Vergelijking van transperitoneale retroperitoneale toegang en percutane punctie voor modellering van lumbale schijfdegeneratie bij konijnen

Samenvatting

Dit protocol vergeleek percutane en transretroperitoneale puncties in een model voor tussenwervelschijfdegeneratie (IVDD) bij konijnen. Beide methoden induceerden IVDD; De transretroperitoneale benadering resulteerde echter in uitgebreidere veranderingen en een lagere mortaliteit.

Samenvatting

Deze studie vergelijkt de werkzaamheid van twee methoden voor het induceren van tussenwervelschijfdegeneratie (IVDD) bij konijnen: percutane en transretroperitoneale punctie van de annulus fibrosus. Vijftien gezonde mannelijke Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden willekeurig toegewezen aan drie groepen: schijnvertoning, percutane punctie en transretroperitoneale punctie. Een uitgebreide beoordeling, inclusief sterftecijfers, morfologische en histologische evaluaties, radiologische beeldvorming en biomarkeranalyse, werd uitgevoerd om een nauwkeurige en gedetailleerde vergelijking tussen de twee methoden te garanderen. De resultaten tonen aan dat beide priktechnieken met succes IVDD induceerden in het konijnenmodel. De transretroperitoneale benadering resulteerde echter in meer uitgesproken degeneratieve veranderingen in de tussenwervelschijven, terwijl een significant lager sterftecijfer behouden bleef in vergelijking met de percutane methode. Deze bevindingen benadrukken de voordelen van de transretroperitoneale benadering bij IVDD-modellering. Deze studie biedt waardevolle inzichten in het opstellen van IVDD-modellen en legt een basis voor toekomstig onderzoek naar effectieve behandelingsstrategieën voor lage rugpijn, waardoor uiteindelijk de resultaten voor de patiënt worden verbeterd.

Inleiding

In de afgelopen decennia is lage rugpijn (LBP) naar voren gekomen als de belangrijkste aandoening aan het bewegingsapparaat die de kwaliteit van leven beïnvloedt¹. LBP is een steeds belangrijker probleem voor de volksgezondheid geworden en legt een aanzienlijke economische last op de samenleving als gevolg van verloren arbeidskrachten en extra medische kosten ^2,3. Alleen al in de Verenigde Staten bedragen de directe en indirecte kosten van LBP meer dan $ 100 miljard per jaar, inclusief medische uitgaven, inkomensverlies en arbeidsverlies⁴. LBP wordt vaak veroorzaakt door tussenwervelschijfdegeneratie (IVDD)5,6,7,8. Gezien de hoge prevalentie en economische impact van LBP, is het nauwkeurig modelleren van IVDD cruciaal voor het verkennen van behandelingsstrategieën.

Om de pathofysiologie van IVDD te begrijpen en behandelingsstrategieën te evalueren, zijn verschillende preklinische in vivo diermodellen ontwikkeld en gebruikt⁹. In deze modellen zijn meerdere methoden gebruikt om schijfdegeneratie te induceren, waaronder chirurgisch of chemisch schijfletsel, niet-invasieve mechanische stress, genetische modificatie en natuurlijk voorkomen¹⁰. Van deze methoden is chirurgisch letsel verantwoordelijk voor maximaal 64.9% van de IVDD-inductie, waarbij naaldpunctie de primaire chirurgische techniek is¹¹. Het naaldprikmodel kenmerkt zich door het gemak waarmee het kan worden aangebracht en de minimale schade aan proefdieren. Veel voorkomende benaderingen van naaldpunctie zijn onder meer open retroperitoneale toegang tot de lumbale schijfruimte en percutane posterolaterale punctie. De diepte van het inbrengen kan worden bepaald met behulp van radiografische monitoring of naaldlengte. Met name de percutane benadering kan iatrogene weefselbeschadiging verminderen in vergelijking met open chirurgische methoden, terwijl retroperitoneale toegang het voordeel biedt van directe visualisatiekenmerken die in eerdere literatuur niet kwantitatief zijn vergeleken. Hoewel studies de effecten hebben onderzocht van het gebruik van naalden met verschillende diameters¹² en het doorprikken van verschillende schijven¹⁰ op IVDD-inductie, blijven vergelijkende studies die zich richten op verschillende benaderingen van naaldpunctie beperkt. Het geselecteerde konijnenmodel is bijzonder bruikbaar voor onderzoekers die kosteneffectieve longitudinale studies nodig hebben met frequente beeldvormingsbeoordelingen, gezien de anatomische gelijkenis met menselijke schijven en de voordelen ten opzichte van knaagdiermodellen in termen van grootte en structuur¹³.

