Hier beschrijven we een techniek voor het oogsten van menselijke vestibulaire eindorganen onder fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie en hun analyse met behulp van immunokleuring.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oogst van vestibulaire eindorganen onder fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het levende menselijke binnenoor is een uitdaging om te bestuderen omdat het is ingekapseld in een dicht otisch capsulebot dat de toegang tot biologisch weefsel beperkt. Traditionele histopathologiemethoden voor tijdelijk bot zijn gebaseerd op langdurige, dure ontkalkingsprotocollen die 9-10 maanden duren en die de soorten weefselanalyse verminderen die mogelijk zijn als gevolg van RNA-degradatie. Er is een kritieke behoefte aan het ontwikkelen van methoden om toegang te krijgen tot vers menselijk binnenoorweefsel om otologische ziekten, zoals de ziekte van Ménière, op cellulair en moleculair niveau beter te begrijpen. Dit artikel beschrijft een techniek voor het oogsten van menselijke vestibulaire eindorganen van een levende donor onder fysiologische omstandigheden. Een persoon met de ziekte van Ménière en 'druppels' die ongevoelig waren voor intratympanische gentamicine-injectie onderging een labyrinthectomie. Een traditionele mastoïdectomie werd eerst uitgevoerd en de horizontale en superieure halfcirkelvormige kanalen (SCC) werden geïdentificeerd. De mastoïdholte werd gevuld met een uitgebalanceerde zoutoplossing, zodat het labyrint onder meer fysiologische omstandigheden kon worden geopend om de cellulaire integriteit te behouden. Een endoscoop van nul graden, uitgerust met een irrigatiesysteem voor het reinigen van lenzen, werd gebruikt om de ondergedompelde mastoïdholte te visualiseren, en een diamantbraam van 2 mm werd gebruikt om de horizontale en superieure SCC's te skeletteren en te openen, gevolgd door de vestibule. De ampullen en een deel van de kanaalkanalen voor de superieure en laterale SCC's werden geoogst. De utrikel werd op dezelfde manier geoogst. Het geoogste weefsel werd onmiddellijk in een ijskoude buffer geplaatst en vervolgens gedurende een uur gefixeerd in 4% paraformaldehyde in met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Het weefsel werd meerdere keren gespoeld in 1x PBS en gedurende 48 uur bij 4 °C bewaard. De weefselmonsters ondergingen immunokleuring met een combinatie van primaire antilichamen tegen tenascine-C (Calyx), oncomoduline (streolaire haarcellen), calretinine (Calyx en Type II haarcellen), synaptisch blaasjeseiwit 2 (efferente vezels en boutons), β-tubuline 1 (Kelk en afferente boutons), gevolgd door incubatie met fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen. De weefselmonsters werden vervolgens gespoeld en gemonteerd voor confocaal microscopisch onderzoek. Beelden onthulden de aanwezigheid van amculaire en maculaire haarcellen en neurale structuren. Dit protocol toont aan dat het mogelijk is om intact, hoogwaardig menselijk binnenoorweefsel van levende donoren te oogsten en kan een belangrijk hulpmiddel zijn voor de studie van otologische aandoeningen.
Inleiding
Het levende menselijke binnenoor is een uitdaging om te bestuderen vanwege de locatie in het dichte otische capsulebot van het slaapbeen. Bijgevolg is de toegang tot menselijk inwendig weefsel beperkt en hebben onderzoekers voornamelijk vertrouwd op postmortale weefseloogst. Postmortale temporele bothistopathologie (TBH) is al meer dan 100 jaar een cruciaal hulpmiddel voor het begrijpen van menselijke otologische aandoeningen 1,2,3. Weefsel voor TBH wordt bereid door de postmortale oogst van het slaapbeen, een langdurig (9-10 maanden) ontkalkings- en weefselvoorbereidingsproces, gevolgd door hematoxyline- en eosinekleuring. Hoewel TBH een essentieel hulpmiddel zal blijven voor het onthullen van nieuwe informatie over het gezonde en zieke menselijke binnenoor, beperken lange postmortale tijden en lange en harde weefselverwerkingsmethoden het nut ervan voor bepaalde doeleinden, waardoor aanvullende methoden nodig zijn om menselijk binnenoorweefsel te bestuderen. Beeldvorming met magnetische resonantie met hoge resolutie kan organen van het binnenoor visualiseren, maar mist voldoende resolutie om structuren op cellulair of moleculair niveau te bekijken 4,5. Als gevolg van deze uitdagingen blijven veel aandoeningen van het binnenoor bij de mens slecht begrepen.
