Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

ATAC-SEQ Bibliotheekbereiding van van muizen beenmerg-afgeleide neutrofielen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67490

⸱

3 januari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Innovation Center, Beijing Shijitan Hospital, Capital Medical University, 2Beijing Key Laboratory for Therapeutic Cancer Vaccines

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit manuscript schetst een protocol voor het voorbereiden van een ATAC-seq-bibliotheek van neutrofielen uit muizenbeenmerg, met als doel een optimale levensvatbaarheid van neutrofielen en een hoge bibliotheekkwaliteit te garanderen. Het biedt stapsgewijze instructies voor BMC-voorbereiding, immunomagnetische sortering en bibliotheekconstructie, en dient als een waardevolle gids, vooral voor nieuwkomers in het bestuderen van neutrofielen.

Samenvatting

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing (ATAC-seq) is een krachtige techniek met hoge doorvoer voor het beoordelen van de toegankelijkheid van chromatine en het begrijpen van epigenomische regulatie. Neutrofielen, als een cruciaal leukocytentype in immuunresponsen, ondergaan substantiële chromatine-architecturale veranderingen tijdens differentiatie en activering, die een aanzienlijke invloed hebben op de genexpressie die nodig is voor hun functies. ATAC-seq heeft een belangrijke rol gespeeld bij het blootleggen van belangrijke transcriptiefactoren bij de rijping van neutrofielen, het onthullen van pathogeenspecifieke epigenomische handtekeningen en het identificeren van therapeutische doelen voor auto-immuunziekten. De gevoeligheid van neutrofielen voor het externe milieu bemoeilijkt echter de productie van hoogwaardige ATAC-seq-gegevens. Hier stellen we een schaalbaar protocol voor voor het bereiden van ATAC-seq-bibliotheken uit van beenmerg afgeleide neutrofielen van knaagdieren, met verbeterde immunomagnetische scheiding om een optimale cellevensvatbaarheid en bibliotheken van hoge kwaliteit te garanderen. De essentiële elementen die van invloed zijn op de kwaliteit van de bibliotheek en de optimalisatieprincipes voor methodologische uitbreiding worden in detail besproken. Dit protocol zal de onderzoekers ondersteunen die bereid zijn om de chromatine-architectuur en epigenomische herprogrammering van neutrofielen te bestuderen, en geavanceerde studies in de basis- en klinische immunologie te bevorderen.

Inleiding

Neutrofielen zijn een van de meest voorkomende en cruciale immuunceltypen bij gewervelde dieren en vormen 50%-70% van de menselijke leukocyten1. Neutrofielen spelen een centrale rol bij het detecteren en elimineren van micro-organismen in gastheren. Tijdens sepsis behoren rijpe neutrofielen tot de eerste hulpverleners2. Ze mobiliseren zich snel naar infectieplaatsen via chemotaxis3, waar ze ziekteverwekkers bestrijden door micro-organismen op te nemen (fagocytose), NADPH-oxidase-afhankelijke reactieve zuurstofsoorten te produceren (respiratoire uitbarstingen), korrels af te scheiden (degranulatie) en neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) te vormen die extracellulaire bacteriën vangen en doden zodra ze op de ontstekingsplaatsaankomen 4. Onrijpe neutrofielen worden ook snel vanuit het beenmerg naar de perifere circulatie gemobiliseerd door chemokines 5,6. Deze neutrofielen die naar de infectieuze plaats worden aangetrokken, geven ook cytokines af, die betrokken zijn bij verschillende fysiologische processen, zoals hematopoëse, angiogenese en wondgenezing 7,8. Patiënten die lijden aan aangeboren of verworven ziekten die leiden tot een verminderd aantal neutrofielen zijn vatbaarder voor infecties 9,10. Activering van neutrofielen is echter een tweesnijdend zwaard. Overmatige activering en afgifte van cytokines kan weefsel- en orgaanschade veroorzaken, wat leidt tot meervoudige orgaandisfunctie als infecties niet onmiddellijk onder controle worden gehouden11,12. Bovendien dragen neutrofielen ook bij aan verschillende ontstekings- en auto-immuunziekten en kunnen ze de progressie en metastase van kanker beïnvloeden13,14. Dit onderstreept de noodzaak om de regulatie van neutrofielenactiviteit te bestuderen om een effectieve immuunrespons in evenwicht te brengen en schade aan de gastheer te voorkomen.

