$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ontwerp van het podium en de rekpaal (Figuur 1)
- Ontwerp een rekpaal die qua afmeting compatibel is met de grootte van het podium/de houders en de objectiefconfiguratie. De twee specifieke rekpalen worden weergegeven in figuur 1A,D.
OPMERKING: De FreeCAD-bestanden in dit protocol (aanvullende map 1) zijn compatibel met de volgende Nikon-microscopen en -trappen: Eclipse Ni-E rechtop uitgerust met een NI-SH-E-tafel en Eclipse Ti-E/B omgekeerd uitgerust met een TI-S-ER-trap, Afbeelding 1D. De paal kan driedimensionaal (3D) worden geprint, maar kan na herhaald gebruik vervormen; Palen op basis van aluminium zullen dit nadeel niet ondervinden. Zorg ervoor dat u palen op basis van aluminium anodiseert om oxidatie te voorkomen. Rechtopstaande configuratie zorgt voor een grotere bewegingsamplitude. Bovendien zorgt een rechtopstaande configuratie voor directe beeldvorming van het monster zonder interface, wat optisch gunstig is in het geval van het vervormbare PDMS-membraansubstraat. In plaats daarvan gaat de verlichtingsstraal in een omgekeerde configuratie door het PDMS-membraan (Figuur 1F); aangezien bij het uitrekken het PDMS-membraan zal bewegen, moeten de onderdompelingsmedia voor het doel zorgvuldig worden gekozen (aanbevolen soorten onderdompeling in water, lucht of glycerol; onderdompeling in olie wordt niet aanbevolen vanwege incompatibiliteit met PDMS-substraten). Commerciële houders kunnen worden aangepast met behulp van extra schroefgaten; pas op voor het gebruik van een plastic schroef of een schroef op basis van teflon om stof te voorkomen tijdens het schroeven. Het kan handig zijn om een houder te ontwerpen waarmee de rekpaal bovenop het podium kan worden gemonteerd, zoals weergegeven in Figuur 1E. Het FreeCAD-bestand in dit protocol is compatibel met de tafel van een Eclipse Ni-E rechtopstaande microscoop.
- Ontwerp rekringen (Figuur 1C) die qua grootte compatibel zijn met de rekpaal (Figuur 1A,B). De FreeCAD-bestanden in dit protocol zijn compatibel met de bijbehorende palen (om de ringen te bedekken tijdens het hanteren van monsters, kan hun diameter worden gekozen om compatibel te zijn met de grootte van een petrischaal).
OPMERKING: De ring kan ook op aluminiumbasis (geanodiseerd) of 3D-geprint zijn. Voeg pakkingen met voldoende diameter toe om de rekpaal en ringen vacuüm af te dichten.
- Optioneel: Fabriceer een vacuümcontroller. Een elektrische kaart van de vacuümschakelkast die in dit protocol wordt gebruikt, vindt u in aanvullende informatie (zie aanvullende map 2). Hiermee kan het vacuümniveau dat op het rekapparaat wordt toegepast, handmatig worden geregeld.
OPMERKING: Commerciële vacuümcontrollers kunnen ook vergelijkbare functies bieden en kunnen meestal worden vergezeld door besturingssoftware die de toepassing van verschillende signaaltypen mogelijk maakt (sinusvormig, driehoekig, enz.) (Fluigent, Kobalt).
2. Fabricage van het rekbare membraan
- Ontwerp ronde platen (aanbevolen materiaal: polymethacrylaat, PMMA). Zorg ervoor dat deze platen breder zijn dan de ringen en qua grootte compatibel zijn met de spin coater (Figuur 2A). Zie Tabel 1 voor voorgestelde afmetingen en Aanvullende Map 3.
LET OP: Voor paal 1 is een diameter van 12 cm gebruikt; voor paal 2, een diameter van 18-21 cm. Voor en tussen elk gebruik moeten de platen zorgvuldig worden gereinigd met niet-geweven doekjes en 96% ethanol. Het is belangrijk om PDMS-ophoping in de platen, maar ook aan de randen en eronder te voorkomen.
- Bereid PDMS 1:10 voor en meng goed om een zeer homogene emulsie te verkrijgen (gebruik aanbevolen roerlepels).
OPMERKING: Bereid voor 12 cm 4,5 g per bord; voor borden van 18 cm, 8 g per bord. Voor het bereiden van meerdere platen bereidt u extra PDMS voor, bijvoorbeeld 10 ml meer dan nodig is voor 10 platen. Bereid voor 10 borden van 12 cm 50 g component A en 5 g component B voor. Het is handig om grote recipiënten te gebruiken om gemakkelijk te pipetteren. De houder mag geen stof of ander vuil bevatten dat het goed centrifugeren en uitharden van PDMS zou kunnen belemmeren. Gebruik handschoenen van compatibel materiaal (vermijd latex; vinylhandschoenen zijn geschikt) om PDMS-uitharding te garanderen.
- Ontgas minimaal 1 uur met behulp van een vacuümkamer.
OPMERKING: Als alternatief kan het PDMS gedurende 5 minuten worden gecentrifugeerd bij 0.2 × g met behulp van een buis van 50 ml, maar houd er rekening mee dat het ingewikkeld is om het PDMS-mengsel uit een buis op te zuigen met de doseerspuit (nodig voor stap 2.4). Ontgas niet te lang (niet meer dan 2 uur) met direct licht om voorharding van PDMS te voorkomen.
- PDMS spin-coating bovenop de PMMA-platen
- Doseer 4,2 ml of 7,5 ml ontgaste PDMS bovenop de PMMA-platen.