Een alternatieve benadering is het oogsten van binnenoorweefsel tijdens de operatie. Tijdens labyrintische resectie of translabyrintische vestibulaire schwannoomresectie worden de weefsels van het binnenoor opzettelijk opgeofferd. Utrikels die zijn geoogst van patiënten tijdens translabyrintische vestibulaire schwannoomresectie zijn gebruikt om de vestibulaire haarcelmorfologiete karakteriseren 6,7,8 en de regeneratie van haarcellen te bestuderen 9,10. Meer recentelijk zijn er technieken ontwikkeld om binnenoororganen van orgaandonoren te oogsten met behulp van een transcanale benadering die kan worden gebruikt om de utrikel en mogelijk andere vestibulaire eindorganen te verwijderen door een verbreed ovaal venster met minimaal weefseltrauma11,12. Met behulp van deze techniek is het mogelijk geweest om eencellige transcriptomische profielen voor de menselijke utrikel te karakteriseren13. Deze technieken stellen de organen van het binnenoor echter bloot aan niet-fysiologische omstandigheden tijdens de oogst. In het bijzonder kunnen de organen van het binnenoor worden blootgesteld aan de afwezigheid van perilymfevocht en onderdompeling in normale irrigatie met zoutoplossing, die een wezenlijk andere ionensamenstelling heeft dan perilymfevloeistof. Verder is het uitgedroogde vliezige labyrint moeilijk te visualiseren, zelfs met maximale vergroting van de operatiemicroscoop, wat atraumatische chirurgische dissectie uitdagend maakt. Mechanisch trauma kan het weefsel verder beschadigen, en onze anekdotische ervaring suggereert dat chirurgisch weefsel vaak van onvoldoende kwaliteit immunokleuring is als gevolg van mechanische schade en cellulaire degeneratie. Er is behoefte aan nieuwe technieken om atraumatisch menselijk binnenoorweefsel te oogsten voor biologische studies die slecht begrepen aandoeningen van het menselijk binnenoor kunnen ophelderen. Hier beschrijven we een onderwatertechniek voor het oogsten van menselijke vestibulaire eindorganen onder meer fysiologische omstandigheden tijdens labyrinthectomie en hun analyse met behulp van immunokleuring.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol is ontwikkeld met de goedkeuring van de institutionele beoordelingsraad (IRB) van de Johns Hopkins University School of Medicine (IRB00203441) en volgens het institutionele beleid voor het gebruik van menselijk weefsel en mogelijk infectieus materiaal. Weefselverzameling werd uitgevoerd tijdens labyrinthectomie, die deel uitmaakt van de standaard klinische zorg voor de recalcitrante ziekte van Ménière met druppelaanvallen.
1. Labyrinthectomie en weefseloogst
- Verkrijg goedkeuring van de raad van bestuur van de lokale institutionele beoordelingsraad (IRB), bekijk het institutionele beleid voor het gebruik van menselijk en infectieus materiaal en verkrijg toestemming voor weefseldonatie voordat u dit protocol gebruikt. Voer weefseloogst uit tijdens chirurgische labyrinthectomie of translabyrintische benadering van de interne gehoorgang, die deel uitmaakt van de standaard klinische zorg.
- Bereid de patiënt voor.
- Bespreek vóór de inductie van de anesthesie met het anesthesieteam het vermijden van langwerkende verlamming, zodat de aangezichtszenuw kan worden gecontroleerd.
- Zodra algemene anesthesie is geïnduceerd, intubert u de patiënt en draait u de operatietafel 180°. Plaats elektroden voor het monitoren van de aangezichtszenuw en zorg ervoor dat preoperatieve antibiotische profylaxe wordt toegediend.
- Injecteer 1% lidocaïne met 1:100.000 epinefrine in de uitwendige gehoorgang en het postauriculaire gebied. Bereid het oor op de standaard manier voor met betadine.
- Gebruik een #15-mes om een standaard (5-6 cm) postauriculaire kromlijnige incisie te maken 1 cm achter de postauriculaire plooi.
- Til het postauriculaire zachte weefsel op.
- Identificeer de temporalis fascia superieur en til de postauriculaire huidflap naar voren op in de richting van de gehoorgang.
- Maak een standaard 7-vormige periostale incisie en til het periosteum naar voren op totdat de wervelkolom van Henle en de benige gehoorgang zijn geïdentificeerd. Plaats zelfcorrigerende oprolmechanismen.
- Voer een mastoïdectomie uit.
- Voer een volledige mastoïdectomie uit, waarbij de tegmen superieur worden geïdentificeerd, de sigmoïde sinus naar achteren en de uitwendige gehoorgang naar voren dunner wordt.