In neutrofielen ondergaat de chromatine-architectuur duidelijke en dynamische veranderingen in hun differentiatie, migratie en activering, waarbij ze gedurende de cellulaire levensduur een cruciale regulerende rol spelen. Deze reis, van de grote, ronde, euchromatinerijke kern van myeloblasten naar een meer ingesprongen kern in myelocyten en metamyelocyten, en vervolgens naar een C- of S-vormige in-band cellen en sterk gelobbeld met dicht opeengepakt chromatine in polymorfonucleaire neutrofielen15,16, is een bewijs van de complexiteit van de biologie van neutrofielen. De gespecialiseerde chromatineconfiguratie zorgt voor de selectieve expressie van genen die essentieel zijn voor de functie van neutrofielen, zoals die welke betrokken zijn bij de productie van granules en snelle transcriptiereacties die nodig zijn voor effectieve eliminatie van pathogenen17. Wanneer neutrofielen via chemotaxis naar ontstekingsplaatsen worden gemobiliseerd, zet de transendotheliale migratie druk op het nucleoskelet/cytoskelet complex linker (LINC)-complex, wat leidt tot chromatineremodellering en meer activeringspotentieel18. Bij sepsis vertonen geactiveerde neutrofielen een "nucleair-linkse verschuiving", met abnormale chromatinemorfologie, zoals tweelobbige of niet-gelobde kernen en significant lossere chromatinecondensatie19. Dit resulteert in een verhoogde toegankelijkheid binnen genregio's die verband houden met ontstekingsreacties, waardoor een significante expressie van deze genen wordt geïnduceerd. Als infecties niet naar behoren onder controle worden gehouden, zijn histoncitrullinatie en daaropvolgende chromatinedeconstructie nodig om NET's te vormen20,21. Daarom is het begrijpen van de architectuur van neutrofiele chromatine cruciaal voor het bevorderen van de biologie van neutrofielen en het ontwikkelen van behandelingen voor ontstekings- en auto-immuunziekten, wat hoop biedt voor toekomstige ziektebehandeling.

De toegankelijkheid van chromatine dient als maatstaf voor chromatine-architectuur op epigenoomniveau. Het geeft aan hoe genomische regio's fysiek toelaatbaar zijn voor versterkers, promotors, isolatoren en chromatinebindende factoren en hoe deze elementen de genexpressie beïnvloeden22. Assay voor transposase-toegankelijk chromatine met sequencing (ATAC-seq) is een veelgebruikte techniek om de toegankelijkheid van chromatine in het genoomte beoordelen 23. Het vereist geen voorkennis van regulerende elementen, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor epigenetisch onderzoek. Deze methode omvat het isoleren van kernen van monsters, het fragmenteren van genomisch DNA door transposase Tn5 en het toevoegen van sequencing-primers voor bibliotheekvoorbereiding, sequencing en gegevensanalyse23. ATAC-seq heeft een belangrijke rol gespeeld bij het bestuderen van nucleosoommapping, transcriptiefactorbindingsanalyse, regulatiemechanismen in verschillende celtypen of ziekten, identificatie van nieuwe enhancers, ontdekking van biomarkers, enz.22,23. Het wordt vaak gecombineerd met andere technieken, zoals RNA-sequencing, voor een uitgebreide analyse van genexpressie.

