Optimalisatie van in vitro transcriptiereactie voor mRNA-productie met behulp van chromatografische at-line monitoring

Samenvatting

Het optimaliseren van in-vitrotranscriptie (IVT) is van cruciaal belang voor kosteneffectieve mRNA-productie. Dit protocol beschrijft een analytische chromatografische methode voor at-line analyse van IVT-reacties, het monitoren van NTP-depletie en mRNA-productie in batch- of fed-batch-modi, van toepassing op verschillende RNA-modaliteiten, waardoor de productiviteit wordt verbeterd en de kosten worden verlaagd.

Samenvatting

In vitro transcriptiereactie (IVT) is een complexe, uit meerdere componenten bestaande enzymatische synthese van mRNA uit een lineair DNA-sjabloon, gekatalyseerd door een RNA-polymerase, bijvoorbeeld T7. Vanwege de hoge kosten van IVT-reagentia is IVT een cruciale stap in het productieproces van mRNA-geneesmiddelen en is het de focus geweest van intensieve optimalisatie in het veld. Om de kosten van mRNA-productie te verlagen, moeten reagentia optimaal worden gebruikt. Effectieve optimalisatie vereist een uitgebreid begrip van de impact van individuele reagentia op de reactiekinetiek, d.w.z. de consumptie van nucleosidetrifosfaten (NTP's) en de productie van mRNA. Traditioneel worden analytische technieken met een lage doorvoer en eindpunten gebruikt voor de analyse van mRNA. Hoewel dergelijke methoden waardevolle informatie geven over de mRNA-inhoud, zijn online en bijna realtime analyses nodig om de IVT-reactie volledig te begrijpen. We laten zien hoe een vloeistofchromatografie-analysemethode die NTP's, evenals pDNA en mRNA scheidt, in bijna realtime kan worden gebruikt om de kinetiek van IVT-reacties te bestuderen. Met de kennis van de invloed van verschillende IVT-componenten op kinetiek en opbrengst, kan snelle chromatografische analyse worden gebruikt om batch IVT-reactie om te zetten in een fed-batch-modus die de productiviteit verder verhoogt en de totale kosten van de reactie verlaagt.

Inleiding

De COVID-19-pandemie heeft een ongekende revolutie in de biogeneeskunde teweeggebracht, die heeft geleid tot de snelle ontwikkeling en autorisatie van op mRNA gebaseerde vaccins, zoals BioNTech/Pfizer's Comirnaty en Moderna's Spikevax, zowel in Europa als in de VS ^1,2,3. De indrukwekkende werkzaamheid en snelle ontwikkeling van deze vaccins hebben het immense therapeutische potentieel van mRNA-technologie benadrukt, niet alleen voor infectieziekten, maar ook voor immunotherapieën bij kanker, eiwitvervangende therapieën, regeneratieve geneeskunde en cellulaire herprogrammering ^4,5. Dit tijdperk, vaak de mRNA-revolutie genoemd, onderstreept de noodzaak van efficiënte en kosteneffectieve mRNA-productieprocessen.

De productie van mRNA omvat bewerkingen met meerdere eenheden, waarbij de in vitro transcriptie (IVT)-reactie een kritieke en meest kostenintensieve eenheidsoperatie is ^6,7,8. De IVT-reactie synthetiseert mRNA uit een DNA-sjabloon met behulp van RNA-polymerase, meestal T7 RNA-polymerase, en nucleosidetrifosfaten (NTP's) in aanwezigheid van magnesiumionen. Het proces is relatief eenvoudig en maakt de productie van grote hoeveelheden mRNA in een kort tijdsbestek mogelijk, waarbij binnen enkele uren reactieopbrengsten van 2-5 g/L worden bereikt en in sommige rapporten tot 14 g/L ^9,10,11. Optimalisatie van de opbrengst van IVT-reacties is echter cruciaal voor het verlagen van de productiekosten en het waarborgen van de schaalbaarheid van mRNA-vaccins en -therapieën¹² en, vanwege sequentieverschillen die de NTP-consumptie beïnvloeden, kan nodig zijn voor elk construct of constructfamilie.

