Methodenartikel

Het vastleggen van veelvoorkomende fragiele site-onderbrekingen door native γH2A. X Kanaal

DOI:

10.3791/67535

⸱

24 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een snelle en efficiënte methode om veel voorkomende fragiele breuken te detecteren door middel van natieve γH2A.X chromatine immunoprecipitatie (ChIP). Deze aanpak vermindert aanzienlijk zowel de tijd als de arbeid die gepaard gaan met traditionele γH2A.X ChIP-assays, terwijl de hoge reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid van de resultaten behouden blijven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Replicatiestress veroorzaakt door blootstelling aan extrinsieke agentia kan leiden tot DNA-breuken op veel voorkomende fragiele plaatsen, dit zijn regio's in het genoom waarvan bekend is dat ze vatbaar zijn voor structurele instabiliteit. De γH2A.X-chromatine-immunoprecipitatie (ChIP)-test dient als een krachtig hulpmiddel in genotoxiciteitsstudies, aangezien γH2A.X-fosforylering een gevestigde marker is voor dubbelstrengsbreuken in het DNA. Traditionele γH2A.X ChIP-testen zijn echter vaak arbeidsintensief en omvatten meerdere, tijdrovende stappen. In deze studie presenteren we een vereenvoudigde maar effectieve methode die subcellulaire fractionering combineert met native ChIP om γH2A.X-geassocieerde complexen te isoleren. Deze benadering is met name geschikt voor het analyseren van γH2A.X-chromatine-interacties met verbeterde specificiteit en efficiëntie. Met behulp van subcellulaire fractionering worden chromatine-ongebonden materialen effectief verwijderd, wat resulteert in een gezuiverde chromatinefractie. Daaropvolgende vertering van microkokkennuclease (MNase) onder milde omstandigheden maakt chromatinefragmentatie mogelijk met behoud van fysiologische interacties tussen γH2A.X en de bijbehorende eiwitcomplexen. Deze conservering is essentieel voor het bestuderen van inheemse interactiepartners die betrokken zijn bij responsroutes voor DNA-schade. Dit geoptimaliseerde native ChIP-protocol vermindert aanzienlijk de tijd en arbeid die gepaard gaan met conventionele γH2A.X ChIP-tests. De gestroomlijnde procedure vereenvoudigt niet alleen de workflow, maar levert ook zeer reproduceerbare resultaten op, waardoor het bijzonder voordelig is in omgevingen waar verwerking van meerdere monsters met een hoge doorvoer vereist is. Deze methode is breed toepasbaar in onderzoeken die gericht zijn op genoomstabiliteit, DNA-herstel en chromatinebiologie, waarbij nauwkeurige en efficiënte detectie van DNA-schadeplaatsen van cruciaal belang is. Door gebruik te maken van geoptimaliseerde protocollen en gestroomlijnde stappen, maakt deze methode de detectie van DNA-schade op fragiele locaties mogelijk met een verbeterde gevoeligheid en minimale monsterbehandeling, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor studies naar genoomstabiliteit en respons op DNA-schade.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gemeenschappelijke fragiele plaatsen (CVS's) zijn grote chromosomale gebieden die worden aangetroffen op elk menselijk chromosoom dat vatbaar is voor breuk tijdens de metafase. Onder replicatiestress wordt replicatie in deze regio's aanzienlijk vertraagd, waardoor hun volledige duplicatie vóór mitotische binnenkomst1 wordt voorkomen, wat uiteindelijk resulteert in plaatsspecifieke hiaten en breuken. CVS'en zijn hotspots voor chromosomale instabiliteit en zijn een belangrijke oorzaak van chromosomale herschikkingen tijdens de vroege ontwikkeling van kanker. Replicatiestress, die vaak aanwezig is onder tumorigene omstandigheden, kan leiden tot het verlies van tumorsuppressorgenen en amplificatie van oncogenen - gezamenlijk aangeduid als kopienummervariatie (CNV)2,3,4,5,6. Bovendien zijn CVS'en zeer vatbaar voor virale integratie, watde ontwikkeling van kanker verder bevordert. Meervoudige homozygote deleties van tumorsuppressorgenen werden gedetecteerd in CVS-regio's tijdens pankankeranalyses van primaire tumoren. De meest getroffen CVS'en bij kanker zijn FRA2F, FRA3B, FRA4F, FRA5H en FRA16D11. CVS'en zijn bijzonder kwetsbaar voor breuk in de aanwezigheid van extrinsieke carcinogene agentia12. Om de schadelijke carcinogene effecten van milieuverontreinigende stoffen te beoordelen, is een snelle en betrouwbare methode nodig om het optreden van CVS-breuken te kwantificeren.

