beeldvorming door ze op punten te monteren en op pinnen te bevestigen. (C) Verkrijg afbeeldingen met een hoge resolutie door middel van focus stacking en integratie. (D) Kwantificeer afbeeldingen met behulp van FIJI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit artikel presenteert een workflow die relatief goedkoop is, een korte voorbereidingstijd voor monsters heeft, gemakkelijk kan worden opgesteld op een laboratoriumbank van 3 voet, geen gevaarlijke materialen vereist en een langdurige aanvulling kan zijn op Drosophila-onderzoekslaboratoria (Figuur 1). Puntmontage is een entomologische techniek die wordt gebruikt om kleine, zachte insecten, zoals Drosophila12, aan de lucht te drogen en te conserveren. Deze methode is gebaseerd op het combineren van microscoopobjectieven met DSLR-camera's met hoge resolutie voor effectieve vergrotingen van 10x tot 1.000x. De beperkte scherptediepte die inherent is aan macrofotografie wordt overwonnen door focus stacking: het aan elkaar naaien van een reeks afbeeldingen waarbij het brandpuntsvlak door het betreffende exemplaar beweegt13. Deze methode levert beelden met een hoge resolutie op die geschikt zijn voor de kwantificering van fenotypes en kan gemakkelijk worden aangepast voor andere interessante structuren, zoals de vleugel, het been, de borstkas en het achterlijf. De workflow voor beeldanalyse maakt gebruik van het gratis beeldanalyseprogramma FIJI (NIH ImageJ). Deze methodologie maakt monstervoorbereiding, beeldvorming met hoge resolutie en analyse toegankelijk voor niet-gegradueerde studenten en wetenschappers bij instellingen met weinig middelen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Verzameling en fixatie van volwassen Drosophila

  1. Zet Drosophila-kruisingen of selecteer stammen op en plaats ze in flesjes met vliegenvoer. Incubeer de flesjes bij de gewenste temperatuur (meestal 25 °C) totdat de vliegen zich hebben ontwikkeld en de volwassen dieren sluiten (~10-14 dagen bij 25 °C).
  2. Verdoof de vliegen met CO2 en plaats ze op een CO2 -pad.
  3. Sorteer de vliegen met een veer en selecteer de individuen met het gewenste fenotype (bijv. rechte vleugels). Maak een verenvliegensorteerder door een ganzenveer bij te knippen zodat deze in het taps toelopende uiteinde van een serologische pipet van 1 ml past.
  4. Bereid een microcentrifugebuisje van 1,7 ml voor met 1 ml 70% ethanol. Plaats de geselecteerde vliegen in de microcentrifugebuis en leg ze op ijs. Bewaar de microcentrifugebuisjes een nacht bij 4 °C (figuur 2A).
    OPMERKING: Bewaar vliegen niet langer dan 24 uur in ethanol. Langdurige opslag van vliegen in 70% ethanol zal resulteren in verlies van oog- en lichaamspigment.

2. Monstervoorbereiding door puntmontage

OPMERKING: Drosophila zijn zachte insecten die broos worden en instorten als ze aan de lucht worden gedroogd; Daarom vereist dit protocol dat monsters op dezelfde dag worden afgebeeld als waarop ze zijn gemonteerd. Werk in kleine sets van ~5 vliegen tegelijk om monsterverlies te voorkomen. Verhoog het aantal monsters in een set op basis van efficiëntie. Monsters die meer tijd nodig hebben voordat ze kunnen worden afgemaakt, kunnen worden gedehydrateerd door middel van een toenemende concentratiereeks hexamethyldisilazaan (HMDS)14.

