GC-MS Analyse van deuteriumverrijking van retinol in serum en schatting van de totale lichaamsvoorraden van vitamine A

Samenvatting

Deze methode omvat het extraheren van retinol uit serum, het scheiden met behulp van HPLC en het bepalen van gelabelde en niet-gelabelde retinolisotopen met behulp van GC-MS. De verhouding tussen gelabelde en niet-gelabelde retinol wordt gebruikt om de totale lichaamsvoorraden vitamine A te schatten.

Samenvatting

Deze methode beschrijft de bepaling van de deuteriumverrijking van retinol in serum en de schatting van de vitamine A-voorraden in het lichaam. Het proces omvat het extraheren van retinol uit 0,4 ml serum met behulp van 0,5 ml 0,85% zoutoplossing, 100 μl interne standaardoplossing en 5 ml chloroform-methanol (2:1 v/v) oplossing. Na centrifugatie en verwijdering van de onderste chloroformlaag wordt het mengsel onder stikstof gedroogd en opnieuw gesuspendeerd in 0,1 ml ethanol, en wordt de retinolfractie gescheiden van andere bestanddelen met behulp van een HPLC-systeem dat is uitgerust met een PE C18-kolom. De retinolfractie kan handmatig of met een fractiecollector worden verzameld. Vervolgens wordt de retinolfractie gedroogd onder stikstof en gederivatiseerd met O-bis(trimethylsilyl)trifluoracetamide (BSTFA) dat 10% trimethylchloorsilaan bevat. Ten slotte worden gelabelde en niet-gelabelde retinolisotopen gekwantificeerd met behulp van een GC-MS-systeem dat is uitgerust met een 19091z-431 HP-1 methylsiloxaancapillaire kolom, waarbij gebruik wordt gemaakt van negatieve chemische ionisatie door elektronenvangst met helium als draaggas en methaan als ionisatiemiddel. De verhouding tussen gelabelde en niet-gelabelde retinol wordt vervolgens gebruikt in de Olson-, Green- of massabalansvergelijkingen om vitamine A-voorraden te schatten.

Inleiding

Vitamine A is een essentiële voedingsstof die nodig is voor het visuele systeem en het behoud van de celfunctie voor groei, epitheliale integriteit, productie van rode bloedcellen, immuniteit en voortplanting¹. Vitamine A-tekort is wereldwijd een ernstig probleem voor de volksgezondheid en treft meer dan 100 landen. Het heeft een onevenredige impact op jonge kinderen en zwangere vrouwen in lage-inkomenslanden. Wereldwijd lijden ongeveer 190 miljoen kinderen aan een vitamine A-tekort, waardoor het een cruciaal probleem is voor de volksgezondheid en de ontwikkeling van kinderen².

Als reactie op deze situatie zijn in veel lage-inkomenslanden al tientallen jaren verschillende programma's geïmplementeerd, waaronder vitamine A-suppletie met tweejaarlijkse distributie van hoge doses vitamine A aan kinderen jonger dan 5 jaar en vitamine A-verrijking van bepaalde voedingsproducten. Deze interventies overlappen elkaar echter vaak, waardoor sommige populaties worden blootgesteld aan onbedoelde chronische overmatige vitamine A-inname ^3,4. Dit dubbele risico op tekort en overmaat benadrukt de noodzaak van een biomarker die de vitamine A-status over het volledige spectrum nauwkeurig kan beoordelen, van tekort tot toxiciteit, om de evaluatie van het programma te begeleiden.

Vitamine A-biomarkers zijn cruciaal voor het beoordelen van de voedingsstatus. De meest gebruikte biomarkers zijn serumconcentraties van retinol en retinolbindend eiwit (RBP). Het is echter belangrijk op te merken dat deze biomarkers tijdelijk kunnen worden onderdrukt door infecties en ontstekingen, wat de specificiteit van vitamine A-beoordelingen in bepaalde populaties kan verlagen ^5,6,7.