- Spin-coat de platen met behulp van de volgende aanbevolen instellingen:
- Draailaag gedurende 5 s bij 500 tpm met een acceleratie van 100 tpm/s.
- Centrifugeer de laag gedurende 1 minuut bij 500 tpm met een acceleratie van 300 tpm/s.
OPMERKING: Het kan handig zijn om het midden van de PMMA-plaat aan de onderkant te markeren om ervoor te zorgen dat de platen tijdens het centrifugeren en homogeen centrifugeren worden gecentreerd. Stap 2.4.2.1 is niet verplicht, vooral als de versnellingsparameter niet kan worden aangepast; het helpt de PDMS te verspreiden voordat het draait. Dit protocol levert PDMS-membranen op met een dikte van ongeveer 140 μm (gemeten met interferometrie; zie aanvullende figuur 1 en tabel 2). Kalibraties moeten voorafgaand aan experimenten worden uitgevoerd voor het geval het spincoatermodel of de parameters tot verschillende membraankenmerken leiden.
- Bewaar elke plaat in een petrischaal om stofophoping te voorkomen en polymeriseer een nacht bij 65 °C in de oven.
OPMERKING: Pas op voor het gebruik van temperatuurbestendige gerechten. De uithardingstoestand heeft invloed op de PDMS-vervormbaarheid voor een bepaald toegepast vacuümniveau.
3. Membraan sandwichen in ringen
- Ontwerp van het bevestigingsmateriaal.
- Ontwerp PMMA-ringen met een inwendige/uitwendige diameter om het spin-coated PDMS cirkelvormige membraan te leggen (Figuur 2A). Zie de voorgestelde afmetingen in Tabel 1 en Aanvullende Map 3.
- Ontwerp een montagesteun (Figuur 2B) waarop de ring past, en de hoogte bepaalt ook de voorrek bij het monteren van het membraan in de ring.
NOTITIE: De montagesteun kan een eenvoudige oplossing zijn op basis van bestaand laboratoriummateriaal (bijv. een petrischaaltje). Een elegantere oplossing is om de steun 3D-te printen (zie FreeCAD-bestand van dit onderdeel in dit protocol, zie aanvullende map 3), omdat de hoogte door de gebruiker kan worden gedefinieerd en gemakkelijk kan worden gevarieerd (in dit protocol werd een hoogte van 10 mm gebruikt voor de kleine ringen). De hoogte van het middendeel van de steun moet kleiner worden gekozen dan de hoogte van de halve ring, zodat het PDMS-substraat de steun niet raakt bij de montage (zie verder gebruik in stap 3.4.2). Een 3D-printer met polymelkzuur (PLA) filamenten (zie Materiaaltabel) is hiervoor geschikt. Er kan ook een snijring worden ontworpen, ook 3D-geprint, om als geleider voor het scalpel te dienen (Figuur 2A).
- Ontwerp en fabriceer messing gewichten die qua grootte compatibel zijn om gewicht uit te oefenen op de ring tijdens het monteren van het membraan (Figuur 2C) en te leiden tot reproduceerbare voorspanning.
OPMERKING: De FreeCAD-bestanden die hier worden verstrekt (zie aanvullende map 3) komen overeen met de ringafmetingen die in dit protocol worden gepresenteerd.
- Verwijder het PDMS-membraan van de PMMA-plaat.
- Bereid PMMA-ringen voor op een vel wit bankpapier.
OPMERKING: Het is belangrijk dat de bank en het papier plat blijven om te voorkomen dat het papier tijdens het monteren in aanraking komt met het PDMS-membraan.
- Ga voorzichtig met een mes langs de rand van de plaat (een of twee keer) en trek vervolgens dezelfde rand over met een scherp pincet om ervoor te zorgen dat het PDMS over de hele omtrek een zuivere snede heeft (Figuur 2A).
- Gebruik een pincet om het membraan voorzichtig aan één kant op te tillen. Trek vervolgens voorzichtig met de duimen de rand van het PDMS-vel af om het membraan gelijkmatig aan de rand op te tillen. Maak de rand van het membraan los van de plaat langs de helft van de plaatomtrek (Figuur 2A).
OPMERKING: Door enkele druppels 96% ethanol onder het PDMS-membraan te gieten, wordt het membraan opgetild zonder het te breken.
- Droog het PDMS-membraan.
- Veeg 96% ethanol rond het hele bovenoppervlak van de eerder voorbereide PMMA-ring (stap 3.2.1) en gebruik de vingers om het gelijkmatig te verdelen.
- Verwijder voorzichtig het PDMS-membraan, til het op van de eerder opgetilde rand (uitgelegd in stap 3.2.3) en plaats het symmetrisch op de met ethanol bedekte PMMA-ring. Verwijder eventuele rimpels uit het PDMS, maar zorg ervoor dat u het membraan niet uitrekt; Maak het alleen recht.
OPMERKING: Het toepassen van voorrek in dit stadium heeft invloed op de PDMS-vervormbaarheid voor een bepaald toegepast vacuümniveau.
- Zodra de ethanol volledig is opgedroogd, moet u ervoor zorgen dat het PDMS-membraan stevig aan de PMMA-ring vastzit.
- Zet de rekring in elkaar.
- Neem nog een lege PMMA-ring. Plaats het bovenop de montagering en gebruik metalen clips om ze aan elkaar af te dichten, waarbij u het PDMS-membraan tussen de twee ringen klemt (PDMS-membraansandwich, afbeelding 2B).