- Identificeer het horizontale halfcirkelvormige kanaal en het korte proces van de incus.
OPMERKING: Het mastoïd mag niet worden geschoteld om ervoor te zorgen dat het een vat blijft dat vloeistof kan bevatten voor het verzamelen van weefsel onder water.
- Identificeer de halfcirkelvormige kanalen (SC).
- Gebruik onder de operatiemicroscoop (2-4x vergroting) een grove diamantbraam van 3 mm om de perilabyrinthine luchtcellen lateraal aan de superieure SC, de subarcuate luchtcellen en retro-labyrintische luchtcellen achter de achterste SC te verwijderen, die zich superieur uitstrekken tot de gewone crus.
- Dompel het labyrint onder.
- Dompel de mastoïdholte onder in een uitgebalanceerde zoutoplossing (BSS) en visualiseer het labyrint met behulp van een endoscoop van nul graden met een irrigatiesysteem voor het reinigen van de lenshuls.
- Gebruik het irrigatiesysteem voor lensreiniging om de mastoïdholte te irrigeren met BSS, bloed weg te spoelen en een betere visualisatie van het labyrint mogelijk te maken.
- Blauwe-lijn' SC's.
- Met behoud van een adequaat niveau van BSS in de mastoïdholte en het gebruik van de endoscoop voor visualisatie, gebruikt u een diamantbraam van 3 mm om alle drie de halfcirkelvormige kanalen te 'blauwe lijn' door het otische capsulebot voorzichtig weg te boren totdat het halfcirkelvormige kanaal verschijnt als een blauwachtige lijn wanneer bekeken met de endoscoop.
- Irrigeer met tussenpozen met BSS-oplossing met behulp van het irrigatiesysteem om bloed weg te spoelen en een adequate visualisatie te bereiken, zoals geïllustreerd in figuur 1.
- Oogst SC ampullae.
- Ga onder BSS de koepel van het laterale halfcirkelvormige kanaal binnen en volg deze naar voren totdat de ampullen zijn geïdentificeerd. Voer de superieure SC in en volg deze mediaal naar de ampullae, die kunnen worden geoogst met de ampullen van de superieure SC. Snijd de laterale SC-buis scherp door om verwijdering te vergemakkelijken.
- Til de horizontale en superieure SC-ampullen van de crista met behulp van een Rosen-naald en scheid de afferente vezels van het epitheel en het vliezige labyrint. Verwijder vervolgens deze structuren.
- Transect de koepel van de achterste SC en volg deze inferieur en anterieur naar zijn ampullae. Oogst op dezelfde manier de achterste SC-ampullen en plaats al het weefsel in BSS op ijs.
- Oogst macula.
- Verwijder het bot tussen de horizontale en achterste SC-ampullen om de vestibule bloot te leggen. De vliezige wanden van de utrikel zullen zijn gescheurd door het verwijderen van de ampullae. Zolang een vloeistofniveau op peil wordt gehouden, blijven de maculae naar voren vastzitten; Verhoog het en verwijder het.
- De saccule zit in de bolvormige uitsparing; Til het scherp op en verwijder het uit de uitsparing. Plaats op dezelfde manier de weefselmonsters in BSS op ijs.
- Transporteer weefselmonsters op ijs van de operatiekamer naar het laboratorium voor fixatie binnen 1 uur na het oogsten.
2. Immunohistochemie en beeldvorming
- Repareer het monster.
- Plaats het weefselmonster in 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) bij kamertemperatuur (RT) met zacht schommelen of orbitaal schudden (100 rpm) gedurende 1 uur.
OPMERKING: 4% PFA-oplossing (voor 5 ml totaal): 625 ml 32% PFA-stockoplossing + 500 ml 10xPBS + 3875 ml ddH2O.
- Plaats het weefselmonster in 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) bij kamertemperatuur (RT) met zacht schommelen of orbitaal schudden (100 rpm) gedurende 1 uur.
- Breng weefselmonsters over naar 1x PBS-oplossing en spoel 3x 15 minuten (of langer indien nodig) bij RT met zacht schommelen of orbitaal schudden.
- Verwijder overtollig bindweefsel onder de snijmicroscoop in 1x PBS bij RT.
- Ontkalk het monster.
- Breng weefselmonsters over naar 5% ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) in 1x PBS-oplossing om het sensorische epitheel te verwijderen van fijn botresten en otoconia. Laat de incubatie 15-30 minuten draaien bij RT, met zacht schommelen of orbitaal schudden.