ATAC-seq heeft onze kennis van de biologie van neutrofielen vergroot door nauwkeurige epigenetische mechanismen in gezondheid en ziekte bloot te leggen. Het heeft verschillende belangrijke transcriptiefactoren (d.w.z. RUNX1, KLF6, PU.1, enz.) onthuld in de rijping van neutrofielen en effectorresponsen24,25, pathogeenspecifieke handtekeningen met biomarkerpotentieel bij sepsis26 blootgelegd, de epigenomische mechanismen van het aangeboren immuungeheugen opgehelderd12 en therapeutische doelen geïdentificeerd bij pediatrische acute myeloïde leukemie (AML)27. Als een prominente cellulaire component in immuunsurveillance vertonen neutrofielen echter een hoge gevoeligheid voor hun externe omgeving en vormen ze dus een uitdaging voor het produceren van hoogwaardige ATAC-seq-gegevens. Onder fysiologische omstandigheden wordt gemeld dat de mediane halfwaardetijd van menselijke neutrofielen 3,8 dagen is, terwijl de gemiddelde halfwaardetijd van neutrofielen van muizen 12,5 uur is. Het is opmerkelijk dat hun halfwaardetijd aanzienlijk korter is wanneer ze in vitro worden bestudeerd 28,29. Tijdens in vitro werking van geïsoleerde neutrofielen kan blootstelling aan micro-organismen of pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's), evenals redundante experimentele procedures en zware operaties, resulteren in afwijkende activering van neutrofielen en verminderde cellulaire levensvatbaarheid als gevolg van apoptose of NETosis. De overleden cellen bevatten gewoonlijk aanzienlijke hoeveelheden niet-gechromatiniseerd DNA dat zeer gevoelig is voor Tn5, waardoor de achtergrondruis van ATAC-seq23 toeneemt.

Hier stellen we een schaalbaar protocol voor voor het voorbereiden van ATAC-seq-bibliotheken die zijn geoptimaliseerd voor neutrofielen die zijn afgeleid van beenmergmonsters van knaagdieren. Figuur 1 geeft een grafisch overzicht van het protocol, dat de immunomagnetische scheiding van neutrofielen uit het beenmerg omvat, gevolgd door ATAC-seq. De verbeterde immunomagnetische sortering garandeert de optimale levensvatbaarheid van neutrofielen voordat de kern voor de ATAC-seq-bibliotheek wordt geëxtraheerd, waardoor de hoge kwaliteit van de bibliotheken wordt gewaarborgd en de opname van aanvullende neutrofielenbeoordelingen in het schema wordt vergemakkelijkt. De implementatie van dit protocol zal onderzoekers helpen bij het begrijpen van de chromatine-architectuurkenmerken en epigenomische herprogrammeringsmechanismen van neutrofielen wanneer ze worden blootgesteld aan verschillende micro-omgevingsuitdagingen. Dit zal naar verwachting brede toepassingen hebben in basis- en klinische immunologische studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hieronder gepresenteerde dierprocedures voldeden aan de nationale richtlijnen en voorschriften voor ethiek en dierenwelzijn, die zijn goedgekeurd door de Animal Care Research Ethics Committee van de Capital Medical University, Beijing, China (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Bereiding van beenmergcelsuspensies (BMC)

  1. Selecteer mannelijke C57BL/6J-muizen van 6-8 weken met een gewicht van 19-21 g. Euthanaseer de muizen met behulp van een CO2 -kamer, gevolgd door cervicale dislocatie nadat de diepe reflex is verdwenen. Desinfecteer ze met 70% ethanolspray op een snijmat.
  2. Gebruik een kleine schaar en een tang om het dijbeen voorzichtig te scheiden van het heupgewricht en het scheenbeen, verwijder de aangehechte huid en skeletspier en spoel het dijbeen af met koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een petrischaaltje van 10 cm.
  3. Snijd de epifysen van het dijbeen af, steek voorzichtig een naald van 28 G die aan een spuit van 2 ml is bevestigd in de mergholte en spoel het beenmerg weg met koude PBS met 2% foetaal runderserum (FBS).
  4. Herhaal de vorige stap totdat de gespoelde donkerrode vloeistof doorschijnend wordt. Meestal zijn drie flushes nodig.
    OPMERKING: Steek de naald niet te diep in de beenmergholte om een optimale celopname te garanderen.
  5. Gebruik een celzeef van 70 μm om de celsuspensie te filteren in een fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuis (FACS) (5 ml).
  6. Lyseer de erytrocyten in BMC's met een commerciële erytrocytenlysisbuffer zonder polyformaldehyde.
    1. Centrifugeer de buis 500 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C, verwijder voorzichtig het supernatant, laat ongeveer 100 μL vloeistof op de bodem over, en tik zachtjes op de buis om de pellet los te maken.
    2. Voeg 2 ml lysisbuffer toe, verdund uit erytrocytenlysisbuffer (10x), en meng door de buis drie keer ondersteboven te draaien. Centrifugeer vervolgens de buis op 500 x g gedurende 5 minuten, gooi de supernatant weg en suspendeer de celpellet opnieuw door zachtjes te tikken.
    3. Was de cellen twee keer met RPMI 1640 medium met 10% FBS en suspendeer ze opnieuw in een volume van 2 ml.
      OPMERKING: Bij het omgaan met niet-verspreide celklonten wordt aanbevolen om een pipetpunt van 200 μL te gebruiken om ze eruit te halen in plaats van de celsuspensies te filteren door een celzeef van 70 μm. Deze methode kan celverlies verminderen.
  7. Bereken de cellulaire levensvatbaarheid en het totale aantal levende cellen per monster met trypanblauwe kleuring.