  1. Snijd kleine driehoekige punten (7,1 mm x 2,7 mm) uit archiefkarton van 65 lb met behulp van een gespecialiseerde puntponser. Bereid punten voor door de punt (smalste 25%) in een hoek van 90° te buigen met een Dumont #5 fijnpunttang (Figuur 2B).
  2. Verwijder met behulp van Dumont #5 een pincet met fijne punt de vliegen uit de microcentrifugebuisjes (stap 1.4). Dep de vliegen voorzichtig met pluisvrij laboratoriumweefsel om overtollige ethanol te verwijderen. Plaats elke vlieg op zijn linkerzij op een indexkaart onder een ontleedmicroscoop.
    OPMERKING: Verwijder de vliegen uit de buis door u vast te houden aan een anatomische structuur die niet het interessegebied is - bij het afbeelden van het hoofd houden we monsters vast bij de vleugel of poot. Houd de monsters niet bij de buik vast, want die structuur wordt gebruikt om de vlieg op de kaartpunt te lijmen.
  3. Bereid de huidlijm voor en pas de consistentie aan de gewenste viscositeit aan. Meng 1-2 druppels huidenlijm met 1-2 druppels gedeïoniseerd (DI) water en meng met een transferpipet op een indexkaart. Pak een voorbereide kaartpunt aan het brede uiteinde op met een tang en plaats een kleine hoeveelheid van de verdunde lijm op de gebogen punt van de punt door deze in het lijm-watermengsel te deppen (Figuur 2C).
    OPMERKING: De lijm moet smeerbaar zijn, maar niet vloeibaar.
  4. Breng de gebogen punt van de punt aan op de voorste zijde van de rechterbuik rond de abdominale segmenten 2-3 (Figuur 2C). Voordat de lijm droogt, maakt u kleine aanpassingen aan de vlieg, zodat de voorste-achterste as van de vlieg loodrecht staat op de gebogen punt van de punt.
  5. Steek een montagepen nr. 3 in het brede uiteinde van de kaartpunt (Figuur 2D) en bevestig deze aan een insectenspeldblok (Figuur 2E). Label elke pin of rij pinnen met het bijbehorende genotype.

figure-protocol-1
Figuur 2: Voorbereiding van het monster. (A) Volwassen Drosophila worden gesorteerd op basis van fenotypische markers en verzameld in geëtiketteerde microcentrifugebuisjes die 70% ethanol op ijs bevatten. Vliegen worden 's nachts bij 4° C bewaard. (B) Papieren kaartpunten worden voorbereid door het smalle uiteinde 90° van de rest van de kaart te buigen met behulp van een paar #5 pincetten. (C) Vliegen worden uit buizen gehaald en kort aan de lucht laten drogen. Huidenlijm wordt aangebracht op het kleine, gevouwen uiteinde van de voorbereide kaartpunt en op de volwassen vlieg gelijmd op de buiksegmenten 2-3. (D) Monsters worden gemonteerd, met een identificatielabel, op een #3 roestvrijstalen insectenpen. (E) Vastgezette monsters worden op een monsterbord bewaard totdat ze klaar zijn voor beeldacquisitie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Beeldacquisitie met hoge resolutie focus stacking