- Breng opnieuw weefselmonsters over naar 1x PBS-oplossing en spoel 3x 15 minuten (of langer indien nodig) bij RT met zacht schommelen of orbitaal schudden.
- Breng 125-200 ml 2x blokkeerbuffer (2x BB) aan op elk monster en incubeer gedurende 1,5-5 uur bij RT of 's nachts (AAN) bij 4 °C. Laat de incubatie draaien onder constant orbitaal schudden.
OPMERKING: 2x Blokkeerbuffer (2x BB): 1 g runderserumalbumine (BSA) opgelost in maximaal 5 ml 1x PBS aangevuld met 0,5% Triton X-100. De BSA dient als blokkeringsmiddel voor niet-specifieke antigeenbindingsplaatsen. - Kleuring met behulp van primaire antilichamen.
- Breng 120-150 ml van een combinatie van primaire antilichamen opgelost in 1x BB aan op de gewenste verdunning. Breng anti-tenascine-C-antilichamen bij konijnen aan bij een verdunning van 1:200 (2,5 μg/ml), anti-oncomoduline-antilichamen bij geiten in een verdunning van 1:200 (2,5 μg/ml), anticalretinine bij muizen in een verdunning van 1:300 (2,2 μg/ml) en DAPI in een verdunning van 1:1000 (1 μg/ml). Breng het monster vervolgens (afgedekt) over naar 4 °C (koelkast of koelcel) onder zacht orbitaal schudden voor AAN-incubatie.
LET OP: 1x BB: Meng gelijk volume van 2x BB en 1x PBS aangevuld met 0,5% Triton X-100.
- Breng 120-150 ml van een combinatie van primaire antilichamen opgelost in 1x BB aan op de gewenste verdunning. Breng anti-tenascine-C-antilichamen bij konijnen aan bij een verdunning van 1:200 (2,5 μg/ml), anti-oncomoduline-antilichamen bij geiten in een verdunning van 1:200 (2,5 μg/ml), anticalretinine bij muizen in een verdunning van 1:300 (2,2 μg/ml) en DAPI in een verdunning van 1:1000 (1 μg/ml). Breng het monster vervolgens (afgedekt) over naar 4 °C (koelkast of koelcel) onder zacht orbitaal schudden voor AAN-incubatie.
- Spoel weefselmonsters in 1x PBS-oplossing, 3x 15 minuten (of langer indien nodig), bij RT met zacht schommelen.
- Kleuring met behulp van secundair antilichaam.
- Breng 120-150 ml van een combinatie van fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen opgelost in 1x BB aan bij een verdunning van 1:2000 (1 μg/ml). Breng 488 nm geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam, 568 nm anti-muis secundair antilichaam en 647 nm anti-geit secundair antilichaam aan.
- Incubeer vervolgens het monster (afgedekt) bij RT onder zacht orbitaal schudden gedurende 1,5-2 uur (of AAN bij 4 °C).
- Spoel weefselmonsters in 1x PBS-oplossing, 3x 15 minuten (of langer indien nodig), bij RT met zacht schommelen.
- Voer microdissectie en montage uit.
- Verwijder onder de ontleedmicroscoop overtollig weefsel en vliezen rond het sensorische vestibulaire epitheel. Gebruik 70% ethanol om het oppervlak van een glashistologieglaasje schoon te maken, aan de lucht te laten drogen en een druppel van 55 ml van het juiste montagemedium aan te brengen.
- Breng de sensorische weefselmonsters over naar het montagemedium. Gebruik een fijne tang om de monsters voorzichtig te oriënteren met de haarbundel naar boven in het montagemedium.
- Leg voorzichtig een dekglas van de juiste maat op het montagemedium met de monsters en probeer luchtbellen te beperken. Zorg ervoor dat het dekglas van #1.5 diktegraad is die vereist is voor confocale microscopie.
- Plaats de geleiders in een donkere ruimte (bijv. een banklade) om het montagemedium te laten uitharden. Sluit het dekglas af op het objectglaasje met doorzichtige nagellak en laat het op een donkere plek drogen voordat u het met de confocale microscoop onderzoekt. Bewaar de verzegelde dia's daarna in het donker (diadoos of diamap) bij 4° tot ze beeldvorming zijn.