2. Immunomagnetische labeling van neutrofielen met anti-Ly6G magnetische kralen

  1. Resuspendeer de beenmergcellen (~2 x 107 levende cellen per muis) in 2 ml RPMI 1640-medium met 10% FBS en centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C.
    OPMERKING: Gezien de beperkte vereiste van 1 x 105 cellen voor ATAC-seq, kunnen de overtollige neutrofielen worden toegewezen voor aanvullende epigenomische analyses (bijv. ChIP-seq en Hi-C) of immuunfunctiebeoordelingen (bijv. cytokineproductie, fagocytose en NET) met behulp van neutrofielen verkregen van dezelfde muis.
  2. Zuig het grootste deel van het supernatant op, laat ongeveer 100 μL achter, en tik zachtjes op de buis om de pellet los te maken.
  3. Voeg 30 μL Ly6G-korrels toe en meng met de BMC's door zachtjes te tikken.
    NOTITIE: Magnetische kralen moeten voor gebruik minimaal 10 seconden worden gevortexd. Na de toevoeging van de kralen aan BMC's, wordt aanbevolen om af te zien van vortexing.
  4. Incubeer de buis gedurende 15 minuten bij 25 °C.
  5. Voeg 2 ml PBS toe om de korrels en cellen opnieuw te suspenderen en centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 500 x g bij 25 °C.
  6. Zuig het grootste deel van het supernatant op, laat ongeveer 100 μL achter, en tik zachtjes op de buis om de pellet los te maken. Voeg extra PBS toe voor een eindvolume van 1 ml.
    OPMERKING: Bij het omgaan met niet-verspreide celklonten wordt aanbevolen om een pipetpunt van 200 μL te gebruiken om ze eruit te halen in plaats van de celsuspensies te filteren door een celzeef van 70 μm. Deze methode kan celverlies verminderen.

3. Neutrofielenscheiding met immunomagnetische celsortering

  1. Behandel de MS-kolom voor met PBS.
    1. Plaats de MS-kolom binnen het magnetische veld van een compatibele magnetische geactiveerde celsorteerder (MACS). Plaats een onbezette buis van 5 ml onder de vloeistof die uit de MS-kolom stroomt.
    2. Spoel de kolom met 500 μL PBS. Herhaal deze stap na de volledige stroom van PBS in de MS-kolom.
      OPMERKING: De PBS moet geleidelijk, druppel voor druppel, via de MS-kolom in de 5 ml fluorescentie-geactiveerde celsorteerbuis (FACS) kunnen stromen. Zorg ervoor dat er geen lucht in de kolom komt, aangezien luchtbellen de kolom kunnen blokkeren.
  2. Breng de magnetisch gelabelde BMC-suspensie aan op de MS-kolom door 500 μL per keer toe te voegen en vul deze onmiddellijk bij zodra het kolomreservoir leeg is.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de celsuspensies geen celmassa bevatten. Plaats indien nodig een nieuw FACS-buisje van 5 ml onder de MS-kolom om de niet-gelabelde cellen (bijv. monocyten en lymfocyten) vóór deze fase te verzamelen.
    OPMERKING: Let op de druppelstroomsnelheid. Een trage doorstroming kan erop duiden dat de sorteerkolom verstopt is.
  3. Was de MS-kolom door 500 μL PBS toe te voegen telkens wanneer het reservoir leeg is, en herhaal dit proces twee keer.
    OPMERKING: De voortijdige toevoeging van PBS kan de invoer van bepaalde cellen in de sorteerkolom belemmeren, waardoor de zuiverheid van de celsortering in gevaar kan komen.
  4. Verzamel de magnetisch gelabelde neutrofielen.
    1. Zodra het kolomreservoir leeg is, verwijdert u de kolom uit het magnetische veld en plaatst u deze voorzichtig op een buis van 5 ml.
      OPMERKING: Zorg er voordat de kolom wordt verwijderd voor dat er geen vloeistof in achterblijft om het verlies van neutrofielen als gevolg van druppelafvoer tijdens het proces te voorkomen. Het residu in de kolom kon met een pipet worden verwijderd.
    2. Doseer 2 ml PBS op de kolom en duw vervolgens onmiddellijk en stevig de zuiger in de kolom om de magnetisch gelabelde neutrofielen te verdrijven.
      OPMERKING: Om voldoende neutrofielen te verkrijgen, moet u zorgen voor voldoende elutievolume en kort blijven wanneer u de zuiger in de kolom duwt.
  5. Gebruik een hemocytometer om de geïsoleerde cellen op te sommen. Identificeer de zuiverheid van de geïsoleerde neutrofielen door 100 μL van de celsuspensie na het sorteren te nemen en deze te analyseren met flowcytometrie.