  1. Maak foto's met een hoge resolutie van vliegenogen met een geassembleerd en op maat gemaakt focus stacking-beeldvormingssysteem dat is geassembleerd en aangepast.
    1. Maak foto's met een DSLR-camerabody met een 70-200 mm telelens die is aangesloten op een 20x Apo-microscoopobjectief via een 77 mm-lensadapter.
    2. Zorg ervoor dat het preparaat met een flits wordt verlicht door een diffuser (Figuur 3).
    3. Bedien de Z-positionering met behulp van een Stackshot Controller en Macro Rail.
    4. Sluit de camera, flitser en gemotoriseerde tafel aan op een zwaar geanodiseerd aluminium statief.
  2. Plaats elk op het punt gemonteerd monster op een universele tafelophanging met het hoofd zo gericht dat het oog naar de lens is gericht. Pas de positie van het hoofd aan door het hoofd voorzichtig met de pincet te bewegen.
    LET OP: Grote en snelle aanpassingen kunnen leiden tot onbedoelde onthoofding.
  3. Terwijl de camera is vastgemaakt aan een laptopcomputer, past u de acquisitie-instellingen in de software aan. Fotografeer exemplaren met een vergroting van 20x met de volgende instellingen: flitsvermogen 1/32, sluitertijd 1/200, diafragma f2.8 en ISO 400. Zorg ervoor dat alle functies voor autofocus en beeldstabilisatie zijn uitgeschakeld.
    OPMERKING: Deze instellingen zorgen voor een optimale flitsverlichting, sluitertijd en scherptediepte. Ze moeten worden aangepast voor andere vergrotingen en/of lenscombinaties.
  4. Stel de locatie in voor het opslaan van de resulterende afbeeldingsstapel (10-50 afbeeldingen) in de gewenste bestandsmap. Zorg voor voldoende opslagcapaciteit voor de afbeeldingen (~8,5 MB per afbeelding).
  5. Pas de instellingen van de focusstapel aan op de Stackshot-besturingseenheid in de Auto Distance-modus .
    1. Stel de stapgrootte in op 5 μm en bereken het aantal stappen door de start - en stopposities van de focusstapel in te stellen.
    2. Bekijk het preparaat in de LiveView-modus en met de camera in de Auto Shoot-modus om de start- en stopposities te identificeren.
    3. Verplaats de rail zodat het dichtstbijzijnde deel van het preparaat scherp is ( startpositie instellen) en ga vervolgens naar de plaats waar het meest interessante kenmerk scherp is ( eindpositie instellen).
  6. Zet de camera terug in de handmatige opnamemodus en start de beeldacquisitie vanaf de Stackshot-besturingseenheid.
    OPMERKING: De opnametijd van het beeld is afhankelijk van de grootte van het monster. Hoe groter de scherptediepte die nodig is voor grote preparaten, hoe meer plakjes er in de beeldstapel worden opgenomen, wat de totale acquisitietijd zal verlengen.
  7. Open bestanden in de software voor focusstapeling waarnaar wordt verwezen. Genereer een gestapelde afbeelding door te klikken op Stapelen | Alles uitlijnen en stapelen (PMax).
  8. Sla de uiteindelijke afbeelding op de harde schijf van de computer op als een .tif bestand door te klikken op Bestand | Sla de uitvoerafbeelding op.
    OPMERKING: Afhankelijk van de resolutie van het gestapelde afbeeldingsbestand en het aantal afgebeelde exemplaren, kunnen grote externe harde schijven (1 TB) nodig zijn voor de back-up van de afbeelding. In dit protocol zijn gestapelde afbeeldingen elk ongeveer 100 MB voordat ze worden gecomprimeerd.

figure-protocol-2
Figuur 3: Beeldacquisitie. (A) Beeldvormingsapparatuur met onderdelen die als volgt zijn gelabeld: a) DSLR-camerabody; b) telelens; c) 20x Apo Microscoop Objectief en Adapter; d) Flits; e) Lens- en koepeldiffusors; f) Stackshot-controller, macrorail en roterende trap; g) Universele Stage Gimbal; h) Statief. (B) Beeldvormingsapparatuur met lichtverspreider. (C) Close-up van het gemonteerde monster in positie voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. FIJI-analyseworkflow om het gebied rond de ogen van volwassenen te berekenen

  1. Voor beeldanalyse verkrijgt u de FIJI-software15 van de ImageJ.net website.
  2. Kies afbeeldingen voor analyse waarbij het oog gecentreerd en uitgelijnd is met voldoende verlichting en minimale perifere vervaging, wat de juiste uitlijning met de camera aangeeft.
  3. Kalibreer de afbeeldingsschaal.
    1. Download de afbeelding van de schaalbalk voor een vergroting van 20x die overeenkomt met 500 μm. U kunt ook op het moment van beeldverwerving een liniaal fotograferen met dezelfde instellingen. Open de afbeelding in FIJI Software.
    2. Meet de lengte van de schaalbalk (Figuur 4A). Gebruik het gereedschap Rechte lijn om de lijn exact over te trekken. Klik op Analyseren | Maatregel. Deze pixelafstand komt overeen met 500 μm (Figuur 4B).
    3. Bereken het aantal pixels per micron. Gebruik dit om pixelmetingen om te zetten in micrometermetingen.
  4. Open het gestapelde afbeeldingsbestand in FIJI (Figuur 4C).
  5. Selecteer Vergrootglas op de werkbalk om het scherpstelgebied te vergroten. Probeer het scherm te vullen met het oog en de direct omringende nagelriem van het hoofd (Figuur 4D).
  6. Selecteer Gereedschap uit de vrije hand selecteren op de werkbalk. Omlijn het netvliesgebied zo nauwkeurig mogelijk en volg de contouren van de buitenste rij ommatidia (Figuur 4E). Als u een deel van de selectie wilt verwijderen, houdt u de Option-toets ingedrukt en selecteert u de pixels die u wilt verwijderen. Als u de selectie wilt uitbreiden, houdt u de Option- en Shift-knoppen ingedrukt en selecteert u de pixels die u wilt toevoegen.
  7. Als u de oppervlakte wilt berekenen, selecteert u Analyseren | Meet vanuit het bovenste menu (Figuur 4F). Er verschijnt een nieuw venster met de parameters Oppervlakte, Gemiddelde, Minimum en Maximum . Kopieer en plak deze gegevens in een spreadsheet voor documentatie en conversie van pixels naar micrometermetingen.
  8. Voer de juiste statistische analyses uit.