Fosforylering van H2A. X op het serineresidu 139 (γH2A.X) door Ataxie Telangiectasia en Rad3-Related Protein (ATR) of Ataxia Telangiectasia Mutated (ATM) is een belangrijke gebeurtenis bij het signaleren van replicatievork die vastloopt13. γH2A.X dient als een indicator van vastgelopen replicatievorken voorafgaand aan de vorming van dubbelstrengsbreuk (DSB)13, waardoor een gunstige chromatineomgeving ontstaat om de efficiënte rekrutering van reparatie-eiwitten naar vastgelopen plaatsen te vergemakkelijken. Bovendien kan γH2A.X worden gerekruteerd om locaties te breken na het instorten van de vork14,15, in overeenstemming met zijn primaire rol bij DSB-reparatie. Aangezien CVS-breuken nauw verbonden zijn met chromosoomafwijkingen die de progressie van kanker aandrijven, kan het detecteren van deze breuken instrumenteel zijn bij het begrijpen van de vroege stadia van tumorigenese. De aanwezigheid van γH2A.X bij CVS kan gebruikt worden als een biomerker om vroege gebeurtenissen van genomische instabiliteit te detecteren. Deze informatie kan helpen bij het identificeren van potentiële kankerverwekkende stoffen en het evalueren van het risico dat gepaard gaat met blootstelling aan verschillende extrinsieke middelen. Door DNA-breuken te meten bij CVS's geïnduceerd door extrinsieke agentia, kan γH2A.X chromatine IP (ChIP) inzicht verschaffen in hoe dergelijke agentia bijdragen aan de mechanismen die aan de basis liggen van tumorigenese.

In de conventionele ChIP (d.w.z. Cross-linked ChIP, X-ChIP) wordt de associatie van γH2A.X met zijn doel-DNA-sequenties gestabiliseerd door omkeerbare formaldehyde-crosslinking. Chromatine wordt vervolgens door middel van sonicatie afgeschoven tot fragmenten van ongeveer 500 basenparen (bp) en de resulterende oplossing wordt door sedimentatie 16,17,18 van puin ontdaan. Een ChIP-grade γH2A.X-antilichaam wordt vervolgens toegevoegd aan de geklaarde chromatinefractie, gevolgd door de toevoeging van eiwit A/G-agarosekorrels om te verrijken voor γH2A.X-gebonden chromatinegebieden 16,17,18. De immuuncomplexen (d.w.z. kralen-antilichaam-γH2A.X-gericht DNA-complex) worden meerdere keren gewassen met strenge wasbuffers om niet-specifiek gebonden DNA-fragmenten te verwijderen 16,17,18. Na het wassen wordt het specifiek gebonden DNA uit de immuuncomplexen geëlueerd. De formaldehyde-crosslinks worden vervolgens omgekeerd, gevolgd door eiwitvertering met behulp van proteïnase K, waarna het verrijkte DNA wordt gezuiverd en geconcentreerd 16,17,18. Om de γH2A.X-geassocieerde regio's te beoordelen, wordt PCR, kwantitatieve PCR (qPCR) of directe sequencing gebruikt 16,17,18. De bezetting van γH2A.X in specifieke regio's, zoals CVS, wordt bepaald door de intensiteit van het PCR- of qPCR-signaal, die evenredig is met de hoeveelheid γH2A.X die op die locatie is gebonden, wat inzicht geeft in locatiespecifieke DNA-schade en herstelgebeurtenissen 16,17,18.

Ondanks dat het een krachtige experimentele benadering is, heeft de X-ChIP een aantal belangrijke beperkingen: (i) het vereist een groot aantal cellen, meestal in het bereik van 1 x 107 tot 5 x 107, vanwege de inefficiëntie van antilichaamprecipitatie geassocieerd met fixatie, wat de totale kosten van het experiment verhoogt19; (ii) het proces van het omkeren van formaldehyde-crosslinks en de daaropvolgende DNA-zuivering is tijdrovend en arbeidsintensief, waardoor het een uitdaging is om consistentie en betrouwbaarheid in de resultaten te behouden; en (iii) γH2A.X-DNA-interacties met een geringe functionele betekenis kunnen niet worden onderscheiden van die met een grotere betekenis, omdat de verknopingsstap voorbijgaande interacties kan stabiliseren, wat leidt tot de detectie van interacties die mogelijk niet biologisch relevant zijn19.

Natief chromatine-immunoprecipitatie (Native ChIP of N-ChIP) is een essentiële biochemische techniek die wordt gebruikt om eiwit-DNA-interacties te bestuderen binnen hun natuurlijke chromatinecontext onder fysiologische zoutomstandigheden. Het heeft een belangrijke rol gespeeld bij het ophelderen van de ruimtelijke en temporele organisatie van chromatine, transcriptiefactorbinding en histonmodificaties. Native ChIP speelt een langdurige rol in het bredere veld van chromatinebiologie en epigenetica en biedt unieke voordelen en beperkingen in vergelijking met X-ChIP. Deze methode, geïntroduceerd in de late jaren 198020, omvat de isolatie van chromatine uit cellen door middel van methoden die de oorspronkelijke structuur behouden, zoals vertering met microkokkennuclease (MNase)21. Hierdoor blijven de inherente eiwit-DNA- en histon-DNA-contacten behouden, waardoor Native ChIP bijzonder geschikt is voor het bestuderen van histonmodificaties en nucleosoompositionering in hun natuurlijke chromatine-instelling22. Native ChIP-studies met hoge resolutie hebben het gebruik van MNase-digestie aangetoond om chromatine te reduceren tot individuele nucleosomen, wat het in kaart brengen van histonmodificaties met grotere nauwkeurigheid vergemakkelijkt23. Bovendien, omdat er geen sprake is van chemische verknoping, wordt het risico op het introduceren van vooroordelen of artefacten die een verkeerde voorstelling van de eiwit-DNA-interacties zouden kunnen geven, geminimaliseerd24.