4. Nucleus extractie

  1. Centrifugeer de 50.000 eencellige suspensies die de neutrofielen bevatten bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een buisje van 0,2 ml en gooi het supernatant vervolgens weg.
  2. Resuspendeer de neutrofielen in 50 μl voorgekoelde lysisbuffer (zie tabel 1), meng de oplossing voorzichtig met een pipet en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
    OPMERKING: Als het monstervolume minder dan 5 μL is, is het rechtstreeks toevoegen van de Lysis-buffer toegestaan. De concentratie van de celsuspensie is niet hoger dan 1 x 107 cellen/ml.
  3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 x g bij 4 °C, gooi het bovenstaande weg en verzamel de kern. Plaats de buis op ijs voordat u met de volgende procedures begint.
    NOTITIE: Om monsterverlies tot een minimum te beperken, geeft u de kant van de buiswand aan waar pellets zich ophopen en zuigt u de vloeistof voorzichtig aan vanaf de andere kant bij het verwijderen van het supernatant.

5. Nucleosoom-gebonden tagmentatie met transposase

  1. Bereid de Tagmentation Reaction Mix met Tn5-transposase in een polymerasekettingreactie (PCR)-buisje volgens de richtlijnen van de DNA Library Prep-kit (zie tabel 2) en verwarm de gekoelde amplicon-zuiveringskorrels gedurende ten minste 30 minuten voor bij 25 °C.
  2. Resuspendeer de neutrofielenkern met 50 μL tagmentatiereactiemengsel en schud voorzichtig met een pipet, gevolgd door centrifugeren gedurende 5s met behulp van een handcentrifuge (~2600 x g).
  3. Incubeer de reactiebuis in een PCR-instrument bij 37 °C gedurende 30 min.
  4. Voeg 100 μL pre-vortexed amplicon-zuiveringsparels toe aan het lysaat en meng de magnetische korrels vervolgens grondig in de oplossing door 10 keer op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Magnetische kralen zijn plakkerig en kunnen gemakkelijk aan de pipetpunten worden bevestigd, zorg er daarom voor dat u het juiste volume aanzuigt en doseer ze langzaam uit de tips bij het overbrengen van de kralen.
  5. Incubeer de reactiebuis gedurende 5 minuten bij 25 °C en centrifugeer deze vervolgens gedurende 5 s met een handcentrifuge (~2600 × g).
  6. Zuiver het onderbroken DNA-fragment door de reactiebuis op een magnetisch rek te plaatsen totdat de oplossing helder wordt (ongeveer 5 min). Verwijder vervolgens voorzichtig het bovenstaande zonder de magnetische kralen te verstoren.
  7. Was de magnetische parel telkens met 200 μL vers bereide 80% ethanol, terwijl u de reactiebuis 30 s op het magnetische rek houdt. Vermijd het verstoren van de kralen bij het toevoegen van ethanol. Herhaal de procedure beschreven in stap 5.7.
  8. Centrifugeer de reactiebuis met een handcentrifuge (ongeveer 2600 × g), zuig de ethanol op met pipetpunten van 10 μl en droog vervolgens de magnetische kralen 3-5 minuten terwijl u het deksel opent.
    OPMERKING: De droogduur van magnetische kralen kan in verschillende regio's variëren als gevolg van variaties in de vochtigheidsgraad. De kralen moeten worden gedroogd totdat ze hun glans verliezen. Te veel drogen kan het elutieproces bemoeilijken, terwijl onvoldoende drogen kan leiden tot de aanwezigheid van alcoholresten, wat gevolgen heeft voor latere experimenten. Bovendien is het horizontaal plaatsen van het magnetische rek meer bevorderlijk voor het gelijkmatig drogen van de magnetische kralen.
  9. Nadat u de reactiebuis uit het magnetische rek hebt verwijderd, voegt u 26 μL ddH2O toe om de magnetische kralen te bedekken en pipettert u op en neer om een grondige menging te garanderen. Incubeer vervolgens gedurende 2 minuten bij 25 °C.
    OPMERKING: Verleng de incubatietijd op de juiste manier als de magnetische kralen te droog zijn.
  10. Centrifugeer de reactiebuis kort met een handcentrifuge (ongeveer 2600 × g) en scheid de magnetische kralen met behulp van een magnetisch rek totdat de oplossing helder wordt (ongeveer 5 min).
  11. Breng het 24 μL supernatans voorzichtig over in het nieuwe PCR-buisje.

