Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nabijheidsligatietest om van oncogen afgeleide transcriptie-replicatieconflicten te bestuderen

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67537

⸱

10 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Biochemistry and Molecular Biology, Hengyang Medical School, University of South China, 2National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Preventio, Hunan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een gevoelige en specifieke methode om oncogen-geïnduceerde transcriptie-replicatieconflicten (TRC's) te detecteren met behulp van de nabijheidsligatietest (PLA). Deze benadering maakt gebruik van specifieke antilichamen gericht tegen PCNA en fosfo-CTD RNAPII, waardoor de TRC-prevalentie tussen RNA-polymerase II-transcriptie en DNA-replicatiemachines kan worden beoordeeld.

Samenvatting

Zowel DNA-replicatie als RNA-transcriptie maken gebruik van genomisch DNA als hun sjabloon, waardoor ruimtelijke en temporele scheiding van deze processen noodzakelijk is. Conflicten tussen de replicatie- en transcriptiemachinerie, transcriptie-replicatieconflicten (TRC's) genoemd, vormen een aanzienlijk risico voor de stabiliteit van het genoom, een kritieke factor bij de ontwikkeling van kanker. Hoewel er verschillende factoren zijn geïdentificeerd die deze botsingen reguleren, blijft het moeilijk om primaire oorzaken aan te wijzen vanwege de beperkte hulpmiddelen voor directe visualisatie en duidelijke interpretatie. In deze studie visualiseren we TRC's direct met behulp van een nabijheidsligatietest (PLA), waarbij gebruik wordt gemaakt van antilichamen die specifiek zijn voor PCNA en gefosforyleerd CTD van RNA-polymerase II. Deze benadering maakt nauwkeurige meting mogelijk van TRC's tussen replicatie- en transcriptieprocessen gemedieerd door RNA-polymerase II. De methode wordt verder verbeterd door DNA-primers die covalent aan deze antilichamen zijn geconjugeerd, in combinatie met PCR-amplificatie met behulp van fluorescerende sondes, waardoor een zeer gevoelige en specifieke manier wordt geboden om endogene TRC's te detecteren. Fluorescentiemicroscopie maakt de visualisatie van deze conflicten mogelijk en biedt een krachtig hulpmiddel om genoominstabiliteitsmechanismen te bestuderen die verband houden met kanker. Deze techniek pakt de kloof in directe TRC-visualisatie aan, waardoor een uitgebreidere analyse en begrip mogelijk is van de onderliggende processen die genoominstabiliteit in cellen veroorzaken.

Inleiding

Het genoom dient als sjabloon voor essentiële biologische processen, waaronder replicatie en transcriptie. In gezonde cellen werken RNA-transcriptie en DNA-replicatiemachines doorgaans samen en zijn ze ruimtelijk en tijdelijk gescheiden 1,2,3,4. Onder pathologische omstandigheden, zoals overexpressie van oncogen, kan deze harmonieuze samenwerking echter worden verstoord.

Oncogenen zorgen vaak voor verhoogde transcriptieniveaus, waardoor de kans op botsingen tussen de transcriptie- en replicatiemachine toeneemt5. Sommige oncogenen veranderen de chromatine-architectuur, waardoor het toegankelijker wordt voor transcriptie, maar mogelijk de progressie van de replicatievork wordt belemmerd5. Bovendien kan oncogenactivering replicatiestress veroorzaken door de celcyclus te versnellen6. De activiteit van RNA-polymerase II (RNAPII) is significant verhoogd tijdens de G1/S-faseovergang als gevolg van cycline-afhankelijke kinase (CDK) fosforylering van Rb, waarbij E2F-transcriptiefactoren vrijkomen die de transcriptie van essentiële eiwitten bevorderen, waaronder cyclines, CDK's en huishoudgenen7. De expressie van histon-gen piekt tijdens de S-fase, wat samenvalt met DNA-replicatie8. Bovendien vereist het transcriberen van de volledige transcripten van enkele zeer lange genen meer dan één celcyclus9. Bij elke intrede in de S-fase kan de gelijktijdige activiteit van transcriptie- en replicatiemachines in dezelfde genomische regio's resulteren in schadelijke ontmoetingen, wat tot conflicten kan leiden. Deze conflicten zijn een primaire intrinsieke bron van genoominstabiliteit, die nauw verbonden is met tumorigenese. Hoe de replicatiemachine coördineert met RNAPAPII-transcriptie om schadelijke botsingen te voorkomen en genomische stabiliteit te behouden, blijft een belangrijke vraag. Daarom is directe visualisatie van RNAPII-geassocieerde transcriptie-replicatieconflicten (TRC's) essentieel geworden voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen die deze conflicten oplossen en kan het uiteindelijk de basis leggen voor het benutten van deze conflicten voor therapeutische doeleinden.

