Patch-clamp-technieken voor analyse van enkelvoudige endolysosomale blaasjes

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor het direct meten van ionkanaalactiviteit op intracellulaire blaasjes met behulp van een handmatig endolysosomaal patch-clamp-systeem. We illustreren de methode waarbij endolysosomen worden vergroot en deze blaasjes handmatig worden geïsoleerd. Deze aanpak zorgt ervoor dat onderzoekers de procedure nauwkeurig kunnen repliceren en toepassen.

Abstract

Endolysosomale ionkanalen zijn van cruciaal belang voor de endolysosomale ionen- en pH-homeostase, de regulering van de membraanpotentiaal en het transport van blaasjes. Het was echter een uitdaging om elektrofysiologisch toegang te krijgen tot deze kanalen in kleine intracellulaire blaasjes. De ontwikkeling van endolysosomale patch-clamp-technieken heeft een belangrijke rol gespeeld bij het overwinnen van deze barrière, waardoor de activiteit van ionenkanalen in endolysosomale membranen direct kan worden gemeten.

Vergeleken met bestaande vlakke patch-clamp-technieken, kan endolysosomale patch-clamp tegelijkertijd meerdere cellen registreren en gemakkelijk worden gecombineerd met andere meetmethoden. Handmatige bediening biedt het voordeel dat gerichte blaasjes worden gevisualiseerd. Het gaat ook in op de beperking van de onmisbare aanwezigheid van Ca²⁺ aan één kant van het endolysosomale membraan, waardoor de flexibiliteit van het experimentele ontwerp wordt vergroot. Door gebruik te maken van endolysosomale patch-clamp-technieken kunnen de ionkanaalactiviteit in endolysosomen direct worden gemeten en geanalyseerd.

Gezien het nauwe verband tussen de afwijkende functie van het endolysosomale ionkanaal en ziekten zoals neurodegeneratieve ziekten en stofwisselingsstoornissen, kan het onderzoeken en moduleren van deze kanalen nieuwe doelwitten voor geneesmiddelen onthullen. Door de intracellulaire ionenbalans te herstellen, kunnen we gerelateerde ziekten verlichten of genezen. Daarom is deze techniek cruciaal voor het ontdekken van nieuwe medicijndoelen en het ontwikkelen van relevante medicijnen.

Introduction

Ionkanalen spelen een cruciale rol in tal van fysiologische processen. Hoewel ionkanalen aan het oppervlak veel aandacht hebben gekregen, wordt het belang van intracellulaire kanalen, met name die in endolysosomen, geleidelijk erkend. Het endolysosomale systeem bestaat uit multifunctionele, membraangebonden organellen die gespecialiseerd zijn in fundamentele cellulaire functies, waaronder recyclingendosomen (RE), vroege endosomen (EE), late endosomen (LE), lysosomen (LY) en hybride organellen met zowel endolysosomale als andere compartimentkenmerken, zoals fagosomen en autofagosomen.

EE, ook bekend als sorteerendosomen (SE), is een van de eerdere bestemmingen voor materialen die uit het plasmamembraan (PM) zijn geïnternaliseerd. EE's zijn kritieke compartimenten die verantwoordelijk zijn voor het sorteren van vracht in verschillende endocytische routes, zoals de rijpingsroute naar LE/LY voor afbraak, de snelle recyclingroute terug naar de PM en de langzame recyclingroute waarbij het recyclingcompartiment of perifere RE betrokken is. Multivesiculaire lichamen (MVB's) afgeleid van endosomen zijn bolvormige compartimenten omgeven door een beperkend membraan, dat kan worden gevuld met intraluminale blaasjes (ILV's)¹. Om de normale functie van deze organellen te behouden, hebben ze membraanionkanalen nodig om de vesiculaire pH, osmolariteit en signaaltransductie te reguleren. Het meten van de activiteit van deze kanalen is echter niet eenvoudig.