Hoewel leverbiopsie of autopsiemonsters worden beschouwd als de gouden standaard voor het beoordelen van de vitamine A-status, is de meest gevoelige indirecte indicator van de totale vitamine A-reserves in de lever de retinolisotopenverdunning (RID) methode⁸. RID geeft een kwantitatieve schatting van de vitamine A-status over het volledige spectrum, variërend van deficiënte tot overmatige voorraden⁹. In de meeste onderzoekstoepassingen omvat de RID-methode het toedienen van een orale dosis deuterium (²H) of ¹³C-gelabeld retinylacetaat, dat vervolgens gedurende een periode van 14 tot 21 dagen wordt gemengd met lichaamsvoorraden. Na deze periode wordt een bloedmonster afgenomen en wordt het serum bewaard bij -80 °C. De verhouding tussen gelabeld en totaal retinol wordt vervolgens geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie om vitamine A-voorraden¹⁰ te schatten, met behulp van de Olson-vergelijking¹¹, de massabalansvergelijking¹² of de groene vergelijking¹³. Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, is geldig voor de toediening van deuterium (²H)- of ¹³C-gelabeld retinylacetaat en is gebaseerd op het werk van Tang et ^al.14. Het algemene doel van deze methode is het nauwkeurig beoordelen en bewaken van de vitamine A-status in het lichaam¹¹. Het is een krachtige methode die een kwantitatieve schatting geeft van vitamine A-concentraties over een breed spectrum van statussen, van tekort tot meer^{dan 15}. Het is nauwkeuriger en preciezer dan andere methoden, die vaak gebaseerd zijn op indirecte maatregelen⁹.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Ministerie van Volksgezondheid (nr. 2015/02/550/CE/CNERSH/SP) en er werd geïnformeerde toestemming verkregen van ouders/voogden.

OPMERKING: Omdat vitamine A lichtgevoelig is, is het van cruciaal belang dat alle procedures worden uitgevoerd bij weinig licht of onder gouden tl-verlichting¹⁶. De gebruikte materialen worden gedetailleerd beschreven in de materiaaltabel.

1. Bereiding van reagentia

1. Natriumchloride (0,85% g/v): Los 0,85 g NaCl op in gedestilleerd water in een maatkolf van 100 ml. Vul tot de maatstreep met gedestilleerd water en meng.
2. Chloroform-methanol (2:1 v/v): Breng 300 ml chloroform over in een maatkolf van 500 ml met een maatcilinder. Voeg 150 ml methanol toe en meng.
3. Mobiele fase A voor HPLC: acetonitril/tetrahydrofuraan/ultrapuur water (50/20/30, v/v/v): breng 500 ml acetonitril over in een maatkolf van 1000 ml. Voeg 200 ml tetrahydrofuraan en 300 ml water toe. Meng de oplossing, filtreer deze met behulp van een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm en sonificeer (amplitude 100%, frequentie 40 kHz en duur 15 min).
4. Mobiele fase B voor HPLC: Acetonitril/tetrahydrofuraan/ultrapuur water (50/44/6, v/v/v): Breng 500 ml acetonitril over in een maatkolf van 1000 ml. Voeg 440 ml tetrahydrofuraan en 60 ml water toe. Meng de oplossing, filtreer deze met behulp van een membraanfilter met een poriegrootte van 0,45 μm en consocaat.

2. Bereiding van standaardoplossingen

1. Bereid de stockoplossing door 40 mg van de standaard in ethanol op te lossen in een maatkolf van 100 ml, zoals aangegeven in tabel 1. Vul tot de maatstreep met het oplosmiddel en meng grondig.
2. Verdunde voorraadoplossingen: Bereid de verdunde voorraadoplossing door 1 ml van de voorraadoplossing over te brengen in een maatkolf van 50 ml, zoals aangegeven in tabel 2. Vul tot de maatstreep met het juiste oplosmiddel en meng grondig.
3. Bepaling van de concentratie van verdunde stamoplossingen: Breng een hoeveelheid (1 ml) van de verdunde oplossing in een kwartsbuis en meet de absorptie ervan in de spectrofotometer bij de gespecificeerde golflengte (tabel 3) met ethanol als blanco. Bereken de aan de hand van de Lambert-Beer Wet¹⁷. Zorg ervoor dat de spectrofotometer vóór de analyse is gekalibreerd door het instrument 15-30 minuten op te warmen, de gewenste golflengte te selecteren en het instrument op nul te zetten door de blanco in de monsterhouder te plaatsen. Bereken de concentratie met behulp van de volgende formule:
   Concentratie = (absorptie-/absorptiecoëfficiënt) x 10⁶ (μg/dL)
   OPMERKING: Om waarden van conventionele eenheden (μg/dL) om te rekenen naar SI-eenheden (μmol/L), vermenigvuldigt u de conventionele waarde met de volgende conversiefactoren: 0.0304 voor retinylacetaat en 0.0349 voor retinol¹⁸.
4. Bereiding van de werkstandaarden: Breng met behulp van een volumetrische pipet 2 ml van de verdunde papieroplossingen over in een erlenmeyer van 100 ml. Vul de kolf tot aan de schaalverdeling met ethanol, meng goed en sluit af met een stop.
   1. Om de exacte concentratie van elke oplossing te bepalen, beoordeelt u de zuiverheid van elk onderdeel met behulp van HPLC dat is uitgerust met een C18-kolom en een diode-array-detector die is ingesteld op 340 nm. Programmeer de pomp om Mobiele Fase A en Mobiele Fase B te gebruiken volgens het schema dat wordt weergegeven in Tabel 4. Zorg ervoor dat het HPLC-systeem vóór de analyse is gekalibreerd door verschillende componenten te valideren, zoals de pomp, detector, autosampler en de prestaties van het hele systeem.
   2. Breng 1 ml van de verdunde voorraadoplossingen over in krimpflacons en injecteer de monsters volgens de normale procedure in het HPLC-systeem. Bepaal de zuiverheid met behulp van de volgende vergelijking:
      