- Plaats de onderste helft van de rekring op de montagesteun die is ontworpen in stap 3.1.2 (Figuur 2B).
- Plaats de PDMS-ringsandwich op de stretchring en duw deze stevig naar beneden totdat deze helemaal naar beneden reikt. Het PDMS-substraat raakt de montagesteun niet. Zet de pakking vast in de juiste positie (Figuur 2B).
- Plaats de ronde messing gewichten op het monster (Figuur 2C). Deze past een vaste voorspanning toe die vergelijkbaar is met die van alle gemonteerde ringen, wat zorgt voor een verdere reproduceerbaarheid bij het kalibreren van het systeem.
- Plaats de bovenste helft van de metalen rekring erop, met de schroefgaten uitgelijnd, plaats alle schroeven en draai ze vast (Figuur 2C).
OPMERKING: In dit stadium heeft het PDMS-membraan gaten, dus probeer niet te ontkoppelen of achteruit te gaan in het protocol.
- Snijd het PDMS rond de ring voorzichtig af met een mes (Figuur 2C).
- Dek af (bijv. met een petrischaaltje) om het membraan tegen stof te beschermen (Figuur 2C).
OPMERKING: Als het PDMS moet worden gefunctionaliseerd met een polyacrylamidegel, gaat u verder met sectie 5. Ga voor de eerste kalibratiemetingen verder naar hoofdstuk 6. Als de PDMS-ring moet worden gebruikt voor het zaaien van cellen, gaat u verder met sectie 7.
4. Variatie van PDMS-membraanfabricage: patroon een referentieraster
- Bereid een PMMA-plaat voor (voorafgaand aan PDMS spin-coating) met een "patroon" met een op SU8 gebaseerd raster gemaakt met behulp van fotolithografie (Figuur 2D). Ontwerp hiervoor een interessant patroon om een fotomaskerfilm (acetaatmasker) te maken.
OPMERKING: Het pdf-bestand dat in dit protocol wordt meegeleverd (zie aanvullende map 4) maakt een raster met alternatieve nummers; zie figuur 2D. Het raster kan worden gemaakt met behulp van eenvoudige software zoals Inkscape, gegeven de grootte van het patroon (of alternatieven zoals Clewin of FreeCAD). Het ontwerp kan door externe bedrijven worden afgedrukt op fotofilms (zie Materiaaltabel).
- Fotolithografieprotocol op de PMMA-plaat (zie aanvullende map 3 voor optische eigenschappen van PMMA).
- Voer een zuurstofplasmabehandeling uit van de PMMA-platen gedurende 20 minuten bij 7 W met een constante zuurstofstroom van 0,8 bar.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de eventuele plastic bescherming van de platen is verwijderd en dat PMMA-platen volledig transparant zijn.
- Bak 5 minuten op 95 °C.
- Koel de PMMA-plaat af met een stikstofpistool en plaats vervolgens 4 ml SU-8 2100-hars op de PMMA-plaat van 12 cm (pas het volume aan als u verschillende plaatformaten gebruikt).
- Centrifugeer met de volgende parameters (of pas de centrifugeparameters aan om een laag van ongeveer 10 μm hoog te creëren): 5 s bij 500 tpm met een acceleratie van 100 tpm/s gevolgd door 30 s bij 4000 tpm met een acceleratie van 300 tpm/s.
- Bak 2,5 min op 95 °C.
- Plaats de PMMA-plaat op een maskeruitlijner in aanwezigheid van het acetaatmasker en gebruik de volgende parameters: zonder i-line. Breedbandblootstelling (tussen 260 en 460 nm), 25 mW/cm2, blootstelling van 7,5 s.
- Bak 3,5 min op 95 °C.
- Ontwikkel het patroon gedurende 1 minuut met propyleenglycolmonomethyletheracetaat.
- Was uitgebreid met isopropanol.
- Voer visuele verificatie uit van de patroonkwaliteit met behulp van een objectief met een lage vergroting (2-10x) in een helderveldmicroscoop.
OPMERKING: Silanisatie van de plaat met PMMA-patroon verlengt de levensduur van het patroon voor herhaald gebruik. Activeer hiervoor de PMMA-plaat met patroon gedurende 30 s met zuurstofplasmabehandeling en voer vervolgens een behandeling van 1 uur uit met Trichloor(1H,1H,2H,2H-perfluorocctyl)silaan onder vacuüm in een chemische kap.
- Gebruik de PMMA-plaat met patroon zoals in stap 2.2 tot 2.5 om het rekbare PDMS-membraan te centrifugeren.
OPMERKING: Het PDMS met patroon kan worden gevisualiseerd in een helderveldmicroscoop, zoals eerder vermeld, evenals in een scanning-elektronenmicroscoop (Figuur 2D). Let op welke kant van het patroon naar boven wijst tijdens het monteren van het PDMS-membraan in de rekring om het patroon in de gewenste richting te verkrijgen.
5. Aanbrengen van een polyacrylamide (PAA) gel op het PDMS-membraan
OPMERKING: Deze stap kan worden uitgevoerd op het PDMS-membraan dat aan de PMMA-plaat is bevestigd (zie sectie 2) of op de eerder gemonteerde rekringen (zie sectie 3). Werk onder een chemische motorkap; voor de stappen met verwarming is het handig om een kleine oven te gebruiken die onder de chemische kap past, zie Materiaaltabel; Bewaar de monsters anders in een hermetische doos in de oven).