Voor ionkanalen die zich op het plasmamembraan bevinden, is de patch-clamp-techniek die in de jaren 1970 is ontwikkeld, lange tijd de gouden standaardmethode^{geweest 2}. Het is echter een uitdaging gebleven om elektrofysiologisch toegang te krijgen tot kanalen in kleine intracellulaire blaasjes. Het toepassen van de gouden standaard voor het meten van ionkanalen op het plasmamembraan op die op intracellulaire organellen staat voor drie belangrijke uitdagingen. Ten eerste is de grootte van endolysosomen meestal erg klein (minder dan 1 μm in diameter), waardoor ze moeilijk waar te nemen en te isoleren zijn onder een microscoop en kleiner dan de openingsdiameter van typische glazen micropipetten, waardoor het experiment onbruikbaar wordt. Ten tweede vereist het isoleren van endolysosomen rechtstreeks uit doelcellen met behoud van de integriteit van organellen speciale vaardigheden. Ten derde, vanwege de afwezigheid van een cytoskelet in intracellulaire organellen, kan het een uitdaging zijn om een afdichting op het endolysosomale membraan in de patchpipet te vormen en deze vervolgens te scheuren om een volledige endolysosoomconfiguratie te bereiken, omdat het de structurele integriteit van het organel in gevaar brengt³.

Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om deze problemen op te lossen, waaronder opname van lipidedubbellagen, het wijzigen van lysosomale targetingsequenties en op vaste stoffen ondersteunde membraangebaseerde elektrofysiologie (SSM of SSME) technieken. De lipidedubbellaag-registratiemethode omvat het reconstrueren van synthetische fosfolipidemembranen met gezuiverde ionkanalen, waardoor een gedetailleerde elektrofysiologische studie van de membraaneiwitfunctie onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk is ^4,5. Het wijzigen van lysosomale targetingsequenties op ionkanalen omvat de omleiding van endolysosomale ionkanalen naar het plasmamembraan voor meting met behulp van conventionele patch-clamp-methoden⁶. Solid-supported membrane-based electrophysiology (SSM of SSME) technieken, ook bekend als de endolysomale vlakke patch-clamp-methode, maken gebruik van vlakke glaschips met een vast substraat en kleine openingen (<1 μm in diameter) in microgestructureerde vlakke borosilicaatchips. Deze glaschips met kleine opening maken de analyse van kleine, zelfs native, endolysosomen mogelijk met behulp van een drukzuigcontrolesysteem (Nanion). Bij de eerste twee methoden bevinden de ionenkanalen zich echter niet in hun natuurlijke fysiologische omgeving. Pogingen om lysosomale kanalen te registreren die tot expressie worden gebracht op het plasmamembraan of worden gereconstitueerd tot lipidedubbellagen, hebben grotendeels onzekere en tegenstrijdige resultaten opgeleverd.

Hoewel vlakke patch-clamp-technieken het probleem van kunstmatige interferentie effectief hebben aangepakt en het voordeel bieden van metingen met hoge doorvoer, worden de gebruikte oplossingen ook beperkt door deze methode. De endolysosomale patch-clamp-techniek die in dit artikel wordt geïntroduceerd, kan tegelijkertijd meerdere cellen registreren en gemakkelijk worden gecombineerd met andere meetmethoden. Handmatige bediening biedt het voordeel van het visualiseren van doelblaasjes. Het overwint ook de onvermijdelijke beperking van Ca²⁺ in de oplossing aan één kant van het endolysosomale membraan, waardoor de vrijheid van experimenteel ontwerp wordt vergroot³. Onlangs hebben endolysosomale patch-clamp-technieken een sleutelrol gespeeld in het onderzoek naar de ontwikkeling van geneesmiddelen. Bij neurodegeneratieve ziekten heeft deze techniek bijvoorbeeld geholpen bij het identificeren van nieuwe geneesmiddelen die gericht zijn op endolysosomale ionkanalen die verband houden met de ziekte van Alzheimer en Parkinson ^7,8. Onderzoekers kunnen deze techniek ook gebruiken om de rol van endolysosomale ionkanalen in tumorcellen⁹ te onderzoeken, waardoor de groei en proliferatie van tumoren worden gecontroleerd. Wat metabole ziekten betreft, onthullen endolysosomale patch-clamp-studies verbindingen die endolysosomale ionkanalen reguleren en nieuwe behandelingsbenaderingen bieden voor diabetes en obesitas. De endolysosomale patch-clamp-techniek helpt bij het begrijpen van endolysosomale disfunctie en het vinden van potentiële therapieën⁶, waardoor ons begrip van de functies van het endolysosomale ionkanaal aanzienlijk wordt vergroot en de ontdekking van nieuwe medicijndoelen wordt bevorderd.