Transcriptie-replicatieconflicten (TRC's) kunnen in twee richtingen ontstaan: frontaal, waarbij transcriptie en replicatie naar elkaar toe verlopen, en co-directioneel, waarbij ze in dezelfde richting bewegen. Frontale botsingen zijn veel destructiever dan co-directionelebotsingen 10,11,12,13. De vorming van DNA-RNA-hybriden (R-lussen) is geïdentificeerd als een belangrijke aanjager van TRC's; zo heeft een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek de aanwezigheid van TRC's afgeleid door het voorkomen van R-lussen en hun regio's te beoordelen als reactie op ontregelde replicatie en/of transcriptie 10,11. Of de accumulatie van transcriptie-afgeleide R-lussen dient als een proportioneel obstakel voor replicatie en direct correleert met TRC's blijft echter een onopgeloste vraag. Onderzoekers hebben ook TRC's onderzocht door de dynamiek van replicatievorken te analyseren. Tweedimensionale gelelektroforese van reportergenen kan bijvoorbeeld locusspecifieke replisoompauzes12 aan het licht brengen, terwijl DNA-vezeltesten onderzoekers in staat stellen veranderingen in replicatievorksnelheid, oorsprongsdichtheid en vorkasymmetrie13 te onderzoeken. De vooruitgang van de volgende generatie sequencing-technologie heeft geleid tot de ontwikkeling van verschillende innovatieve methoden, zoals Okazaki-fragmentsequencing (Ok-seq)14,15, sequencing op de initiatieplaats (ini-seq)16,17, sequencing van korte ontluikende strengen (SNS-seq)18, Repli-seq19 en sequencing van polymerasegebruik (Pu-seq)20. Deze technieken hebben genoombrede profielen opgeleverd van het gebruik van replicatieoorsprong, vorkrichting en replicatiebeëindiging, waarbij sleutelfactoren aan het licht komen die betrokken zijn bij de coördinatie van replicatie en transcriptie. TRIPn-seq is een van de weinige methoden die in staat is om transcriptie en replicatie co-occupancy direct te detecteren, waardoor ons begrip van de dynamische organisatie van DNA-replicatie en transcriptie onder fysiologische en pathologische omstandigheden aanzienlijk wordt uitgebreid21. Ondanks de waardevolle inzichten die deze op sequencing gebaseerde methoden bieden, beperken hun hoge kosten en tijdrovende aard hun bredere toepassing. Daarom is het van cruciaal belang om een meer definitieve, zeer gevoelige, gemakkelijke en snellere detectiemethode vast te stellen om TRC's op eencellig niveau te visualiseren en te kwantificeren.