De reactie wordt meestal uitgevoerd als een batchproces, maar recente ontwikkelingen in de verwerking van fed-batches en at-line analyses hebben nieuwe wegen geopend voor het optimaliseren van de mRNA-productie ^7,13. Fed-batchreacties, waarbij een bolus of continue toevoeging van reagentia wordt gebruikt, kunnen de reactietijden verlengen en de opbrengst verhogen door remming van het substraat en cofactorafhankelijke productdegradatie te voorkomen^14,15.

De ontwikkeling van snelle at-line analyse is een belangrijke vooruitgang op het gebied van IVT, waardoor de monitoring van belangrijke reactiecomponenten zoals NTP's en mRNA mogelijk is met minimale analytische vertraging^13,16, wat een extra dimensie toevoegt aan IVT-monitoring, die doorgaans alleen gericht is op mRNA-concentratie¹⁷. Traditioneel worden mRNA's geanalyseerd met behulp van technieken zoals polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), agarosegelelektroforese of capillaire elektroforese. Dit zijn eindpuntmethoden en kunnen daarom niet worden gebruikt voor real-time IVT-monitoring. Een alternatief voor analyses die in dit protocol worden beschreven, zijn methoden die gebruik maken van oplichtende RNA-aptameer en fluorescentiekleurstofparen. Bij deze methode wordt RNA-aptameer gelabeld aan RNA en geïncubeerd met een oplichtende fluorescentiekleurstof. Transcriptieactiviteit kan vervolgens worden gevisualiseerd door fluorescentie-intensiteit¹⁷. Dit maakt real-time analyse mogelijk van de kwantiteit en kwaliteit van getranscribeerd mRNA tijdens IVT 21, maar maakt gelijktijdige monitoring van andere IVT-componenten, bijv. NTP's, niet mogelijk. Een ander alternatief dat mogelijk real-time kwantificering van NTP en mRNA mogelijk maakt, is Raman-spectroscopie¹⁸, maar tot op heden heeft geen enkel rapport het nut ervan voor IVT-monitoring aangetoond, wat suggereert dat verdere optimalisatie van de methode nog steeds nodig is om de nodige selectiviteit en gevoeligheid af te leiden.

De voortdurende ontwikkeling van snellere en selectievere analyses ondersteunt de optimalisatie van IVT voor een hoger rendement in batch- en fed-batch-modi. De reactie blijft een complex proces met meerdere parameters met meerdere op elkaar inwerkende factoren, waarvoor optima kunnen verschillen tussen constructtypen (bijv. mRNA versus saRNA). De concentratie en verhouding van Mg²⁺-ionen en NTP's zijn bijzonder invloedrijk, en hun optimale niveaus moeten zorgvuldig worden uitgebalanceerd om de mRNA-opbrengst te maximaliseren en tegelijkertijd de vorming van dubbelstrengs RNA (dsRNA), een krachtig stimulerend middel van het aangeboren immuunsysteem, tot een minimum te beperken^19,20. Onlangs werd het voeden van UTP op steady-state niveaus gerapporteerd als een benadering om dsRNA-vorming te verminderen²¹. Het monitoren van UTP-niveaus in bijna realtime zou een extra niveau van procesbeheersing toevoegen.

In dit protocol laten we zien hoe at-line monitoring van de IVT-reactie de opbrengst van mRNA-productie in batch- en fed-batch-modus kan verhogen.

Protocol

1. Voorbereiding van de buffer

OPMERKING: Alle buffers moeten RNase-vrij worden voorbereid, wat betekent dat alle chemicaliën en glaswerk alleen mogen worden gebruikt voor RNase-vrij werk en met voorzorg mogen worden gehanteerd. Water dat wordt gebruikt voor de voorbereiding van de buffer en het reinigen van glaswerk moet gecertificeerd zijn als nucleasevrij. Alvorens een experiment uit te voeren, moeten alle werkoppervlakken en glaswerk worden besproeid met een decontaminatiereagens dat RNases elimineert. Het decontaminatiereagens moet grondig worden weggespoeld met RNase-vrij water voordat glaswerk/werkruimte wordt gebruikt. Gebruik indien mogelijk steriele verbruiksartikelen en verbruiksartikelen voor eenmalig gebruik.

