Methodenartikel

Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

932 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67508

⸱

2 mei 2025

 ,  , 
1School of Life Sciences, Beijing University of Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol dat CRISPR/Cas9-technologie integreert met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om kandidaatgenen te identificeren die cruciaal zijn voor de abnormale proliferatieve capaciteit van hematopoëtische stam- en voorlopercellen.

Samenvatting

Hematopoëtische stamcellen bezitten het vermogen tot zelfvernieuwing op lange termijn en het potentieel om te differentiëren in verschillende soorten rijpe bloedcellen. De accumulatie van kankermutaties in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) kan echter normale differentiatie blokkeren, afwijkende proliferatie induceren en uiteindelijk leiden tot leukemogenese. Om de kankermutaties te identificeren en/of te evalueren, hebben we CRISPR/Cas9-technologie geïntegreerd met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om een modelgen Trp53 te onderzoeken, dat essentieel is voor abnormaal proliferatief vermogen van HSPC's. In het bijzonder werden beenmergcellen verrijkt voor HSPC's van Cas9-muizen geoogst en vervolgens onderworpen aan virale transfectie met single-guide RNA's (sgRNA's) gericht op een of meer kandidaatgenen om genetische veranderingen in HSPC's te introduceren. Vervolgens werd een CCK-8-test uitgevoerd om de proliferatieve capaciteit van getransfecteerde HSPC's te onderzoeken. De efficiëntie van de sgRNA-targeting werd bevestigd door een Tracking of Indels by Decomposition assay. Deze geïdentificeerde genen kunnen een cruciale rol spelen bij leukemogenese en kunnen dienen als potentiële therapeutische doelen.

Inleiding

Hematopoëse, die gedurende het hele leven alle afstammingslijnen van bloedcellen produceert, wordt in stand gehouden door een kleine populatie die hematopoëtische stamcellen (HSC's) wordt genoemd. HSC's houden zichzelf in stand door zelfvernieuwing en produceren verschillende toegewijde voorlopercellen die aanleiding geven tot volledig gedifferentieerde functionele bloedcellen 1,2,3. Dit proces is streng gereguleerd. De accumulatie van kankermutaties in hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's) belemmert echter de normale differentiatie, verleent een abnormaal proliferatief vermogen en transformeert HSPC's uiteindelijk in leukemie-initiërende cellen (LIC's)4,5,6,7. Het identificeren en bevestigen van leukemogene mutaties blijft nog steeds een grote uitdaging voor kankeronderzoek.

Onlangs is het geclusterde, regelmatig op afstand geplaatste korte palindromische herhalingen (CRISPR)/CRISPR-geassocieerd eiwit 9 (Cas9) systeem ontwikkeld en is het een efficiënte en nauwkeurige genbewerkingsmethode geworden, bestaande uit de Cas9-nuclease en single-guide RNA (sgRNA)8. Het sgRNA leidt het Cas9-sgRNA-complex naar een specifieke genomische locatie door middel van RNA-DNA-complementariteit, waar de Cas9-nuclease dubbelstrengsbreuken induceert. Het gebroken DNA wordt onderworpen aan endogene genbewerkingsmechanismen, hetzij door nauwkeurige homologiegerichte reparatie in aanwezigheid van homologiesjablonen, hetzij door mismatch-gevoelige, niet-homologe eindverbindingen, wat leidt tot kleine inserties of deleties9. Momenteel is het CRISPR/Cas9-systeem een krachtig hulpmiddel geworden voor gerichte genbewerking en transcriptieregulatie10.

Hier gebruikten we CRISPR/Cas9-technologie om genetische veranderingen in HSPC's te introduceren en voerden we vervolgens de Cell Counting Kit-8 (CCK-8) -test uit om te onderzoeken of de geïntroduceerde mutaties cruciaal waren voor de abnormale proliferatie van HSPC's. In het bijzonder werden beenmergcellen verrijkt voor HSPC's geoogst van Cas9-muizen, gevolgd door virale transfectie met sgRNA's gericht op kandidaatgenen. Vervolgens werd de CCK-8-test uitgevoerd om te bepalen of de mutaties een verhoogd proliferatief vermogen verleenden aan de getransfecteerde HSPC's. Ten slotte werden de mutaties geïntroduceerd door CRISPR/Cas9 bevestigd door Tracking of Indels by Decomposition (TIDE)11 of gerichte diepe sequentie12. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het beoordelen van kankermutaties en mogelijke therapeutische doelen voor leukemie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven die volgens dit protocol zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door het Animal Care and Welfare Committee van de Beijing University of Chinese Medicine.