In deze studie werden konijnenmodellen van lumbale IVDD opgesteld met behulp van twee methoden: open retroperitoneale toegang om de lumbale schijfruimte te doorboren en percutane posterolaterale punctie. Een uitgebreide reeks uitkomstmaten, waaronder morfologische, histologische en radiologische veranderingen, werd geanalyseerd.

Protocol

De dierexperimentele procedures hielden zich strikt aan de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, uitgegeven door de National Institutes of Health en werden goedgekeurd door de Ethical s Committee voor proefdieren van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (Ethics Approval Number: 2021-23). Vijftien gezonde, 4 maanden oude, schone Nieuw-Zeelandse witte konijnen (2,25 kg ± 0,25 kg) werden gebruikt, waaronder zeven mannetjes en acht vrouwtjes. De dieren werden gehuisvest in een omgeving met een kamertemperatuur van 23 °C ± 3 °C en een luchtvochtigheid van ongeveer 60% ± 10% gedurende een week van aanpassing, met vrije toegang tot water en voedsel. Voorafgaand aan het experiment werden de 15 konijnen willekeurig toegewezen aan een van de drie groepen: de schijngroep (Groep A), de percutane annulus fibrosus-punctiegroep (Groep B) en de transretroperitoneale space annulus fibrosus-punctiegroep (Groep C), met vijf konijnen in elke groep. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Opstelling van een IVDD-model voor konijnen via percutane annulus fibrosuspunctie

OPMERKING: Het IVDD-model voor konijnen is opgesteld met behulp van de percutane annulus fibrosus-punctiemethode. De procedure volgde de punctiemodelleringsmethode beschreven door Luo TD et ^al.14 en werd uitgevoerd onder röntgenbegeleiding (Figuur 1).

1. Bereid het konijn voor.
   1. Vast de konijnen 24 uur voor de operatie, zorg ervoor dat ze toegang hebben tot water.
   2. Toediening van anesthesie via intraveneuze injectie van 3% pentobarbitalnatrium (1,3 ml/kg) in de oorader (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
   3. Bevestig succesvolle anesthesie door te controleren op immobiliteit, ontspannen spieren, gebrek aan hoornvliesreflex en afwezigheid van pijnrespons.
2. Plaats en markeer het konijn.
   1. Bevestig het konijn in buikligging op een fixatiebord.
   2. Scheer en bereid het operatiegebied voor en palpeer vervolgens botoriëntatiepunten.
   3. Palpeer de benige oriëntatiepunten op de lendenrug van het konijn. Zoek de onderste rib van het konijn, die meestal overeenkomt met de wervel net boven de processus l1 doornuitsteeksels.
   4. Identificeer de processus spinosus direct onder deze wervel om de processus l1 spinosus te bepalen.
   5. Zoek de hoogste punten van de darmbeenkammen, ongeveer ter hoogte van de L6-wervel.
   6. Traceer vanaf de processus spinosus L1 om achtereenvolgens elke processus spinosus te identificeren tot aan L7.
   7. Gebruik een markeerpen om de processus L1 doornuitsteeksels duidelijk op de rug van het konijn te markeren.
   8. Ga naar de volgende processus spinosus en markeer deze als L2.
   9. Ga door met het markeren van elke volgende processus spinosus als L3, L4, L5, L6 en L7. Zorg ervoor dat elke markering duidelijk is en in opeenvolgende volgorde staat voor duidelijke identificatie.
3. Zoek en markeer de prikplaats.
   1. Palpeer de transversale uitsteeksels en lokaliseer het middelpunt tussen de distale uiteinden van L5 en L6.
   2. Markeer dit punt en bereid je voor om de priknaald ongeveer 1 cm erboven in te brengen.
4. Plaats de priknaald.
   1. Houd de priknaald horizontaal en steek deze naar de grond, waardoor de huid breekt.
   2. Beweeg de naald vooruit om het L4-wervellichaam te bereiken en controleer de juiste positionering onder röntgengeleiding.
   3. Kantel de naald iets cephalisch in een hoek van ongeveer 20° in de richting van de tussenwervelschijf L4-5. Doorboor de schijf en bevestig de nauwkeurigheid van de punctie onder röntgenonderzoek.
5. Voer schijfpuncties uit.
   1. Prik de annulus fibrosus nauwkeurig door, indien nodig met behulp van röntgengeleiding.
   2. Herhaal het aanprikproces voor de tussenwervelschijven L2-3 en L3-4 en prik ze elk één keer aan.
   3. Houd een prikdiepte van ongeveer 5 mm aan met een contacttijd van 5 s voor elke schijf.
6. Zorg na de procedure
   1. Desinfecteer en verbind de prikplaats.
   2. Injecteer penicilline intramusculair in de gluteus maximus in een dosering van 40.000 U per konijn per dag gedurende 3 dagen.
      OPMERKING: Pas de aanpak aan als de naald in aanraking komt met hard weefsel. Gebruik röntgengeleiding voor nauwkeurig doorprikken. Bewaak het herstel van het konijn en zorg voor de juiste zorg.