De in situ proximity ligation assay (PLA), ook bekend als Duolink PLA-technologie, is een krachtige methode voor het evalueren van de fysieke nabijheid van doeleiwitten in weefselsecties of celculturen. Deze techniek genereert alleen een signaal wanneer twee eiwitten of eiwitcomplexen zich binnen 40 nm van elkaar bevinden. Het vereist twee primaire antilichamen tegen de doeleiwitten, elk van een andere soort (bijv. muis/konijn, konijn/geit of muis/geit). Na incubatie van het monster met deze primaire antilichamen worden secundaire antilichamen die bekend staan als PLA-sondes (één PLUS en één MINUS) aangebracht. In tegenstelling tot reguliere secundaire antilichamen die binden aan de constante gebieden van primaire antilichamen, zijn PLA-sondes covalent gekoppeld aan specifieke DNA-primers. Wanneer de doeleiwitten zich in de buurt bevinden (minder dan 40 nm), kan een connectoroligonucleotide hybridiseren met beide PLA-sondes, waardoor de enzymatische ligatie van hun aangehechte oligonucleotiden in een DNA-molecuul van volledige lengte wordt vergemakkelijkt. Dit nieuw gevormde DNA dient als een surrogaatmarker voor de gedetecteerde eiwitinteractie en fungeert als een sjabloon voor amplificatie. Het versterkte product wordt vervolgens gevisualiseerd met behulp van fluorescerend gelabelde oligonucleotide-sondes. Als de eiwitten meer dan 40 nm van elkaar verwijderd zijn, kunnen de PLA-sondes geen DNA-sjabloon vormen, waardoor er geen detecteerbaar signaal is. Het schematische diagram van PLA is weergegeven in figuur 1. De nabijheid en/of interactie wordt door fluorescentiemicroscopie gevisualiseerd als fluorescerende stippen, en het aantal en de intensiteit van deze stippen kunnen worden gekwantificeerd. Sinds de uitvinding in 2002 is PLA populair geworden voor het monitoren van eiwitinteracties vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit. In tegenstelling tot op sequencing gebaseerde assays, vereist PLA slechts kleine hoeveelheden monsters, waardoor het gunstig is voor het analyseren van schaarse monsters.

Studies hebben aangetoond dat de expressie van de oncogene KRAS G12D-mutatie leidt tot transcriptie-replicatieconflicten (TRC's)22,23. Onderzoek gepresenteerd door Meng et al.23 geeft bijvoorbeeld aan dat ectopische expressie van KRAS G12D in menselijke ductaal epitheelcellen van de alvleesklier (HPNE) TRC's en TRC-gerelateerde R-lussen verbetert. Om botsingen tussen RNAPAPI-transcriptie- en replicatiemachines in cellijnen te kunnen detecteren, bieden we een protocol dat speciaal voor dit doel is ontwikkeld. Het KRAS (G12D) plasmide en de vectorcontrole worden getransfecteerd in menselijke longepitheliale BEAS-2B-cellen, en KRAS (G12D) expressie, samen met DNA-schade (γH2AX), wordt geverifieerd door Western blot. De accumulatie van R-lus wordt bevestigd door S9.6 dot blot-analyse, die samen de accumulatie van replicatiewegversperringen en genoominstabiliteit aangeeft in cellen die KRAS (G12D) tot expressie brengen. Ten slotte worden de cellen op objectglaasjes gefixeerd voor de PLA-test. Voor gelokaliseerde detectie van botsingen worden cellen eerst gekleurd met primaire RNAPII- en PCNA-antilichamen, gevolgd door kleuring met secundaire antilichamen geconjugeerd met PLA-sondes. Een cirkelvormig DNA-molecuul vormt zich door succesvolle ligatie en dient als sjabloon voor daaropvolgende rollende cirkelversterking (RCA). De dia's worden vervolgens gemonteerd met de juiste montagemedia en gevisualiseerd onder een fluorescentiemicroscoop. De beelden kunnen worden geanalyseerd met behulp van ImageJ.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Productie en transductie van lentivirussen in de doelcellijn