In tegenstelling tot X-ChIP, waar formaldehyde of andere verknopingsmiddelen worden gebruikt om eiwit-DNA-interacties vast te leggen, biedt Native ChIP een realistischer beeld van chromatine door mogelijke verknopingsartefacten te vermijden. Hoewel X-ChIP over het algemeen beter geschikt is voor het detecteren van voorbijgaande of dynamische interacties tussen DNA en regulerende eiwitten25, is Native ChIP ideaal voor stabiele eiwit-DNA-interacties, zoals histonen of andere chromatine-gebonden eiwitten26,27. Een van de beperkingen die worden opgemerkt voor Native ChIP is het onvermogen om low-affiniteit of voorbijgaande bindingsgebeurtenissen vast te leggen, die vaak worden gestabiliseerd door cross-linking in X-ChIP25.

Een aanzienlijk deel van het werk op het gebied van epigenetica heeft gebruik gemaakt van Native ChIP om histonmodificaties in diverse biologische omgevingen aan het licht te brengen28. Deze inspanningen zijn cruciaal geweest bij het definiëren van de histoncode - het patroon van histonmodificaties die genexpressie en chromatinedynamiek reguleren29. Hoewel H2A. X is een minder sterk geassocieerde linker histon, de inheemse H2A. De X ChIP-methode is met succes toegepast in embryonale stamcellen30. In deze studie hebben we een chromatine-extractieprocedure geoptimaliseerd om Native ChIP van γH2A.X uit te voeren in menselijke 293T-cellen (Figuur 1). Hydroxyureum en aphidicolin worden veel gebruikt in onderzoek om DNA-replicatiestress, schade en genomische instabiliteit te onderzoeken31. In deze studie werden deze middelen toegepast op cellen om replicatiestress te induceren en DNA-breuken te genereren bij CVS.

Gebruikmakend van uitgangsmateriaal van ongeveer 1 x 106 tot 5 x 106 cellen, kan deze methode worden onderverdeeld in vier hoofdfasen: (i) subcellulaire fractionering om chromatine te isoleren, (ii) microkokkennuclease (MNase) digestie om chromatine te fragmenteren, (iii) immunoprecipitatie en elutie, en (iv) DNA-analyse door kwantitatieve PCR (qPCR). Het uitvoeren van ChIP na subcellulaire fractionering biedt verschillende voordelen en is goed gedocumenteerd in tal van onderzoeken 32,33,34,35. Deze aanpak maakt het mogelijk om chromatine-ongebonden eiwitten en ander cellulair afval te verwijderen, wat resulteert in een sterk gezuiverde chromatinefractie. Door chromatine te isoleren vóór immunoprecipitatie, helpt subcellulaire fractionering om inheemse chromatine-interacties te behouden en vermindert het achtergrondgeluid van niet-chromatine-geassocieerde eiwitten, wat leidt tot meer specifieke en betrouwbare resultaten, aangezien alleen chromatine-gebonden complexen worden behouden voor analyse. Bovendien zorgt subcellulaire fractionering voor mildere omstandigheden voor de vertering van chromatine, waardoor fysiologische eiwit-DNA-interacties behouden blijven en een nauwkeurigere weergave van de chromatinedynamiek binnen de oorspronkelijke cellulaire omgeving wordt geboden.

Het gebruik van native ChIP van γH2AX om de impact van extrinsieke middelen op veelvoorkomende fragiele breuk van de plaats te meten, biedt een aanzienlijk potentieel voor kankeronderzoek. Deze techniek maakt de detectie mogelijk van DNA-schade veroorzaakt door blootstelling aan kankerverwekkende stoffen in het milieu, en geeft inzicht in de moleculaire mechanismen waarmee verontreinigende stoffen bijdragen aan genomische instabiliteit en de ontwikkeling van kanker. Door de natieve chromatinecontext te behouden, vergemakkelijkt deze methode de nauwkeurige beoordeling van DNA-schadepatronen die verband houden met carcinogene blootstelling, wat helpt bij de evaluatie van milieurisico's en de studie van door vervuiling veroorzaakte tumorigenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cellen oogsten

  1. Zaai ongeveer 5 x 105 HEK 293T-cellen in elk van de vier schaaltjes van 6 cm, elk met 4 ml volledig DMEM-medium.
  2. Behandel na 24 uur een schaaltje met 2 μl 1 mM aphidicolin (zie materiaaltabel) stockoplossing (eindconcentratie van 0,5 μM) en een ander schaaltje met 20 μl 1 M hydroxyureum (zie materiaaltabel) stockoplossing (eindconcentratie van 5 mM) om replicatiestress te induceren. Voeg DMSO toe aan de overige twee gerechten om als bedieningselementen te dienen.
  3. Gooi na 24 uur behandeling de kweekmedia weg. Een plaat van 6 cm levert doorgaans ongeveer 2 x 106 cellen op bij een samenvloeiing van 60%-70%.
  4. Spoel elk gerecht 2x af met 5 ml ijskoude 1x PBS. Gebruik celschrapers om de cellen los te maken en breng de celsuspensie over naar vier afzonderlijke buisjes van 1,5 ml. Piket voorzichtig op en neer met een P1000-pipet om eventuele celklonten te scheiden.
  5. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het bovenstaande vervolgens weg. Leg de cellen op ijs.