6. Bibliotheekconstructie voor sequencing van de volgende generatie (NGS)

  1. Bereid het PCR-reactiemengsel in een gesteriliseerde buis met behulp van gezuiverde DNA-fragmenten en primers met sequentieadapters (zie tabel 3).
  2. Voer de PCR-reactie uit volgens de aanbevolen procedures (zie tabel 4), die doorgaans ongeveer 1 uur duren.
    OPMERKING: Het experiment kan na deze procedure tijdelijk worden stopgezet en de PCR-producten kunnen worden bewaard bij -20 °C of ten minste 2 weken.
  3. Voeg 27,5 μL pre-vortexed amplicon-zuiveringsparels toe aan 50 μL PCR-producten en meng de magnetische parels vervolgens grondig in de oplossing door 10 keer op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: De onjuiste verhouding van magnetische kralen tot PCR-producten kan leiden tot discrepanties in de lengtes van gesorteerde fragmenten. Gebruik ddH2O om het verdampte volume van het PCR-product bij te vullen tot 50 μL. Zorg ervoor dat u het juiste volume magnetische kralen opzuigt en doseer ze langzaam uit de pipetpunten om de parels die kunnen worden bevestigd te minimaliseren.
  4. Incubeer de reactiebuis gedurende 5 minuten bij 25 °C en centrifugeer deze vervolgens gedurende 5 s met een handcentrifuge (ongeveer 2600 x g).
  5. Zuiver het bibliotheek-DNA door de reactiebuis op een magnetisch rek te plaatsen totdat de oplossing helder wordt (ongeveer 5 minuten). Breng vervolgens het bovenstaande voorzichtig over in een nieuw gesteriliseerd PCR-buisje en gooi de magnetische kralen weg.
  6. Voeg 50 μl pre-vortexed amplicons zuiveringsparels toe aan het supernatant en meng de magnetische korrels vervolgens grondig door de oplossing door 10 keer op en neer te pipetteren.
  7. Incubeer de reactiebuis gedurende 5 minuten bij 25 °C en centrifugeer deze vervolgens gedurende 5 s met een handcentrifuge (ongeveer 2600 x g).
  8. Plaats de reactiebuis op een magnetisch rek totdat de oplossing helder wordt (ongeveer 5 min) en verwijder vervolgens voorzichtig het bovenstaande zonder de magnetische kralen te verstoren.
  9. Was de magnetische kraal twee keer met 200 μL vers bereide 80% ethanol per keer, waarbij u de reactiebuis 30 seconden op het magnetische rek houdt. Vermijd het verstoren van de kralen bij het toevoegen van ethanol.
  10. Droog de magnetische kralen 5 minuten terwijl u het deksel opent.
  11. Nadat u de reactiebuis uit het magnetische rek hebt verwijderd, voegt u 22 μL ddH2O toe om de magnetische kralen te bedekken en pipettert u 10 keer op en neer om een grondige menging te garanderen. Incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 25 °C.
  12. Centrifugeer de reactiebuis kort met een handcentrifuge (ongeveer 2600 × g) en scheid de magnetische kralen met behulp van een magnetisch rek totdat de oplossing helder wordt (ongeveer 5 min).
  13. Breng het 20 μL supernatans voorzichtig over in een nieuw gesteriliseerd PCR-buisje en bewaar het bij -20 °C.
    OPMERKING: Om een bibliotheek te krijgen met een meer geconcentreerde lengteverdeling, kunt u overwegen een gelherstelkit te gebruiken om het versterkte product te sorteren. Als er geen specifieke vereisten zijn voor het lengteverdelingsbereik, kan het versterkte product ook direct worden gezuiverd met behulp van een magnetische parel- of kolomzuiveringsset zonder lengtesortering.