      VERGELIJKING 1
      Bereken met deze correctie voor zuiverheid de exacte concentratie van de verschillende componenten in de standaardoplossing.
5. Bereiding van interne standaard (retinylacetaat OD ~ 0,2): Breng met behulp van een volumetrische pipet 30 ml van de retinylacetaatwerkstandaard over in een conische kolf van 100 ml. Vul de kolf tot aan de schaalverdeling met ethanol, meng goed en sluit af met een stop.
6. Bereiding van werkoplossingen: Voeg 20 μg niet-gelabelde retinol toe aan 10,00, 3,33, 1,00, 0,33 en 0,00 μg gelabelde retinol om gelabelde en niet-gelabelde retinolverhoudingen van 0,500, 0,167, 0,050, 0,0167 en 0,00 te verkrijgen.

3. Analyse van monsters

OPMERKING: De serummonsters die in dit onderzoek zijn gebruikt, werden op de 14e^{dag verzameld} bij kinderen die een orale dosis (2 mg retinol-equivalenten) D8-retinol kregen als onderdeel van een onderzoek dat is opgezet om de vitamine A-status van kinderen in Kameroen te controleren en te beoordelen.

1. Extractie van retinoïden in serum: Deze extractie is gebaseerd op het werk van Folch et ^al.19 zoals gemodificeerd door Tang et ^al.14. Volg de stappen die hieronder worden beschreven.
   1. Laat ingevroren serummonsters vóór de analyse voorzichtig ontdooien bij kamertemperatuur (20-25 °C). Doseer 400 μl serum in een wegwerpkweekbuis van 16 x 100 mm. Voeg 500 μl 0,85% zoutoplossing plus 100 μl interne standaard en 5 ml chloroform-methanol (2:1 v/v) oplossing toe.
   2. Vortex gedurende 30 s en centrifugeren bij 1157 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder met behulp van een glazen pasteurpipet voorzichtig de chloroform onderlaag op een wegwerpkweekbuis van 13 x 100 mm. Droog onder stikstofgas in een waterbad (40 °C) en suspendeer het residu in 100 μL ethanol. Vortex en sonicaat gedurende 30 s. Breng het monster over in een krimpflacon met een inzetstuk, sluit het putje en etiketteer. Het monster is klaar voor HPLC-retinolverzameling.
2. Voer HPLC-retinolverzameling uit zoals hieronder beschreven.
   1. Injecteer 70 μl van elk serummonster in een HPLC-systeem dat is uitgerust met een C18-kolom en een diode-array-detector die is ingesteld op 340 nm. Programmeer de pomp om mobiele fasen A en B te leveren met een constant debiet van 1 ml/min, volgens het schema weergegeven in tabel 4.
   2. Voordat de serummonsters worden geïnjecteerd, injecteert u 70 μl van de retinolwerkoplossing in het HPLC-systeem en registreert u de retentietijd van de retinolpiek. Stel vervolgens de fractiecollector in om de geëlueerde retinolfractie binnen een bepaald bereik op te vangen in een buis van 5 ml met een stop van geslepen glas. In dit geval werd de retinolfractie verzameld over een interval van 3 minuten, van 7,5-10,5 minuten.
      OPMERKING: De concentratie retinol kan in deze stap ook worden berekend door gebruik te maken van een kalibratiecurve van retinolstandaarden en het herstelpercentage dat is verkregen uit de interne standaard.
3. Voer de derivatisering van retinol uit zoals hieronder beschreven.
   1. Droog de retinolfractie uit HPLC onder stikstofgas in een waterbad bij 40 °C gedurende ten minste 3 uur. Voeg ethanol toe om de verdamping van vocht tijdens het drogen te vergemakkelijken (monsters moeten volledig droog zijn, omdat de derivatisering vochtgevoelig is). Voeg 20 μL BSTFA met 10% TMCS toe aan de buis.
   2. Plaats de buis in een droge blokverwarmer die is ingesteld op 70 °C en incubeer gedurende 30 minuten. Breng het reactiemengsel met behulp van een glazen pasteurpipet over in een krimpflacon met een inzetstuk, sluit het goed af met een krimpdop met een dopkrimper en etiketteert. Het monster is nu klaar voor GC/MS-analyse en kan tot analyse in een exsiccator bij 4 °C worden bewaard.
   3. Droog bovendien een set van 100 μL werkende standaardoplossingen en derivatiseer zoals hierboven beschreven om de GC/MS te kalibreren.
      OPMERKING: De derivatisering van retinol met behulp van BSTFA omvat een chemische reactie waarbij de hydroxylgroep (-OH) van retinol wordt vervangen door trimethylsilylgroep (-Si(CH₃)₃), waardoor retinyltrimethylsilylether wordt gevormd. Dit proces verbetert de vluchtigheid en stabiliteit van retinol, waardoor het geschikter wordt voor GC/MS-analyse²⁰.
4. GC/MS-analyse: GC/MS-analyse wordt uitgevoerd met behulp van de procedure beschreven door Tang et ^al.14. Volg de stappen die hieronder worden beschreven.
   1. Injecteer 3 μL van het afgeleide retinolmonster met behulp van een autosampler in de GC met een koele on-column injector die via een connector zonder dood volume is aangesloten op een 15 m x 0,25 mm binnendiameter gesmolten silica capillaire kolom gecoat met een DB-1 stationaire fase van 0,25 μm filmdikte.
   2. Programmeer de temperaturen van de kolomoven en de injector op de kolom om te stijgen van 50 °C naar 285 °C met een snelheid van 15 °C/min, en stel de temperatuur van de GC/MS-interface in op 285 °C. Gebruik helium als draaggas om het trimethylsilylderivaat van retinol gedurende ongeveer 12 minuten te elueren.
   3. Detecteer de GC-eluatie met een quadrupoolmassaspectrometer met behulp van 0,5 torr methaannegatieve ionenionisatie, met de ionenbrontemperatuur ingesteld op 150 °C. Stel de massaspectrometer in om tussen de 260 en 280 dalton te scannen.