- PDMS-membraan voorcoating (Figuur 2E)
- Bereid de coatingoplossing voor door 96% ethanol te mengen met 10% (3-aminopropyl)triethoxysilaan (APTES) in een microcentrifugebuis (bijv. 20 μL APTES in 180 μL ethanol).
- Activeer de PDMS-membranen met een corona-plasmaontlader gedurende 1 minuut (of activeer gedurende 30 s met een zuurstofplasmareiniger).
- Plaats 200 μL van de APTES/ethanoloplossing in het midden van het membraan.
- Laat het membraan 1 uur in de oven op 65 °C staan.
- Was twee keer met PBS. Laat de PBS voor de tweede keer 10 minuten schudden staan.
- Bereid de 3% glutaaraldehyde (GA) oplossing in PBS. Breng 200 μL GA per membraan aan op hetzelfde gebied van het membraan dat met APTES is behandeld.
- Wacht 25 minuten (niet langer dan 30 minuten).
- Was twee keer met PBS, de tweede keer tijdens het schudden.
- Zuig de vloeistof op en plaats de ring in een verlaagde positie, totdat PBS volledig is opgedroogd.
- Dekglaasje silanisatie
- Bereid 6 ml Repel Silaan voor en giet het in een petrischaaltje.
- Plaats vierkante 18 mm glazen dekglaasjes voorzichtig, één voor één, in de vloeistof.
- Incubeer de dekglaasjes gedurende 5 min.
- Bereid twee bekers voor; de ene bevat 96% ethanol en de andere ultrapuur water.
- Verwijder het dekglaasje met een pincet van de Repel Silaan en was eerst in 96% ethanol, gevolgd door een wasbeurt in ultrapuur water (het dekglaasje moet "droog" uit de waterwas komen).
- Laat nog 30 minuten drogen aan de rand van een petrischaaltje.
- Bevestiging van polyacrylamide (PAA) gel aan PDMS-membraan
- Leg de helft van de met Repel Silane behandelde dekglaasjes op de bodem van een petrischaaltje.
- Bereid een PAA-gelmix voor met de gewenste stijfheid16,18.
- Plaats een druppel van 10 μL gelmix op elk dekglaasje.
- Leg er nog een met Repel Silaan behandeld dekglaasje op om de gel te verspreiden. Lijn de twee dekglaasjes niet uit. Zorg ervoor dat ze in een stervorm zijn gerangschikt om ze gemakkelijk te kunnen scheiden. Druk zachtjes zodat de gel platgedrukt wordt, maar niet verder komt dan het dekglaasje.
- Wacht 45 minuten tot 1 uur.
- Scheid de dekglaasjes voorzichtig met een pincet. Zorg ervoor dat de gel op een van de dekglaasjes blijft zitten.
- Pak het dekglaasje waarop de gel is bevestigd en breng de gel in contact met het PDMS-gebied dat eerder met GA is behandeld (Figuur 2E).
- Druk met twee vingers vanaf de onderkant en de bovenkant gedurende 5 s.
- Incubeer een nacht bij 37 °C.
- Vul de volgende dag de ring 30 minuten met PBS.
- Maak het bovenste dekglaasje voorzichtig los met een pincet.
- Teken de omtrek van de PAA-gel met een permanente marker vanaf de andere kant van het PDMS-membraan. Dit helpt om het monster in de volgende stappen te lokaliseren.
- Aspireer de PBS.
- Voer een functionaliseringsstap uit om de hechting van het gewenste extracellulaire matrixeiwit aan de gelte vergemakkelijken 15.
6. Bediening van het rekapparaat, rekkalibratie en resolutiebeoordeling
- Bereid een PDMS-rekring voor met fluorescerende kralen voor rekkalibratie.
- Bereid een verdunning van 1:50000 van 0,1 μm of 0,2 μm fluorescerende kraal (zie materiaaltabel) in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) door middel van seriële verdunning (1:500 tussenoplossing van 1 ml in PBS met 2 μl van de korrelige voorraadoplossing gevolgd door eindverdunning van 10 μl uit de tussenoplossing in 1 ml PBS).
OPMERKING: Een hoge pareldichtheid op het membraan is optimaal voor de kalibratiestap; Soniceer de oplossing niet, omdat parelklonten de werking tijdens het kalibreren helpen.
- Plaats een druppel van 10-30 μL in het midden van de PDMS.
OPMERKING: Montagesteun kan gemakkelijk worden ontworpen met een cross-to-center monsterafzetting
- Laat drogen bij niet hoger dan 40 °C om problemen met verstorende factoren na uitharding te voorkomen.
- Bereid een PDMS-rekring met fluorescerende kralen voor voor de beoordeling van de resolutie.
- Volg het protocol van Cole en al.19 om de kralenoplossing te bereiden met behulp van kralen met een diameter die kleiner is dan de diffractielimiet, meestal kralen met een diameter van 0.1 μm.
(zie Tabel met materialen). Sonificeer de kralenoplossingen zorgvuldig bij elke tussenstap.
- Gebruik een coronabehandeling in het midden van de ring om het PDMS-substraat te activeren.
- Verdeel onmiddellijk 20 μL van de kralenoplossing over het behandelde PDMS-centrale gebied en laat het drogen.
OPMERKING: In dit geval wordt de kralenoplossing sterk verdund en geïncubeerd op de hydrofiele PDMS om een uitgebreide verspreiding te garanderen en enkelvoudig gescheiden korrels van 0,1 μm te verkrijgen die op het substraat worden geadsorbeerd.