figure-protocol-3
Figuur 4: Beeldanalyse in FIJI. (A) Schaal de originele afbeelding. Download de kalibratieafbeelding en meet de lengte van de 500 μm staaf. (B) Pas de schaal aan met behulp van de functie Schaal instellen . (C) Open de gestapelde afbeelding. (D) Vergroot het beeld zodat het oog gecentreerd is en bijna volledig scherm. (E) Gebruik het gereedschap Selecteren uit de vrije hand om het oog te omlijnen op de grens tussen de buitenste rij ommatidia en de omringende cuticula. (F) Meet de oppervlakte binnen het geselecteerde gebied wordt berekend door te klikken op Analyseren | Maatregel | Gebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het Drosophila-oog is een uitstekend modelsysteem voor het bestuderen van weefselpatronen, groeicontrole en celdood. We hebben onlangs een studie gepubliceerd waarin we onderzoeken hoe intracellulaire pH (pHi) de weefselgroei beïnvloedt. Ten eerste hebben we een genetisch systeem opgezet waarbij overexpressie van de natrium-protonenwisselaar DNhe2 (de ortholoog van zoogdier NHE1) in het zich ontwikkelende oog patroondefecten en verhoogde proliferatie veroorzaakt16. Verhoogde proliferatie met een hogere pHi wordt waargenomen bij soorten, van gisten totzoogdieren17. We zagen echter ook dat bij een verhoogde pHI het volwassen oog kleiner leek in vergelijking met controles.

Kwantitatieve analyse van het gebied rond de ogen van volwassenen werd uitgevoerd om te bepalen hoe verhoogde DNhe2-expressie de weefselgrootte in het Drosophila-oog vermindert. We hebben eerst beelden met een lage resolutie verkregen met behulp van een oculaire insert-microscoop (Figuur 5A), maar deze waren van onvoldoende kwaliteit om kwantitatieve metingen uit te voeren. In het bijzonder zijn de randen van het oog niet scherp, waardoor een nauwkeurige meting van het gebied rond de ogen wordt voorkomen.

We hebben het gebied van elk oog gemeten in afbeeldingen met een hoge resolutie van volwassen Drosophila-ogen (Figuur 5B). Vliegen die GMR>DNhe2 tot expressie brachten, hadden significant kleinere ogen (gemiddeld 74,28 μm2) dan de genetische achtergrondcontrole w1118 vliegen (gemiddeld 125,83 μm2) of de drivercontrole GMRGAL4 heterozygote vliegen (gemiddeld 142,49 μm2), wat een vermindering van respectievelijk 41% en 48% in oppervlakte is (figuur 5C). Deze afname van de ooggrootte, ondanks de verhoogde proliferatie, kan worden toegeschreven aan verhoogde niveaus van celdood.

Bekende autofagiegenen, waaronder Atg1, dat fagoforenvorming induceert, werden gebruikt in genetische interactiestudies (figuur 5). Effecten op de ooggrootte van volwassenen werden gekwantificeerd met behulp van fotografie met hoge resolutie en gebiedsanalyse (Figuur 5B). De ooggrootte werd hersteld (129,9 μm2 versus 74,28 μm2) in GMR>DNhe2-vliegen heterozygoot voor Atg13 in vergelijking met GMR>DNhe2 alleen en was vergelijkbaar met controles (Figuur 5C). In combinatie met moleculaire markeranalyse ondersteunen onze resultaten een verhoogde autofagische celdood bij een hogere pHi.