2. Opstelling van een IVDD-model bij konijnen via trans-retroperitoneale space annulus fibrosuspunctie

OPMERKING: Het IVDD-model voor konijnen is opgesteld met behulp van de transretroperitoneale space annulus fibrosus-punctiemethode¹² (Figuur 2).

1. Vast de konijnen 24 uur voor de operatie, zodat ze toegang hebben tot water.
2. Verdoof het konijn door intraveneus 3% pentobarbitalnatrium (1,3 ml/kg) in de oorader te injecteren (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
3. Zorg ervoor dat het konijn onbeweeglijk is, met ontspannen spieren, geen hoornvliesreflex en geen pijnreactie op druk om succesvolle anesthesie te bevestigen.
4. Bevestig het konijn in buikligging op een fixatiebord.
5. Scheer en bereid het operatiegebied voor.
6. Palpeer botoriëntatiepunten, markeer de L1-L7 lumbale doornuitsteeksels op de lumbale rug van het konijn met een markeerpen.
7. Palpeer de transversale processen van het konijn opnieuw om de locatie van de chirurgische incisie te bepalen.
8. Leg een steriel laken en desinfecteer de lokale huid om aseptische omstandigheden te garanderen.
9. Gebruik een posterieure retroperitoneale benadering om de fascia en spieren laag voor laag te ontleden, waardoor het laterale aspect van de lumbale tussenwervelschijf wordt blootgelegd.
10. Prik de annulus fibrosus met een priknaald aan tot een diepte van ongeveer 5 mm en een verblijftijd van 5 s.
11. Doorboor achtereenvolgens de tussenwervelschijven L3-4, L4-5 en L5-6 en zorg ervoor dat elke schijf slechts één keer wordt doorboord.
12. Hecht de weefsels laag voor laag met behulp van een hechtdraad met een diameter van 0,25 mm.
13. Desinfecteer en verbind de prikplaats na het modelleren.
14. Injecteer penicilline dagelijks intramusculair in de gluteus maximus van het konijn in een dosering van 40.000 U per konijn gedurende drie opeenvolgende dagen.
    OPMERKING: Gebruik penicilline met een specificatie van 800.000 eenheden/injectieflacon en goedkeuringsnummer Veterinary Drug 140051251.