4. Gegevensanalyse

1. Gebruik de GC/MS data-analysesoftware.
2. Extraheer alle gewenste ionen op basis van hun massa-tot-lading (m/z) verhoudingen, integreer het gebied van de piek (gebruik handmatige integratie om het begin- en eindpunt van de piek aan te passen) en breng de resultaten over naar een spreadsheetbestand.
   OPMERKING: Afhankelijk van de gebruikte isotoop zijn de gewenste ionen als volgt: 268-270 m/z voor natief retinol; 271-274 m/z voor [²H₄]-retinol; 278-280 m/z voor [¹³C]-retinol; en 276-280 m/z voor [²H₈]-retinol.
3. Bereken de som van de pieken voor gelabelde retinol (ΣD) door het piekoppervlak op m/z 274, 275, 276, 277 en 278 bij elkaar op te tellen. Bereken de som van de pieken voor niet-gelabelde retinol (ΣH) door het piekoppervlak bij m/z 268, 269 en 270 op te tellen.
4. Bereken de verrijking van gelabeld retinol (D) met behulp van de volgende vergelijking: D = ΣD/(ΣH + ΣD). Bereken de hoeveelheid niet-geëtiketteerde retinol (H) met behulp van de volgende vergelijking: H = 1 - D.
   OPMERKING: Gaschromatografie Electron Capture Negative Chemical Ionisation Mass Spectrometry van retinyltrimethylsilylether geeft geen moleculair ion maar een belangrijk fragmention bij m/z 268 tot 271 voor niet-gelabeld retinol, bij m/z 272 tot 275 voor D4-retinol en bij m/z 276 tot 280 voor D8-retinol¹⁴.
5. Om het systeem te besturen, berekent u een lineaire regressievergelijking tussen de gewichtsverhoudingen van de kalibratiestandaarden en de geïntegreerde gebieden voor gelabelde retinol en niet-gelabelde retinol.

5. Schatting van vitamine A-voorraden

OPMERKING: Met deze stap kan de vitamine A-status van een persoon worden beoordeeld.