2. Subcellulaire fractionering

  1. Resuspendeer de celpellet in 500 μl vers bereide koude buffer A (zie tabel 1) en zorg ervoor dat de celklonters volledig worden gescheiden door voorzichtig te pipetteren.
  2. Incubeer de lysaten 5-10 minuten op ijs. Controleer de lysisprogressie onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de cellyse volledig is.
    1. Neem een kleine hoeveelheid lysaat (ongeveer 5 - 10 μL) en plaats het op een schoon microscoopglaasje. Dek het af met een dekglaasje om besmetting te voorkomen.
    2. Gebruik een lichtmicroscoop met een geschikte vergroting (bijv. 20x - 40x) om cellen of puin te visualiseren. Vergelijk met een niet-gelyseerd controlemonster om onderscheid te maken tussen intacte cellen en gelyseerd materiaal.
      OPMERKING: Een correct gelyseerd monster heeft geen duidelijke celcontouren, alleen diffuus chromatine of cellulair materiaal. Pas de scherpstelling aan om het lysaat duidelijk waar te nemen. Oefen indien nodig mechanische kracht uit tijdens de lysisstap, zoals het gebruik van een Dounce-homogenisator, bij het werken met bepaalde celtypen.
  3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, zodra de cellen volledig zijn gelyseerd. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg. Resuspendeer de kernpellet in 500 μl koude buffer A met behulp van pipetpunten met brede opening.
    OPMERKING: Brede openingen helpen de schuifkrachten te minimaliseren en beschermen delicate monsters zoals chromatine. Maak punten met een brede diameter door het uiteinde van standaardpunten met een scherp mes af te snijden.
  4. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg.
  5. Verwarm een broedstoof voor op 37 °C en bereid een stopbuffer voor (100 mM EDTA, pH 8,0; Tabel 1).
  6. Optimaliseer de concentraties en incubatietijden van microkokkennuclease (MNase, zie materiaaltabel) van tevoren.
    1. Verdeel 40 μL van het testende chromatinemonster in verschillende gelijke hoeveelheden om verschillende MNase-concentraties en incubatietijden te testen.
    2. Gebruik een reeks MNase-concentraties (bijv. 0,0625 U, 0,125 E, 0,25 E, 0,5 E, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U per reactie) en test meerdere incubatietijden (bijv. 2, 5, 10 en 15 min).
    3. Voeg MNasebuffer (zie tabel 1) met verschillende concentraties MNase toe aan de chromatine-aliquots en incubeer de monsters gedurende de aangegeven tijden bij 37 °C.
    4. Beëindig de reactie door onmiddellijk na de gewenste incubatietijd 1/4 volume stopbuffer (eindconcentratie: 20 mM EDTA) toe te voegen.
    5. Isoleer DNA uit de verteerde chromatinemonsters met behulp van een extractiemethode voor fenol/chloroform/isoamylalcohol.
    6. Laat het geëxtraheerde DNA op een 1,5% agarosegel draaien om spijsverteringspatronen te visualiseren: Onderspijsvertering zal banden met een hoog moleculair gewicht vertonen (Figuur 2, baan 1-4); oververtering zal resulteren in een uitstrijkje of zeer korte fragmenten (Figuur 2, baan 6-8), en een optimale spijsvertering zal een duidelijk nucleosomaal ladderpatroon opleveren (Figuur 2, baan 5, bijv. mono-, di-, tri-nucleosomen).
    7. Identificeer de omstandigheden die de gewenste nucleosomale resolutie produceren zonder overmatige oververtering.
      OPMERKING: CaCl2 fungeert als een cofactor voor MNase-activiteit. Optimaliseer de spijsvertering door de CaCl2-concentratie aan te passen tussen 1 mM en 5 mM.
  7. Resuspendeer de intacte kernen voorzichtig met 100 μL MNase Buffer door 5 - 10 keer te pipetteren met wijde openingen. Voeg onmiddellijk de vooraf bepaalde hoeveelheid MNase toe aan de monsters (1,25 U MNase/100 μL MNase Buffer).
    OPMERKING: Als u met meerdere monsters werkt, verteer ze dan afzonderlijk om oververtering te voorkomen.
  8. Plaats de buizen op een rotator en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Breng de buizen onmiddellijk terug naar ijs en beëindig de MNase-vertering door EDTA toe te voegen tot een eindconcentratie van 20 mM en meng door vortexing.
  9. Voeg 500 μL Buffer B (zie Tabel 1) toe aan elk monster en meng grondig door 5x - 10x op en neer te pipetteren. Los eiwitten op door 5 minuten op ijs te incuberen.
    OPMERKING: Het zout en het wasmiddel in Buffer B helpen zwakke chromatine-gebonden eiwitten te dissociëren en de epitopen bloot te stellen voor immunoprecipitatie.
  10. Pellet het onoplosbare materiaal door het gedurende 5 minuten bij 4 °C op maximale snelheid te centrifugeren. Breng het heldere supernatans over in nieuwe buisjes van 1,5 ml die zijn gelabeld als de natieve chromatinefractie. De monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C of worden gebruikt om de efficiëntie van chromatinefragmentatie te valideren.
    OPMERKING: Vermijd frequente vries-dooicycli, omdat deze interessante eiwit-DNA-interacties kunnen verstoren. Minimaliseer vries-dooicycli waar mogelijk.