  1. Productie van lentivirussen24
    1. Zaai 293T verpakkingscellen op 3 × 106 cellen per 10 cm-plaat in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; compleet medium) met een hoge glucose. Cellen nog 18-20 uur bij 37 °C laten groeien in een bevochtigde 5% CO2 -incubator.
    2. Bereid in twee buisjes van 1,5 ml een DNA-mengsel van in totaal 24 μg plasmide-DNA in 500 μl Opti-MEM (gereduceerd serummedium) dat respectievelijk 9,2 μg psPAX2, 2,8 μg pMD2.G bevat, samen met 12 μg pLVX-KRAS-plasmide of lege vector.
      OPMERKING: Omdat endotoxinen de transfectieefficiency aanzienlijk verminderen, wordt het geadviseerd om endotoxine uit het plasmide tijdens zuivering te verwijderen.
    3. Verdun 144 μl polyethyleenimine (PEI; 1 mg/ml) in 1 ml gereduceerd serummedium, meng en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    4. Voeg druppelsgewijs 500 μL verdunde PEI toe aan het verdunde DNA-mengsel terwijl u de buis voorzichtig aflikt. Incubeer de PEI/DNA-mengsels gedurende 15 minuten bij RT.
    5. Zuig tijdens de incubatie voorzichtig de media op van de eerder gezaaide platen van 10 cm. Vervang door 10 ml verse complete DMEM.
    6. Na de incubatie pipettert u langzaam het mengsel van DNA: PEI-transfectie op de platen van 10 cm en zorg ervoor dat de cellen niet worden losgemaakt.
      OPMERKING: PEI is een veelgebruikt transfectiereagens, maar zijn concentratie moet zorgvuldig worden geoptimaliseerd om transfectieefficiency en cytotoxiciteit in evenwicht te brengen. Ondanks de hogere kosten van Lipofectamine 3000 (transfectiereagens), heeft het hogere transfectieefficiency en lagere cytotoxiciteit aangetoond in vergelijking met PEI in bepaalde cellijnen, die tot betere virale productie leiden. Elektroporatie is een ander alternatief dat elektrische pulsen gebruikt om nucleïnezuren in cellen te introduceren. Hoewel het effectief is, vereist het gespecialiseerde apparatuur en kan het arbeidsintensiever zijn.
    7. Laat de cellen 18 uur groeien en vervang vervolgens voorzichtig de transfectiemedia door vers 10 ml DMEM Compleet medium dat 25 μM chloroquine bevat.
    8. Na 72 uur transfectie verzamelt u de kweekmedia die het virusdeeltje bevat. Verwijder de verpakking 293T cellen door 500 x g gedurende 5 minuten te centrifugeren.
    9. Verzamel het bovenstaande en filtreer het door een polyethersulfonfilter (PES) van 0,45 μm. Gebruik het virale supernatans rechtstreeks.
      OPMERKING: Het virale supernatans moet worden verdeeld en ingevroren in vloeibare stikstof en bij -80 °C worden bewaard om titerverlies te voorkomen.
  2. Lentivirale infectie van doelwitcellen
    1. Zaai 2 × 106 doelwitcellen BEAS-2B in twee platen van 6 cm en groei 's nachts bij 37 °C, 5% CO2 . Zorg er bij transductie voor dat de BEAS-2B-cellen voor ongeveer 70% samenvloeien.
    2. Verwijder voorzichtig het oude medium en voeg de juiste 0,5 ml KRAS of vector lentivirale deeltjes samen met 3 ml vers compleet RPMI-1640 medium toe aan respectievelijk twee platen.
    3. Kweek de cellen gedurende 18-20 uur bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator. Vervang het oude medium met lentivirale deeltjes door 3,5 ml vers, voorverwarmd volledig kweekmedium. Verzamel na 72 uur transductie de cellen voor de volgende test.
      OPMERKING: Als nachtelijke incubatie met het virus toxiciteit veroorzaakt, kan de incubatietijd worden verkort tot 4 uur. Om het evenwicht tussen transductie-efficiëntie en cellulaire gezondheid te bereiken, moeten de volgende strategieën worden overwogen: (1) Optimaliseer de veelheid van infecties; (2) Gebruik virale preparaten van hoge kwaliteit; (3) Gebruik polykationen (zoals polybreen) om de efficiëntie te verbeteren, waardoor het gebruik van lagere virale titers mogelijk is en potentiële toxiciteit wordt verminderd; (4) Overweeg voor langetermijnstudies het gebruik van induceerbare expressiesystemen om transgenexpressie tijdelijk te controleren, waardoor de belasting van cellen wordt verminderd en potentiële toxiciteit wordt geminimaliseerd.