- Gebruik een confocale microscoop met een vergroting van 40x-100x met kanalen van 488 nm en 657 nm om het preparaat in beeld te brengen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van deze techniek werden de ampullen van de menselijke utrikel en het laterale en superieure kanaal intact geoogst met minimaal trauma (Figuur 2). Zoals te zien is in figuur 2, kunnen de ampullen worden geoogst met een aanzienlijk deel van de vliezige buis. Immunofluorescerende labeling met anti-tenascine-C (extracellulair matrixeiwit) en anti-oncomoduline (klein calciumbindend eiwit van de parvalbumine-eiwitfamilie) ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit artikel beschrijft een nieuwe techniek voor het onder water oogsten van vestibulaire eindorganen in BSS met behulp van endoscopen en hun analyse met behulp van immunofluorescerende beeldvorming. Hier demonstreren we de oogst van intacte vestibulaire eindorganen met intacte vestibulaire haarcellen en voldoende weefselkwaliteit voor succesvolle immunolabeling. De dichtheid van haarcellen in ons exemplaar was vergelijkbaar met die verkregen in andere onderzoeken van levende orgaandonore...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We danken Mohamed Lehar voor zijn hulp bij dit project. Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders (U24DC020850).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10x Phosphate Buffered Saline Stock | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| 32% Paraformaldehyde Stock Solution | ThermoFisher Scientific | 50-980-495 | |
| Alexa Fluor 488 Anti-Rabbit Secondary Antibody | Jackson Immunoresearch | 111545144 | |
| Alexa Fluor 568 Anti-Mouse Secondary Antibody | Jackson Immunoresearch | 115575146 | |
| Alexa Fluor 647 Anti-Goat Secondary Antibody | Jackson Immunoresearch | 705607003 | |
| Balanced Salt Solution | ThermoFisher Scientific | 14040117 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 10711454001 | |
| Confocal microscope | Nikon A1 | A1 | |
| Cover glass (18 mm x 18 mm, thickness #1.5 ) | Corning | 2850-18 | |
| Endo-Scrub 2 Lens Cleaning Sheath | Medtronic | IPCES2SYSKIT | |
| Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) Acid Solution | Sigma-Aldrich | E8008 | |
| Goat Anti-oncomodulin Antibody | R&D Systems | AF6345 | |
| Hopkins 0 Degree Telescope | Karl Storz | ||
| Mouse Anti-calretinin Antibody | BD Biosciences | 610908 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | P10144 | |
| Rabbit Anti-tenascin C Antibody | Millipore | AB19013 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 |
Referenties
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, Current Situation, and Future Perspectives. Otol Neurotol. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal. , Williams and Wilkins Pubs. Baltimore, MD. (1993).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger Pubs. Philadelphia, PA. (1993).
- Swartz, J. D., Loevner, L. A. Imaging of the Temporal Bone. , 4th edition, Thieme Medical Pubs. Stuttgart. (2009).
- Nagururu, N. V., Akbar, A., Ward, B. K. Using magnetic resonance imaging to improve diagnosis of peripheral vestibular disorders. J Neurol Sci. 439, 120300(2022).
- Hızlı, Ö, et al. Quantitative vestibular labyrinthine otopathology in temporal bones with vestibular schwannoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 154 (1), 150-156 (2016).
- Sans, A., Bartolami, S., Fraysse, B. Histopathology of the peripheral vestibular system in small vestibular schwannomas. Am J Otol. 17 (2), 326-324 (1996).
- Johnson Chacko, L., et al. Growth and cellular patterning during fetal human inner ear development studied by a correlative imaging approach. BMC Dev Biol. 19 (1), 11(2019).
- Taylor, R. R., et al. Regenerating hair cells in vestibular sensory epithelia from humans. Elife. 7, e34817(2018).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Aaron, K. A., et al. Selection criteria optimal for recovery of inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e507-e514 (2022).
- Vaisbuch, Y., et al. Surgical Approach for rapid and minimally traumatic recovery of human inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e519-e525 (2022).
- Wang, T., et al. Single-cell transcriptomic atlas reveals increased regeneration in diseased human inner ear balance organs. Nat Commun. 15 (1), 4833(2024).
- Creighton, F. X., Zhang, L., Ward, B., Carey, J. P. Hearing outcomes for an underwater endoscopic technique for transmastoid repair of superior semicircular canal dehiscence. Otol Neurotol. 42 (10), e1691-e1697 (2021).
- Schoo, W. W., Schoo, D. P., Chen, J. X., Carey, J. P. Underwater plugging of superior canal dehiscence via the middle cranial fossa is possible. Otolaryngol Head Neck Surg. 169 (6), 1702-1703 (2023).
- Basura, G. J., et al. Clinical practice guideline: Ménière's disease. Otolaryngol Head Neck Surg. 162 (2_suppl), S1-S55 (2020).
- Chandrasekhar, S. S., et al. Clinical practice guideline: Sudden hearing loss (Update). Otolaryngol Head Neck Surg. 161 (1_suppl), S1-S45 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