3. Verificatie van de chromatinefragmentatie

  1. 10 μl van het bovenstaande uit elk monster in een nieuwe buis van 1,5 ml. Meng met 20 μL gedestilleerd water en 30 μL fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1).
  2. Sluit de buizen goed en draai krachtig gedurende 15-30 s. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 20.000 x g (of de maximale snelheid van de centrifuge) bij 4 °C. Na het centrifugeren worden drie verschillende lagen waargenomen: een heldere toplaag, een witte middenlaag en een gele onderlaag.
  3. Breng voorzichtig 20 μL van de bovenste waterige fase (met DNA) over in een vers buisje. Scheid het gezuiverde DNA in 1,5% agarosegel gedurende 30 minuten bij 100 V en visualiseer de verteringspatronen. Zorg ervoor dat de grootte van chromatinefragmenten voornamelijk tussen 200 en 1000 basenparen ligt.
    OPMERKING: De juiste chromatinefragmentgroottes zijn cruciaal voor het succes van native ChIP en zijn afhankelijk van de MNase-behandelingsomstandigheden, waaronder enzymeenheden, incubatietijd en CaCl2-concentratie. De efficiëntie van de MNase-vertering kan ook variëren op basis van het celtype en het aantal. Het chromatinefragmentatiepatroon dat wordt weergegeven in figuur 2 (baan 5) wordt aanbevolen voor deze ChIP-test.

4. Immunoprecipitatie

  1. Veraliquot 20 μL verteerd chromatine van elk monster in een verse buis van 1,5 ml en meng met 180 μL elutiebuffer (zie tabel 1). Label deze buisjes als Input samples en bewaar ze bij -20 °C.
  2. Breng 400 μL chromatinemonster over in een andere buis van 1,5 ml voor ChIP.
  3. Voeg γH2A.X-antilichaam (zie materiaaltabel) toe aan één met DMSO behandeld, één met aphidicolin behandeld monster en één met hydroxyureum behandeld monster. Voeg dezelfde hoeveelheid normaal IgG (zie materiaaltabel) toe aan een ander DMSO-behandeld monster als negatieve controle voor de ChIP-test.
    OPMERKING: Hier wordt doorgaans 1 μg primair antilichaam gebruikt voor 400 μL chromatine (d.w.z. de eindconcentratie van het antilichaam is 2,5 μg/ml). De optimale hoeveelheid moet echter empirisch worden bepaald voor verschillende γH2A.X-antilichamen.
  4. Plaats de ChIP-buisjes op een rotator bij 4 °C en incubeer gedurende minstens 5 uur, of bij voorkeur een nacht.
  5. Ondertussen aliquot 100 μL magnetische proteïne A/G-kralen van ChIP-kwaliteit (zie materiaaltabel) in een nieuwe buis van 1.5 ml. Gebruik de uiteinden met brede opening en pipette langzaam om een nauwkeurige meting van de kralen te garanderen. Plaats de buis minimaal 1 minuut op een magnetische standaard en gooi de vloeistof vervolgens voorzichtig weg.
  6. Resuspendeer de korrels in 1 ml 1x PBS met 0,5% BSA. Draai ongeveer 4 uur op 4 °C. Plaats de buis minimaal 1 minuut op een magnetische standaard en gooi de supernatant weg.
  7. Was de kralen opnieuw met 1 ml 1x PBS met 0,5% BSA. Plaats de buis 1 minuut op de magnetische standaard om de magnetische kralen te pelleteren en gooi de supernatant weg.
    OPMERKING: Stappen 4.5 tot 4.7 zijn het voorcoaten van kralen om niet-specifieke binding van antilichamen aan magnetische kralen te verminderen.
  8. Resuspendeer de voorgecoate korrels in 100 μL Buffer B met behulp van brede openingen. Voeg 25 μL van de voorgecoate magnetische kralensuspensie toe aan elke ChIP-monsterbuis. Draai gedurende 2 uur op 4 °C.
  9. Plaats de ChIP-buisjes op de magnetische standaard en wacht tot de kralen volledig aan de zijkant van de buis zijn bevestigd en de oplossing helder wordt.
  10. Gooi het doorzichtige bovenstaande weg zonder de magnetische kralen te verstoren. Resuspendeer de parels met 1 ml wasbuffer (zie tabel 1) en draai gedurende 10 minuten op 4 °C.
  11. Plaats de buisjes terug op de magnetische standaard en wacht tot de oplossing helder wordt. Gooi de wasbuffer weg. Herhaal de wasbeurt voor in totaal vier wasbeurten.
  12. Gooi de wasbuffer na de laatste wasbeurt weg en centrifugeer de buizen kort op 400 x g gedurende 30 s bij 4 °C om eventuele restvloeistof te centrifugeren. Plaats de buisjes terug op de magnetische standaard en verwijder voorzichtig alle resterende vloeistof van de bodem van de buis.

5. Elutie en DNA-precipitatie

OPMERKING: De efficiëntie van antilichamen kan variëren tussen verschillende batches. Het is belangrijk om de bindingsaffiniteit van een nieuw antilichaam te bevestigen door de immunoprecipiteerde monsters te controleren door middel van Western blot-analyse.

