Methodenartikel

Organotypische weefselmodelsystemen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro

DOI:

10.3791/67487

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol schetst de toepassing van organotypische weefselmodellen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro. Concreet maakt het beschreven modelsysteem gebruik van een meerlagig oraal epitheel dat wordt blootgesteld aan micro-organismen geassocieerd met biofilms (tandplak) in de context van mondgezondheid versus ziekte.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het in vitro samenvatten van de gastheer-pathogeen interface aan de epitheliale of mucosale barrière blijft een uitdagend vooruitzicht voor infectiebiologen. Hoewel in-house gekweekte 2D-epitheelmonolagen geen waarheidsgetrouwe weergave van de in vivo situatie hebben, worden in de handel verkrijgbare weefselmodellen vaak over het hoofd gezien vanwege hun kosten en bruikbaarheid. Met een zorgvuldige planning bieden dergelijke modellen echter reproduceerbare platforms voor een breed scala aan verschillende toepassingen. Hier rapporteren we het gebruik van epitheelmodellen die kunnen worden gebruikt voor een breed scala aan experimentele doeleinden om interacties tussen gastheer en pathogeen te onderzoeken in verschillende ecologische niches, zoals de mondholte, huid en vaginaal slijmvlies. Van eenvoudige planktoncellen tot complexe biofilm-co-cultuur, epitheelmodellen worden gebruikt om microbiële adhesie en invasie te beoordelen en om de gastheerrespons op transcriptie- en/of eiwitniveau te evalueren, met ruimte voor meer gedetailleerde profilering met behulp van verschillende omics-benaderingen. Bovendien kunnen deze biologische systemen worden gebruikt als nauwkeurigere testbanken voor het evalueren van conventionele en nieuwe antimicrobiële activiteit in een complexe gastheer-pathogeen micro-omgeving in vitro. De hierin beschreven protocollen documenteren hoe modellen bij aankomst worden gehanteerd en in het laboratorium worden voorbereid voor co-cultuurstimulatie met biofilmgemeenschappen. De methoden beschrijven hoe experimentele output wordt bereikt uit de modelsystemen, inclusief de verwerking van weefsel, de co-cultuuropstelling en het genereren van gegevens. Deze experimenten omvatten genexpressie van de gastheer door middel van enkelvoudige en multiplex qPCR-analyses en detectie van inflammatoire eiwitten met behulp van ELISA's. Concluderend bieden epitheelmodellen nuttige in vitro systemen voor preklinische onderzoeksstudies naar eenvoudige of complexe interacties tussen gastheer en pathogeen

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In vitro modelsystemen bieden uitstekende testbedden voor het onderzoeken van interacties tussen gastheer en pathogeen. Deze organotypische systemen zijn bedoeld om de micro-omgeving van verschillende ecologische niches die vatbaar zijn voor microbiële verstoringen samen te vatten. Er zijn een aantal onderzoeksartikelen gepubliceerd waarbij gebruik wordt gemaakt van EpiSkin (voorheen SkinEthic) weefselmodellen om gastheer-pathogeen interacties in de mondholte 1,2,3,4,5, huidbarrière 6,7,8,9,10,11 en het vaginale slijmvlies 5,12,13 te beoordelen , onder andere14,15. In tegenstelling tot "tweedimensionale" of "2D" celcultuur, die berust op het gebruik van monolagen van epitheelcellijnen die zijn blootgesteld aan micro-organismen, bestaan deze in de handel verkrijgbare modellen uit meerdere lagen gedifferentieerde cellen die worden gekweekt op een lucht-vloeistofinterface. Hoewel goedkoper en vaak als beter reproduceerbaar beschouwd, zijn 2D-kweeksystemen vatbaar voor cellulaire schade wanneer ze worden gekweekt met micro-organismen, wat niet altijd nauwkeurig de epitheliale of mucosale barrières in vivo weergeeft 16,17.

Recent bewijs toont aan dat "driedimensionale" of "3D" kweektechnieken steeds populairder worden in verschillende wetenschappelijke disciplines, waaronder kankerwetenschappen, stamcelonderzoek en het ontdekken van geneesmiddelen16,18. Binnen de context van infectiebiologie kunnen 3D-weefselmodellen worden gebruikt voor onderzoek naar gastheer-bacteriële, schimmel- of mixed-species interacties op het epitheliale of mucosale barrière-grensvlak binnen een gecontroleerde micro-omgeving in vitro. Deze modellen hebben veel voordelen voor 2D-kweeksystemen, waardoor weefselkolonisatie en/of invasie door pathogene organismen of complexe biofilmgemeenschappen kan worden beoordeeld17, en gastheerreacties op meercomponentenniveau kunnen worden geëvalueerd voor verschillende biomarkers waar 2D-modellen soms worden beperkt door hun transcriptionele of proteomics-profielen 16,17,18. Uiteindelijk zijn de preklinische toepassingen van dergelijke 3D-systemen enorm en leveren ze belangrijke verkennende gegevens op die kunnen worden meegenomen in in vivo-modellen of klinische studies.

In de context van mondgezondheid en ziekte is het belangrijk voor clinici om de ontstekingsroutes te begrijpen die betrokken zijn bij het mondslijmvliesoppervlak, omdat dit de behandelingsmodaliteiten kan bepalen. Eerdere studies hebben aangetoond dat "gezondheidsgerelateerde" biofilms minimale ontstekingsreacties kunnen uitlokken 3,19,20,21. Dit kan het gevolg zijn van een lagere microbiële bioburden geassocieerd met mondgezondheid of als gevolg van de samenstelling van de biofilm met Streptococcus spp. die algemeen wordt beschouwd als immuunmodulerend 22,23. Aan de andere kant zijn biofilms bestaande uit ziekte-geassocieerde micro-organismen zoals Fusobacterium nucleatum en Porphyromonas gingivalis pro-inflammatoir van aard 3,20,24,25,26,27. Een review van Mountcastle et al. in 2020 beschreef alle relevante co-cultuurmodellen die op dat moment bestonden voor de orale micro-omgeving17. Hoewel dergelijke organotypische modellen er in overvloed zijn, waarvan er sinds28,29 verschillende zijn geproduceerd, blijven er een aantal uitdagende obstakels verbonden aan het maken van dergelijke 3D-modellen. Om er maar een paar te noemen: deze modellen vereisen aanzienlijke optimalisatie en zijn zeer arbeids- en arbeidsintensief om te produceren; De reproduceerbaarheid kan ook zeer variabel zijn, tenzij deze zorgvuldig wordt gecontroleerd16,17. In de handel verkrijgbare modellen omzeilen dergelijke problemen en bieden platforms voor het onderzoeken van interacties tussen gastheer en pathogeen in de mondholte en in andere ecologische niches in het menselijk lichaam.