figure-results-1
Figuur 5: Redding van verminderde netvliesgrootte geassocieerd met verhoogde intracellulaire pH met verminderde autofagie. (A) Beelden met een lage resolutie van volwassen vliegenogen, gemaakt met een oculair inzetmicroscoop. (B) Afbeeldingen met hoge resolutie van volwassen vliegenogen die worden gebruikt voor de kwantificering van de ooggrootte voor de volgende genotypen: w1118; GMRGAL4; GMR>DNhe2; GMRGAL4; Atg13; GMR>DNhe2; Atg13. (C) De gemiddelde gemeten oogmaten voor volwassenen waren: w1118 (125,83 μm2, N = 7); GMRGAL4 (142,49 μm2, N = 9) en GMR>DNhe2 (74,28 μm2, N = 6), GMRGAL4; Atg13 (146,4 μm2, N = 15); GMR>DNhe2; Atg13 (129,9 μm2, N = 19) en aangegeven door mediaanwaarden met interkwartielafstanden weer te geven. Statistische significantie werd bepaald door ongepaarde t-toetsen met de correctie van Welch. De gegevens in B en C zijn eerder gepubliceerd18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Onze conclusies worden versterkt door de monstervoorbereiding, beeldvorming met hoge resolutie en de hier beschreven analyse. Deze methoden maakten een nauwkeurige en kwantitatieve beschrijving mogelijk van de grootte van volwassen Drosophila-ogen met verschillende genotypen. We blijven deze benadering gebruiken om andere genetische interacties te beoordelen die mechanismen van pH-afhankelijke groeicontrole zullen ophelderen.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we een methode voor monstervoorbereiding, beeldvorming met hoge resolutie en analyse van volwassen Drosophila-structuren . Het Drosophila-oog is een genetisch handelbaar modelsysteem dat cruciale inzichten heeft opgeleverd in moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ziekten, waaronder kanker19, neurodegeneratie20 en stofwisselingsziekten21. In het bijzonder worden "avatars" van kankerpatiënten gegenereerd waar transgene Drosophila met oncogene mutaties worden gegenereerd en kunnen worden gebruikt voor high-throughput screeningvan geneesmiddelen 22. Hoewel we ons richten op het oog van volwassenen, kan dit protocol worden aangepast om andere interessante structuren te analyseren, zoals vleugel, been, thorax en buik.

Fijne motoriek is vereist bij verschillende kritieke stappen van dit protocol. Monstervoorbereiding van de volwassen Drosophila door puntmontage vereist geduld en oefening. We raden beginners aan om puntmontage te oefenen voordat ze zeldzame of kostbare monsters voorbereiden. Er zijn verschillende kritieke stappen die de oefening van fijne motoriek en zorgvuldige aandacht vereisen.

De eerste kritische stappen in het protocol zijn de voorbereiding van de kaartpunten en het aanbrengen van de lijm om de kaartpunt aan de buik te hechten (protocolstap 2.4-2.5). Het is belangrijk om precies de juiste hoeveelheid lijm aan te brengen, omdat de beoogde anatomische structuren (d.w.z. het hoofd) bedekt kunnen zijn met lijm als er te veel wordt aangebracht of als het niet de juiste consistentie heeft. Het monster moet ook op een geschikte plaats worden gelijmd, met de voorste-achterste as loodrecht op de montagepen. De tweede cruciale stap is het positioneren van de kop voor beeldvorming met hoge resolutie (protocolstap 3.2). Het is van cruciaal belang dat het hoofd is georiënteerd met het oog naar de cameralens gericht. Om het hoofd af te stellen, worden kleine aanpassingen gemaakt met behulp van een pincet. Zachte en stapsgewijze bewegingen zijn cruciaal, aangezien onbedoelde onthoofding kan plaatsvinden met grote of krachtige aanpassingen. Een extra stap waarbij fijne motoriek vereist is, is bij het gebruik van de Freehand Select Tool uit de FIJI-werkbalk (protocolstap 4.6). Hier is het van cruciaal belang om zo dicht mogelijk bij de buitenste rij ommatidia van het oog te traceren. Deze precisie is essentieel voor rigoureuze en reproduceerbare gebiedsmetingen van het oog (Figuur 4E).

