Patch-clamp-technieken voor analyse van enkelvoudige endolysosomale blaasjes

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire blaasjes met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp-systeem. We illustreren de methode waarbij endolysosomen worden vergroot en deze blaasjes handmatig worden geïsoleerd. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.

Abstract

Endolysosomale ionkanalen zijn van cruciaal belang voor de endolysosomale ionen- en pH-homeostase, de regulering van de membraanpotentiaal en het transport van blaasjes. Het was echter een uitdaging om elektrofysiologisch toegang te krijgen tot deze kanalen in kleine intracellulaire blaasjes. De ontwikkeling van endolysosomale patch-clamp-technieken heeft een belangrijke rol gespeeld bij het overwinnen van deze barrière, waardoor de activiteit van ionenkanalen in endolysosomale membranen direct kan worden gemeten.

Vergeleken met bestaande vlakke patch-clamp-technieken, kan endolysosomale patch-clamp tegelijkertijd meerdere cellen registreren en gemakkelijk worden gecombineerd met andere meetmethoden. Handmatige bediening biedt het voordeel dat gerichte blaasjes worden gevisualiseerd. Het gaat ook in op de beperking van de onmisbare aanwezigheid van Ca²⁺ aan één kant van het endolysosomale membraan, waardoor de flexibiliteit van het experimentele ontwerp wordt vergroot. Door gebruik te maken van endolysosomale patch-clamp-technieken kunnen de ionkanaalactiviteit in endolysosomen direct worden gemeten en geanalyseerd.

Gezien het nauwe verband tussen de afwijkende functie van het endolysosomale ionkanaal en ziekten zoals neurodegeneratieve ziekten en stofwisselingsstoornissen, kan het onderzoeken en moduleren van deze kanalen nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen onthullen. Door de intracellulaire ionenbalans te herstellen, kunnen we gerelateerde ziekten verlichten of genezen. Daarom is deze techniek cruciaal voor het ontdekken van nieuwe medicijndoelen en het ontwikkelen van relevante medicijnen.

Introduction

Ionkanalen spelen een cruciale rol in tal van fysiologische processen. Hoewel ionkanalen aan het oppervlak veel aandacht hebben gekregen, wordt het belang van intracellulaire kanalen, met name die in endolysosomen, geleidelijk erkend. Het endolysosomale systeem bestaat uit multifunctionele, membraangebonden organellen die gespecialiseerd zijn in fundamentele cellulaire functies, waaronder recyclingendosomen (RE), vroege endosomen (EE), late endosomen (LE), lysosomen (LY) en hybride organellen met zowel endolysosomale als andere compartimentkenmerken, zoals fagosomen en autofagosomen.

EE, ook bekend als sort....

Protocol

1. Instrument instellen

1. Hardware
   OPMERKING: Zie figuur 1 voor een standaard elektrofysiologische opstelling.
   1. Bescherm de opstelling tegen interferentie van buitenaf met behulp van een tafel en een kooi van Faraday.
   2. Gebruik een omgekeerde microscoop met een micromanipulator om de micro-elektrode stabiel te positioneren.
   3. Stel een versterker in om de ontvangen signalen te verzamelen en te versterken.
   4. Gebruik een digitizer om de analoge signalen om te zetten in digitale signalen.
   5. Gebruik software voor gegevensverzameling en ....

Results

Het volgende beschrijft de huidige vormen die zijn waargenomen tijdens endolysomale patch-clamp-experimenten. Als de huidige vorm niet is zoals verwacht, kan dit te wijten zijn aan slecht contact of lekkage. Er kan een slecht contact optreden als de referentie-elektrode niet volledig in contact is met de badoplossing of als de pipetelektrode op het punt staat te breken. Lekkage kan optreden als er een opening is tussen de kamer en het dekglaasje waardoor vloeistof op de objectieflens of .......

Discussion

Elektrofysiologische experimentele opstellingen hebben vier belangrijke laboratoriumvereisten: i) omgeving: methoden om het monster gezond te houden; ii) optica: methoden om het monster te visualiseren; iii) mechanica: methoden om de micro-elektrode stabiel te positioneren; en iv) elektronica: methoden om het signaal te versterken en op te nemen.

Om endolysomale patch-clamp-experimenten met succes uit te voeren, zijn verschillende belangrijke stappen cruciaal........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOROSILICATE GLASS	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	O.D.:1.5 mm, I.D. 0.75 mm 10 cm length, with filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Inverted microscope IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 micropipette puller	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Quick Release Chamber	Warner instruments	641943	QR-40LP, for 25 mm Coverslips