Protocol

1. Instrument instellen

1. Hardware
   OPMERKING: Zie figuur 1 voor een standaard elektrofysiologische opstelling.
   1. Bescherm de opstelling tegen interferentie van buitenaf met behulp van een tafel en een kooi van Faraday.
   2. Gebruik een omgekeerde microscoop met een micromanipulator om de micro-elektrode stabiel te positioneren.
   3. Stel een versterker in om de ontvangen signalen te verzamelen en te versterken.
   4. Gebruik een digitizer om de analoge signalen om te zetten in digitale signalen.
   5. Gebruik software voor gegevensverzameling en -analyse om experimentele protocollen op te zetten en zinvolle, analyseerbare resultaten uit de verzamelde gegevens te halen.
2. Elektroden
   1. Gebruik twee elektroden: een badelektrode en een pipetelektrode.
      OPMERKING: Platina en zilverchloride hebben de beste polarisatie-eigenschappen. Zilverchloride-elektroden bestaan uit zilverdraad of pellets die zijn gechlorideerd, waardoor ze een AgCl-laag hebben op het buitenoppervlak van de draad of pellet (Figuur 2).
3. Bereiding van de pipet
   1. Trekken
      1. Installeer de capillaire buis in de trekker.
         OPMERKING: De onderstaande parameter die wordt gebruikt voor de fabricage van pipetten is instrumentspecifiek. Het instrument dat we in dit artikel hebben gebruikt, wordt vermeld in de materiaaltabel.
      2. Onder experimentele omstandigheden (kamertemperatuur 22 °C, doorlopende verwarmingsdraad, borosilicaatglas met gloeidraad) die de verwarmingsdraad niet doorbrandt, voert u een RAMP-test uit op de trekker om de warmtewaarde (HEAT) te bepalen die nodig is om het glascapillair te smelten.
      3. Ontwerp een nieuw trekprogramma met zes afzonderlijke trekcycli met behulp van de parameters HEAT, snelheid (VEL) en tijd (TIME) (Tabel 1).
         OPMERKING: WARMTE verwijst naar de parameter die de gloeidraad van de kachel verwarmt, waardoor de glasdraad kan smelten. Snelheid geeft de snelheid aan waarmee de trekker het filament in beide richtingen trekt. Tijd vertegenwoordigt de duur van het interval tussen elke cyclus.
      4. Druk op de groene trekknop op het toetsenbord.
      5. Draai de clampknop los en verwijder de pipetten uit de trekker.
      6. Inspecteer de pipetpunten onder het oculair van de microsmidse om de diameter, scherpte en geometrie van de punt te bepalen. Zorg ervoor dat de diameter van de punt 0.5-0.9 μm is.
         OPMERKING: Naarmate het filament vaker wordt gebruikt, zal de warmtewaarde die nodig is om het glascapillair te smelten veranderen.
      7. Als de tipgrootte niet aan de verwachtingen voldoet, pas dan de HEAT- en VEL-parameters aan. Hogere temperaturen en hogere snelheden zorgen voor fijnere, langere tips en vice versa. Pas de HEAT aan in stappen van 5 graden en de snelheid in stappen van 3.
   2. Polijsten
      1. Plaats de getrokken patchpipetten in de microsmidhouder.
      2. Inspecteer de pipetpunten met behulp van een 35x objectieflens (gecombineerd met een 15x oculair, resulterend in een vergroting van 525x ).
      3. Gebruik de micromanipulator om de patchpipetten dicht bij het filament te brengen.
      4. Zet de temperatuurknop op 80.
      5. Gebruik de voetschakelaar om de kachel aan te zetten en breng een korte warmtepuls (1 - 2 s) aan, waarbij u het polijstproces bewaakt via het microsmeedoculair.
      6. Herhaal het proces totdat alle pipetten gepolijst zijn.
      7. Plaats de voltooide pipetten in een afgesloten doos om te voorkomen dat er stof binnendringt.
         OPMERKING: Het doel is om de punt snel te smelten, zodat het glas de uiteindelijke geometrie van de punt vormt zonder deze te scherp te maken. Dit voorkomt dat de pipet het blaasjesmembraan binnendringt waartegen het wordt gedrukt en bevordert effectief de vorming van afdichtingen. Na de laatste polijsting moet het binnenste pad van de pipetpunt zeer smal, recht en lineair zijn.
         De beste opnamepipetten hebben doorgaans een weerstand van 5 - 8 MΩ na brandpolijsten. De diameter van de tipopening moet 2 μm zijn. Een perfect gepolijste patchpipet is essentieel voor een succesvolle gigasealvorming, aangezien dit een van de belangrijkste technieken is die cruciaal zijn voor het succes van de procedure.