1. Bereken de totale levervoorraden van vitamine A met behulp van de Olson-vergelijking¹¹
   Vitamine A Totale levervoorraden = F x Dosis x [S x a x (H/D - 1)]
   waarbij F een factor is voor de efficiëntie van absorptie en opslag van de oraal toegediende dosis (F = 0,50), Dosis is de hoeveelheid gelabelde vitamine A die oraal wordt toegediend (μmol), S is een factor die corrigeert voor de ongelijkheid van het plasma tot de leververhouding van gelabelde tot niet-gelabelde retinol (S = 0,65), a is een factor die corrigeert voor onomkeerbaar verlies van gelabelde vitamine A tijdens de mengperiode; in het bijzonder is a = ^e-kt, waarbij k de geschatte fractionele katabole snelheid van het systeem is (k = ln 2/32 dagen voor kinderen), en t de tijd, uitgedrukt in dagen sinds de dosis; D/H is de serumisotopenverhouding van gelabelde tot niet-gelabelde retinol, -1 corrigeert voor de bijdrage van de dosis gelabelde vitamine A aan de totale vitamine A-pool van het lichaam.
2. Gebruik voor het berekenen van de totale lichaamsvoorraden (TBS) van vitamine A de groene vergelijking¹³
   TBS = Fa × S × (1/SAp)
   waarbij Fa de fractie is van de oraal gelabelde dosis VA die op tijdstip t is geabsorbeerd en aangetroffen in de uitwisselbare opslagpools van het lichaam, en S de verhouding is tussen retinolspecifieke activiteit in serum en die in winkels op tijdstip t (voor kinderen, Fa × S = 0,642 na 14 dagen)²¹. SAp is de fractie van de dosis in serum per dosis μmol (d.w.z. [gelabelde retinol] / ([niet-gelabelde + gelabelde retinol] in serum) / orale dosis gelabelde retinol (μmol)).

Resultaten

De injectie van 3 μL van een afgeleid monster van een gedroogde oplossing met ongeveer 50 pM/μL calibranten (retinol en D 8-retinol) in de GC/MS toonde geen moleculair ion, maar vertoonde een belangrijk fragmention bij m/z 268 voor retinol (Figuur 1) en m/z 278 voor D_8-retinol (Figuur 2). Dit geeft aan dat de moleculaire ionen van retinyltrimethylsilylether, gevormd tijdens de derivatisering van retinol en D_8-retinol, niet stabiel zijn onder de ionisatieomstandigheden die worden gebruikt in GC/MS. Ze vallen uiteen in kleinere fragmenten, voornamelijk door alfa-splitsing. Dit veel voorkomende fragmentatiepatroon omvat het verbreken van de binding naast de trimethylsilylethergroep. De alfa-splitsing resulteert in het verlies van de trimethylsilylgroep (TMS, die een massa heeft van 73 Da) en een waterstofatoom, wat leidt tot een fragmention met een massa van 268 Da voor retinol en 278 Da voor D_8-retinol ²². Dit mechanisme helpt bij het identificeren en bevestigen van de aanwezigheid van retinol en zijn derivaten in het monster door de specifieke fragmentionen te analyseren die tijdens massaspectrometrie worden geproduceerd. Injectie van mengsels van retinol en D8-retinol toonde twee belangrijke fragmentionen bij m/z 268 voor retinol en m/z 276 voor D8-retinol (Figuur 3), wat de aanwezigheid van deze verbindingen in het monster aangeeft. De kalibratiecurve vertoonde een uitstekende lineariteit, zoals aangegeven door een hoge correlatiecoëfficiënt (figuur 4), wat aantoont dat de relatie tussen piekverhouding en gewichtsverhouding een zeer recht en voorspelbaar patroon vertoont.

De GC/MS-respons verkregen uit de injecties van serummonsters (serum van kinderen die een orale dosis van 2 mg retinolequivalenten van D8-retinol kregen; Figuur 5) toont de aanwezigheid van retinol en D8-retinol, waarbij de twee belangrijkste fragmentionen worden waargenomen bij m/z 268 en m/z 274. Resultaten verkregen na extractie van ionen en integratie van piekgebieden bij m/z 274, 275, 276, 277 en 278 voor D8-retinol en bij m/z 268, 269 en 270 voor niet-gelabelde retinol worden weergegeven in tabel 5. Deze resultaten moeten worden geïntegreerd in de Olson-vergelijking¹¹ of de Groene vergelijking¹³ om de vitamine A-voorraden in het lichaam te berekenen.

De stabiele isotopenverdunningstechniek biedt metingen van vitamine A-spiegels die niet met andere methoden kunnen worden verkregen, waardoor nauwkeurige beoordelingen van de vitamine A-status mogelijk zijn. Deze methode is waardevol voor voedingsstudies, klinische diagnostiek en epidemiologisch onderzoek.