3. Selectie van IVDD-modellen en evaluatie van de resultaten

1. Beoordeling van de mortaliteit en de algemene conditie van konijnen
   1. Observeer konijnen wekelijks om de overleving te bepalen en de algemene toestand vast te leggen, inclusief mentale toestand, activiteitspatronen, voedsel- en waterinname, evenals fecale en urineproductie.
   2. Registreer waarnemingen nauwkeurig en noteer eventuele veranderingen in de toestand.
2. Gewichtscontrole van konijnen
   1. Registreer het lichaamsgewicht van konijnen voor en na het modelleren, evenals voorafgaand aan het verzamelen van weefsels.
   2. Zorg voor een nauwkeurige gewichtsregistratie en noteer eventuele belangrijke wijzigingen.
3. Radiologisch onderzoek
   1. Verkrijg sagittale 1.5T T2-gewogen magnetische resonantiebeeldvorming van de gehele lumbale wervelexplantatiesequentie van elk wit konijn vóór en 4 weken na modelvestiging.
   2. Observeer de mate van degeneratie van de tussenwervelschijf.
   3. Voer een kwantitatieve beoordeling uit van degeneratie van de tussenwervelschijf met behulp van het gewijzigde Pfirrmann-beoordelingssysteem voorgesteld door Griffith et ^al.15. Laat drie onafhankelijke geblindeerde radiologen T2-gewogen MRI-sequenties evalueren volgens vastgestelde criteria: schijfhoogte, nucleus pulposus-signaalintensiteit en integriteit van annulus fibrosus.
   4. Bepaal eindcijfers door middel van consensus wanneer de verschillen meer dan één leerjaar bedragen. Voer alle beoordelingen uit met behulp van gestandaardiseerde DICOM-weergavesoftware met gekalibreerde weergave-instellingen.
4. Histopathologische evaluatie en scoren
   1. Euthanaseer de konijnen 4 weken na modellering met behulp van een intraveneuze overdosis pentobarbital-natrium (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen), en oogst vervolgens snel de tussenwervelschijven L2-L3, L3-L4 en L4-L5 op ijs¹⁵.
   2. Fixeer de L2-L3-schijven met 4% paraformaldehyde en bewaar de resterende monsters bij -80 °C.
   3. Dompel de vaste schijven onder in een ontkalkingsoplossing, zoals 10% EDTA, en zorg voor volledige onderdompeling. Vervang de ontkalkingsoplossing elke 2-3 dagen om de effectiviteit te behouden.
   4. Controleer het ontkalkingsproces regelmatig totdat volledige ontkalking is bereikt, wat enkele dagen tot een week kan duren, afhankelijk van de grootte en dikte van de schijf.
   5. Spoel de ontkalkte schijven grondig af met stromend water om eventuele sporen van de ontkalkingsoplossing te verwijderen.
   6. Dehydrateer de schijven door ze onder te dompelen in een reeks graduele ethanoloplossingen, beginnend met 70% ethanol en geleidelijk oplopend tot 100% ethanol. Voer elke uitdrogingsstap 1-2 uur per leerjaar uit.
   7. Infiltreer de gedehydrateerde schijven met paraffinewas (smeltpunt 56-58 °C) gedurende minimaal 2 uur, zodat u een volledige infiltratie kunt garanderen.
   8. Integreer de geïnfiltreerde schijven in een wasblok en positioneer ze voor secties. Laat het wasblok afkoelen en volledig stollen.
   9. Snijd de ingebedde schijven met behulp van een microtoom in dunne, uniforme plakjes (5-10 μm). Monteer de secties op glasplaatjes voor verdere analyse, zoals histologische kleuring of immunohistochemie ^12,13.
   10. Voer hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring uit, leg beelden vast onder een optische microscoop en wijs HE-kleuringsscores toe met behulp van de IVD-histopathologische beoordelingsschaal¹².
5. TONIJN-test
   1. Ontwas en rehydrateer delen van het weefsel van de tussenwervelschijf, voer vervolgens antigeenverwijdering en membraanpermeabilisatie uit.
   2. Voeg een mengsel van reagens 1 (TdT) en reagens 2 (dUTP) toe in een verhouding van 1:9 en incubeer in een bevochtigde kamer.
   3. Was secties met PBS-buffer, breng DAPI-kleuring aan en incubeer 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
   4. Leg beelden vast met behulp van een volledig geautomatiseerde panoramische scanner en verwerkingssoftware.
6. Detectie van cytokines
   1. Euthanaseer de experimentele konijnen (stap 3.4.1) en verzamel bloedmonsters uit de abdominale aorta.
   2. Centrifugeer bloedmonsters van konijnen bij 2000 × g gedurende 10 minuten bij 25 °C om het serum van de bloedcellen te scheiden. Verzamel voorzichtig het bovenstaande (serum) en zorg ervoor dat er geen celresten worden opgenomen.
   3. Volg de instructies in de ELISA-kit om de expressie van TGF-β in serummonsters te detecteren.
   4. Bereid reagentia en standaarden voor zoals aangegeven in de ELISA-kit.
   5. Voeg serummonsters toe aan de daarvoor bestemde putjes in de ELISA-plaat.
   6. Incubeer de plaat op de aanbevolen temperatuur en duur volgens de instructies van de kit.
   7. Was de plaat volgens de instructies om ongebonden reagentia te verwijderen.
   8. Voeg het detectie-antilichaam en andere noodzakelijke reagentia toe, volgens het protocol van de kit.
   9. Incubeer de plaat opnieuw gedurende de aangegeven tijd en temperatuur.
   10. Was de plaat grondig om overtollige reagentia te verwijderen.
   11. Voeg de substraatoplossing toe aan de putjes en incubeer gedurende de aanbevolen periode om kleurontwikkeling mogelijk te maken.
   12. Meet de optische dichtheid (OD) met behulp van een spectrofotometer op de golflengte die is gespecificeerd in de instructies van de kit.
   13. Bereken monsterconcentraties door OD-waarden te vervangen door de verstrekte vergelijking of door de standaardcurve te gebruiken die is gegenereerd op basis van de bekende concentraties van de normen.