Beeldvormingsmethoden zoals scanning-elektronenmicroscopie (SEM) blijven de primaire benadering om externe structuren te visualiseren en te analyseren. SEM-protocollen vereisen echter dat de gebruiker met gevaarlijke chemicaliën omgaat en meerdere instrumenten bedient, waaronder drogers met kritieke punten, sputtercoatingapparaten en de SEM zelf. De voorbereiding van het monster duurt enkele dagen en vereist intensieve training en vaardigheid. Een belangrijke uitdaging waarmee academische instellingen worden geconfronteerd, zijn de financiële investering en de inzet voor het onderhoud van het instrument en, naar onze ervaring, personeel met expertise in het onderhoud en de bediening van deze apparatuur wordt over het algemeen niet ondersteund op institutioneel niveau. Ons protocol verlaagt de kosten en elimineert de blootstelling aan gevaarlijke chemicaliën ten koste van beeldvorming met een lagere resolutie in vergelijking met SEM.

Het systeem dat in deze studie werd beschreven, was een voorgemonteerd pakket, maar het modulaire karakter maakt het mogelijk de kosten te verlagen door afzonderlijke componenten te vervangen door in eigen huis vervaardigde apparatuur (bijv. monsterfasen, flitsdiffusors), alternatieve merken of modellen, of apparatuur die mogelijk al in het laboratorium aanwezig is. Hoewel het aansluiten van microscoopobjectieven op macrocamera's steeds populairder wordt onder hobbyisten en professionele fotografen, kan er wat vallen en opstaan nodig zijn voor verschillende combinaties van objectieven en lenzen. Om het hier beschreven systeem na te bootsen, moet een oneindig gecorrigeerd microscoopobjectief worden aangesloten op een buislens (hier telelens) met een adapter met de juiste schroefdraad. Een andere overweging bij het vervangen van componenten is ervoor te zorgen dat de werkafstand van de lens compatibel is met de afmetingen van de camerabevestiging, de samplebevestiging en de macrofocusrail. Ten slotte is de hier geselecteerde software voor focus stacking commercieel, maar er bestaan veel goedkope of gratis oplossingen voor focusstapeling na verwerking, waaronder ImageJ-plug-ins.

Hoewel dit protocol oefening vereist om technieken voor het hanteren van monsters onder de knie te krijgen, is het ontworpen om beelden met een hoge resolutie te verkrijgen en te analyseren voor gedetailleerde fenotypische analyse. De hier gepresenteerde procedures vormen een snel en goedkoop alternatief voor traditionele beeldvormingsmethoden. Door gebruik te maken van op freeware gebaseerde digitale beeldvormingstechnieken voor kwantitatieve analyse, is onze methodologie toegankelijk en vereist deze geen dure software-aankopen of updates. De opstelling van de beeldvorming vereist enige kosten en inspanningen, maar als deze eenmaal is vastgesteld, zou het een langdurige aanvulling moeten zijn op de Drosophila-laboratoria . Deze methode levert beelden met een hoge resolutie op die geschikt zijn voor de kwantificering van fenotypes en kan gemakkelijk worden aangepast voor andere interessante structuren, zoals de vleugel, het been, de borstkas en het achterlijf. Deze methodologie maakt monstervoorbereiding, beeldvorming met hoge resolutie en analyse toegankelijk voor niet-gegradueerde studenten en wetenschappers bij instellingen met weinig middelen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen de leden van het Grillo-Hill pHly-lab bedanken voor de discussies en de steun. We danken Tim Andriese, Randy Kirschner, Kitty (Ngoc-Huong) Nguyen, Marco Parent, Jonny Shaloub en Librado Veliz voor de uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door NIH SC3GM132049 en 1R16GM153640 awards (BKGH), een CSU Biotechnology Faculty-Student Research Award (LM en BKGH) en start-up fondsen van het College of Science en het Department of Biological Sciences aan de San José State University (FJL). Een speciale vermelding gaat uit naar Bernd Becker voor hun vindingrijkheid en hulp tijdens dit proces. We danken de BioIcons (https://bioicons.com/) gemeenschap voor het leveren van hoogwaardige iconen voor onze figuren en in het bijzonder aan Serviere voor het pipetpictogram, en DBCLS voor de Drosophila-, pincet- en desktop-elektronenmicroscooppictogrammen die worden gebruikt in Figuur 1 en Figuur 2, die zijn gelicentieerd onder CC-BY 4.0 Unported. We danken ook de SciDraw (https://scidraw.io/) gemeenschap voor het leveren van hoogwaardige iconen voor onze figuren, met name Diogo Losch De Oliveira (doi.org/10.5281/zenodo.3925953), die zijn gelicentieerd onder de Creative Commons 4.0-licentie (CC-BY).