Samenvattend heeft het huidige protocol tot doel de toepassing van organotypische weefselmodellen te schetsen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro in de context van mondgezondheid en ziekte. In het bijzonder maakt het beschreven modelsysteem gebruik van een meerlagig commercieel verkrijgbaar oraal epitheel dat wordt blootgesteld aan een gedefinieerde biofilmgemeenschap die representatief is voor de orale ontstekingsziekte, gingivitis.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het volgende protocol omvat de bereiding van een biofilm met meerdere soorten die representatief is voor gingivitis, met in totaal 7 soorten (spp.)7,30. Drie Streptococcus spp., Streptococcus mitis (NCTC 12261), Streptococcus intermedius (DSM 20753) en Streptococcus oralis (NTCC 11427) zijn opgenomen om de mondgezondheid na te bootsen en fungeren als eerste kolonisatoren van het speekselvlies. Vervolgens worden vier anaërobe micro-organismen toegevoegd die verband houden met de verschuiving van mondgezondheid naar ziekte: Veillonella dispar (NCTC 11831), Actinomyces naeslundii (DSM 17233) en twee Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) en Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii (DSM 19507). Alle betrokken stappen worden aseptisch uitgevoerd, hetzij bij de vlam, hetzij in een veiligheidskast van klasse II. Alle media en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) die voor microbiologische preparaten worden gebruikt, worden vóór gebruik geautoclaveerd en de steriliteit wordt tijdens het protocol met regelmatige tussenpozen beoordeeld. De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van microbiële gemeenschappen op co-cultuur

OPMERKING: Dit protocol toont de generatie van een biofilm met meerdere soorten die representatief is voor consortia die verband houden met ontsteking van het tandvlees, ook wel gingivitis genoemd. Een dergelijk model is gebruikt voor de beoordeling van de gastheerrespons bij mondgezondheid en ziekte, zoals eerder beschreven3.

  1. Breng alle drie de Streptococcus-soorten tot leven op bloedagarplaten (Columbia Blood Agar-basis met 5% steriel gedefibrineerd paardenbloed) uit bevroren voorraden poreuze korrels (in de handel verkrijgbaar) die de micro-organismen bevatten die bij -80°C zijn bewaard.Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een inoculatielus en de streak-plate-techniek.
    1. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2, en isoleer vervolgens 3-4 kolonies voor vermeerdering in 10 ml trypton-sojabouillonmedium. Kweekbouillon gedurende 16-18 uur bij 37 °C, 5% CO2.
  2. Voor de intermediaire pathogenen moeten V. dispar, A. naeslundii, F. nucleatum en F. nucleatum subspp. vincentii anaëroob op kieskeurige anaërobe agarbasis met 5% steriel gedefibreerd paardenbloed gedurende 48 uur bij 37 °C, voorafgaand aan de kweek in Schaedler's bouillon gedurende nog eens 24-48 uur onder dezelfde omstandigheden.
  3. Na de groei pelletcelsuspensies door centrifugeren gedurende 5 min, 20 °C bij 3000 x g, vervolgens pellets wassen in 10 ml steriel PBS (pH 7,2-7,6). Pelletcelsuspensies opnieuw via centrifugeren gedurende 5 min, 20 °C bij 3000 x g en vervolgens de wasstappen voor de tweede keer herhalen. Resuspendeer gewassen cellen in 10 ml steriel PBS voor standaardisatie.
  4. Standaardiseer alle drie de Streptococcus spp. afzonderlijk met behulp van een spectrofotometer bij 550 nm. Absorptiewaarden van 0,50 (bereik van 0,45-0,55 acceptabel) zijn indicatief voor een celgetal van ~1 x 108 cellen/ml, zoals eerder bepaald met behulp van de Miles en Misra-celtellingstechniek31. Om deze extinctiewaarde te bereiken, verdunt u 10 ml suspensies met gewassen cellen verder in steriel PBS.
  5. Verdun na standaardisatie alle Streptococcus spp. 1:10 tot 1 x 107 cellen/ml in een 1:1 mix van Todd Hewitt Broth (THB) en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) medium. Voeg 500 μl celsuspensies toe door te pipetteren op een weefselkweekplaat met 24 putjes voor microtiter met een hydroxyapatietschijf met een diameter van 13 mm. Laat biofilms 24 uur rijpen bij 37 °C, 5% CO2 .
    OPMERKING: Biofilms van meerdere soorten kunnen worden gekweekt op verschillende orale substraten, zoals glazuur, dentine32 en poly (methylmethacrylaat) protheseoppervlakken 33,34. Voor deze modellen kunnen ook alternatieve media worden gebruikt, zoals kunstmatig of synthetisch speeksel, hoewel er een zorgvuldige afweging moet worden gemaakt, afhankelijk van de gebruikte consortia van micro-organismen: studies hebben aangetoond dat de selectie van groeimedia belangrijke implicaties heeft voor de groei van biofilm in gemengde gemeenschappen35,36.
  6. Standaardiseer de volgende dag de vier anaërobe micro-organismen op dezelfde manier als hierboven (stappen 1.2-1.4). Pelletcelsuspensies, twee keer wassen en vervolgens standaardiseren V. dispar tot 0,50 absorptie (bereik van 0,45-0,55) en de drie resterende micro-organismen tot 0,20 absorptie (bereik van 0,18-0,22). Eenmaal gestandaardiseerd, verdun alle suspensies verder 1:10 tot 1 x 107 cellen/ml in een 1:1 mix van THB en RPMI.
  7. Verwijder niet-aangehechte cellen en gebruikte media voorzichtig en gooi ze door pipetteren weg uit de Streptococcus-biofilms . Vervang de putjes van de microtiterplaat door 500 μl gestandaardiseerde 1 x 107 cellen/ml suspensies van de vier anaëroben. Kweek biofilms gedurende 24 uur onder anaërobe omstandigheden bij 37 °C.
  8. Verwijder na 24 uur niet-aangehechte cellen en gebruikte media uit de 7-soorten biofilms en vervang deze door 500 μL steriel 1:1 mengsel van THB: RPMI-media. Biofilms worden gedurende 4 dagen anaëroob gerijpt bij 37 °C, waarbij de media dagelijks worden verwijderd en aangevuld (in totaal vier mediawisselingen).
  9. Op dag 7 is de multi-species biofilm volledig volgroeid en klaar voor stroomafwaartse experimenten. Was biofilms twee keer met 500 μL steriel PBS voor gebruik in co-cultuur.
    OPMERKING: Biofilms kunnen worden geprofileerd met behulp van een reeks biologische methodologieën zoals qPCR (voor beoordeling van de samenstelling) en microscopische profilering met confocale of elektronenmicroscopie zoals eerder beschreven3.

2. Behandeling van organotypische weefsels en experimentele opstelling

OPMERKING: De hieronder beschreven experimentele opstelling omvat humaan oraal epitheel (HOE) weefsel dat is samengesteld uit TR146-cellen die zijn gekweekt op een inert membraanfilter van polycarbonaat. Er bestaan andere modellen, waaronder epidermismodellen, blaas-, slokdarm-, hoornvlies-, gingivaal- en vaginaal epitheel. Alle modellen worden gehanteerd en voorbereid op een manier die vergelijkbaar is met de hieronder beschreven manier voor het onderzoeken van interacties tussen gastheer en ziekteverwekker.