2. Verificatie van KRAS (G12D) afgeleide DNA-schade en R-lusvorming

  1. Bevestig genexpressie en DNA-schade door WB-assay
    1. Zuig het kweekmedium van de platen op.
    2. Was de cellen voorzichtig met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om eventueel achtergebleven medium of vuil te verwijderen.
    3. Voeg een kleine hoeveelheid 1x PBS toe om de cellen vochtig te houden tijdens het schrapen.
    4. Gebruik een celschraper, houd deze schuin en schraap de cellen voorzichtig in een consistente richting van het oppervlak.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te veel druk uitoefent, dit kan de cellen beschadigen.
    5. Kantel de plaat en gebruik een pipet om de celsuspensie in een buis op te vangen en draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g . Gooi het bovenstaande weg.
    6. Bereid de 1x RIPA buffer voor door de 2x RIPA buffer te verdunnen (zie Tabel 1), en voeg direct voor gebruik de proteaseremmercocktail en fosfataseremmercocktail toe.
    7. Lyseer de celpellet met voorgekoelde RIPA buffer (1x) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Verwijder het vuil door 10 minuten te centrifugeren op 15.000 x g . Verzamel het bovenstaande en meet de eiwitconcentratie met behulp van de Bradford-test.
    8. Voeg 4 x natriumdodecylsulfaat (SDS) monsterlaadbuffer toe aan het bovenstaande en denatureer de eiwitten gedurende 5 minuten bij 95 °C. Scheid eerst 40 μg eiwit van elk monster in een 12,5% SDS-polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) gel en breng het vervolgens over naar 0,2 μm nitrocellulosemembranen (zie Materiaaltabel).
    9. Blokkeer na het voltooien van de overdracht de membranen met Blocking Buffer (5% magere melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween 20 [TBST; Tabel 1]) gedurende 1 uur.
    10. Spoel het membraan kort met TBST en incubeer het membraan vervolgens 's nachts bij 4 °C met primaire antilichamen tegen FLAG-tag (1:2500 verdunning in PBST) en γH2AX (1:1000 verdunning in PBST) (zie materiaaltabel).
    11. Verwijder de primaire antilichamen en was het membraan 3 keer met TBST, telkens gedurende 10 minuten.
    12. Dompel de membranen onder in verdunde mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:5.000 in TBST-buffer met 5% magere melk) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (RT).
    13. Was het membraan 3 keer met TBST, telkens gedurende 10 minuten.
    14. Visualiseer de eiwitniveaus via de verbeterde chemiluminescentie (ECL) reagentia (zie Materiaaltabel).
  2. Detectie van R-lus door Dot blot25​
    1. Zuig het kweekmedium van de platen op.
    2. Was de cellen voorzichtig met 1x PBS om achtergebleven medium of vuil te verwijderen.
    3. Voeg een kleine hoeveelheid 1x PBS toe om de cellen vochtig te houden tijdens het schrapen.
    4. Gebruik een celschraper, houd deze schuin en schraap de cellen voorzichtig in een consistente richting van het oppervlak.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te veel druk uitoefent, dit kan de cellen beschadigen.
    5. Kantel de plaat en gebruik een pipet om de celsuspensie in een buis op te vangen en draai de cellen gedurende 5 minuten op 500 x g . Gooi het bovenstaande weg.
    6. Lyse 2 × 106 cellen met 300 μL ijskoude cellysisbuffer (zie tabel 1). Incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer 5 minuten op 500 x g bij 4 °C en gooi het supernatant weg. De korrel bevat kernen.