Figuur 1: Chromatogram en massaspectrum van retinol. De figuur toont het gaschromatografie/methaan-elektronenvangst negatieve chemische ionisatie-massaspectrometriechromatogram (bovenpaneel) uit de analyse van de afgeleide retinolstandaard. Het onderste paneel is een massaspectrum met m/z 268 voor retinol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Chromatogram en massaspectrum van D8-retinol. De figuur toont het gaschromatografie/methaan-elektronenvangst negatieve chemische ionisatie-massaspectrometriechromatogram (bovenpaneel) uit de analyse van de afgeleide D8-retinolstandaard. Het onderste paneel is een massaspectrum met m/z 278 voor D8-retinol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Chromatogram en massaspectrum van een mengsel van retinol en D8-retinol. De figuur toont het gaschromatografie/methaan-elektronenvangst negatieve chemische ionisatie-massaspectrometriechromatogram (bovenpaneel) uit de analyse van een afgeleid mengsel van retinol- en D8-retinolstandaarden. Het onderste paneel is een massaspectrum met m/z 268 voor retinol en m/z 276 voor D8-retinol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Kalibratiecurve. Deze figuur illustreert de relatie tussen de GC/MS-respons en de concentratie van niet-gelabeld en gelabeld retinol. Het wordt beschreven door de vergelijking y = 9,8379x + 0,7019, waarbij y (de oppervlakteverhoudingen) de respons van het instrument vertegenwoordigt, 9,8379 de gevoeligheid, x (de gewichtsverhoudingen) de analytconcentratie vertegenwoordigt en 0,7019 het achtergrondsignaal is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Chromatogram en massaspectrum van het serummonster. Deze figuur illustreert het gaschromatografie/methaan-elektronenvangst negatieve chemische ionisatie-massaspectrometriechromatogram (bovenpaneel) uit de analyse van de afgeleide retinolfractie van serum. Het onderste paneel is een massaspectrum met m/z 274 voor D8-retinol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Standaard	Gewicht (mg)	Maatkolf (ml)	Oplosmiddel
Retinol	40	100	Ethanol
Retinylacetaat	40	100	Ethanol
Deuterium-gelabeld retinylacetaat	40	100	Ethanol

Tabel 1: Bereiding van de stockoplossing. Deze tabel laat zien hoe geconcentreerde oplossingen van retinol en deuterium-gelabeld retinylacetaat kunnen worden bereid, die vervolgens kunnen worden verdund tot lagere concentraties voor toekomstige experimenten.

Standaard	Voorraad oplossing (ml)	Maatkolf (ml)	Oplosmiddel
Retinol	1	50	Ethanol
Retinylacetaat	1	50	Ethanol
Deuterium-gelabeld retinylacetaat	1	50	Ethanol

Tabel 2: Bereiding van verdunde stamoplossingen. Deze tabel laat zien hoe u kant-en-klare oplossingen van retinol en deuterium-gelabeld retinylacetaat kunt bereiden.

Standaard	Golflengte (nm)	E1%1 cm
Retinol	325	1850
Retinylacetaat	326	1550

Tabel 3: Golflengte en E1% 1 cm (absorptiecoëfficiënt).

Tijd (min)	Debiet (ml/min)	Mobiele fase A (%)	Mobiele fase B (%)
0 – 6	1	100	0
6 – 13	1	100 → 50	0 → 50
13 - 18	1	50	50
18 - 20	1	50 → 0	50 → 100
20 - 28	1	0	100
28 - 29	1	0 → 100	100 → 0

Tabel 4: Tijdschema voor de mobiele fasen van HPLC. Deze tabel illustreert de geplande volgorde en duur van de verschillende fasen tijdens de HPLC-chromatografische run.