1. Constructie van sgRNA-plasmiden gericht op kandidaatgenen (4 - 5 dagen)

  1. Ontwerp het targeting-sgRNA met behulp van online sgRNA-ontwerptools. Voer de genomische DNA-sequentie van het doelwit in een online sgRNA-ontwerptool in (bijv. https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public). Selecteer de juiste sgRNA-doelen en bestel de benodigde oligonucleotiden.
  2. Bereid de sgRNA oligo-inserts voor. Resuspendeer de bovenste en onderste strengen van de ontworpen oligo's voor elk sgRNA (stap 1.1) tot een eindconcentratie van 100 μM. Bereid mengsels volgens tabel 1 om de sgRNA-oligo's te fosforyleren en te gloeien. Gebruik de volgende thermocyclusparameters: 37 °C gedurende 30 min; 95 °C gedurende 5 min; helling naar 25 °C bij 5 °C min-1.
  3. Voeg 1 μL van de gefosforyleerde en gegloeide oligo's toe aan 199 μL kamertemperatuur ddH2O om een verdunde verhouding van 1:200 te verkrijgen.
  4. Lineariseer het vectorplasmide.
    1. Gebruik de gerefereerde backbone-vector (zie de Tabel met materialen) om het vectorplasmide te verteren met behulp van het restrictie-enzym Esp3I (BsmBI). Stel de reacties in volgens tabel 1 en incubeer gedurende 1 uur bij 55 °C.
    2. Voeg 0,5 μl alkalische fosfatase (rSAP) voor garnalen toe aan dezelfde buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C om de kans op autoconjugatie van het lineaire plasmide te verkleinen.
    3. Controleer of de linearisatie is geslaagd. Laad de gelineariseerde plasmiden en ongesneden plasmiden voor elektroforese op een agarosegel van 0,8-1% (m/v).
    4. Zuiver het gelineariseerde plasmide met een PCR-zuiveringskit, elueer in 20 μL ddH2O en kwantificeer de DNA-concentratie.
  5. Kloon de sgRNA-oligo's in het vectorplasmide door de ligatiereacties voor elk sgRNA op te zetten volgens tabel 1. Incubeer gedurende 4 uur bij 16 °C.
  6. Voeg voor de omzetting 10 μl van het product uit stap 1.5 toe aan 50 μl ijskoude competente Stbl3-cellen, incubeer het mengsel gedurende 30 minuten op ijs, schud het gedurende 90 s bij 42 °C en breng het dan onmiddellijk gedurende 2 minuten terug naar ijs. Voeg 200 μL antibioticavrij LB-medium toe aan dezelfde buis, schud bij 220 tpm gedurende 30 minuten bij 37 °C en leg het vervolgens op een LB-plaat met 100 μg/ml ampicilline. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
  7. Onderzoek de volgende dag de platen op koloniegroei. Selecteer uit elke plaat 6-8 kolonies en controleer op de juiste invoeging van sgRNA met behulp van kolonie-PCR. Selecteer positieve kolonies en inoculeer individuele kolonies in 5 ml LB-medium dat 100 μg/ml ampicilline bevat met behulp van een steriele pipetpunt. Incubeer en schud de cultuur een nacht bij 37 °C.
  8. Isoleer het plasmide-DNA uit culturen met behulp van een mini-plasmide-DNA-zuiveringskit. Sequentie van de U6-promotor om er zeker van te zijn dat de 20-nt guide-sequentie correct is ingevoegd.