7. Kwaliteitscontrole en volgorde van bibliotheken

  1. Gebruik DNA-fragmentanalysatorplatforms om de lengteverdeling van bibliotheek-DNA te beoordelen.
  2. Gebruik NGS-platforms om sequencing met hoge doorvoer uit te voeren op de bibliotheken die de kwaliteitsinspectie hebben doorstaan.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het geschetste protocol werd gebruikt om neutrofielen uit het beenmerg van C57BL/6-muizen te isoleren en hun respectievelijke variantie in chromatine-toegankelijkheid voor en na lipopolysaccharide (LPS) stimulatie via ATAC-seq te vergelijken. Doorgaans kunnen 2 x 107 BMC's worden geoogst uit beide dijbenen van een 6-8 weken oude C57BL/6-muis, en vervolgens kunnen 2-5 x 106 neutrofielen worden geïsoleerd. Onder hen worden 1 x 105 cellen gebruikt voor ATAC-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit manuscript rapporteert een experimenteel protocol voor het bereiden van ATAC-seq-bibliotheken die zijn geoptimaliseerd voor neutrofielen die zijn afgeleid van beenmergmonsters van knaagdieren. Omdat neutrofielen zeer gevoelig zijn en gemakkelijk kunnen worden geactiveerd, gaven optimalisatie-inspanningen prioriteit aan het behoud van de levensvatbaarheid van geïsoleerde neutrofielen. Onjuiste behandeling kan leiden tot NETosis en andere vormen van celdood, waardoor aanzienlijke hoeve...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het R&D-programma van de Beijing Municipal Education Commission (KZ202010025041) en de Chinese Institutes for Medical Research, Beijing (Grant No. CX24PY29).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.4% Trypan BlueWetenschappelijkT10282
1x fosfaat-gebufferde zoutoplossingBiosharpBL302A
20 bp–5000 bp UitlijningsmarkeringBiopticC109102-100ADNA-fragmentanalyzer ondersteunende producten
5k Groottemarkering(Standaard 50 bp Ladder)BiopticC109101-100ADNA-fragmentanalyzer ondersteunende producten
Amplicons ZuiveringskralenBeckmanA63881Amplicons Zuiveringskralen is een nucleïnezuurzuiveringskit voor het verkrijgen van DNA-producten van hoge kwaliteit.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, muismiltenyi130-120-337De Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, muis zijn ontwikkeld voor positieve selectie of depletie van muisneutrofielen uit enkellaagse suspensies van muisbeenmerg.
Anti-muis CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
Anti-muis CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
Anti-muis Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J muizen, wild type, 8 weken oud, mannelijkThe Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical SciencesThe Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences
DNA Separatie BufferBiopticC104406DNA-fragmentanalyzer ondersteunende producten
E. coli afgeleide ultrapure LPS (serotype0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
DNA Kwantitatieve ReagensvazymeEQ111DNA Kwantitatieve Reagens is een eenvoudig, gevoelig en nauwkeurig dubbelstrengs DNA (dsDNA) fluorescentie kwantitatief analysekit.
Erytrocyt lysebuffer (10x)BioLegendCat#420301
Foetaal bovien serumGibcoCat#10099141C
MS Separatiekolommenmiltenyi130-042-201MS Kolommen zijn ontworpen voor positieve selectie van cellen. 
RPMI 1640 mediumGibcoC11875500BT
S2 Gel elektroforese naald BiopticC105101DNA-fragmentanalyzer ondersteunende producten
Chirurgische instrumenten: scalpel, dissectiescharen, microdissectiescharen, fijne pincetten, stompe anatomische pincetten, naaldhouderFisher Scientifichttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-toolsKan worden gekocht bij andere gekwalificeerde leveranciers
Spuit (1 mL)Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464Kan worden gekocht bij andere gekwalificeerde leveranciers
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 voor IlluminavazymeTD501-01TruePrep DNA Library Prep Kit V2 voor Illumina is een speciaal ontwikkelde kit speciaal ontwikkeld voor Illumina's high-throughput sequencingplatform. Met behulp van de kit kan DNA worden voorbereid in sequencingbibliotheken die zijn toegewijd aan Illumina's high-throughput sequencingplatform.
TruePrepTM Index Kit V2 voor IlluminavazymeTD202TruePrep Index Kit V2 voor Illumina is een kit voor de TruePrep DNA Library Prep Kit V2 voor Illumina. Het kan worden gebruikt om 96 verschillende dubbelzijdige Indexbibliotheken voor te bereiden.