- Montage van de rekinrichting op de houder van de microscooptafel (Afbeelding 1F).
- Monteer de rekpaal in de microscoop.
- Breng royaal smeermiddel (vaseline) aan op het ronde gedeelte van de paal (middelste deel, Figuur 1D, F).
OPMERKING: Het gebruik van het smeermiddel is verplicht voor het PDMS-substraat om wrijvingen te overwinnen en over de paal te glijden, en het is noodzakelijk om het smeermiddel tussen elk monster te verversen. Vaseline wordt gebruikt als een zeer handig smeermiddel in de opstelling die in dit protocol wordt gepresenteerd.
- Monteer de in stap 6.1 voorbereide rekring in de rekpaal en schroef de bovenkap vast om het geheel af te dichten.
- Sluit de vacuümregelaar aan op de vacuümbron en de rekpaal (Figuur 3A).
- Sluit de achterkant van de vacuümschakelkast aan op de vacuümbron (Figuur 3A).
- Sluit de voorkant van de doos aan op de stretch-post (Figuur 1B, D, F).
OPMERKING: De vacuümbron kan de vacuümleiding zijn die beschikbaar is in de infrastructuur van het gebouw. Een matig vacuüm is vereist voor voldoende rek, maar is afhankelijk van de diameter van de rekring (een kleinere rek wordt verkregen bij hetzelfde vacuümniveau voor een kleinere diameter). Als alternatief zijn vacuümpompen in de handel verkrijgbaar (Fluigent of Elveflow leveren autonome vacuümpompen); Volg in dit geval de instructies van de fabrikant voor aansluiting op de vacuümbron. Gebruik geen vacuümvoorziening zonder een vacuümgestuurde bron (zoals de op maat gemaakte vacuümschakelkast die in dit protocol wordt gepresenteerd of de in de handel verkrijgbare systemen)
- Kalibratie van de spanning
- Kies een interessegebied met een hoge kralendichtheid over het hele gezichtsveld en herkenbare kralenklonten voor de gebruiker (zie afbeelding 3B).
- Verkrijg een afbeelding "in rust" van het gekozen gezichtsveld (sla de positie op).
- Breng rek aan op een laag vacuümniveau (in deze opstelling -20 mbar). Het monster beweegt in alle richtingen (X-Y-Z).
- Stel eerst opnieuw scherp in het z-vlak.
- Verplaats het podium in x-y-richtingen om hetzelfde interessegebied te vinden dat in rust is afgebeeld, stel het beeld van de kralen in uitgerekte toestand nauwkeurig scherp en verkrijg een afbeelding.
OPMERKING: Als het monster erg uit het midden is, zal het interessegebied aanzienlijk verschuiven, afhankelijk van de omvang van de spanning. De verplaatsing zal groter zijn weg van het centrum, maar de rekgrootte is onafhankelijk van de locatie van het monster op het substraat. Neem beelden op zonder binning, met een resolutie van 2048x2048.
- Laat de spanning los. Herhaal stap 6.4.3-6.4.5 met een hoger vacuümniveau (-30 mbar, -40 mbar, enz.).
OPMERKING: Keer voor kalibratiedoeleinden altijd terug naar de rusttoestand voordat u opnieuw wordt uitgerekt (zie aanvullende afbeelding 3A), aangezien PDMS een hysteresegedrag vertoont bij vervorming.
- Monteer een tweede rekring en herhaal stap 6.4.1-6.4.6. Voer deze kalibratie uit voor minimaal 3 verschillende stretchringen.
- Sla de verkregen afbeeldingen op in een map die is geordend op voorbeeld.
- Noem in elke map de referentie-kraalafbeelding die in rust reference_str1 is verkregen en de afbeeldingen die zijn uitgerekt bij toenemende vacuüm-stretched_str1, stretched_str2, stretched_str3, enz.
OPMERKING: Deze stap vormt de kernkalibratie van het systeem. Afhankelijk van de behoeften van de gebruiker moet aanvullende kalibratie worden uitgevoerd met behulp van vergelijkbare parelmonsters, maar met behulp van andere vacuümtoepassingsprotocollen. Pas een stamprotocol toe dat lijkt op de stam die op het biologische monster is aangebracht (zie het hoofdstuk over representatieve resultaten).
- Gebruik de Matlab-code om de stam20 te kwantificeren.
- Download de hele Matlab-map via de volgende link https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
OPMERKING: De hoofdcode die moet worden uitgevoerd, heeft de naam gel_strain en roept andere Matlab-codebestanden aan die moeten worden bewaard zoals geleverd, opgeslagen in dezelfde map als de hoofdcode.
- Open Matlab en open de code gel_strain.
- Stel de parameters in (zie Tabel 3, Code_Parameter voor aanbevolen instellingen).
- Definieer de paden van de bovenliggende map en de experimentmap zoals aangegeven in de code.
OPMERKING: Als de map niet bestaat, verschijnt er een pop-up met een waarschuwing in de code; Selecteer Toevoegen aan pad en blader naar de experimentele map waar afbeeldingen zijn opgeslagen.
- Voer de gel_strain code uit.
- Open stretched_str1 zoals gevraagd door de code.
- Open reference_str1 zoals gevraagd door de code.
NOTITIE: Het is handig om alle uitgerekte afbeeldingen in één keer op verschillende vacuümniveaus te verwerken, zoals aangegeven in dit protocol; Alle bestanden moeten in dezelfde experimentele map worden opgeslagen, maar de code vraagt alleen om de eerste uitgerekte afbeelding te openen. Afbeeldingsnamen moeten eindigen op strX-namen, waarbij X de oplopende getallen 1, 2, 3, enz. zijn, zoals aangegeven in punt 6.4.9 van dit hoofdstuk.