2. Lentiviral verpakking (2 - 3 dagen)

  1. Kweek HEK 293T-cellen in DMEM-medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS) en 1% (v/v) penicilline-streptomycineoplossing bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Passeer de HEK293T cellen door het oude medium uit de petrischaal op te zuigen en was de schaal voorzichtig 2x met 3 ml PBS. Voeg 1 ml trypsine toe aan een schaaltje van 10 cm en incubeer het gedurende 1 minuut bij 37 °C. Voeg 3 ml warm DMEM-medium toe aan de schaal om de trypsine te inactiveren, verzamel de cellen in een tube van 15 ml en draai gedurende 5 minuten op 800 × g . Gooi de supernatant weg, suspendeer de cellen in 5 ml medium en plaats de cellen indien nodig in nieuwe schaaltjes.
    OPMERKING: Gebruik HEK 293T-cellen met minder dan 10 passages voor de productie van lentivirus.
  3. Zestien tot 24 uur vóór transfectie, zaai de HEK293T cellen in schalen van 10 cm met een dichtheid van 2-4 × 106 cellen per schaal. Zorg ervoor dat de gebruikte DMEM antibioticavrij is.
  4. Zorg ervoor dat de cellen 70-80% samenvloeien op de dag van transfectie. Transformeer 10-15 μg plasmide per schaaltje van 10 cm en houd de molaire verhouding van plasmide tot PEI 1:3. Bereid Mix 1 en Mix 2 voor transfectie voor volgens Tabel 2.
  5. Laat Mix 2 5 minuten staan. Voeg Mix 2 toe aan Mix 1 (pas op dat u de volgorde van toevoegen niet omkeert), meng grondig en laat het dan 15-20 minuten staan.
  6. Voeg het complex (stap 2.5) toe aan de cellen, schud de schaal voorzichtig om te mengen en incubeer in een incubator van 37 °C met 5% CO2 . Vervang zes tot 8 uur later het medium door DMEM-medium (met 10% FBS).
  7. Twee dagen na het begin van lentivirale transfectie, poolen de lentivirus-supernatanten uit de schalen. Centrifugeer bij 4.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en filtreer door een microfiltratiemembraan van 0,45 μm. Doseer het lentivirus en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Het verzamelde lentivirus kan naar behoefte worden geconcentreerd. Vermijd het verminderen van virale titers als gevolg van herhaaldelijk bevriezen en ontdooien.

3. Extractie en kweek van beenmergcellen (12 - 13 dagen)

OPMERKING: Alle muislijnen werden onderhouden in een zuivere C57BL/6 genetische achtergrond. LSL-Cas9-muizen (T002249) werden gekruist met Mx1-Cre-muizen13 om LSL-Cas9/+ te genereren; Mx1-Cre/+ muizen. Hier verzamelden we beenmergcellen van Mx1-Cre/+; LSL-Cas9/+ muizen en hun nestgenoten.

  1. Om de expressie van Cre-recombinase te induceren, injecteert u de muizen (8-12 weken oud) intraperitoneaal met 150 μL Polyinosinisch-polycytidylisch (1,5 mg/ml) op dag 1 en dag 3. Injecteer de muizen op dag 6 intraperitoneaal met 5-fluorouracil (5-FU, 150 mg/kg).
    OPMERKING: Mx1-Cre transgene muizen zijn gemanipuleerd om Cre-recombinase tot expressie te brengen onder controle van de induceerbare Mx1-promotor13. Intraperitoneale injectie van polyinosinisch-polycytidylisch kan de Mx1-promotor effectief activeren en Cre-recombinase-expressie14 induceren. De injectie van 5-FU wordt gebruikt om prolifererende cellen in het beenmerg uit te putten, waardoor HSC's worden geïnduceerd om de celcyclus binnen te gaan en resulteren in een relatieve overvloed van HSPC's15. Ongeveer 2-4 × 106 beenmergcellen kunnen per muis worden geoogst na behandeling met 5-FU.
  2. Offer op dag 11 de muizen door CO2 -verstikking. Neem het dijbeen en het scheenbeen van de muizen, spoel de beenmergholte door met PBS met 2% FBS met behulp van een steriele spuit van 1 ml en verzamel beenmergcellen zoals beschreven door Gavrilescu et al.16.
    OPMERKING: Breng de botten over naar een laminaire stroomkap zodra het scheenbeen en kuitbeen van de muizen zijn verwijderd om de steriliteit te behouden tijdens het verzamelen van beenmergcellen.
  3. Pipetteer de beenmergcellen op en neer (30-50x) om ze in afzonderlijke cellen te verspreiden, breng het celmengsel vervolgens over in een buis van 50 ml en draai om goed te mengen.
  4. Voeg 10 μL van de celsuspensie toe aan 40 μL erytrocytenlysisbuffer en plaats deze 5 minuten op ijs om de erytrocyten te laten lyseren. Voeg 50 μL trypan blauwe oplossing toe, meng goed en tel levensvatbare cellen.
  5. Centrifugeer de cellen gedurende 15 minuten bij 800 × g bij 4 °C. Aspiratie van het bovenlevende.
  6. Resuspendeer de cellen bij 1-2 × 106 cellen/ml in het beenmergprestimulatiemedium zoals beschreven in tabel 3. Zaai de cellen in schaaltjes van 10 cm, 10 ml/bord, en incubeer gedurende 24 uur.