1. Bereiding van IVT-buffers: bereid 10x IVT-buffer voor door 400 mM Tris, 10 mM DTT, 20 mM spermidine, pH 7,9 toe te voegen. Bereid een afschrikbuffer voor met 100 mM EDTA, pH 8. Filter elke buffer door een PES-filter van 0,22 μm.
2. Bereiding van mobiele fasen: bereid mobiele fase A (MPA) voor door toevoeging van 50 mM HEPES, pH 7,0, mobiele fase B (MPB) door toevoeging van 50 mM HEPES, 100 mM Na₄P₂O₇, pH 8,3, mobiele fase C (MPC) door toevoeging van 0,1 M NaOH, 1 M NaCl, mobiele fase D (MPD) door toevoeging van 0,5 M HEPES, pH 7,0. Filter elke buffer door een PES-filter van 0,22 μm.

2. Bereiding van in vitro transcriptiereactie (IVT)

OPMERKING 1: IVT-reactie kan een batchreactie zijn, waarbij alle reagentia aan het begin worden toegevoegd en de reactie wordt gestopt nadat de NTP's zijn uitgeput/de mRNA-productie een plateau bereikt, of kan een fed-batchreactie zijn, waarbij uitgeputte NTP's worden aangevuld met extra NTP's en daarmee de mRNA-productie extra toeneemt. Een lineaire pDNA-sjabloon die wordt gebruikt bij IVT-reacties kan worden verkregen door gebruik te maken van restrictie-enzym dat direct na de poly(A)-sequentie in plasmide-DNA splitst of door PCR-reactie. In beide gevallen moet de reactie worden gevolgd door zuivering, hetzij chromatografisch, hetzij met behulp van in de handel verkrijgbare DNA-zuiveringskits.