  1. Bij aankomst pakt u het HOE-weefsel en de media uit en brengt u deze over naar een veiligheidskast van klasse II. Voeg in totaal 1 ml onderhoudsmedia die bij het doekje zijn geleverd toe aan platen met 12 putjes.
  2. Verwijder de inzetstukken van polycarbonaat met de HOE met een steriel pincet van de 24-putjes platen en voedingsagar die voor het transport zijn gebruikt en breng ze over naar de 12-gaats platen met de media, zorg ervoor dat er geen luchtbellen onder het weefsel achterblijven. Zorg ervoor dat overtollige agar die aan de zijkanten of onderkant van de inzetstukken is bevestigd, voorzichtig wordt verwijderd met een extra pincet of tissuepapier.
  3. Incubeer weefselmodellen gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2 voorafgaand aan de experimentele opstelling om te acclimatiseren aan laboratoriumomstandigheden na verzending. Het is opmerkelijk dat er extra onderhoudsmedia of groeimedia beschikbaar zijn voor langer onderhoud of verdere rijping van de weefselmodellen.
  4. Er kunnen nu experimenten met co-cultuur worden uitgevoerd. Voor het hier gegeven voorbeeld, verwijdert u de biofilms van 7 soorten die zijn gemaakt zoals hierboven (stappen 1.1-1.9) van hun substraten door middel van sonicatie. Om dit te bereiken, verwijdert u HA-schijven met biofilms van de bodem van platen met 24 putjes met behulp van een naald en een pincet van 19 G en brengt u vervolgens een bijoux met 1 ml steriele Dulbecco's PBS over. Sonificeer op 35 kHz gedurende 10 minuten in een sonicatiewaterbad.
  5. Verwijder voorzichtig de inzetstukken met de weefselmodellen met een pincet uit de nachtelijke acclimatisatie en voeg 100 μL biofilmsonicatensuspensie rechtstreeks aan het weefsel toe door te pipetteren. Gebruik niet-gestimuleerde controleweefsels voor vergelijkende doeleinden. Voeg voor deze controleweefselinleggers 100 μL steriele Dulbecco's PBS toe zonder de biofilmsuspensie.
    OPMERKING: Planktoncellen, gebruikte biofilmsupernatanten die gedispergeerde cellen bevatten, of hele biofilms kunnen worden gebruikt voor het co-cultuurmodel in plaats van biofilmsonicate. Verschillende toepassingen voor deze gastheer-pathogeen modellen met behulp van verschillende microbiële stimulerende middelen worden geschematiseerd in Figuur 1 zoals elders gedocumenteerd 3,5,6,8,13,37,38.
  6. Breng na de toevoeging de inzetstukken over naar een andere plaat met 12 putjes met 1 ml verse onderhoudsmedia, waarbij u er opnieuw voor zorgt dat er geen luchtbellen onder de inzetstukken aanwezig zijn. Incubeer platen met weefselmodellen gedurende 24 uur bij 37 °C, 5% CO2 voorafgaand aan weefselverwerking voor downstream-toepassingen.
    OPMERKING: Weefselleveranciers kunnen extra media leveren om de voortdurende kweek van het weefsel te ondersteunen na blootstelling aan gesonificeerde aggregaten of biofilms. Daartoe zijn verschillende eerdere modellen gepubliceerd die langdurige weefsel-biofilminoculatie onderzoeken 21,28,39. Om vergelijkbare resultaten te bereiken met het huidige organotypische model, sonificeert u het weefsel (zoals hierboven, stap 2.6) en laat u de micro-organismen 24 uur hechten. Gooi de resterende microbiële suspensie weg en ga door met kweken op het grensvlak tussen lucht en vloeistof gedurende het vereiste experimentele tijdsverloop.

3. Weefselverwerking voor experimentele output

OPMERKING: Na co-cultuur worden weefselmodellen verwerkt voor experimentele output. De volgende stappen documenteren hoe RNA uit het weefsel wordt geëxtraheerd voor transcriptionele profilering en hoe gebruikte weefselmedia worden gebruikt voor eiwitdetectie. Weefsel kan ook worden gefixeerd in formaline, paraformaldehyde of een soortgelijk fixatief voor histologische beoordeling, zoals eerder beschreven 3,6.

  1. Bereid eerst 350 μL RLT-lysisbuffer voor in 2,0 ml O-ringbuisjes met schroefdop die 1% β-mercaptoethanol bevatten en ~100 μL equivalent van 0,5 mm zuurgewassen glasparels.
  2. Verwijder de inzetstukken met het weefsel met een pincet van de media en gooi de resterende microbiële suspensie van de inlegger weg. Houd vervolgens, omgekeerd, op ooghoogte voor het gemak. Snijd met een naald van 19 G het weefsel en het membraan voorzichtig vanaf de onderkant van het inzetstuk en breng over naar de RLT-buffer.
    1. Homogeniseer het weefsel bij 30 s met behulp van een tafelmodel kralenklopperhomogenisator en extraheer vervolgens RNA uit het lysaat volgens de instructies van de fabrikant van de RNA-extractiekit (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: Geëxtraheerd RNA wordt gebruikt voor cDNA-synthese om de expressie van cytokine- en chemokinegenen als ontstekingsmarkers te profileren met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR) of RNA-sequencing. qPCR wordt bereikt met behulp van multiplex-arrays zoals de RT2 PCR-profiler-array die putjes bevat met kant-en-klare primers voor specifieke genen, of SYBR-reagens op groene basis met in-house ontworpen primersequenties en nucleasevrije ddH2O3.
  3. Verzamel de resterende gebruikte weefselmedia (~850-900 μL) voor proteomische analyses met behulp van low- en high-throughput methodologieën zoals ELISA's, multiplex immunoassays of multiplex eiwit biomarker analyse7.
  4. Beoordeel met behulp van de gebruikte weefselmedia een reeks markers die verband houden met ontsteking op eiwitniveau. Gebruikte media kunnen direct worden gebruikt voor de bovenstaande methodologieën (stap 3.3) of worden opgeslagen bij -20 °C of -80 °C. Vermijd meerdere vries-dooicycli van de media voor dergelijke analyses.
    OPMERKING: De media moeten mogelijk 1:10 worden verdund, afhankelijk van het weefselstimulerende middel voor nauwkeurige proteomische profilering met behulp van ELISA's.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit experiment werd HOE blootgesteld aan 7-soorten biofilmsonicaat dat organismen bevat die representatief zijn voor de verschuiving van mondgezondheid naar ontsteking van het tandvlees (bekend als gingivitis). Deze ziekte ontstaat door een ontsteking van het tandvlees- of orale epitheelweefsel als gevolg van microbiële verstoringen door de opbouw van tandplak op het tandoppervlak. Na stimulatie worden weefsel en gebruikte media gebruikt voor transcriptionele en proteomische analyses, zoals hierboven besproken. Voor dit experiment werd de genexpressie van een panel van inflammatoire biomarkers gedetecteerd in het weefsel na stimulatie met biofilmsonicaat (Figuur 2). Dit werd bereikt door gebruik te maken van een op maat gemaakte RT2 PCR-profiler-array die 16 verschillende genen bevatte, en genexpressie werd aangetoond als vouwverandering ten opzichte van niet-gestimuleerd weefsel na normalisatie naar het huishoudgen GAPDH. Microbiële stimulatie verhoogde de expressie van alle genen, met uitzondering van CXCL5, met statistische verschillen waargenomen voor NFKB, CCL2, CXCL1, CXCL3, CSF2, CSF3, TNF, IL1A, IL1B en TLR4 (Figuur 2A). De grootste vouwverandering werd waargenomen voor CCL2, CXCL1 en CSF3, met stijgingen van respectievelijk 16,9, 10,3 en 15,1 (Figuur 2B).