4. Lentivirale transfectie van beenmergcellen (2 - 3 dagen)

  1. Verzamel de volgende dag cellen van de voorgestimuleerde platen. Spoel de plaat krachtig af met 5--10 ml PBS met 2% FBS. Tel de levensvatbare cellen door trypanblauw toe te voegen zoals beschreven in stap 3.4.
  2. Centrifugeer de cellen bij 800 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid de virusinfectieoplossing voor zoals beschreven in tabel 4.
  3. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de cellen opnieuw in een vers bereide spinfectieoplossing (∼106 cellen/ml). Zaai de zwevende cellen in een plaat met 6 putjes, 4 ml per putje. Sluit de plaat met 6 putjes af met parafilm en centrifugeer de plaat 90 minuten bij 1.500 × g bij 32 °C.
  4. Resuspendeer de cellen na het centrifugeren voorzichtig met een pipet (maar verander het medium niet) en incubeer de plaat vervolgens 4-6 uur in een incubator.
  5. Voor de eerste transfectie, aspireer zoveel supernatans medium als mogelijk is uit elk putje (~3 ml) zorgvuldig en voeg een gelijk volume van beenmergprestimulatiemedium toe. Als sommige cellen tijdens de procedure per ongeluk worden opgezogen, centrifugeer dan gedurende 5 minuten bij 800 × g bij kamertemperatuur. Gooi de supernatant weg, suspendeer de cellen opnieuw met een kleine hoeveelheid voorstimulatiemedium en voeg ze dan weer toe aan het putje.
  6. Voor de secundaire transfectie verwijdert u de volgende dag 2-3 ml medium uit elk putje en voegt u een gelijk volume vers ontdooide retrovirale voorraadoplossing samen met de juiste hoeveelheden HEPES en polybreen toe, zoals beschreven in Tabel 4. Centrifugeer de plaat bij 1.500 × g gedurende 90 min, 37 °C.
  7. Na het centrifugeren worden de cellen voorzichtig opnieuw suspendeerd en wordt de plaat 4-6 uur in de incubator verder geïncubeerd.
  8. Vervang het medium zoals in stap 4.5. Incubeer gedurende 24 uur.

5. Voer in vitro CCK-8-assay uit (3 - 4 dagen)

  1. Spoel de putjes krachtig om beenmergcellen te verzamelen. Was de plaat met PBS met 2% FBS om het maximale aantal cellen te verkrijgen. Filtreer de cellen door een zeef van 70 μm en tel de levensvatbare cellen met trypanblauw zoals beschreven in stap 3.4.
  2. Centrifugeer de cellen bij 800 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Resuspendeer de cellen met DMEM met 10% FBS en mIL-3, mIL-6 (10 ng/ml), mSCF (100 ng/ml) tot 1 × 105 cellen/ml. Neem ~0,5-1 × 106 cellen en centrifugeer op 800 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de celpellet bij -80 °C voor genomische DNA-extractie.
  4. Voeg de cellen toe aan platen met 96 putjes met een dichtheid van 1 × 104 cellen per putje. Maak zes replicatieputten voor elke groep. Voeg 100 μL steriel PBS toe aan een cirkel van putjes rond de putjes waar de cellen zijn gezaaid. Incubeer gedurende 0, 24, 48 en 72 uur.
  5. Zuig het medium voorzichtig op van de plaat met 96 putjes op het overeenkomstige tijdstip. Voeg 110 μL medium met 1/10 volume CCK-8 toe aan putjes. Stel een lege groep in (alleen medium en CCK-8, geen cellen). Incubeer gedurende 1 uur in de broedmachine.
  6. Lees de absorptiewaarde van 450 nm af met behulp van een microplaatspectrofotometer.
  7. Gebruik statistische software om de experimentele gegevens te analyseren en druk de experimentele gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). Analyseer de verschillen tussen de twee groepen met behulp van de onafhankelijke steekproeven t-toets, waarbij P < 0,05 een statistisch significant verschil aangeeft.