- Controleer of de resultatenmap wordt weergegeven met de 4 submappen: Bijgesneden gegevens met de bijgesneden en uitgelijnde gegevens; Verplaatsingen die het bestand voor het verplaatsen van kralen bevatten; Afbeeldingen met de grafiek van de radiale verplaatsingen en spanning; Stammen die de spreadsheet bevatten van de rekmatrix die voor elk vacuümniveau is verkregen.
- Bereken de mediaan van de rekstrookmatrix voor elk vacuümniveau.
- Herhaal dit voor elk monster (minimaal 3).
- Zet de mediane rekmatrix uit versus het vacuümniveau voor de 3 monsters om de kalibratiecurve te verkrijgen (Figuur 3C).
OPMERKING: Een paar parameters kunnen worden gewijzigd in het geval dat de afbeelding van de kraal niet correct wordt verwerkt vanuit de code. Open hiervoor het bestand set_settings_stretch in Matlab en wijzig Settings.Resolution en Settings.Overlap volgens de aanbevelingen in codecommentaren (zie ook Tabel 3). Afhankelijk van de experimentele behoeften kan de op het biologische monster toegepaste stam worden gevarieerd (cyclische spanning, grotere spanning, enz.): een kalibratie van deze omstandigheden wordt aanbevolen (zie voorbeelden in aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3).
- Beoordeling van de resolutie (volg het protocol van Cole et al.19)
- Monteer de rekring die in stap 6.2 is voorbereid.
- Afbeelding: een gezichtsveld met enkele beaddots (afbeelding: een stapel met een Z-stapafstand die relevant is voor het gebruikte objectief).
- Gebruik MetroloJ (Fiji-plug-in), zoals aangegeven in Cole et al., om de X-Y-Z-resolutie van de stretch-opstelling te karakteriseren (Figuur 3D en aanvullende figuur 4).
7. Cellen zaaien en uitrekken
- Coating van het PDMS met celadhesie-eiwit
- Steriliseer de PDMS-ring door deze gedurende 15 minuten bloot te stellen aan UV-licht (Figuur 4A). Voer alle volgende stappen van het protocol uit onder de biohood om steriliteit te garanderen.
- Spoel de plaat onder de kap af met steriel PBS.
- Incubeer een celadhesie-eiwit 11,14,15 door een druppel van 100-200 μL van de oplossing in het midden van de ring te deponeren (Figuur 4A).
OPMERKING: Gewoonlijk is een oplossing van 10 μg/ml fibronectine geschikt11. Andere adhesie-eiwitten die van belang zijn, kunnen worden gebruikt om de PDMS te coaten (bijv. laminine, keratine15; specifieke behandelingen/protocollen kunnen nodig zijn). Incubatie voor fibronectinecoating wordt 's nachts aanbevolen bij 4 °C; de alternatieve methode is 1 uur bij 37 °C.
- Teken de omtrek van de druppel met een permanente marker vanaf de onderkant van het PDMS-membraan. Dit helpt bij het lokaliseren van het monster in de volgende stappen.
- Celzaaiing op de PDMS-ring (Figuur 4A).
- Indien nodig, transfecteer de cellen van belang met een fluorescerend eiwit voorafgaand aan het uitrekkende experiment (voor voorbijgaande transfecties, 1-3 dagen vóór het experiment, afhankelijk van de transfectiemethode en kenmerken) of gebruik specifieke protocollen om de fluorescerende markers van belang te visualiseren.
OPMERKING: Voor de eerste experimenten is het handig om een plasmamembraanmarker zoals GFP-mem11,12 te gebruiken om de celmembraanrespons en mogelijke scheuren te visualiseren. De marker is gemakkelijk te transfecteren en het wordt geadviseerd om de getransfecteerde cellen uit te rekken bij toenemende rekniveaus om de rekdrempel te beoordelen die tot plasmamembraanruptuur zal leiden. Zie de plasmidekaart in aanvullende map 5. Dit is afhankelijk van het celtype en zal lager zijn in experimenten met één cel in vergelijking met celmonolagen. Deze membraanmarker is compatibel met celrek, in tegenstelling tot sommige membraaninvoegende kleurstoffen waarvan werd waargenomen dat ze leidden tot plasmamembraanruptuur bij lage rekniveaus.
- Verwarm op de dag van het experiment celmedia en bereid CO2 -onafhankelijke media voor.
OPMERKING: Als de microscoop CO2 -controle heeft die compatibel is met het reksysteem, kunnen de experimenten worden uitgevoerd in reguliere celkweekmedia (dit zou een noodzakelijke opstelling zijn voor delicate monsters die niet kunnen overleven in CO2 -onafhankelijke media). CO2-onafhankelijk aangevuld met een antibleekmiddel wordt aanbevolen (bijv. voor GFP-eiwitten rutinesupplement21 met 10 mg/ml).
- Probeer de cellen en tel ze.
- Zaai een geschikt aantal cellen in een klein volume (20-50 μl) met standaard celmedia om de celhechting te bevorderen en bewaar deze in een CO 2-vochtigheidsgecontroleerde incubator.
OPMERKING: Voor platte en grote fibroblasten en experimenten met één cel, 5000 cellen; Getallen zijn afhankelijk van het celtype en het experiment zelf.