Gebruikte HOE-media werden gebruikt voor proteomische analyses om eiwitten te detecteren die door het weefsel na stimulatie werden geproduceerd en vrijgegeven. Dit is handig om te bepalen of genexpressie correleert met eiwitproductie. Om dit te doen, werden IL8-genexpressie en IL-8-eiwitafgifte beoordeeld in controleweefsel en door biofilmsonicaat gestimuleerd weefsel (Figuur 3). Genexpressie werd beoordeeld met behulp van qPCR op basis van SYBR-green met primers voor IL8 en GAPDH zoals eerder beschreven3. De expressie van IL8-mRNA in HOE was 8,67 keer verhoogd na stimulatie met biofilmsonicaat (Figuur 3A). Op eiwitniveau werden IL-8-niveaus gekwantificeerd met behulp van een IL-8 ELISA-kit. De concentratie van IL-8 in gebruikte media werd verhoogd van ~1.005 ng/ml in controleweefsel tot ~4.245 ng/ml in biofilm-sonicaat gestimuleerd weefsel (Figuur 3B).

figure-results-1
Figuur 1: Verschillende toepassingen voor organotypische weefselco-cultuurmodellen. Gestandaardiseerde suspensies van micro-organismen worden rechtstreeks op het weefsel aangebracht om soort-gastheerinteracties te onderzoeken (A). Deze worden vaak gebruikt voor het beoordelen van microbiële kolonisatie gedurende een korte periode (bijv. <24 uur). Complexe biofilms worden gesonificeerd om de effecten van gedispergeerde cellen of biofilmaggregaten op de weefsels te onderzoeken (B). Dit is belangrijk omdat eerder is aangetoond dat dergelijke cellen unieke fenotypes hebben in vergelijking met planktonische of biofilm-tegenhangers; daartoe kunnen intacte biofilms rechtstreeks aan het weefsel worden toegevoegd met behulp van extra kleinere inserts om aangrenzende blootstelling met de gastheer (C) te creëren. Ten slotte worden planktoncellen toegevoegd aan weefsel in geschikte kweekmedia om microbiële kolonisatie, biofilmvorming en groeidynamiek op het weefsel te beoordelen (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Genexpressie van HOE-weefsel na stimulatie met 7-species biofilmsonicate. mRNA-expressievouwverandering van in totaal 15 ontstekingsgenen genormaliseerd naar het huishoudgen, GAPDH, in HOE-weefsel in controle, niet-gestimuleerde monsters en die zijn blootgesteld aan 100 μL 7-species biofilmsonicaat (A). De drie genen (CCL2, CXCL1, CSF3) met de hoogste veranderingen in mRNA-expressie worden weergegeven in (B). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een parametrische ongepaarde T-toets, waarbij significante veranderingen werden weergegeven als respectievelijk *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001. Gegevens werden geplot en geanalyseerd met behulp van statistische en grafische software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: IL8-genexpressie en IL-8-eiwitniveaus geproduceerd door HOE-weefsel. mRNA-expressievouwverandering van IL8 in HOE-weefsel zoals bepaald door op SYBR-groen gebaseerde qPCR (A) en IL-8-eiwitniveaus gekwantificeerd uit gebruikte weefselmedia met behulp van de ELISA-methodologie (B). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een parametrische ongepaarde T-toets, met significante veranderingen weergegeven als respectievelijk *p < 0,05 en ****p < 0,0001. Gegevens werden geplot en geanalyseerd met behulp van statistische en grafische software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier worden methodologieën beschreven om een complex multi-species biofilmmodel te produceren dat representatief is voor gingivitis voor co-culturatie met HOE-weefsel om de gastheerrespons na microbiële stimulatie te beoordelen. Dit protocol kan worden aangepast voor gebruik bij het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties tussen planktoncellen, biofilms van enkele, dubbele of gemengde soorten, of biofilm-gedispergeerde cellen met epitheelweefsel uit verschillende ecologische niches in het menselijk lichaam. Het gebruik van weefselmodellen voor het onderzoeken van interacties tussen gastheer en pathogeen biedt een belangrijke vooruitgang ten opzichte van eerdere co-cultuursystemen die beperkt zijn tot 2D-monolagen die de in vivo situatie niet altijd echt samenvatten, waarbij epitheelweefsel meerdere cellagen bevat 16,17,18. Bovendien zijn er tal van uitdagingen in verband met in vitro groei van meerlagige weefselmodellen, met het gebruik van meerdere cellijnen en/of groei van cellagen op een lucht-vloeistofinterface die vatbaar is voor besmetting. De in de handel verkrijgbare weefsels bieden een reproduceerbaar platform met modellen van consistent hoge kwaliteit die vergelijkbaar zijn tussen replicaten en batches, zoals aangetoond in eerdere publicaties 3,7.

Voor de sectie "voorbereiding van microbiële gemeenschappen op co-cultuur" werd de opname van deze micro-organismen voor het gingivitismodel met 7 soorten gekozen op basis van algemeen geïdentificeerde commensalen en pathogenen die verband houden met de verschuiving van mondgezondheid naar ziekte. Zoals bij alle complexe biofilmmodelsystemen in vitro, wordt de opname van micro-organismen gestuurd door microbioomstudies met betrekking tot de specifieke gezonde of zieke ecologische niche. Daartoe hebben wij en anderen het gebruik gerapporteerd van een biofilmmodel dat verband houdt met de mondgezondheid en dat commensale micro-organismen bevat (bijv. Streptococcus en Rothia spp.)3,40,41. Bovendien kunnen extra ziekteverwekkers aan deze modellen worden toegevoegd om biofilms te creëren die verband houden met andere ziekten. Er kunnen bijvoorbeeld drie micro-organismen worden toegevoegd aan de 7 soorten die hier worden beschreven om een ziektemodel te creëren dat verband houdt met parodontitis3, terwijl de schimmelpathogeen Candida albicans kan worden toegevoegd om de polymicrobiële gevoeligheid te vergroten en een laag van interkoninkrijkscomplexiteit toe te voegen33. Het bevorderen van schimmel-bacteriële interacties kan inderdaad enorme implicaties hebben voor verschillende experimentele outputs waarbij dergelijke biofilmmodellen in vitro worden gebruikt in vergelijking met biofilms die alleen bacteriën bevatten42. Uiteindelijk wordt het ten zeerste aanbevolen om zorgvuldig na te denken over het maken van een nieuw multi-species biofilmmodel voor dergelijke studies. Hoewel de opgenomen micro-organismen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd aan de hand van uitgebreid literatuuronderzoek, kunnen deze voor de meeste niches en/of ziekten om verschillende redenen niet goed integreren in een complex model in vitro. Het volgende geeft enkele andere mogelijke overwegingen weer die moeten worden gemaakt:

Dynamiek van biofilmvorming
De vorming van biofilm in vivo omvat vaak vroege, tussenliggende en late kolonisatie door bepaalde micro-organismen. Supra- en subgingivale tandplakvorming wordt sterk gekenmerkt door initiële aanhechting van het speekselvlies dat op het glazuur wordt aangetroffen door baanbrekende soorten (bijv. Streptococcus-soorten ), waarbij intermediaire en latere pathogenen deze nodig hebben als steiger voor kolonisatie43. Een soortgelijk fenomeen is voorgesteld in de vaginale omgeving tijdens bacteriële vaginose, waarbij wordt aangenomen dat Gardnerella vaginalis de eerste kolonisator is, gevolgd door daaropvolgende anaëroben44. Het is echter belangrijk op te merken dat dit misschien niet het geval is voor andere ziekten in andere ecologische niches.

Zaaidichtheid voor elk micro-organisme
Micro-organismen zullen verschillende groottes en/of groeidynamieken hebben wanneer ze in vitro worden gekweekt; Daarom is het belangrijk om hier rekening mee te houden tijdens het standaardisatieproces. C. albicans is bijvoorbeeld 100-150 keer zo groot als bacteriecellen45,46, daarom kan het toevoeging in een lagere concentratie rechtvaardigen, bijvoorbeeld 1 x 106 cellen/ml, aan dergelijke biofilmmodellen.

Soorten antagonisme
Sommige micro-organismen (waaronder dezelfde soort maar verschillende isolaten, laboratorium- en/of klinische stammen) die voor deze modellen worden gebruikt, kunnen tijdens de vorming van biofilm met andere concurreren, wat leidt tot remming van de groei van sommige microbiële soorten47. Een studie van Sadiq et al. benadrukte hoe verschillende combinaties van micro-organismen de biofilmbiomassa kunnen beïnvloeden als gevolg van microbiële synergie (of antagonisme)48. Hoewel het onderzoeken van dergelijke interacties binnen een biofilmmodel interessant kan zijn voor onderzoeksgroepen (bijv. het testen van pre- of probiotische behandeling), is het mogelijk dat andere geen rekening houden met dergelijk antagonisme, wat van invloed kan zijn op de complexiteit van meerdere soorten bij het maken van het model.

Duur van de rijping van de biofilm
Het is van cruciaal belang om de rijpingstijd van biofilm te optimaliseren, aangezien dit kan afhangen van de groeidynamiek van de opgenomen micro-organismen en het modelsysteem (inclusief substrata) dat voor de kweek wordt gebruikt. Langere rijpingstijden zouden kunnen resulteren in een betere kolonisatie voor latere pathogenen, maar meer celdood binnen de modellen, met name van de eerdere kolonisatoren. Omgekeerd kunnen kortere incubatietijden belangrijk zijn als u de effecten van onrijpe biofilmmodellen op de gastheer wilt onderzoeken. Een studie van Brown et al. beschreef hoe hetzelfde 10-soorten wondbiofilmmodel verschillende ontstekingsprofielen had in menselijke THP-1-cellen wanneer ze 24 uur, 48 uur en 72 uur gerijpt waren, wat suggereert dat hoe minder volwassen de biofilm, hoe pro-inflammatoire het is7. Vergelijkbare resultaten kunnen worden waargenomen in meerlagige weefselmodellen. Het is ook belangrijk op te merken dat regelmatige dagelijkse veranderingen in de media een noodzaak zijn om celdood in de biofilm te minimaliseren, hoewel dit kan worden gewijzigd afhankelijk van lopende behandelingsregimes, bijvoorbeeld bij het beoordelen van de effecten van langdurige antimicrobiële interventies.

Voor het gedeelte "organotypische weefselbehandeling, experimentele opstelling en weefselverwerking" kunnen de incubatietijdschema's worden aangepast aan de behoeften van de onderzoeker. Interacties tussen gastheer en pathogeen kunnen worden onderzocht op eerdere tijdstippen, bijvoorbeeld 1-12 uur, tot latere tijdstippen van 48 uur en 72 uur, afhankelijk van de onderzoeksvraag. Ten tweede worden alle onderhoudsmedia met antibiotica meegeleverd; Daarom moeten er bij de bestelling verzoeken worden ingediend bij het bedrijf om deze te verwijderen, afhankelijk van het experimentele ontwerp. Hoewel de media onder het inzetstuk niet in direct contact komen met de bovenste periferie van het weefsel, kan verwijdering van antibiotica overwegen bij het onderzoeken van microbiële invasie in het weefsel, tenzij er een wond wordt toegebracht in het model 6,8.

Het microbiële materiaal dat wordt gebruikt voor co-cultuurstimulatie kan ook worden gewijzigd, zoals hierboven besproken, met de mogelijkheid om planktonische, gebruikte biofilm-supernatanten (gefilterd en niet-gefilterd), hele biofilms of biofilmsonicaatincubaties met het weefsel te beoordelen. Eerder bewijs heeft bijvoorbeeld aangetoond dat weefselmodellen zoals die geleverd door EpiSkin nuttige modellen bieden voor het onderzoeken van planktonische schimmel-gastheerinteracties: C. albicans, Candida auris, Malassezia furfur en Trichophyton rubrumcellen hebben aangetoond dat ze zich hechten aan en interageren met perifere weefsellagen in HOE, gereconstrueerde menselijke epidermis (RHE) of menselijk vaginaal epitheel, waarbij sommige van deze onderzoeken stimulatie van een gastheerrespons aantonen na schimmelinfectie 1,5,6,11,12,49. Soortgelijke publicaties bestaan voor interacties tussen bacteriën en gastheren, bijvoorbeeld de vorming van biofilm van Cutibacterium acnes, een veel voorkomende ziekteverwekker geassocieerd met de hoofdhuidmicrobiota bij roos, is bestudeerd op het oppervlak van RHE, wanneer het alleen werd gekweekt en met het schimmelhuidorganisme, Malassezia restricta10. Anderen hebben het vermogen van Staphylococcus spp. om zich aan RHE te hechten onderzocht, waarbij de fysisch-chemische en microbiologische kenmerken van deze bacterie-gastheerinteractie worden gemeten50. N'Diaye en de co-auteurs onderzochten hoe het van de mens afgeleide neuropeptide, Calcitonin Gene-Related Peptide, de virulentie van Staphylococcus aureus beïnvloedde in het RAH-weefselmodel51. Anderen hebben de beschermende effecten van probiotische interventies op Pseudomonas aeruginosa-infectie van humaan hoornvliesepitheel14 onderzocht. Ondertussen hebben verschillende groepen, vanuit een polymicrobieel perspectief, de effecten van biofilms van gemengde soorten op verschillende weefselsubstraten bestudeerd 2,3,7,13.