1. Batch IVT-reactie
   1. Stel het thermoblok in op 37 °C en 300 tpm. Ontdooi alle in tabel 1 vermelde reagentia, met uitzondering van de enzymen, en verwarm ze in het thermoblok voor bij 37 °C. Bereid een mengsel van 25 mM NTP met behulp van 100 mM stockoplossing van ATP, CTP, UTP en GTP.
   2. Terwijl de reagentia ontdooien, bereidt u monsteraliquots voor op experimenten met het tijdsverloop. Neem 0,5 ml steriele buisjes en pipetteer 2 μl 100 mM EDTA in elk buisje. Markeer elke buis met een aangewezen IVT-nummer (bijv. IVT001, IVT002, enz.) en tijdstip (bijv. 0 min, 15 min, 30 min, 60 min, enz.).
   3. Wanneer de reagentia zijn ontdooid en ongeveer 15 minuten bij 37 °C zijn bewaard, verwijder dan enzymen (T7 RNA-polymerase, pyrofosfatase, RNASE-remmer) uit de vriezer van -20 °C en bewaar deze in een koeler totdat deze weer in de vriezer wordt bewaard.
   4. Gebruik voor het mengen van afzonderlijke IVT-reagentia (behalve enzymen) een vortex. Meng enzymen door voorzichtig op en neer te pipetteren.
   5. Meng IVT-reagentia in verhoudingen die zijn vastgelegd in het experimentele ontwerp (bijv. het generieke INT-protocol wordt weergegeven in tabel 1) in een tube van 1,5 ml. Bij het uitvoeren van IVT-optimalisatie kan het uiteindelijke IVT-volume variëren tussen 50-100 μL. Houd bij het ontwerpen van het totale IVT-volume rekening met het aantal monsters van 2 μl dat tijdens het tijdsverloopexperiment uit de reactie moet worden genomen. Zorg ervoor dat het totale volume van de monsters niet groter is dan 50% van het totale IVT-volume (bijv. als de bemonstering van 2 μL elke 15 minuten gedurende 3 uur is, is het totale volume van de genomen aliquots 30 μL, wat betekent dat het totale volume IVT minimaal 60 μL moet zijn).
   6. Meng IVT's voorzichtig, voeg T7 RNA-polymerase toe als het laatste reagens. Wanneer alle reagentia zijn toegevoegd, meng IVT dan grondig door op en neer te pipetteren, gebruik geen vortex.
   7. Onmiddellijk nadat alle IVT-reagentia zijn toegevoegd en gehomogeniseerd, verwijdert u 2 μL IVT-mengsel uit de buis en pipett u deze in eerder voorbereide buisjes van 0,5 ml met 2 μl 100 mM EDTA zoals beschreven in stap 2.1.2 (tijdstip 0 min).
   8. Plaats reactiebuisjes met IVT-reactiemengsels in een thermoblok en incubeer ze bij 37 °C.
   9. Stel de timer in op de gewenste tijdsintervallen (bijv. 15 min/30 min). Neem op elk tijdstip 2 μl van een IVT-monster uit elk bereid IVT-reactiemengsel en pipetteer dit in een eerder voorbereide buis (zie stap 2.1.2) die 2 μl 100 mM EDTA bevat. Deze aliquotes zullen worden gebruikt voor chromatografische analyse (zie stap 3).
   10. Nadat chromatografische analyse de volledige uitputting van NTP's heeft bevestigd, dooft u bulk IVT-reacties met EDTA af tot een eindconcentratie van 50 mM (bijv. 30 μL IVT inactiveert met 30 μL 100 mM EDTA).
2. Fed-batch IVT-reactie
   OPMERKING: de mRNA-productie kan extra worden verhoogd door NTP's en Mg²⁺ -ionen toe te voegen nadat de NTP's zijn uitgeput.
   1. Meng batch IVT-reactie en bemonster het zoals beschreven in stap 2.1. Bereid NTP+MgCl_2-voer voor op de gevoede batch. Voor de bereiding bijv. 500 μl NTP+MgCl_2-mengsel mengt u 106 μl van elk 200 mM NTP, 76,25 μl 1 M MgCl₂ en 5,5 μl ddH₂O. De uiteindelijke concentraties in het mengsel zijn 42,4 mM NTP en 152,5 mM MgCl₂.
   2. Bewaak het NTP-verbruik met at-line analyses die worden beschreven in stap 3. Wanneer at-line analyse bevestigt dat de NTP-concentratie onder de 10% van de startconcentratie daalt, voegt u het voer met NTP+Mg²⁺ toe aan bulk-IVT.
   3. Meet/bereken het precieze volume van de bulk IVT-reactie die overblijft in een buis van 1,5 ml nadat alle aliquots zijn genomen voor analyse. Voeg een geschikte hoeveelheid NTP+MgCl2-mengsel toe aan een IVT, zodat de uiteindelijke concentratie 4 mM van elke NTP en 12 mM MgCl₂ is. Bijvoorbeeld, voor 80 μL bulk IVT die nog in een tube van 1,5 ml zit, voegt u 16,8 μL NTP+MgCl_2-mengsel toe.
   4. Ga verder met de bemonstering zoals beschreven in stap 2.1. Nadat de NTP's weer zijn uitgeput, herhaalt u paragraaf 2.2.2. Ga door met voeren en bemonsteren totdat de gewenste mRNA-productie is bereikt.
   5. Nadat de gewenste mRNA-productie is bereikt, inactiveert u de hele reactie zoals in stap 2.1.10.