    7. Gebruik een punt met brede opening om elke pellet opnieuw te suspenderen met 300 μL voorgekoelde nucleaire lysisbuffer (zie tabel 1).
    8. Voeg 3 μl 20 mg/ml proteïnase K (zie materiaaltabel) toe aan elk monster en verteer gedurende 3-5 uur bij 55 °C.
    9. Voeg 100 μL Elution Buffer (zie tabel 1) toe aan elke buis en meng grondig.
    10. Voeg 400 μL fenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1 pH 8,0) toe aan elke buis. Centrifugeer na krachtige vortex bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om DNA te scheiden van andere celinhoud.
    11. Breng de bovenste waterige fase voorzichtig over naar de nieuwe buizen.
    12. Precipiteer het DNA door 1/10 volume 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 2,5 volume voorgekoelde 100% ethanol aan het monster toe te voegen. Meng grondig en incubeer gedurende 4 uur of een nacht bij -20 °C.
      OPMERKING: De toevoeging van glycogeen (zie materiaaltabel) aan het monster kan het DNA-herstel door ethanolprecipitatie verhogen. De uiteindelijke glycogeenconcentratie is ongeveer 0,05-1 μg/μL.
    13. Pellet het DNA door 30 minuten bij 4 °C te centrifugeren bij 12.000 x g . Gooi het bovenstaande weg zonder de pellet te verstoren.
    14. Spoel de pellet af met 1 ml ijskoude 70% ethanol en centrifugeer nogmaals 5-15 minuten op 12.000 x g bij 4 °C.
    15. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg om te voorkomen dat de DNA-pellet wordt verstoord.
    16. Laat de DNA-pellet 5-10 minuten aan de lucht drogen.
    17. Los de DNA-pellet op door 50 μl voorverwarmde TE-buffer (pH8.0) toe te voegen en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C. Meet de DNA-concentratie van elk monster.
    18. Bereid verdunningen van DNA tot de gewenste concentraties in TE-buffer (5 ng/μL tot 200 ng/μL). Breng gelijkmatig 20 μL van elk monster aan op een positief geladen nylon membraan door een dot-blot-apparaat.
      OPMERKING: Om R-lussen te detecteren met behulp van een dot blot-assay, wordt aanbevolen om ongeveer 500 ng genomisch DNA per punt toe te passen. Het is aangetoond dat deze hoeveelheid voldoende gevoelig is voor het detecteren van RNA-DNA-hybriden bij gebruik van het S9.6 monoklonale antilichaam, dat specifiek aan deze structuren bindt.
    19. Immobiliseer het DNA door het DNA te verknopen met het nylonmembraan (zie Materiaaltabel) via de UV-crosslinker "Auto Crosslink"-instelling (1.200 μJ x 100) (zie Materiaaltabel).
    20. Dompel de membranen 1 uur onder in de blokkeerbuffer (zie tabel 1) bij kamertemperatuur. Spoel de membranen vervolgens kort af met TBST.
    21. Incubeer een nacht het membraan met primair antilichaam (zie materiaaltabel) bij 4°C. De verdunning van S9.6 is 1:1.000 in TBST met 5% BSA.
    22. Verwijder het primaire antilichaam en was 3 keer met TBST, en elke keer gedurende 10 minuten.
    23. Incubeer het membraan met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam in 5% BSA in TBST bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
    24. Verwijder secundair antilichaam en was 3 keer met TBST, en elke keer gedurende 10 minuten.
    25. Visualiseer de R-lusniveaus via de ECL-reagentia (Enhanced Chemiluminescence) Zie materiaaltabel).