2. Voorbereiding van het monster

1. Celcultuur (met HEK293 als voorbeeld)
   1. Kweek de cellen in een standaard bevochtigde broedmachine bij 37 °C met 5% CO₂ .
   2. Kweek de HEK293-cellen in DMEM met een laag glucosegehalte, aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine.
   3. Plaats de 12 mm dekglaasjes met poly-L-lysine in een plaat met 24 putjes.
2. Uitbreiding van organel
   1. Voeg 1 μM vacuoline-1 toe aan HEK293-cellen in de plaat met 24 putjes (uit stap 2.1) en incubeer 's nachts bij 37 °C met 5% CO₂ totdat vergrote blaasjes zich beginnen te vormen.
      OPMERKING: De grootte van de vergrote endolysosomen kan 1-10 μm bereiken, afhankelijk van het gereedschap, de verbinding, de incubatietijd en het celtype (Figuur 3 en Tabel 2).
3. Voorbereiding van de oplossing
   OPMERKING: De standaardbereiding van de oplossing is bedoeld om de ionische concentraties in de cel en organellen te simuleren. De standaardoplossingen voor het meten van ionenkanalen op lysosomen zijn bijvoorbeeld als volgt:
   1. Bereid badoplossing (in mM): 140 K-methaansulfonaat (MSA), 5 KOH, 4 NaCl, 0,39 CaCl₂, 1 EGTA, 10 HEPES. Pas de pH aan op 7,2 met KOH. Stel de osmolariteit in op 300 mosm/L met glucose.
   2. Bereid pipetoplossing (in mM): 140 Na-MSA, 5 K-MSA, 2 Ca-MSA, 1 CaCl₂, 10 HEPES, 10 MES. Pas de pH aan op 4,6 met MSA. Stel de osmolariteit in op 310 mosm/L met glucose.
      OPMERKING: Laat de oplossing door een filter van 0,2 μm lopen, bereid 45 ml aliquots in conische buizen van 50 ml en bewaar ze bij 4 °C gedurende maximaal 2-4 weken.

3. Organel isolatie

1. Verwijder een dekglaasje met behandelde cellen (zie rubriek 2) van de plaat met 24 putjes, breng het over naar de microscoopkamer en voeg 1 ml badoplossing toe.
   OPMERKING: Cellen mogen niet gedurende >1 uur in de badoplossing worden bewaard voor experimenten met volledige endolysomale patch-clamps waarbij endolysosoom wordt geïsoleerd, afgedicht en geregistreerd. Na 1 uur zullen de vergrote endolysosomen krimpen, zich aan de pipet hechten en moeilijk te isoleren worden.
2. Gebruik een zelfgemaakte plastic vulnaald om de isolatiepipet te vullen met pipetoplossing en installeer de pipet aan de voorkant van de patch-clamp-opstelling.
3. Stel de diagonale bewegingshoek van de micromanipulator in op bijna 30° (fabrieksinstelling).
4. Onderzoek onder de microscoop (40x objectief en 10x oculair) de cellen op voldoende vergrote endosomen of lysosomen die zich in de buurt van de celmembraanrand bevinden voor isolatie. Beweeg de isolatiepipet dicht bij de geselecteerde cel.
5. Laat de isolatiepipet met behulp van de micromanipulator zakken totdat deze de rand van het plasmamembraan raakt (Figuur 4). Beweeg de isolatiepipet snel horizontaal om een klein stukje van het plasmamembraan af te scheuren.
6. Druk met dezelfde pipet op de cel vanaf de andere kant om het endosoom/lysosomen uit te knijpen tot een afstand van ~2 μm van de cel.
   OPMERKING: Als er een resterend celmembraan op het organel zit, kan dit de vorming van een gigaseal voorkomen.
7. Onderzoek het geïsoleerde endolysosoom onder de microscoop.