3. Voorbereiding van chromatografische analyse

1. Voorbereiding van standaard- en systeemgeschiktheidstests (SST)
   1. Bereid de SST voor door afdekreagens, NTP's, pDNA-sjabloon en mRNA te combineren. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentraties ongeveer 3 μM zijn voor het afdekreagens, 5 μM voor elke NTP, 4 ng/μl voor de pDNA-sjabloon en 10 ng/μl voor het mRNA. Zorg ervoor dat de uiteindelijke SST 0,1 M NaCl bevat.
   2. Bereid voor elke analyse een nieuwe kalibratiecurve voor. Creëer de kalibratiestandaard door een gezuiverd mRNA-monster met een bekende concentratie te verdunnen met MPA. De kalibratiepunten moeten 0,5 ng/μl, 2 ng/μl, 5 ng/μl, 10 ng/μl, 15 ng/μl en 20 ng/μl zijn, elk met een eindconcentratie van 0,1 M NaCl.
   3. Bereid indien nodig een kalibratiecurve voor alle NTP's voor. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentraties van elke NTP in de kalibratiestandaarden 0,5 μM, 2 μM, 5 μM, 10 μM, 15 μM en 20 μM zijn.
2. Kolomconditionering en voorbereiding voor analyse
   1. Breng de analytische kolom van 0,1 ml gedurende 12 uur voorafgaand aan de analyse in evenwicht bij kamertemperatuur. Bevestig de kolom aan het chromatografische systeem in de richting die op de kolombehuizing is aangegeven.
   2. Spoel de kolom met een debiet van 1 ml/min: eerst met 50 kolomvolumes (CV) ddH₂O en vervolgens met 50 CV MPA.
   3. Voer ten minste 3 blanco monsters uit (alleen MPA injecteren) vóór de analyse om de basislijn vast te stellen. Gebruik de chromatografische methode beschreven in Skok et ^al.15.
   4. Zodra de basislijn stabiel is en twee opeenvolgende blanco metingen vergelijkbaar zijn (reproduceerbare basislijn), gaat u verder met het uitvoeren van de SST-steekproef en de kalibratiecurvesteekproeven.
   5. Als aan de SST-criteria is voldaan en de scheiding van het afdekreagens en de NTP's bevredigend is, ga dan verder met de analyse van de IVT-monsters. Injecteer na analyse van alle IVT-monsters opnieuw een SST-standaard om te bevestigen dat de systeemomstandigheden tijdens de analyse stabiel bleven.
3. Voorbereiding van het monster
   OPMERKING: Monsters voor chromatografische analyse worden onmiddellijk voor de analyse voorbereid. Anders worden de monsters in een vriezer bewaard bij -20 °C (maximaal 24 uur) of <-65 °C (meer dan 24 uur).
   1. Vóór verdunning voor chromatografische analyse, vortex en spin naar beneden het gedoofde IVT-monster. Analyseer alle EDTA-geïnactiveerde IVT-monsters (zie stap 2.1.9) met chromatografische analyse met behulp van de methode beschreven in Skok et ^al.15.
   2. Verdun vóór de analyse de IVT-monsters om een concentratie binnen de kalibratiecurve te bereiken. Gebruik gedurende het hele tijdsverloopexperiment dezelfde verdunningsfactor om ervoor te zorgen dat NTP-gebieden kunnen worden vergeleken om te bepalen wanneer een NTP is uitgeput.
   3. Gebruik de volgende formule om de minimale verdunning te bepalen die nodig is voor IVT-monsters: Benodigde verdunning = (verwachte eindmRNA-concentratie) / (verdunning tijdens inactivering) / (hoogste kalibratiestandaard)
      Als bijvoorbeeld een mRNA-productie van 8 mg/ml wordt verwacht bij IVT, zal de concentratie in het gedoofde monster 4 mg/ml zijn. Om de concentratie binnen de kalibratiecurve te bereiken, verdunt u het monster verder met een factor 200.
      Benodigde verdunning = (8000 ng/μL]) / 2 / (20 ng/μL) = 200
   4. Pipetteer de MPA en 4 M NaCl in een conische glazen injectieflacon. Zorg ervoor dat de uiteindelijke concentratie van NaCl in het monster 100 mM is. Voeg ten slotte het afgeschrikte IVT-monster toe.
   5. Vortex bereidde het monster voor en plaatste het in de autosampler voor analyse. Stel de temperatuur van de autosampler in op 4 °C.
   6. Injecteer 100 μL verdunde monsters op de analytische kolom. Meet de extinctie A260 en A280 voor elk IVT-monster.
   7. Voor het analyseren van monsters met bekende concentraties, of als het volgen van NTP-consumptie op basis van gebiedsverschillen niet nodig is, verdunt u de monsters om een doelconcentratie van 10 ng/μL te bereiken.