  1. Controleer de efficiëntie van het pull-downen van ChIP-antilichamen met behulp van Western blot (WB) zoals hieronder beschreven.
    1. Neem een klein deel van het ChIP-monster voor analyse (d.w.z. meestal 10% van het ChIP-monster). Neem ter vergelijking input chromatine (pre-immunoprecipitatie) en negatieve controle (bijv. IgG pull-down) op.
    2. Eluteer eiwitten uit de antilichaamgebonden bolletjes door verhitting in 20 μL 1x SDS-PAGE laadbuffer (zie materiaaltabel) bij 95 °C gedurende 5 min.
    3. Laad de IP-samples, invoer en bedieningselementen op een 15% SDS-PAGE-gel. Laat de gel lopen.
    4. Breng de eiwitten over naar een 0.2 μm nitrocellulose (zie materiaaltabel) of PVDF-membraan met behulp van een nat of halfdroog overdrachtssysteem.
    5. Blokkeer het membraan met 5% magere melk of BSA in TBST (zie tabel 1) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen.
    6. Incubeer het membraan met het primaire antilichaam tegen het γH2A.X (zie de materiaaltabel) verdund in blokkeerbuffer gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C.
    7. Was het membraan 3x met TBST om ongebonden antilichamen te verwijderen. Incubeer het membraan met een HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (zie de materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was het membraan opnieuw om overtollige secundaire antilichamen te verwijderen.
    8. Ontwikkel het membraan met behulp van een chemiluminescerend substraat en visualiseer het signaal met een imager. Vergelijk de signaalintensiteit tussen de IP-, invoer- en controlestroken om de efficiëntie en specificiteit van de pull-down te beoordelen.
      OPMERKING: Een band die overeenkomt met het doeleiwit in de IP-baan bevestigt dat het antilichaam met succes is neergehaald. Deze aanpak zorgt ervoor dat u de werkzaamheid van het antilichaam bij het vangen van het doeleiwit tijdens het ChIP-experiment kunt evalueren.
  2. Voeg 50 μL elutiebuffer (zie tabel 1) toe aan elk van de resterende ChIP-monsters. Plaats de buizen op een thermomixer en schud ze 15 minuten op kamertemperatuur.
  3. Plaats de buisjes minimaal 1 minuut op de magnetische houder. Verzamel de elute in nieuwe buizen. Herhaal dit 1x en vang de elase op in dezelfde buisjes.
  4. Voeg 100 μL elutiebuffer toe aan elk ChIP-elutiemonster en 180 μL elutiebuffer aan elk invoermonster.
  5. Voeg 200 μL fenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) toe aan elk monster en draai krachtig. Centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 20.000 x g (of maximale snelheid) bij 4 °C.
  6. Voeg 19 μl 3M natriumacetaat (NaOAc, pH 5,2; zie tabel 1) en 2 μl glycogeenoplossing (20 mg/ml, zie de materiaaltabel) toe aan elke nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
  7. Breng na het centrifugeren de bovenste waterige laag (ongeveer 190 μl) voorzichtig over op de buisjes met NaOAc en glycogeen en meng door vortex.
  8. Voeg 500 μL 100% ethanol en vortex toe. Precipiteer het DNA door de monsters gedurende ten minste 2 uur of een nacht bij -20 °C te incuberen.
  9. Centrifugeer de buisjes bij 20.000 x g (of maximale snelheid) gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi de bovenstaande weg en zorg ervoor dat u de witte korrel niet verstoort. Resuspendeer de pellet in 1 ml 70% ethanol en draai grondig.
  10. Centrifugeer de buisjes bij 20.000 x g (of maximale snelheid) gedurende 5 minuten bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het supernatant. Centrifugeer de buizen opnieuw kort om eventuele resterende ethanol naar beneden te laten draaien. Verwijder de ethanol voorzichtig met behulp van een P20-pipet. Laat de DNA-pellets 2-3 minuten aan de lucht drogen.
    OPMERKING: Vermijd overdroging van de pellet, omdat dit het moeilijk kan maken om het DNA opnieuw op te lossen.
  11. Voor ChIP-monsters moet het DNA opnieuw worden gerusteerd in 400 μL TE-buffer (zie tabel 1). Voor invoer-DNA resuspenis in 1000 μL TE-buffer. De geëlueerde monsters kunnen nu worden bewaard bij -20°C.