6. Verificatie van genbewerking (5 - 7 dagen)

  1. Extraheer het genomische DNA (stap 5.3) met behulp van een genomische DNA-zuiveringskit volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
  2. Ontwerp primers die het gebied van 200 tot 500 bp rond de sgRNA-snijplaats versterken (Tabel 5).
  3. Voor Sanger-sequencing bereidt u het mengsel zoals in tabel 6 voor PCR. Amplificeer de doelgenfragmenten met behulp van een thermocycler als volgt: 95 °C gedurende 5 min, 40 cycli (95 °C gedurende 30 s, 58 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 9 s), 72 °C gedurende 10 min, 4 °C ∞.
    OPMERKING: Genbewerking kan ook worden geverifieerd met behulp van next-generation sequencing (NGS) en het PCR-product moet worden gezuiverd met behulp van een zuiveringskit voor NGS.
  4. Analyseer de resultaten van de Sanger-sequencing op de TIDE-website (http://tide.nki.nl). Bereken de bewerkingsefficiëntie van sgRNA door de sgRNA-sequentie en de sequentieresultaten van zowel experimentele als controlegroepen in deze online tool in te voeren.
    OPMERKING: Analyseer de NGS-resultaten met behulp van CRISPREsso2 (http://crispresso.pinellolab.org/submission)17. Voer gepaarde lezingen (twee bestanden) of single-end lezingen (enkel bestand) in fastq- of fastq.gz-formaat in van een deep sequencing-experiment, samen met een referentiesequentie en een sgRNA-sequentie. De software zal de gerichte mutagenese evalueren en kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Effect van Trp53 knock-out op de proliferatieve capaciteit van muis HSPC's
Hier hebben we Trp53 knockout als voorbeeld gebruikt om dit protocol te demonstreren. Om het effect van Trp53-knock-out op de proliferatieve capaciteit van HSPC's bij muizen te onderzoeken, gebruikten we lentivirale transfectie om Trp53-sgRNA te introduceren in beenmergcellen die Cas9 tot expressie brengen en verrijkt zijn me...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

CRISPR/Cas9-technologie wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek vanwege het gebruiksvriendelijke karakter en de hoge efficiëntie, waardoor toepassingen zoals genfunctiescreening18, ziektemodellering19, immunotherapie20 en labeling en beeldvorming van levende cellen21 mogelijk zijn. Recente studies hebben grootschalige CRISPR-screening uitgevoerd om nieuwe therapeutische doelen te identific...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen de Beijing University of Chinese Medicine bedanken voor het gebruik van haar gedeelde diensten om dit onderzoek te voltooien. Dit werk werd ondersteund door het Young Scientists Fund van de National Natural Science Foundation of China (nr. 31701280 aan J. Zhang).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm microfiltration membraneSartoriu16533K-1
1.5 mL EP tubeLABLEADMCT-150-CLD-1
10 cm dishCorning430167
15 mL TubeLABLEADLXG1500
1 mL sterile syringe
2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)Accurate BiologyAG11010Voor kolonie PCR
50 mL TubeLABLEADLXG5000
5-FluorouracilSigmaF6627-1
6-well plateCorning3516
70 µm cell sieveFalcon®352350
96-well platesCorning3599
ACK Lysis BufferLeageneCS0001
AgarBIODEEDE0010
AmpicillinSolarbioA8180
Applied Biosystems Thermal Cyclers for PCRThermofisher
Cell Counting Kit-8BimakeB34304
CentrifugeeppendorfCentrifuge 5810R
CO2 IncubatorThermo SCIENTIFIC
DMEMGibcoC11995500BT
DNA Clean&Concentrator-5ZYMOD4014
Dneasy Blood & Tissure KitQiagen69504
Esp3I (BsmbI)NEBR0580L
Fetal Bovine SerumExCellFSP500
GraphPad Prism 9.3
HEK-293TATCC;Virginia,USA
HEPEsSigmaV900477
KOD-Plus-NeoTOYOBOKOD-401
lentiGuide-PuroAddgene52963backbone vector
LSL-Cas9 miceModel Animal
Research Center of
NANJING UNIVERSITY 		T002249
microplate absorbance spectrophotometerBIO-RADxMark™
NaclRhawnR019772
PBSSolarbioP1003
PEIProteintechB600070
Penicillin-Streptomycin Solution, 100xSolarbioP1400
pMD2.G plasmidAddgene12259
polybreneBeyotimeC0351
Polyinosinic-polycytidylic acid sodium saltSigmaP1530
psPAX2Addgene12260
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen28104
RecombinantMurineIL-3Peprotech213-13-10ug
RecombinantMurineIL-6Peprotech216-16-2ug
RecombinantMurineSCFPeprotech250-03-10ug
Regular agaroseBIOWESTBY-R0100
Shrimp Alkaline Phosphatase (rSAP)NEBM0371S
SpectraMax QuickDrop Ultra-Micro SpectrophotometerMOLECULAR DIVICES
Stbl3 Competent cellsBioMedBC108-01 
T4 Polynucleotide KinaseNEBM0201L
T4-LigaseTakara2011B
TIANprep Rapid Mini Plasmid KitTIANGENDP105-03
Trypan Blue solutionLABLEADC0040-100ml
Trypsin-EDTAGibco25200072
TryptoneOXOIDLP0042
WEHI-CMNanjing Fuksai Biotechnology CBP50079
YEAST EXTRACTOXOIDLP0021