4. Kwantificering van monsters en gegevensanalyse

1. Vóór de integratie van elk IVT-monster moet het blanco monster van het monsterchromatogram worden afgetrokken.
2. Integreer alle NTP-, pDNA- en mRNA-pieken bij A260 en gebruik de piekgebieden om de concentraties NTP's en mRNA in de IVT te berekenen.
   OPMERKING: Als alternatief kunnen de piekgebieden worden gebruikt om het percentage van elke NTP dat overblijft in de IVT-reactie te vergelijken, op voorwaarde dat de verdunningsfactor consistent was op alle tijdstippen.
3. Beslis op basis van mRNA/NTP-concentraties, bepaald door at-line chromatografische analyse, of IVT kan worden geïnactiveerd of dat extra NTP's in de IVT-reactie moeten worden ingevoerd (zie stap 2).

Resultaten

De chromatografische analyse die in dit protocol wordt beschreven, kan worden gebruikt voor IVT-optimalisatie of voor het omzetten van een batch-IVT-reactie in een fed-batch-reactie (Figuur 1).

Om het effect van verschillende buffersamenstellingen op de kinetiek van de IVT-reactie te testen, werden drie verschillende IVT-reacties gemengd volgens het protocol in tabel 2. Buffer met Tris, waarbij de pH werd aangepast met HCl, werd vergeleken met Tris-buffer, waarbij de pH werd aangepast met azijnzuur. Verder werden beide Tris-buffers vergeleken met de HEPES-buffer, waarbij de pH werd aangepast met NaOH. De samenstelling van alle 1x IVT-buffer was 40 mM Tris/HEPES, 10 mM DTT, 2 mM spermidine en pH 7,9.

Van 100 μl IVT-reactiemengsel werd 2 μl IVT-monster uit de IVT-reactie gehaald en geblust met 2 μl 100 mM EDTA elke 15 minuten in het eerste uur van de incubatie en vervolgens elke 30 minuten tot 180 minuten incubatie. De verwachte uiteindelijke mRNA-opbrengst voor deze reactietoestand was 15 mg/ml, wat betekent dat 2-voudige verdunning als gevolg van afschrikken werd gevolgd door 400-voudige verdunning in MPA+NaCl voor analyse. Het monster werd in totaal 800 keer verdund, wat betekent dat zelfs bij een productie van 15 mg/ml de mRNA-concentratie die op de analytische chromatografische kolom was geladen, nog steeds binnen de concentraties van de kalibratiecurve lag.

NTP- en mRNA-gebieden op A260 werden geïntegreerd voor elk afzonderlijk monster op elk individueel tijdstip (t_x). Gebieden werden vervolgens omgezet in concentraties voor mRNA, met behulp van de mRNA-kalibratiecurve en het consumptiepercentage voor NTP's, waarbij het A260-gebied van NTP's op 0 min (t0) als 100% werd gebruikt (zie onderstaande vergelijking).

De resultaten kunnen worden weergegeven in de vorm van grafieken voor elke individuele IVT-reactie, waarbij de tijd wordt weergegeven op de x-as en de mRNA-concentratie en de resterende NTP's op de y-as (Figuur 2A). Alle IVT, d.w.z. mRNA-concentraties afhankelijk van de tijd, kunnen ook samen in één grafiek worden uitgezet, en de kinetiek van de mRNA-productie kan worden bestudeerd en optimale IVT-omstandigheden kunnen worden geselecteerd (Figuur 2B).