6. kwantificering van qPCR

  1. Voer qPCR uit met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie materiaaltabel) met technische drievouden voor elk monster. Bevestig de aanwezigheid van een enkel specifiek PCR-product door een smeltcurveanalyse uit te voeren om de specificiteit van de amplificatiete garanderen 36.
  2. Gegevensanalyse
    OPMERKING: In relatieve kwantificeringsanalyse wordt het testmonster uitgedrukt als een vouwverandering ten opzichte van een controlemonster (immunoprecipiteerd met behulp van normaal gezuiverd IgG of nep-IP). DNA-loci waarvan bekend is dat ze niet bezet zijn door het immunoprecipiteerde eiwit (negatieve locus) kunnen op deze manier worden gebruikt als referentiegen in vergelijking met bekende, bezette, positieve controle-DNA-loci36.
    1. Bereken het invoerpercentage voor elke ChIP met behulp van de onderstaande formule
      %input = 2(-ΔCt [genormaliseerde ChIP])
    2. Normaliseer de positieve locus ΔCt-waarden naar negatieve locus (ΔΔCt) door de ΔCt-waarde verkregen voor de positieve locus af te trekken van de ΔCt-waarde voor de negatieve locus met behulp van de onderstaande formule
      (ΔΔCt = ΔCtpositief - ΔCtnegative)
    3. Bereken de vouwverrijking van de positieve locussequentie in ChIP-DNA over de negatieve locus met behulp van de onderstaande formule
      Vouw verrijking =2ΔΔCt
      De sequenties van de qPCR-primers die voor de analyse zijn gebruikt, zijn weergegeven in tabel 2. De genomische organisatie van FRA3B en FRA16D37is weergegeven in Figuur 3A,B.
  3. Statistische analyse
    1. Analyseer de resultaten statistisch met behulp van de gepaarde t-toets van Student. Een p-waarde van ≤0,05 wordt als statistisch significant beschouwd, wat aangeeft dat het onwaarschijnlijk is dat de waargenomen verschillen te wijten zijn aan willekeurige variatie38.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De grootte van chromatinefragmenten is cruciaal voor het succes van Native ChIP, omdat het een directe invloed heeft op de toegankelijkheid van DNA-regio's voor antilichaambinding. Om de optimale MNase-concentratie voor chromatinefragmentatie te bepalen, hebben we een reeks microcentrifugebuisjes voorbereid met verschillende concentraties MNase (d.w.z. 0,0625 U, 0,125 E, 0,25 E, 0,5 E, 1 U, 2 U, 4 U, 8 U per reactie) en 40 μL geïsoleerde kernen. Elke reactie werd gedurende 5 minuten bij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Milieuvervuiling levert een belangrijke bijdrage aan kanker bij de mens. Veel verontreinigende stoffen zijn kankerverwekkend, wat betekent dat ze genetische schade kunnen veroorzaken die leidt tot de ontwikkeling van kanker40,41. Het is echter een uitdagende taak om te bepalen of een bepaalde stof tumorageen is. Een snelle, betrouwbare en kostenefficiënte methode voor het identificeren van kankerverwekkend potentieel zou wetensch...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de startup-financiering van de Universiteit van Zuid-China.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm nitrocellulose membraneAmersham10600011
Actin Bproteintech20536-1-AP
AphidicolinMedChemExpressHY-N6733
ChIP-grade magnetic Protein A/G beadsThermoFisher26162
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad#1705061
Glycogen, molecular biology gradeThermoFisherCat. No.  R0561
HRP-conjugated secondary antibody proteintechSA00001-2
hydroxyurea MedChemExpressHY-B0313
Micrococcal Nuclease NEBM0247S
normal IgG Santa Cruzsc-2025
Taq Universal SYBR Green Supermix BioRad1725120
γH2A.X antibody  (for ChIP)Sigma-Aldrich05-636
γH2A.X antibody (for WB)Cell Signaling#25955