- Na 20-30 minuten incubatie (controleer de initiële celbevestiging), voegt u voorzichtig 500 μL media toe aan de bovenkant van de cellen. Plaats terug in de couveuse om verdere celverspreiding mogelijk te maken.
OPMERKING: De zaaitijd is afhankelijk van het celtype en van de experimentele vereisten; De vorming van een monolaag met nachtelijke incubatie is ook mogelijk. Het volume van de kweekmedia moet dienovereenkomstig worden aangepast. Secundaire celkleuring: eenmaal gehecht, kunnen cellen worden gekleurd met een kleurstof zoals SpyDNA (zie Materiaaltabel) om de kernen te visualiseren (aanvullende figuur 5) of een andere kleuring om elke interessante structuur te visualiseren. Pas altijd op dat levend-cel kleuring of eiwitoverexpressie door transfectie de reactie van de cel kan beïnvloeden om uit te rekken, vooral bij de celschors, het plasmamembraan, of mechanosensitive eiwitten/structuren.
- Omruilen naar CO2-onafhankelijke media en onmiddellijk gebruiken in het rekapparaat.
OPMERKING: Nu is het monster klaar voor een rekexperiment.
- Celrekexperiment: voorbeeld van een enkele rek-afgiftecyclus en beeldvorming van het plasmamembraan (PM) om dynamische PM-remodellering van fibroblasten vast te leggen.
- Monteer de rekring op de microscooptafel zoals in paragraaf 6, stap 6.2.
- Zoek een interessante cel, noteer de positie en maak een afbeelding van de vooruitgerekte cel (Figuur 4B).
- Breng het gewenste vacuüm aan dat, volgens de kalibratiecurve, overeenkomt met de gewenste substraatspanning.
- Om de uitgerekte cel te vinden, stelt u eerst opnieuw scherp in Z en beweegt u vervolgens in de X-Y-richting om de cel te vinden en terug te centreren naar het gezichtsveld.
- Neem beelden op gedurende de gewenste duur (Figuur 4B).
OPMERKING: Eerste experimenten zijn vaak nodig om de celrespons op trekspanning te bepalen, afhankelijk van het type (gemiddeld). Rek de cellen uit bij verschillende substraatstammen om de maximale rekbelasting te bepalen die ze kunnen dragen. Plasmamembraanruptuur zal optreden, zoals gevisualiseerd door de fluorescerende membraanmarker van het plasmamembraan, als de belasting buitensporig is voor de cel.
- Ga voor het vrijgeven van cellen terug naar de celpositie in rust en zet de acquisitiemodus van de microscoop AAN om ervoor te zorgen dat de acquisitie kan beginnen zodra het monster opnieuw is scherpgesteld.
- Laat de rek los en stel snel handmatig opnieuw scherp in Z.
- Neem beelden op van de vrijgekomen cel gedurende de gewenste tijd (Figuur 4B). Door het flexibele karakter van het PDMS-membraan defocust het monster na verloop van tijd gemakkelijk. Pas daarom de scherpstelling tijdens de beeldacquisitie handmatig aan.
OPMERKING: Om tijdens de beeldvorming na het loslaten met succes opnieuw scherp te stellen, moeten beelden vaak genoeg worden gevisualiseerd; Een video-opname van 3-5 minuten om de 3 s is redelijk. Het PDMS-substraat is niet compatibel met het perfecte focussysteem van de microscoop, dus handmatige aanpassing door de gebruiker voor snelle acquisitie is meestal vereist. Softwarematige scherpstelling kan worden geregeld, maar pas op voor mogelijke fouten en grote podiumbewegingen die het doel kunnen beschadigen door een stuk paaldeel te raken. De gebruiker kan besluiten om meerdere stukken van het monster uit te voeren, afhankelijk van het experiment.
- Nabewerking: Lijn de afbeeldingen uit met Fiji
- Open de afbeeldingen in rust en zeef.
- Gebruik de Fiji-plug-in-sjabloon en selecteer een deel van de cel om uit te lijnen (Afbeelding 4C).
OPMERKING: Relatieve verplaatsingen van het uitgelijnde stambeeld worden weergegeven door Fiji en afbeeldingen worden bijgesneden en uitgelijnd. Download de template_matching plugin via deze link : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin
8. Cellen zaaien op een voorgerekt substraat
- Monteer de uitgerekte ring die is bedekt met het adhesie-eiwit in het rekapparaat.
- Rek het PDMS-substraat uit tot het gewenste rekniveau.
- Zaai de cellen zoals in sectie 7.
OPMERKING: In dit experiment wordt het zaaien niet uitgevoerd in steriele omstandigheden, dus het protocol is mogelijk niet geschikt voor alle celtypen.
- Nadat de cellen zich hebben gehecht, vervangt u de media door een CO2 -onafhankelijk medium.
OPMERKING: Kies snel hechtende cellen om de hechtingstijd te minimaliseren.
- Laat na een gewenste incubatietijd de rek los en beeld een interessante cel af.
OPMERKING: In deze stap omhoog is het moeilijk om dezelfde cel te vinden na het loslaten van de rek, omdat de celpositie in rust onbekend is en de beweging van het PDMS-substraat niet gemakkelijk te voorspellen is.
9. Fixeren van uitgerekte of ontspannen cellen
- Fixeer cellen in uitgerekte toestanden (werk onder een chemische kap)
OPMERKING: Paraformaldehyde (PFA) is een standaard fixatiemiddel; gebruik het warm bij 37 °C voor een snelle fixatie. Als alternatief maakt glyoxal-oplossing22 een snelle monsterfixatie mogelijk met een goede bewaring van het monster.