Over het algemeen documenteren deze protocollen en studies waarnaar hierboven wordt verwezen het brede scala aan toepassingen voor organotypische weefselmodellen om interacties tussen gastheer en pathogeen te onderzoeken. Hoewel studies hebben aangetoond dat EpiSkin-modellen, met name het RH-huidmodel, goed toepasbaar zijn voor het testen van cosmetische producten op corrosie/irritatie 52,53,54,55, bestaan er enkele beperkingen tussen deze en echte ex vivo weefselexplantaten of andere leveranciers van in de handel verkrijgbaar weefsel 56,57. Een voor de hand liggende beperking zou zijn dat alle in de handel verkrijgbare weefselmodellen worden gegenereerd uit cellijnen in een steriele, "kiemvrije" omgeving, wat betekent dat het weefsel nooit is blootgesteld aan microbiële verstoringen: dit kan elke ontstekingsreactie in de gastheer verergeren, veel verder dan wat zou worden gezien in vivo of na stimulatie van ex vivo weefselexplantaten57. Omgekeerd zullen deze laboratoriummodelsystemen geen onderliggende bindlagen of vasculatuur bevatten die men zou associëren met in vivo weefsel, kenmerken die behouden kunnen blijven tijdens ex vivo weefselexplantatie en kenmerken die van invloed zijn op ontstekingsreacties. Een recente systematische review benadrukte inderdaad dat er zorgvuldig moet worden overwogen om weefselmodellen met de juiste vasculatuur te gebruiken die zijn gemaakt met behulp van verschillende technische technologieën, waaronder biomaterialen58. In een recente studie werd bijvoorbeeld een op fibrine gebaseerde matrix gebruikt die is ingebed met gingivale fibroblasten en microvasculaire endotheelcellen om een equivalent van gevasculariseerd tandvleesweefsel te creëren. De auteurs beschreven een differentiële ontstekingsreactie in het model na blootstelling aan gezondheids- of ziekte-geassocieerde micro-organismen59. Vanuit commercieel oogpunt bestaan er nu complexere modellen, zoals het "T-Skin-model", dat een weefsel over de volledige dikte bevat dat bestaat uit een dermis die bestaat uit fibroblasten die over de epidermis zijn gelegd. Het zou interessant zijn om te zien hoe dergelijke complexe modellen zich verhouden tot de systemen met alleen epidermis.

Hoewel geen enkel model perfect is, vertegenwoordigen organotypische weefselmodellen veelbelovende alternatieven voor preklinische tests, in overeenstemming met het kader dat wordt geschetst door de drie R's, voor vervanging, vermindering en verfijning bij het uitvoeren van dieronderzoek. Hoewel diermodellen belangrijke inzichten verschaffen in de complexe pathofysiologische aard van biofilmgerelateerde ziekten bij de mens, hebben ze duidelijke nadelen. Deze 3D-modellen zijn gemakkelijk te manipuleren, waardoor grote, subtiele wijzigingen in onderzoeken mogelijk zijn zonder ethische goedkeuring. Het combineren van deze modellen met bestaande complexe biofilmsystemen die hierboven zijn beschreven, kan ons begrip van gastheer-pathogeen interacties aanzienlijk verbeteren en het succes van nieuwe therapieën beter voorspellen voorafgaand aan in vivo onderzoeken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen Haleon bedanken voor de financiële steun aan Saeed Alqahtani om geassocieerde projecten uit te voeren met betrekking tot de beschreven weefselmodellen, evenals het Ministerie van Onderwijs, Saoedi-Arabië, voor de PhD-financiering van Muhanna Alshehri.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
13 mm hydroxyapatite (HA) discsPlasma Biotal Limitedn/a (made to order)Substraat voor orale biofilmvorming, die het tandoppervlak nabootst
19 G naald (40 mm) VWR613-2028Wordt gebruikt om HA-schijven uit platen te verwijderen en om weefsel uit inserts te snijden
24 well TC-behandelde platte bodem microtiterplaten met deksels Scientific Laboratory Supplies3524 (verpakking van 100)Platen voor het kweken van biofilms en weefsel co-cultuur experimenten
Zuurgewassen glazen kralen (425-600 μm)Merck: Sigma-AldrichG8772Voor weefsellyse om de opbrengst van RNA-extractie te verbeteren  
Actinomyces naeslundii DSM 17233 Leibniz Institute DSMZn/aEen van de micro-organismen die wordt gebruikt voor het complexe biofilmmodel
Bead Mill 24 Homogenizer (of equivalent) Fisher Scientific15-340-163Voor weefsellyse om de opbrengst van RNA-extractie te verbeteren  
Bijouxes  (7 mL)Greiner Bio-One189170 (700 per zak)Wordt gebruikt voor biofilm sonicatie  
cDNA-synthesekit (hoge capaciteit)Thermo Fisher Scientific4368814 (voor 200 reacties)cDNA-synthese uit weefsel-RNA
Columbia Bloed Agar (CBA) basis Thermo Fisher ScientificCM0331B (voor 500 gram)Wordt gebruikt om CBA-platen te bereiden voor het kweken van aerobe micro-organismen
Defibrinerend paardenbloedE&O LaboratoriesDHBWordt gebruikt om CBA- en FAA-platen aan te vullen voor het kweken van aerobe en anaërobe micro-organismen
Dulbecco's Fosfaat Gebufferde Saline (dPBS: zonder CaCl2 en MgCl2)Merck: Sigma-AldrichDB537dPBS voor celco-cultuur met biofilm sonicaat
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953American Type Culture Collectionn/aEen van de micro-organismen die wordt gebruikt voor het complexe biofilmmodel
Fusobacterium nucleatum subspeks (subspp.) vincentii DSM 19507Leibniz Institute DSMZn/aEen van de micro-organismen die wordt gebruikt voor het complexe biofilmmodel
GraphPad Prism (versie 10)GraphPad Software, Incn/aVoor het maken van grafieken en gegevensanalyse 
Human IL-8 ELISA-kit (ongecoat ELISA-kit met platen)Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (voor 10 x 96 tests)ELISA-kit en platen voor eiwitbeoordeling van uitgeput weefselmedium
Human Oral Epithelium (HOE) Episkinn/a (made to order)Het epitheelweefsel dat wordt gebruikt voor het co-cultuurmodelsysteem
Inoculating loops (wegwerp, 10 µL, of equivalent) Fisher Scientific12870155 (verpakking van 1000)Voor microbiologische kweek in vaste en vloeibare media
MicroAmp Fast Reaction 96-well qPCR-platen (0,1 mL) Thermo Fisher Scientific4346907 (voor 10 platen)Voor qPCR genexpressieprofilering van weefsel
Microbank kralenPro-Lab DiagnosticsPL.170Opslag en cryoconservering van micro-organismen 
Nuclease-vrij waterThermo Fisher ScientificAM9935 (10 x 1,5 mL)RT-PCR-kwaliteit water voor qPCR-experimenten 
Petri Dishes (90 mm)Fisher Scientific (Sterilin) 11309283 (verpakking van 500)Wordt gebruikt voor de bereiding van agarplaten voor microbiële kweek
Fosfaat-gebufferde saline (PBS)Thermo Fisher Scientific 18912014 (verpakking van 100 tabletten)PBS voor standaardisatie van micro-organismen en biofilm wasstappen
Rneasy mini kitQiagen74106 (voor 250 reacties)Kolom-gebaseerde RNA-extractiekit voor weefsel 
Roswell Park Memorial Institute 1640 mediumMerck: Sigma-AldrichR7755-10L (voor 10 L) Media voor biofilmcultuur 
RT2 profiler arrayQiagen330171 (op maat gemaakt)qPCR array met kant-en-klare primers voor genexpressieprofilering
Schaedler anaërobe agar basisMerck: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (voor 500 g)Wordt gebruikt om Fastdious Anaerobic Agar-platen te bereiden 
Schaedler anaërobe bouillonThermo Fisher Scientific CM0497B (voor 500 g)Vloeibaar medium voor de groei van anaërobe micro-organismen
Schroefkap Beadbug O-Ring buis Scientific Laboratory SuppliesZ763837-1000EA (verpakking van 1000)Voor gebruik in Bead Mill 24 homogenisator, om weefsel te lysen
SonicatiebadFisher Scientific (Fisherbrand)n/aVoor sonicatie van biofilms van HA-schijven 
Streptococcus intermedius DSM 20753 Leibniz Institute DSMZn/aEen van de micro-organismen die wordt gebruikt voor het complexe biofilmmodel
Streptococcus mitis NCTC 12261National Collection of Type Culturesn/aEen van de micro-organismen die wordt gebruikt voor het complexe biofilmmodel
Streptococcus oralis NTCC 11427 National Collection of Type Culturesn/aEen van de micro-organismen die wordt gebruikt voor het complexe biofilmmodel
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)PCR BiosystemsPB20.12SYBR-green mix voor qPCR 
Todd Hewitt bouillonMerck: Sigma-AldrichT1438 Media voor biofilmcultuur 
Tryptone soja bouillon (TSB) mediumMerck: Sigma