4. Statistische analyse

1. Voer statistische analyses uit met behulp van in de handel verkrijgbare software.
2. Druk continue variabelen uit als gemiddelde ± standaarddeviatie.
3. Gebruik eenrichtings-ANOVA om verschillen tussen groepen te testen.
4. Pas LSD-tests toe voor paarsgewijze vergelijkingen.
5. Gebruik ANOVA met herhaalde metingen voor het analyseren van gegevens met herhaalde metingen.
6. Voer een Spearman-correlatieanalyse uit om de correlatie tussen variabelen te beoordelen.
7. Stel het significantieniveau in op α = 0,05 en beschouw P-waarden kleiner dan 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

De chirurgische ingrepen werden zonder complicaties uitgevoerd. Een konijn uit groep B (percutane punctiegroep) stierf na de ingreep. Alle andere dieren hervatten postoperatief hun normale voedings- en activiteitspatronen en overleefden gedurende de hele experimentele periode. Er werd geen langdurige bloeding of infectie waargenomen op de operatieplaatsen.

Beoordeling van sterfte en algemene toestand
Het sterftecijfer was 0% voor zowel groe...

Discussie

De bevindingen van deze studie geven aan dat zowel percutane als transretroperitoneale punctiebenaderingen effectief zijn bij het induceren van tussenwervelschijfdegeneratie (IVDD) in konijnenmodellen. Met name op basis van een uitgebreide evaluatie van de algemene toestand, mortaliteit, histopathologische beoordeling, TUNEL-test en serum TGF-β-spiegels, resulteerde het transretroperitoneale punctiemodel in uitgebreidere degeneratieve veranderingen in de tussenwervelschijven met behoud v...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.3 T Veterinary Maenetic Resonance lmaging(MRI)	NINGBO CHUANSHANJIA	CSJ-MR
Alcohol medical	LIRCON	20230107
Benzylpenicillin potassium	Jiangxi Keda Animal Pharmaceutical	140051251
Haemostatic forceps	SHINVA	20211239
Injection syringe	CONPUVON	20153151307
Knife blades	Hons Medincal	20210615
Medical absorbent cotton ball	Cofoe	20210006
Medical suture needle	Shanghai Xiaoyi Medical Devices	20192020430
Medullo-puncture needle	Yangzhou Jiangzhou Medical Devices	20190902	Gebruikt om de lumbale schijf te puncteren
Physiological saline	NeilMed	C1210504D2
Povidone iodine solution	Sichuan IJIS Medical Technology	20221209
Quasi-microbalance	Explorer
Rabbit dissection operating table	Zhenhua Biomedical	ZH-BXT-3Z
Shaver	AUX
Statistical analysis software	IBM	SPSS
Sterile gauze	Cofoe	20202140675
Surgical gloves	DR.LERSH	20172140028
Surgical knife	Hons Medinca	20210019
Surgical tweezers	SHINVA	20210233
USB-C data transmission line	KINI
White light photography microscope	Nikon	Eclipse Ci-L