3. PLA-test

  1. Voorbereiding van de cellen
    OPMERKING: Transductie van cellen met het KRAS G12D-oncogen leidt tot een toename van TRC's, zoals blijkt uit een positief PLA-signaal. Deze methode onderscheidt oncogen-gedreven TRC's effectief van achtergrondniveaus zonder dat antibioticaselectie nodig is. Het implementeren van antibioticaselectie na transductie kan echter het algehele signaal verbeteren door de populatie van succesvol getransduceerde cellen te verrijken, waardoor de gevoeligheid en specificiteit van de test worden verbeterd.
    1. Plaats een dekglaasje met een diameter van 12 mm in elk putje van een plaat met 12 putjes.
    2. Zaai de met lentivirus geïnfecteerde cellen 24 uur na de infectie in deze putjes en houd de cellen op een afdekbril in 500 μl compleet RPMI-1640-medium bij 37 °C met 5% CO2.
    3. Optimaal) Als de experimentele opzet antibioticaselectie omvat om te verrijken voor succesvol getransduceerde cellen, voeg dan in dit stadium het juiste antibioticum toe aan het kweekmedium.
    4. Bewaak de cellen om ervoor te zorgen dat ze 48-72 uur na infectie ongeveer 60% samenvloeiing bereiken.
    5. Verwijder RPMI-1640 voorzichtig en pre-extract cellen met koude 0,5% NP-40 gedurende 4 minuten op ijs.
    6. Voeg 500 μL fixatiebuffer (zie tabel 1) rechtstreeks toe om de cellen gedurende 15 minuten bij RT te fixeren.
      OPMERKING: Het wordt aangeraden om cellen niet te wassen vóór de fixatiestap, omdat dit ertoe kan leiden dat ze loskomen van het oppervlak waarop ze groeien, vooral als de cellijn gevoelig is voor loslating; Daarom wordt vaak de voorkeur gegeven aan het direct toevoegen van de fixeeroplossing.
    7. Stop de reactie door de fixatiebuffer te verwijderen en de cellen 3 keer voorzichtig te wassen met 1x PBS.
    8. Zuig PBS op en voeg 500 μL voorgekoelde 100% methanol toe aan de cellen.
    9. Permeabiliseer de cellen door 15-30 minuten bij -20 °C te incuberen.
    10. Blokkeer cellen met Duolink-blokoplossing gedurende 1 uur bij RT.
  2. Antilichaam kleuring
    1. Verdun anti-RNAPII 8WG16 (1:500) en anti-PCNA (D3H8P) van konijnen (1:500) in verdunningsbuffer van Duolink-antilichamen. Incubeer de cellen met het mengsel van primaire antilichamen een nacht bij 4 °C in een vochtigheidskamer.
      OPMERKING: Voer het PLA-protocol uit met slechts één van de primaire antilichamen (anti-RNAPII of anti-PCNA) en laat de andere weg. Dit helpt bij het identificeren van elk achtergrondsignaal dat het gevolg is van niet-specifieke interacties van de individuele antilichamen of PLA-sondes.
    2. Verwijder voorzichtig de primaire antilichamen van de objectglaasjes met behulp van een pluisvrij vel oud papier zonder de cellen aan te raken. Was de cellen vervolgens 3 keer met 1x PBS.
    3. Bereid PLA-sondes (of secundair antilichaam) volgens de volgende procedure (zie tabel 2), meng en laat 20 minuten bij kamertemperatuur staan.
    4. Voeg het secundaire antilichaammengsel toe aan de objectglaasjes en incubeer gedurende 2 uur in een vochtigheidskamer bij RT.
  3. Ligatie en amplificatie
    1. Gooi de secundaire antilichaammix weg en was de dia's twee keer met 1x Buffer A elk gedurende 5 minuten.
    2. Bereid het ligatiemengsel voor volgens de volgende procedure (zie tabel 2).
    3. Breng 15 μL ligatiemix aan op elk afdekglaasje en incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten in een vochtigheidskamer.
    4. Was de dia's twee keer met elk 1x Buffer A gedurende 2 minuten.
    5. Bereid het versterkingsmengsel voor volgens de volgende procedure (zie tabel 2).
    6. Breng 15 μL Amplification Mix aan op elk glaasje en incubeer gedurende 100 minuten bij 37 °C in een vochtigheidskamer. Gooi Amplification Mix weg en was twee keer met 1x Buffer B elk gedurende 10 min.
    7. Was de dia's eenmaal met 0,01x buffer B gedurende 1 min.
    8. Zuig buffer B aan en monteer de geleiders in Duolink In Situ montagemedium met DAPI.
  4. Beeldanalyse en drempelbepaling:
    1. Kwantificeer het aantal PLA-foci aan de hand van ImageJ. Geautomatiseerde beeldanalysesoftware kan helpen bij het objectief kwantificeren van PLA-signalen. Kies een drempel van 3 of meer PLA-foci per kern als drempel, omdat minder dan 1% van de controlecellen 3 PLA-foci verwerft onder onverstoorbare omstandigheden.
      OPMERKING: Aangezien de drempel experimenteel wordt bepaald door meerdere monsters en controles te analyseren om rekening te houden met variabiliteit, moeten consistente beeldvormingsinstellingen (bijv. belichtingstijd, versterking) voor alle monsters worden gehandhaafd om vergelijkbaarheid te garanderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