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moyes, D. L., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of candida albicans in epithelial cells. Cell Host Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  2. Morse, D. J., et al. Denture-associated biofilm infection in three-dimensional oral mucosal tissue models. J Med Microbiol. 67 (3), 364-375 (2018).
  3. Brown, J. L., et al. Biofilm-stimulated epithelium modulates the inflammatory responses in co-cultured immune cells. Sci Rep. 9 (1), 15779(2019).
  4. Yadev, N. P., Murdoch, C., Saville, S. P., Thornhill, M. H. Evaluation of tissue engineered models of the oral mucosa to investigate oral candidiasis. Microb Pathog. 50 (6), 278-285 (2011).
  5. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  6. Brown, J. L., et al. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere. 5 (3), e00371-e00420 (2020).
  7. Brown, J. L., et al. Assessing the inflammatory response to in vitro polymicrobial wound biofilms in a skin epidermis model. NPJ Biofilms Microbiomes. 8 (1), 19(2022).
  8. Butcher, M. C., et al. Antifungal-loaded calcium sulfate beads as a potential therapeutic in combating candida auris. Antimicrob Agents Chemother. 66 (1), e0171321(2022).
  9. Duckney, P., et al. The role of the skin barrier in modulating the effects of common skin microbial species on the inflammation, differentiation and proliferation status of epidermal keratinocytes. BMC Res Notes. 6, 474(2013).
  10. Meloni, M., Balzaretti, S., Collard, N., Desaint, S., Laperdrix, C. Reproducing the scalp microbiota community: Co-colonization of a 3D reconstructed human epidermis with c. Acnes and m. Restricta. Int J Cosmet Sci. 43 (2), 235-245 (2021).
  11. Pedrosa, A. F., et al. Malassezia colonisation on a reconstructed human epidermis: Imaging studies. Mycoses. 62 (12), 1194-1201 (2019).
  12. Schaller, M., Weindl, G. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia for the study of host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 470, 327-345 (2009).
  13. Rosca, A. S., et al. Six bacterial vaginosis-associated species can form an in vitro and ex vivo polymicrobial biofilm that is susceptible to thymbra capitata essential oil. Front Cell Infect Microbiol. 12, 824860(2022).
  14. Paterniti, I., et al. Protective effect of probiotics against pseudomonas aeruginosa infection of human corneal epithelial cells. Int J Mol Sci. 25 (3), 1770(2024).
  15. Pellegatta, G., et al. Evaluation of human esophageal epithelium permeability in presence of different formulations containing hyaluronic acid and chondroitin sulphate. Med Devices (Auckl). 13, 57-66 (2020).
  16. Jensen, C., Teng, Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, (2020).
  17. Mountcastle, S. E., et al. A review of co-culture models to study the oral microenvironment and disease. J Oral Microbiol. 12 (1), 1773122(2020).
  18. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  19. Langfeldt, D., et al. Health- and disease-associated species clusters in complex natural biofilms determine the innate immune response in oral epithelial cells during biofilm maturation. FEMS Microbiol Lett. 360 (2), 137-143 (2014).
  20. Ramage, G., et al. The epithelial cell response to health and disease associated oral biofilm models. J Periodontal Res. 52 (3), 325-333 (2017).
  21. Shang, L., et al. Multi-species oral biofilm promotes reconstructed human gingiva epithelial barrier function. Sci Rep. 8 (1), 16061(2018).
  22. Myers, S., et al. Immunomodulatory streptococci that inhibit cxcl8 secretion and NF-kappaB activation are common members of the oral microbiota. J Med Microbiol. 70 (3), 001329(2021).
  23. Tang, Y. L., Sim, T. S., Tan, K. S. Oral streptococci subvert the host innate immune response through hydrogen peroxide. Sci Rep. 12 (1), 656(2022).
  24. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  25. Yee, M., Kim, S., Sethi, P., Duzgunes, N., Konopka, K. Porphyromonas gingivalis stimulates il-6 and il-8 secretion in gsm-k, hsc-3 and h413 oral epithelial cells. Anaerobe. 28, 62-67 (2014).
  26. Groeger, S., Jarzina, F., Domann, E., Meyle, J. Porphyromonas gingivalis activates NF-kappaB and MAPK pathways in human oral epithelial cells. BMC Immunol. 18 (1), 1(2017).
  27. Groeger, S., Zhou, Y., Ruf, S., Meyle, J. Pathogenic mechanisms of fusobacterium nucleatum on oral epithelial cells. Front Oral Health. 3, 831607(2022).
  28. Li, X., et al. Saliva-derived microcosm biofilms grown on different oral surfaces in vitro. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 74(2021).
  29. Krishnamoorthy, A. L., Lemus, A. A., Solomon, A. P., Valm, A. M., Neelakantan, P. Interactions between Candida albicans and Enterococcus faecalis in an organotypic oral epithelial model. Microorganisms. 8 (11), 1771(2020).
  30. Brown, J. L., et al. Generation of multi-species oral bacteria biofilm models. Methods Mol Biol. 2588, 187-199 (2023).
  31. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg (Lond). 38 (6), 732-749 (1938).
  32. Lukic, D., Karygianni, L., Flury, M., Attin, T., Thurnheer, T. Endodontic-like oral biofilms as models for multi-species interactions in endodontic diseases. Microorganisms. 8 (5), 674(2020).