Referenties

  1. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: Concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: Self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  4. Vetrie, D., Helgason, G. V., Copland, M. The leukaemia stem cell: Similarities, differences and clinical prospects in cml and aml. Nat Rev Cancer. 20 (3), 158-173 (2020).
  5. Chopra, M., Bohlander, S. K. The cell of origin and the leukemia stem cell in acute myeloid leukemia. Genes Chromosomes Cancer. 58 (12), 850-858 (2019).
  6. Cox, C. V., Diamanti, P., Evely, R. S., Kearns, P. R., Blair, A. Expression of CD133 on leukemia-initiating cells in childhood all. Blood. 113 (14), 3287-3296 (2009).
  7. González-García, S., et al. IL-7R is essential for leukemia-initiating cell activity of T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 134 (24), 2171-2182 (2019).
  8. Jinek, M., et al. A programmable dual-rna-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  9. Porteus, M. H., Baltimore, D. Chimeric nucleases stimulate gene targeting in human cells. Science. 300 (5620), 763-763 (2003).
  10. Wang, S. -W., et al. Current applications and future perspective of CRISPR/Cas9 gene editing in cancer. Mol Cancer. 21 (1), (2022).
  11. Zhao, C., et al. HIT-Cas9: A CRISPR/cas9 genome-editing device under tight and effective drug control. Mol Ther Nucleic Acids. 13, 208-219 (2018).
  12. Joung, J., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protoc. 12 (4), 828-863 (2017).
  13. Kühn, R., Schwenk, F., Aguet, M., Rajewsky, K. Inducible gene targeting in mice. Science. 269 (5229), 1427-1429 (1995).
  14. Arnheiter, H., Skuntz, S., Noteborn, M., Chang, S., Meier, E. Transgenic mice with intracellular immunity to influenza virus. Cell. 62 (1), 51-61 (1990).
  15. Randall, T. D., Weissman, I. L. Phenotypic and functional changes induced at the clonal level in hematopoietic stem cells after 5-fluorouracil treatment. Blood. 89 (10), 3596-3606 (1997).
  16. Gavrilescu, L. C., Van Etten, R. A. Murine retroviral bone marrow transplantation models for the study of human myeloproliferative disorders. Curr Protoc Pharmacol. Chapter 14 (Unit 14.10), (2008).
  17. Pinello, L., et al. Analyzing CRISPR genome-editing experiments with CRISPResso. Nat Biotechnol. 34 (7), 695-697 (2016).
  18. Cai, P., et al. A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis. Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).
  19. Ng, S. R., et al. CRISPR-mediated modeling and functional validation of candidate tumor suppressor genes in small cell lung cancer. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (1), 513-521 (2020).
  20. Crowther, M. D., et al. Genome-wide CRISPR-Cas9 screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHC class i-related protein MR1. Nat Immunol. 21 (2), 178-185 (2020).
  21. Ma, H., et al. Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow. Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).
  22. Szlachta, K., et al. CRISPR knockout screening identifies combinatorial drug targets in pancreatic cancer and models cellular drug response. Nat Commun. 9 (1), 4275(2018).
  23. Baeten, J. T., Liu, W., Preddy, I. C., Zhou, N., Mcnerney, M. E. Crispr screening in human hematopoietic stem and progenitor cells reveals an enrichment for tumor suppressor genes within chromosome 7 commonly deleted regions. Leukemia. 36 (5), 1421-1425 (2022).
  24. Korkmaz, G., et al. Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using crispr-cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 192-198 (2016).
  25. Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancy with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hematopo tische stamcellengen knock outceltelkitabnormale proliferatieleukemogeneseisolatie van beenmergTrp53 knock outTIDE analyse

Gerelateerde artikelen