Voor het fed-batch-experiment werd IVT gemengd zoals beschreven in Tabel 3. Van 300 μl IVT-reactiemengsel werd 2 μl IVT-monster uit de IVT-reactie verwijderd en elke 30 minuten geblust met 2 μl 100 mM EDTA. Bovendien werd het monster onmiddellijk na elke bulk NTP+MgCl_2-toevoeging genomen. Vooraf werd een toevoeroplossing bereid die 42,4 mM van elke NTP en 152,5 mM MgCl₂ bevatte, en 106 μL van elke individuele 200 mM NTP werd gemengd met 76,2 μL van 1 M MgCl₂. Er werd een voedingsregime opgesteld, waarbij elk uur bolusvoer werd toegevoegd (na 60 minuten, 120 minuten, 180 minuten en 240 minuten incubatie). Het voedingsregime wordt beschreven in Tabel 3 Monsters werden in bijna realtime geanalyseerd met analyses zoals beschreven voor bulk-IVT-reactie. Na 300 minuten monitoring was de IVT-reactie gedoofd.

De resultaten kunnen worden weergegeven als de resterende NTP's/mRNA-productie gedurende de incubatietijd. Aangezien bolustoevoegingen ook de IVT-reactie verdunnen, daalt de mRNA-concentratie in IVT bij elke toevoeging van voer (Figuur 3A). Toename van de mRNA-massa kan ook worden gemeten en gepresenteerd door transcriptiefactoren (gedefinieerd als m_mRNA/m_pDNA), die een lineaire toename van de mRNA-productie in de loop van de tijd laten zien (Figuur 3B).

Figuur 1: Schematisch overzicht (A) Weergave van de workflow voor IVT-optimalisatie met at-line chromatografische analysekwantificering van NTP's en mRNA. (B) Representatieve chromatogrammen van een batch IVT-reactie bemonsterd op (i) t0, (ii) middelpunt, (iii) uiteindelijke reactietijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Batch IVT-grafieken. (A) Representatieve grafiek van IVT-reactie met mRNA-productie en NTP-consumptie op de y-as. mRNA-concentratieplateau zichtbaar bij 120 - 180 minuten incubatie, wat correleert met NTP-consumptie, aangezien beperkende NTP (ATP) wordt verbruikt na 120 minuten. (B) IVT-grafiek die de invloed van IVT-buffer op de IVT-kinetiek laat zien. IVT met Buffer A (Tris+azijnzuur) vertoonde de snelste mRNA-productie, gevolgd door Buffer B (Tris+HCl) en Buffer C (HEPES+NaOH) als de langzaamste. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Fed-batch IVT-grafiek. (A) IVT-grafiek waarbij NTP+MgCl_2-feeds werden toegevoegd met 60-, 120-, 180- en 240-min. mRNA-concentratie in de IVT-reactie daalt bij elke toevoeging van feed als gevolg van verdunning met NTP+MgCl_2-feed . (B) De toename van de mRNA-massa, aangetoond door de transcriptiefactor, is lineair tijdens de reactie-incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Generiek IVT-protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Batch IVT-protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Fed-batch IVT-protocol. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Bij deze methode worden IVT-monsters op verschillende tijdstippen tijdens de incubatie geanalyseerd met behulp van een analytische chromatografische multimodale kolom die NTP's, pDNA en mRNA scheidt, waardoor het NTP-verbruik en de mRNA-productie nauwlettend kunnen worden gevolgd. Deze methode meet NTP's en mRNA-concentratie op een kwantitatieve manier op basis van veranderingen in A260-gebieden op aangewezen tijdstippen. Aangezien de methode informatie geeft over NTP- en mRNA-concentratie, is deze zeer geschikt voor IVT-optimalisatie, waarbij het primaire doel vaak is om de mRNA-opbrengst te maximaliseren en de reactietijd te minimaliseren; daarom is het van cruciaal belang om het effect van verschillende IVT-reagentia op de kinetiek van de mRNA-productie te begrijpen²². We laten zien hoe at-line monitoring kan worden toegepast om de IVT-reactie in batch- en fed-batch-modi te optimaliseren.

Het belangrijkste voordeel van deze methode is een at-line analyse die het mogelijk maakt om IVT bijna in realtime te monitoren, aangezien elk monster in minder dan 8 minuten wordt geanalyseerd. De voorbereiding van monsters voor analyse is eenvoudig, aangezien alleen verdunning in MPA nodig is zonder voorafgaande voorbehandeling van het monster. Het monstervolume dat nodig is voor de analyse is zeer laag, bijvoorbeeld 1 μL IVT. Dit kleine pipetteervolume kan mogelijk leiden tot analytische afwijkingen als gevolg van pipetteerfouten. Omdat de hoge doorvoer van de analytische benadering echter drievoudige metingen mogelijk maakt, zijn uitschieters gemakkelijk te identificeren en zijn afwijkingen van de verwachte kinetische curve niet moeilijk te detecteren.