4. Gigaseal-vorming

1. Vul een pas gepolijste patchpipet met de juiste pipetoplossing en installeer de pipet aan de voorkant van de ampverliezer.
2. Breng 20 - 50 mbar positieve druk aan op de pipet (of gebruik 0,03-0,05 ml uit een spuit van 1 ml voor drukregeling) en houd deze druk vast (vergrendel de klep).
   OPMERKING: 1 mbar (millibar) = 0,001 bar = 0,1 kPa (kilopascal) = 1 hPa (hectopascal) = 1.000 dyn/cm2.
3. Beweeg de pipetpunt in de badoplossing, in het midden van het gezichtsveld, om te bevestigen dat de druk hoog genoeg is om de vloeistof in de badoplossing te zien stromen.
4. Pas herhaalde stroompulsen (+5 mV; 5 ms) toe om de pipetweerstand, afdichtingsweerstand en serieweerstand te bepalen. Bewaak de grootte van de pipetpunt, de vorming van de afdichting en de vaststelling van de volledige endolysosomale configuratie.
5. Beweeg de pipet snel dicht bij de bovenkant van het doelblaasje. Breng de pipet in de buurt van het blaasje totdat het blaasje beweegt of rolt door de vloeistofstroom van de pipet (Figuur 5).
6. Stel de offset voltage van de pipet in op 0 mV. Laat de positieve druk onmiddellijk los. Idealiter wordt het blaasje naar de pipet getrokken en verbonden met het membraan, waardoor binnen 1 s een gigaseal (1-20 GΩ) wordt gevormd. Zoek naar een afname tot <10 pA van de stroomamplitude die wordt opgeroepen door de spanningspuls van 5 mV, wat wijst op een succesvolle gigasealvorming.
   OPMERKING: Stabiele positieve druk is essentieel voor de vorming van gigaseals. Soms kunnen lekken in de slang de vorming van gigasealers voorkomen. Het wordt aanbevolen om een manometer te gebruiken om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn. Als er een lek wordt gedetecteerd, bevestig dan de slang weer of breng een kleine hoeveelheid vaseline aan op de naden om de afdichting te verbeteren.

5. Huidige meting

1. Membraan breuk
   OPMERKING: Afhankelijk van de experimentele behoeften kan het elektrode-membraancontact worden onderverdeeld in vier modi: celgebonden modus, hele celmodus, inside-out-modus en outside-out-modus (Figuur 6).
   1. Gebruik voor de opname van het hele blaasje een korte hoogspanningspuls (ZAP-puls) van 200 μs of 500 μs om het membraan op het contactpunt tussen de pipet en het organel te breken. Stel de spanning in van -500 mV tot -1.200 mV en verlaag elke keer met 100 mV totdat het membraan wordt verstoord.
   2. Voor de inside-out-modus (opname met één kanaal) trekt u na het vormen van de gigaseal de pipet weg van het organel, scheurt u een klein stukje van het membraan af, waardoor de kant wordt blootgelegd die oorspronkelijk naar het lumen van het blaasje was gericht.
   3. Voor de outside-out-modus, na het vormen van de gigaseal en de overgang naar de hele blaasjesmodus, trekt u de pipet weg van het organel, scheurt u een klein stukje van het membraan af met behoud van een kleine vesiculaire structuur.
2. Huidige opname
   1. Registreer de stroom over het endolysosomale membraan terwijl de ingangsspanning varieert in endolysosomale spanningsklem patch-clamp-experimenten.
      1. Regel deze spanningen door spanningsstappen of spanningshellingen; gebruik een breed scala aan ingangsspanningen (bijv. -100 mV tot +100 mV) in endolysosomale spanningsklemexperimenten.

Results

Het volgende beschrijft de huidige vormen die zijn waargenomen tijdens endolysomale patch-clamp-experimenten. Als de huidige vorm niet is zoals verwacht, kan dit te wijten zijn aan slecht contact of lekkage. Er kan een slecht contact optreden als de referentie-elektrode niet volledig in contact is met de badoplossing of als de pipetelektrode op het punt staat te breken. Lekkage kan optreden als er een opening is tussen de kamer en het dekglaasje waardoor vloeistof op de objectieflens of ...

Discussion

Elektrofysiologische experimentele opstellingen hebben vier belangrijke laboratoriumvereisten: i) omgeving: methoden om het monster gezond te houden; ii) optica: methoden om het monster te visualiseren; iii) mechanica: methoden om de micro-elektrode stabiel te positioneren; en iv) elektronica: methoden om het signaal te versterken en op te nemen.

Om endolysomale patch-clamp-experimenten met succes uit te voeren, zijn verschillende belangrijke stappen cruciaal....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BOROSILICAAT GLAS	SUTTER INSTRUMENT	BF150-75-10	O.D.:1,5 mm, I.D. 0,75 mm 10 cm lengte, met filament
Digidata 1140A	Axon Instruments
Omgekeerd microscoop IX73	OLYMPUS
MODEL P-97 micropipet puller	SUTTER INSTRUMENT
MPC-200	SUTTER INSTRUMENT
MultiClamp 700B	Axon Instruments
POLISHER
Quick Release Chamber	Warner instruments	641943	QR-40LP, voor 25 mm dekglasjes