	SH	SD	D	H
Onderwerp 1	64030809	566089.7	0.008763	0.991237
Onderwerp 2	194354	43861.39	0.184125	0.815875
Onderwerp 3	793490	80179.28	0.091773	0.908227
Onderwerp 4	2002063	45286.7	0.02212	0.97788
Onderwerp 5	80999193	355980.7	0.004376	0.995624
Onderwerp 6	32196717.7	216152.7	0.006669	0.993331
Onderwerp 7	40905724.5	334818.1	0.008119	0.991881
Onderwerp 8	28336711.5	218924.1	0.007667	0.992333
Onderwerp 9	8695135.5	542077	0.058684	0.941316
Onderwerp 10	103260212	1717728	0.016363	0.983637
SH: som van de piekoppervlakte op m/z 268, 269 en 270
SD: som van de piekoppervlakte op m/z 274, 275, 276, 277 en 278
D: verrijking van gelabelde retinol
H: niveau van niet-gelabelde retinol

Tabel 5: Resultaten van GC/MS van afgeleide retinolfractie van serum. Deze tabel geeft de GC/MS-output weer die nodig is voor de berekening van de totale lichaamsopslag van vitamine A. H is de som van het piekgebied op m/z 268, 269 en 270; D is de som van het piekgebied op m/z 274, 275, 276, 277 en 278; D is de verrijking van gelabelde retinol; H is het niveau van niet-gelabelde retinol; TBS is vitamine A Total Body Store.

Discussie

De succesvolle implementatie van dit protocol is afhankelijk van de effectieve uitvoering van elke stap. Een goede voorbereiding van oplossingen en standaarden is cruciaal om ervoor te zorgen dat de verzamelde gegevens nauwkeurig en betrouwbaar zijn. De procedures die in het protocol worden beschreven, zijn in verschillende omgevingen getest en zijn geschikt voor het verkrijgen van oplossingen en normen die voldoen aan de doelstellingen van monsteranalyse.

De analyse van monsters begint met de extractie en scheiding van retinol in het serum. Het bewaren van serummonsters bij -80 °C tot analyse is essentieel om de afbraak van vitamine A te voorkomen. Bovendien is werken bij weinig licht noodzakelijk¹⁶. De HPLC-procedure die wordt gebruikt om de retinolfractie te verzamelen, is ontworpen om retinol te scheiden van andere vetoplosbare componenten om interferentie in het derivatiseringsproces te voorkomen. Het maakt het ook mogelijk om honderden monsters uit te voeren zonder de kolom te spoelen.

De retinolfractie die uit HPLC wordt verzameld, wordt gedurende 30 minuten gederivatiseerd met BSTFA bij 70 °C. De derivatiseringsstap is van cruciaal belang voor het verbeteren van de vluchtigheid van retinol en de detecteerbaarheid ervan bij GC-MS. Aangezien het gevoelig is voor water, is het van cruciaal belang om het monster volledig te drogen vóór de derivatisering en om voldoende tijd te geven om de derivatiseringsreactie te laten plaatsvinden vóór de GC-MS-analyse. Er werd opgemerkt dat het derivatiseringsproces met BSTFA zeer mild en efficiënt is in vergelijking met het proces met N-methyl-N-(tert-butyldimethylsilyl) trifluoracetamide (MTBSTFA)^23,24 en een zeer scherpe piek biedt voor afgeleide retinol, zonder residu- of achtergrondpieken in het gescande massabereik¹⁴. Afgeleide retinol in een afgesloten injectieflacon kan in een exsiccator gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard zonder afbraak¹⁴.

Voor de GC-MS-analyse is het van cruciaal belang om te zorgen voor een goede kalibratie en onderhoud van de kolom en om het injectievolume, de temperatuur en de stroomsnelheden te optimaliseren. De hier gebruikte omstandigheden met injectie op de kolom lieten goede en betrouwbare resultaten zien¹⁴. Tijdens GC-MS-analyse van gedeutereerde en niet-gelabelde retinol merkten Tang et ^al.14 op dat de pieken van gedeutereerde retinol zowel in de toegediende dosis als in het serum van proefpersonen die de dosis kregen, voorkwamen. Dit patroon werd niet gezien bij niet-gelabelde retinol. Daarom concludeerden ze dat de pieken van gedeutereerde retinol vooraf worden gevormd in de dosis en niet het gevolg zijn van fragmentatie in de massaspectrometer, wat suggereert dat de gedeutereerde retinol zijn structuur behoudt tijdens het metabolische proces, wat een betrouwbare marker is voor het volgen van retinol in biologische studies. De verrijking van gedeutereerde retinol in serum na toediening van 2 mg D8-retinol bij kinderen in de voorschoolse leeftijd begon na 7 uur toe te nemen en bereikte zijn hoogtepunt na 14 dagen, wat de kortere optimale bemonsteringstijd is²⁵. In 200 μl humaan serum is het minimaal detecteerbare percentage verrijking van retinol 0,01%, wat aantoont dat de methode gevoelig genoeg is om serummonsters te analyseren die zijn verzameld van proefpersonen met een breed scala aan vitamine A-statussen¹⁴.