Een van de beperkingen van de methode is de chromatografische co-elutie van UTP en CTP. Nauwkeurige kwantificering van UTP en CTP is meestal niet nodig, aangezien de beperkende NTP in een mRNA-sequentie vaak ATP of GTP is. Als afzonderlijke kwantificering van UTP en CTP vereist is, kan het verschil in UV-absorptie bij 260 nm en 280 nm voor UTP en CTP worden gebruikt om de relatieve abundantie van elke NTP in de chromatografische piek af te leiden.

Deze analytische methode scheidt geen RNA-soorten met een lengte van meer dan 100 nucleotiden; daarom kan het niet worden gebruikt om verschillen in mRNA-kwaliteit te detecteren, het maakt bijvoorbeeld geen onderscheid tussen niet-gepolyadenyleerd en gepolyadenyleerd mRNA, tussen dsRNA of mislukte transcripten en ssRNA en is niet geschikt voor stabiliteitsstudies omdat het geen onderscheid kan maken tussen gedegradeerd en niet-gedegradeerd mRNA. De methode kan echter worden gebruikt voor de kwantificering van andere RNA-modaliteiten, zoals circRNA, tRNA en saRNA. Hoewel deze moleculen variëren in grootte en structuur, kan dezelfde analytische methode worden gebruikt om de productieopbrengsten van elk in een IVT-reactie te bestuderen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.22 µm PES-membraanfilter, b.v. Sartolab BT 500	Sartorius	180E14---------E
0.5 mL plastic buisjes; b.v. DNA LoBind, PCR clean	Eppendorf	30108035
1.5 mL plastic buisjes; b.v. DNA LoBind, PCR clean	Eppendorf	30108051
ATP-oplossing	MEBEP BIOSCIENCE	R1331T2
Benchtop koeler -20 °C	Brand	114935
CIMac PrimaS 0.1 mL Analytische Kolom (2 µm)	Sartorius BIA Separations	110.5118-2, 2 µm kanalen
CTP-oplossing	MEBEP BIOSCIENCE	R3331T2
DTT	Sigma	10197777001
EDTA-Na2 x 2H2O	Kemika	b.v. 11368 08
GTP-oplossing	MEBEP BIOSCIENCE	R2331T2
HEPES	Merck	1.10110.1000
HPLC hoge herstel buisje	Macherey-Nagel	702860
MgCl2	Invitrogen	AM 9530G
Microvolume spectrofotometer	Thermo Scientic	Nanodrop
mRNA-standaard, mFix4, 4000 nt	Sartorius BIA Separations	BIA-mFix4.1.1
Na4P2O7 + 10 H2O	Sigma	S6422-500G
NaCl	Fluka	31434-1KG-M
NaOH	Merck	1064691000
PATfix mRNA analytisch platform	Sartorius BIA Separations	PAT0021
Pipet 100 – 1000 μL	Eppendorf	Referentie 2
Pipet 2 – 10 μL	Eppendorf	Referentie 2
Pipet 20 – 200 μL	Eppendorf	Referentie 2
Pyrofosfatase	MEBEP BIOSCIENCE	M2403L
Rnase Away Decontaminatie Reagens	Thermo Scientic	10328011
RNAse-inhibitor	MEBEP BIOSCIENCE	RNK3501
Spermidine	Sigma	85558-5G
T7 mRNA polymerase	MEBEP BIOSCIENCE	TR01
Thermoblok	Thermo Scientic	EPPE5382000.015
Trizma Base	Sigma	T6066-1KG
UTP-oplossing	MEBEP BIOSCIENCE	R5331T2
Buisjesdoppen	Macherey-Nagel	70245
Vortex	IKA	V1900