  33. Sherry, L., et al. Viable compositional analysis of an eleven-species oral polymicrobial biofilm. Front Microbiol. 7, 912(2016).
  34. Brown, J. L., et al. An in vitro evaluation of denture cleansing regimens against a polymicrobial denture biofilm model. Antibiotics (Basel). 11 (1), 113(2022).
  35. Ammann, T. W., Gmur, R., Thurnheer, T. Advancement of the 10-species subgingival zurich biofilm model by examining different nutritional conditions and defining the structure of the in vitro biofilms. BMC Microbiol. 12, 227(2012).
  36. Montelongo-Jauregui, D., Srinivasan, A., Ramasubramanian, A. K., Lopez-Ribot, J. L. An in vitro model for oral mixed biofilms of candida albicans and streptococcus gordonii in synthetic saliva. Front Microbiol. 7, 686(2016).
  37. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  38. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  39. Buskermolen, J. K., Janus, M. M., Roffel, S., Krom, B. P., Gibbs, S. Saliva-derived commensal and pathogenic biofilms in a human gingiva model. J Dent Res. 97 (2), 201-208 (2018).
  40. Rosier, B. T., Buetas, E., Moya-Gonzalvez, E. M., Artacho, A., Mira, A. Nitrate as a potential prebiotic for the oral microbiome. Sci Rep. 10 (1), 12895(2020).
  41. Rosier, B. T., Moya-Gonzalvez, E. M., Corell-Escuin, P., Mira, A. Isolation and characterization of nitrate-reducing bacteria as potential probiotics for oral and systemic health. Front Microbiol. 11, 555465(2020).
  42. Young, T., et al. Candida albicans as an essential "keystone" component within polymicrobial oral biofilm models. Microorganisms. 9 (1), 59(2020).
  43. Marsh, P. D., Lewis, M. A., Rogers, H., Williams, D., Wilson, M. Marsh and Martin's oral microbiology-e-book: Marsh and Martin's oral microbiology-e-book. , Elsevier Health Sciences. (2016).
  44. Johnston, W., et al. In vitro bacterial vaginosis biofilm community manipulation using endolysin therapy. Biofilm. 5, 100101(2023).
  45. Janus, M. M., Willems, H. M., Krom, B. P. Candida albicans in multi-species oral communities; a keystone commensal. Adv Exp Med Biol. 931, 13-20 (2016).
  46. Delaney, C., et al. Fungi at the scene of the crime: Innocent bystanders or accomplices in oral infections. Curr Clin Microbiol Rep. 5, 190-200 (2018).
  47. Luo, A., Wang, F., Sun, D., Liu, X., Xin, B. Formation, development, and cross-species interactions in biofilms. Front Microbiol. 12, 757327(2021).
  48. Sadiq, F. A., De Reu, K., Burmolle, M., Maes, S., Heyndrickx, M. Synergistic interactions in multi-species biofilm combinations of bacterial isolates recovered from diverse food processing industries. Front Microbiol. 14, 1159434(2023).
  49. Liang, P. P., et al. A trichophyton rubrum infection model based on the reconstructed human epidermis - EpiSkin(r). Chin Med J (Engl). 129 (1), 54-58 (2016).
  50. Lerebour, G., Cupferman, S., Bellon-Fontaine, M. N. Adhesion of staphylococcus aureus and staphylococcus epidermidis to the EpiSkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. J Appl Microbiol. 97 (1), 7-16 (2004).
  51. N'diaye, A. R., et al. Skin-bacteria communication: Involvement of the neurohormone calcitonin gene-related peptide (cgrp) in the regulation of staphylococcus epidermidis virulence. Sci Rep. 6, 35379(2016).
  52. Géniès, C., et al. Comparison of the metabolism of 10 cosmetics-relevant chemicals in EpiSkin s9 subcellular fractions and in vitro human skin explants. J Appl Toxicol. 40 (2), 313-326 (2020).
  53. Alépée, N., Grandidier, M. -H., Cotovio, J. Usefulness of the EpiSkin reconstructed human epidermis model within integrated approaches on testing and assessment (IATA) for skin corrosion and irritation. Toxicol Vitro. 54, 147-167 (2019).
  54. Spielmann, H., et al. The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EpiSkin and epiderm assays and on the skin integrity function test. Alternatives to Laboratory Animals. 35 (6), 559-601 (2007).
  55. Cotovio, J., Grandidier, M. -H., Portes, P., Roguet, R., Rubinstenn, G. The in vitro acute skin irritation of chemicals: Optimisation of the EpiSkin prediction model within the framework of the ECVAM validation process. Alt Lab Anim. 33 (4), 329-349 (2005).
  56. Netzlaff, F., Lehr, C. M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and epiderm: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 60 (2), 167-178 (2005).
  57. Larson, P. J., Chong, D., Fleming, E., Oh, J. Challenges in developing a human model system for skin microbiome research. J Invest Dermatol. 141 (1), 228-231.e4 (2021).
  58. Dechelette, C., Smirani, R., Medina, C., Naveau, A. Cellularized biomaterials used as gingival connective tissue substitutes in vivo: A systematic review. Tissue Eng Part B Rev. , (2024).
  59. Makkar, H., Lim, C. T., Tan, K. S., Sriram, G. Modeling periodontal host-microbe interactions using vascularized gingival connective tissue equivalents. Biofabrication. 15 (4), (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Organotypische weefselmodellenepitheliale modellenbiofilm cocultuurin vitro infectiemicrobi le adherentiegenexpressieanalyseproteomische profileringmultiplex qPCRinflammatoire biomarkers

Gerelateerde artikelen