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL serologische pipetteThermoFisher Scientific170353N
1,7 mL microcentrifugebuisjesGenesee Scientific 24-282LR
20x Apo Microscoop ObjectiefMitutoyo Corp.378-804-3
Archivaal 65 lb karton Neenah, Inc.91901
Canon EF 70-200 mm USM II telefotolensCanon3044C002
Canon EOS 6D Mark II DSLR Camera BodyCanon1897C002
Diffuser DomeMacroscopic Solutions PA-DIF-GIM-SM
Diffuser voor Mitutoyo M Plan APO ObjectievenMacroscopic Solutions mitutoyo-diffusers
Drosophila vialen en pluggenGenesee Scientific 32-117BF
Dumont #5 pincet met fijne puntFisher ScientificNC9889584
Gazen verenAmazonB01CMMJI6U
Heavy-Duty Geanodiseerd Aluminium StatiefReally Right Stuff, LLCTFA-32G
KimwipesFisher Scientific06-666Avezelvrij lab tissue
Levenhuk M1000 Plus Digitale CameraLevenhuk70358
Nr. 3 montagespeldIndigo Instruments33414-3
Nutri-Fly Bloomington Drosophila mediumGenesee Scientific 66-113vliegvoer
PunsM.C. Mieth Manufacturing, Inc.448Detail
SchroefklemmingReally Right Stuff, LLCSK-ClampVoor het bevestigen van de macro rail aan het statief
Stackshot Controller en Macro RailCognisys Inc.ST3X_100_BUNDLE
Step-down Ring Adapter RAF Camera763461174207Lens adapter om het microscoopobjectief op de cameralens aan te sluiten
Titebond LijmFranklin International5013
Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite FlitserShenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.YN-24EX
Software
Canon EOS Utility (v. 3.16.1). Canonacquisitiesoftware
FIJINational Institutes of HealthFiji wordt uitgebracht als open source onder de GNU General Public License.  FIJI Versie 2.14.0/1.54f 
GraphPad PrismGraphPad Software, Boston, Massachusetts USAPrism Versie 10.3.1
Zerene Stacker (v.1.04)Zerene Systems, LLCFocus Stacking Software
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
  2. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
  3. Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia. Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).
  4. Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila. Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).
  5. Bonini, N. M. A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease. Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).
  6. Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases. Development. 147 (11), dev189340(2020).
  7. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).
  8. Johnson, R. I. Hexagonal patterning of the Drosophila eye. Dev Biol. 478, 173-182 (2021).
  9. Weasner, B. P., Kumar, J. P. The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster. Genetics. 221 (1), iyac041(2022).
  10. Pichaud, F., Casares, F. Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye. Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).
  11. Oster, I. I., Crang, R. E. Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes. Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).
  12. Gibb, T. J., Oseto, C. Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory. , Academic Press. (2019).
  13. Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects. ZooKeys. 712, 141-154 (2017).
  14. Brown, B. V. A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies. Fly Times. 11, 10(1993).
  15. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).
  16. Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression. eLife. 4, e03270(2015).
  17. White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance. J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).
  18. Peralta, J., et al. Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death. Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).
  19. Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies. Front Genet. 13, 949241(2022).
  20. Nitta, Y., Sugie, A. Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis. Fly. 16 (1), 275-298 (2022).
  21. Pletcher, R. C., et al. A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development. G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).
  22. Bangi, E., et al. A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Drosophila oogfenotypische analysehoge resolutie beeldvormingImageJ kwantificatiefocus stackingmeting van ommatidiadigitale microscopieentomologische techniekenalternatief voor scanning elektronenmicroscopie

Gerelateerde artikelen