- Bereid fixatiemiddel voor.
- Zaadcellen op de ringen volgens stap 7.2.
- Monteer de rekpaal en controller in een chemische kap en sluit deze aan op de vacuümvoorziening.
- Plaats de ring met gezaaide cellen in de rekpaal.
- Om de uitgerekte toestand te fixeren, rekt u uit tot de gewenste spanning. Verwijder de celkweekmedia en fixeer door de 4% PFA-oplossing gedurende 10 minuten bij 37 °C aan de cellen toe te voegen. Was vervolgens met PBS, altijd de rek vasthoudend. Laat het vacuüm langzaam los en was met meer PBS.
OPMERKING: Vergeet niet om een niet-rekbare controletoestand voor te bereiden (hiervoor kan een klein PDMS-stukje worden gesneden en gedroogd met een kleine hoeveelheid 96% ethanoloplossing eronder, bovenop een glazen dekglaasje). Om de vaste steekproef in beeld te brengen, wordt aanbevolen de steekproef terug te rekken tot dezelfde grootte. Aangezien PFA giftig is, moeten bij deze stap passende voorzorgsmaatregelen worden genomen. Het is handig om een kleine oven te gebruiken die onder de motorkap kan worden gehouden, zie Materiaalopgave).
- Stel het monster voor, bij voorkeur door het vacuüm opnieuw aan te brengen, op hetzelfde niveau dat is gebruikt bij het fixeren, wat zorgt voor "afvlakking" van het monster (Figuur 4D).
- Fixeer de cel na het losmaken van de rek (werk onder een chemische kap).
- Rek de cellen uit tot de gewenste soort en tijd. Vlak voor het losmaken van de rek, verwijder je het grootste deel van het medium zonder het monster volledig te drogen en laat je de zeef los. U kunt ook een cyclische rek van een bepaalde duur aanbrengen.
- Verwijder snel media en fixeer onmiddellijk 10 minuten met de fixeeroplossing. Wassen met PBS en afbeelding.
OPMERKING: Het monster kan ook worden gezaaid op een voorgerekt substraat en, na een door de gebruiker gedefinieerde zaaitijd, een vaste post-stretch release zoals in stap 9.2.2.
- Immunofluorescentie van vast monster: volg standaardprotocollen voor immunofluorescentie op uitgerekt of vrijgegeven; blokkeren met visgelatine heeft de voorkeur boven BSA17.
- Stel het voorbeeld voor (Figuur 4E).
- Bewaren van monsters
- Bereid montagemedia voor op het bewaren van monsters (Mowiol of Prolong).
- Verwijder de PBS en voeg een druppel (ongeveer 75 μL) montagemedia toe.
- Pak een dekglaasje met een pincet en plaats het er voorzichtig op (vermijd luchtbellen, die de visualisatie zouden belemmeren).
- Droog minimaal 48 uur bij kamertemperatuur (RT).
- Knip rond het vaste PDMS-monster en monteer het op een ander glazen dekglaasje voor latere beeldvorming.
OPMERKING: Deze stap is niet compatibel met post-imaging van het monster op het uitgerekte membraan, aangezien het monteren van het PDMS-membraan op een dekglaasje met de conserveringsmedia alleen het behoud van het membraan in ontspannen toestand inhoudt.
10. Fixatie met het raster voor het afbeelden van hetzelfde monstergebied in verschillende modi - SEM-beeldvorming als voorbeeld
OPMERKING: Dit protocol kan worden gebruikt om dezelfde enkele cel in twee verschillende microscopen af te beelden, fluorescentiemicroscopie en scanning-elektronenmicroscopie, zoals hier gepresenteerd. Correlatieve beeldvorming vereist geavanceerde beeldverwerking die niet binnen het bereik van dit protocol valt. Andere nuttige toepassingen kunnen bijvoorbeeld visualisatie van het monster in live-modus zijn, verdere fixatie onder de kap en visualisatie van dezelfde cel na immunokleuring (het protocol dat is gebruikt voor aanvullende figuur 5).
- Bereid een rekring voor met behulp van de PMMA-platen met patroon uit sectie 4.
- Zaai de cellen zoals in stap 7.2.
OPMERKING: Houd er rekening mee dat de coatingoplossing zorgvuldig moet worden aangebracht om een volledige dekking van het PDMS te garanderen, zelfs in de kleine roostergaten.
- Fixeer zoals beschreven in sectie 8, maar met behulp van het juiste fixatief en protocol dat compatibel is met de beeldvorming van het monster en de elektronenmicroscopie.
OPMERKING: Als u een mengsel van PFA + glutaaraldehyde gebruikt (bijv. 2%-2,5%), pas dan op voor autofluorescentie door de aanwezigheid van glutaaraldehydereagens en voer uiteindelijk een afschrikstap23 uit.
- Beeld het monster af in fluorescentiemodus en noteer de celpositie (druk het raster af en noteer de positie met bijvoorbeeld een kruis).
- Zodra alle foto's zijn gemaakt, bereidt u het monster voor op EM door eerst het PDMS rond het monster te knippen (voordat u het smeermiddel verwijdert).
- Verwerk het PDMS-membraan + monster voor scanning-elektronenmicroscopie (waarbij het standaardprotocol voor monsterdehydratatie en metaalsputtering betrokken is)12.
- Zoek bij beeldvorming in de SEM-microscoop de rasterposities en zoek naar de cellen die eerder in fluorescerende modus zijn afgebeeld (Figuur 4F,G).