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Glover, T. W., Berger, C., Coyle, J., Echo, B. DNA polymerase alpha inhibition by aphidicolin induces gaps and breaks at common fragile sites in human chromosomes. Hum Genet. 67 (2), 136-142 (1984).
  2. Bignell, G. R., et al. Signatures of mutation and selection in the cancer genome. Nature. 463 (7283), 893-898 (2010).
  3. Hellman, A., et al. A role for common fragile site induction in amplification of human oncogenes. Cancer Cell. 1 (1), 89-97 (2002).
  4. Kotzot, D., et al. Parental origin and mechanisms of formation of cytogenetically recognisable de novo direct and inverted duplications. J Med Genet. 37 (4), 281-286 (2000).
  5. Miller, C. T., et al. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. Oncogene. 25 (3), 409-418 (2006).
  6. Zack, T. I., et al. Pan-cancer patterns of somatic copy number alteration. Nat Genet. 45 (10), 1134-1140 (2013).
  7. Gao, G., et al. Common fragile sites (CFS) and extremely large CFS genes are targets for human papillomavirus integrations and chromosome rearrangements in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Genes Chromosomes Cancer. 56 (1), 59-74 (2017).
  8. Thorland, E. C., Myers, S. L., Gostout, B. S., Smith, D. I. Common fragile sites are preferential targets for HPV16 integrations in cervical tumors. Oncogene. 22 (8), 1225-1377 (2003).
  9. Matovina, M., Sabol, I., Grubisić, G., Gasperov, N. M., Grce, M. Identification of human papillomavirus type 16 integration sites in high-grade precancerous cervical lesions. Gynecol Oncol. 113 (1), 120-127 (2009).
  10. Yu, T., et al. The role of viral integration in the development of cervical cancer. Cancer Genet Cytogenet. 158 (1), 27-34 (2005).
  11. Bignell, G. R., et al. Signatures of mutation and selection in the cancer genome. Nature. 463 (7283), 893-898 (2010).
  12. Thavathiru, E., Ludes-Meyers, J. H., MacLeod, M. C., Aldaz, C. M. Expression of common chromosomal fragile site genes, WWOX/FRA16D and FHIT/FRA3B is downregulated by exposure to environmental carcinogens, UV, and BPDE but not by IR. Mol Carcinog. 44 (3), 174-182 (2005).
  13. Sirbu, B. M., et al. Analysis of protein dynamics at active, stalled, and collapsed replication forks. Genes Dev. 25 (12), 1320-1327 (2011).
  14. Barlow, J. H., et al. Identification of early replicating fragile sites that contribute to genome instability. Cell. 152 (3), 620-632 (2013).
  15. Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Shanbhag, N. M., Rafalska-Metcalf, I. U., Balane-Bolivar, C., Janicki, S. M., Greenberg, R. A. ATM-dependent chromatin changes silence transcription in cis to DNA double-strand breaks. Cell. 141 (6), 970-981 (2010).
  18. Stiff, T., et al. ATR-dependent phosphorylation and activation of ATM in response to UV treatment or replication fork stalling. EMBO J. 25 (24), 5775-5782 (2006).
  19. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nuc Acids Res. 34 (5), e2(2006).
  20. Dorbic, T., Wittig, B. Isolation of oligonucleosomes from active chromatin using HMG17-specific monoclonal antibodies. Nuc Acids Res. 14 (8), 3363-3376 (1986).
  21. Dorbic, T., Wittig, B. Chromatin from transcribed genes contains HMG17 only downstream from the starting point of transcription. EMBO J. 6 (8), 2393-2399 (1987).
  22. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO J. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  23. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Clayton, A. L., Crane-Robinson, C. Histone acetylation and globin gene switching. Nuc Acids Res. 20 (5), 1017-1022 (1992).
  24. Hebbes, T. R., Clayton, A. L., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. Core histone hyperacetylation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBO J. 13 (8), 1823-1830 (1994).
  25. Orlando, V. Mapping chromosomal proteins in vivo by formaldehyde-crosslinked-chromatin immunoprecipitation. Trend Biochem, Sci. 25 (3), 99-104 (2000).
  26. Myers, F. A., Evans, D. R., Clayton, A. L., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. Targeted and extended acetylation of histones H4 and H3 at active and inactive genes in chicken embryo erythrocytes. J Biol Chem. 276 (23), 20197-20205 (2001).
  27. Litt, M. D., Simpson, M., Recillas-Targa, F., Prioleau, M. N., Felsenfeld, G. Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBO J. 20 (9), 2224-2235 (2001).
  28. Madisen, L., Krumm, A., Hebbes, T. R., Groudine, M. The immunoglobulin heavy chain locus control region increases histone acetylation along linked c-myc genes. Mol Cell Biol. 18 (11), 6281-6292 (1998).
  29. Clayton, A. L., Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. Histone acetylation and gene induction in human cells. FEBS Lett. 336 (1), 23-26 (1993).
  30. Tseng, Z., Wu, T., Liu, Y., Zhong, M., Xiao, A. Using native chromatin immunoprecipitation to interrogate histone variant protein deposition in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1176, 11-22 (2014).
  31. Durkin, S. G., Glover, T. W. Chromosome fragile sites. Ann Rev Genetics. 41, 169-192 (2007).
  32. Lee, J. B., Keung, A. J. Chromatin immunoprecipitation in human and yeast cells. Methods Mol Biol. 1767, 257-269 (2018).
  33. Miyamoto, R., Yokoyama, A. Protocol for fractionation-assisted native ChIP (fanChIP) to capture protein-protein/DNA interactions on chromatin. STAR Protoc. 2 (2), 100404(2021).
  34. Mendez, J., Stillman, B. Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: Assembly of prereplication complexes in late mitosis. Mol Cell Biol. 20 (22), 8602-8612 (2000).
  35. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-κB gene network by chromatin immunoprecipitation. BioTechniques. 39 (5), 715-725 (2005).
  36. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  37. Lu, X., Parvathaneni, S., Hara, T., Lal, A., Sharma, S. Replication stress induces specific enrichment of RECQ1 at common fragile sites FRA3B and FRA16D. Mol Cancer. 12, 29(2013).
  38. Ruijter, J. M., et al. Amplification efficiency: linking baseline and bias in the analysis of quantitative PCR data. Nucl Acids Res. 37 (6), e45(2009).
  39. Lyu, X., Chastain, M., Chai, W. Genome-wide mapping and profiling of γH2AX binding hotspots in response to different replication stress inducers. BMC Genomics. 20, 579(2019).
  40. Farmer, P. B., et al. Molecular epidemiology studies of carcinogenic environmental pollutants. Effects of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in environmental pollution on exogenous and oxidative DNA damage. Mutat Res. 544 (2-3), 397-402 (2003).
  41. Phillips, D. H., Arlt, V. M. Genotoxicity: damage to DNA and its consequences. EXS. 99, 87-110 (2009).
  42. Nitsch, S., Schneider, R. Native ChIP: Studying the genome-wide distribution of histone modifications in cells and tissue. Meth Mol Biol. 2846, (2024).
  43. Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
  44. Teves, S. S., Henikoff, S. Salt fractionation of nucleosomes for genome-wide profiling. Methods Mol Biol. 833, 421-432 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Gamma H2A X ChIPreplicatiestresschromatinimmunoprecipitatieDNA schaderesponssubcellulaire fractioneringmicrococcaal nuclease digestiechromatinfragmentatiegenoomstabiliteitDNA herstel

Gerelateerde artikelen