Hoewel de hier gepresenteerde stabiele isotopenverdunningstechniek aanzienlijke voordelen biedt voor het beoordelen van de vitamine A-status, moet worden opgemerkt dat deze methode geavanceerde apparatuur en technische expertise vereist, waardoor het duur en minder toegankelijk is voor routinematig gebruik in veel omgevingen²⁶. Daarom is het essentieel om met deze beperking rekening te houden wanneer u van plan bent deze techniek te gebruiken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
13x100 mm disposable culture tubes		99445-13	PYREX  Disposable Rimless Culture Tubes
16x100 mm disposable culture tubes		99445-16	PYREX  Disposable Rimless Culture Tubes
24 Position N-EVAP Nitrogen Evaporator	Organomation Associates, Inc	11250	N-EVAP 112, Nitrogen Evaporator, with OA-SYS heating system
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	00687	Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%
Amber colored Crimp vials, 2 mL,		SU860033	Short thread autosampler vial, amber vial 11.6 x 32 mm
Analytical Balance	Mettler Toledo	30133525	Precision Balance MS303TS/00
C18 column	Perkin-Elmer Inc	2580195	Brownlee Pecosphere RA C18 Cartridge Column - 33 mm x 4.6 mm I.D., Pkg. 5
cap crimper	MilliporeSigma	Z114243	Hand-operated aluminum cap crimper O.D. 20 mm
Capillary column	J & W Scientific	122-1011	15 m × 0.25 mm i.d. fused silica capillary column coated with a DB-1 stationary phase of 0.25 mm film thickness
Centrifuge	Sigma 3-18KS
Chloroform	Sigma-Aldrich	528730	Chloroforme, HPLC grade, ≥ 99.9%
Conical Flasks: 100 mL,		4980016	Borosil Erlenmeyer Flasks Graduated Conical NM Borosilicate
Crimp caps with PTFE seal	Supelco	27455-U	Crimp seals with PTFE/silicone septa
D8-Retinyl acetate	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	DLM-2244-PK	Vitamin A acetate 3-4% cis (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%)
Dispenser for 1-10 mL	Gilson	F110103	DISPENSMAN Bottle-top Dispenser
Dry Block Heater	Grant		Grant QBH2 High Performance Digital Dry Block Heater
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	Ethyl alcohol, Pure, ≥ 99.5%, ACS reagent, 200 proof
GC-MS	Agilent		Agilent 7890 A Series Gas Chromatography with 5975C Mass Spectrometer System equipped with a 5975C inert XL EI/CI MSD/DS Turbo CI System, a 7693A Auto?injector Includes transfer turret and a 7693 sample Tray
Glass stoppered volumetric Flasks:  2000 mL		956854	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 100 mL		956849	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 1000 mL		956853	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 25 mL		956841	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 50 mL		956847	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 500 mL		956852	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Helium (highest purity)	Air Liquide		UN 1046 Helium compressed, Class 2.2
HPLC	Varian		Varian 940LC HPLC with fraction collector
Inserts for crimp vials, 5 mm, 175 μL,		AR0-4521-12	Verex insert, 5 mm Dia, 175 µl, clear, conical bottom, w/bottom spring
Measuring Cylinders: 100 mL		213902402	DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A
Measuring Cylinders: 250 mL		213903604	DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A
Methane (highest purity)	Air Liquide		UN1971 Methane compressed, Class 2.1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Methanol, suitable for HPLC, ≥ 99.9%
N, O-bis(trmethylsilyi)trifluoroacetamide (BSTFA) with 10% Trimethylchlorosilane (TMCS)	Thermo Scientific	043939.22
Nitrogen			Produced by Parker Balston NitroVap Generator
Pasteur Pipettes, glass,		13-678-20A	Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets
Quartz glass Cuvettes		EW-83301-12	Cole-Parmer Standard Single Quartz Cuvettes
Retinol	Sigma-Aldrich	17772	≥95.0% (HPLC), ~2700 U/mg
Retinyl acetate	Sigma-Aldrich	R0635	analytical standard grade
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Chlorure de sodium, ACS reagent, ≥ 99.0%
Spectrophotometer	Shimadzu		Uvmini-1240 UV-Vis Spectrophotometer
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	439215	Tetrahydrofurane, HPLC grade, ≥ 99.9%, inhibitor-free
Ultrasonic cleaner	Bransonic	CPX-952-339R	Branson CPX Bransonic Ultrasonic Bath
Volumetric Pipettes: 100-1000 µL		3123000063	Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.1
Volumetric Pipettes: 20-200 µL		3123000055	Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.0
Vortex mixer	Ika		Vortx Genius 3