Referenties

  1. Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171(2018).
  2. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  3. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  4. Herrera-Uribe, J., et al. Integrative profiling of gene expression and chromatin accessibility elucidates specific transcriptional networks in porcine neutrophils. Front Genet. 14, 1107462(2023).
  5. Kipnis, E. Neutrophils in sepsis: Battle of the bands. Crit Care Med. 41 (3), 925-926 (2013).
  6. Kong, Y., et al. Sepsis-induced thymic atrophy is associated with defects in early lymphopoiesis. Stem Cells. 34 (12), 2902-2915 (2016).
  7. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound. Adv Immunol. 73, 369-509 (1999).
  8. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  9. Newburger, P. E. Autoimmune and other acquired neutropenias. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 38-42 (2016).
  10. Skokowa, J., Dale, D. C., Touw, I. P., Zeidler, C., Welte, K. Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Primers. 3, 17032(2017).
  11. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  12. Wang, B., et al. Sepsis induces non-classic innate immune memory in neutrophils. Cell Rep. 42 (9), 113044(2023).
  13. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 43-50 (2016).
  14. Shaul, M. E., Fridlender, Z. G. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 16 (10), 601-620 (2019).
  15. Hong, C. W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw. 17 (5), 298-306 (2017).
  16. Carvalho, L. O., Aquino, E. N., Neves, A. C., Fontes, W. The neutrophil nucleus and its role in neutrophilic function. J Cell Biochem. 116 (9), 1831-1836 (2015).
  17. Tamassia, N., et al. Cutting edge: An inactive chromatin configuration at the il-10 locus in human neutrophils. J Immunol. 190 (5), 1921-1925 (2013).
  18. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  19. Chang, C. C., Sun, J. T., Chu, F. Y. Bacterial sepsis, neutrophils and intracellular organisms. QJM. 110 (6), 393-394 (2017).
  20. Walling, B. L., Murphy, P. M. Protean regulation of leukocyte function by nuclear lamins. Trends Immunol. 42 (4), 323-335 (2021).
  21. Sollberger, G., Tilley, D. O., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: The biology of chromatin externalization. Dev Cell. 44 (5), 542-553 (2018).
  22. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).
  23. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  24. Khoyratty, T. E., et al. Distinct transcription factor networks control neutrophil-driven inflammation. Nat Immunol. 22 (9), 1093-1106 (2021).
  25. Fischer, J., et al. Safeguard function of pu.1 shapes the inflammatory epigenome of neutrophils. Nat Immunol. 20 (5), 546-558 (2019).
  26. Ram-Mohan, N., et al. Profiling chromatin accessibility responses in human neutrophils with sensitive pathogen detection. Life Sci Alliance. 4 (8), e202000976(2021).
  27. Wei, L., et al. Integrative analysis of single-cell rna-seq and atac-seq data across treatment time points in pediatric AML. Blood. 136 (1), 29(2020).
  28. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  29. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H20 reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  30. Orchard, P., Kyono, Y., Hensley, J., Kitzman, J. O., Parker, S. C. J. Quantification, dynamic visualization, and validation of bias in ATAC-seq data with ataqv. Cell Syst. 10 (3), 298-306.e4 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Chromatine-toegankelijkheidBeenmergneutrofielenImmunomagnetische scheidingNeutrofielenisolatieTn5-transposaseEpigenomische regulatieNucleosoompositioneringPCR-zuiveringChromatine-herprogrammering
ATAC-SEQ Bibliotheekbereiding van van muizen beenmerg-afgeleide neutrofielen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.