γH2AX dient als biomarker voor DNA-schade. Overexpressie van KRAS (G12D) schaadt de genomische stabiliteit in deze cellen, zoals blijkt uit het verhoogde γH2AX-signaal in de Western blot-analyse (Figuur 2A). Bovendien geeft het geïntensiveerde S9.6 dot blot-signaal in cellen die KRAS (G12D) tot expressie brengen in vergelijking met vectorcontroles (Figuur 2B) aan dat oncogene KRAS-expressie leidt tot de accumulatie van afwijkend...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De RNAPAPI-transcriptiemachine kan een belemmering vormen voor de progressie van de DNA-replicatievork26,27, waardoor TRC's en DNA-schade worden bevorderd, vooral in kankercellen28,29. Het ontcijferen van de eiwitten die TRC's reguleren en het begrijpen van de gedetailleerde mechanismen kan ons helpen begrijpen hoe deze schadelijke gebeurtenissen plaatsvinden en de ontwik...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de startup-financiering van de Universiteit van Zuid-China.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Clarity Western ECL SubstrateBio-Rad1705061
Duolink In Situ Detection Reagents GreenSigmaDUO92014
FLAG antibodyMilliporeF7425
gamma H2AX antibodyCell Signaling25955
Glycogen, molecular biology gradeThermoFisherR0561
Image JNIHhttps://imagej.net/ij/
nitrocellulose membranesAmersham10600004
PCNA antibodyCell Signaling13110
pLVX-Kras G12DN/AN/A
pMD2.GAddgene12259
Proteinase K, recombinant, PCR gradeThermoFisherEO0491
psPAX2Addgene12260
RNAPII antibodySCBTsc-56767
S9.6 antibodyActive motif65683
UV crosslinkersFisher ScientificFB-UVXL-1000

Referenties

  1. Wei, X., Samarabandu, J., Devdhar, R. S., Siegel, A. J., Acharya, R., Berezney, R. Segregation of transcription and replication sites into higher order domains. Science. 281 (5382), 1502-1505 (1998).
  2. García-Muse, T., Aguilera, A. Transcription-replication conflicts: how they occur and how they are resolved. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 553-563 (2016).
  3. Hamperl, S., Cimprich, K. A. Conflict resolution in the genome: how transcription and replication make it work. Cell. 167 (6), 1455-1467 (2016).
  4. Merrikh, H., Zhang, Y., Grossman, A. D., Wang, J. D. Replication-transcription conflicts in bacteria. Nat Rev Microbiol. 10 (7), 449-458 (2012).
  5. Kotsantis, P., Petermann, E., Boulton, S. J. Mechanisms of oncogene-induced replication stress: Jigsaw falling into place. Cancer Discov. 8 (5), 537-555 (2018).
  6. Gnan, S., Liu, Y., Spagnuolo, M., Chen, C. -L. The impact of transcription-mediated replication stress on genome instability and human disease. Genome Instab Dis. 1, 207-234 (2020).
  7. Bertoli, C., Skotheim, J. M., de Bruin, R. A. M. Control of cell cycle transcription during G1 and S phases. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 8518-8528 (2013).
  8. Stein, G. S., Stein, J. L., Van Wijnen, A. J., Lian, J. B. Transcriptional control of cell cycle progression: the histone gene is a paradigm for the G1/S phase and proliferation/differentiation transitions. Cell Biol Int. 20 (1), 41-49 (1996).
  9. Helmrich, A., Ballarino, M., Tora, L. Collisions between replication and transcription complexes cause common fragile site instability at the longest human genes. Mol Cell. 44 (6), 6966-6977 (2011).
  10. Lang, K. S., et al. Replication-transcription conflicts generate R-loops that orchestrate bacterial stress survival and pathogenesis. Cell. 170 (4), 787-799 (2017).
  11. Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
  12. Prado, F., Aguilera, A. Impairment of replication fork progression mediates RNA polII transcription-associated recombination. EMBO J. 24 (6), 1267-1276 (2005).
  13. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Mechanisms of transcription-replication collisions in bacteria. Mol Cell Biol. 25 (3), 888-895 (2005).
  14. Chen, Y. H., et al. Transcription shapes DNA replication initiation and termination in human cells. Nat Struct. Mol Biol. 26 (1), 167-177 (2019).
  15. Petryk, N., et al. Replication landscape of the human genome. Nat Commun. 7, 110208(2016).
  16. Guilbaud, G., Murat, P., Wilkes, H. S., Lerner, L. K., Sale, J. E., Krude, T. Determination of human DNA replication origin position and efficiency reveals principles of initiation zone organisation. Nucleic Acids Res. 50 (13), 7436-7450 (2022).
  17. Langley, A. R., Gräf, S., Smith, J. C., Krude, T. Genome-wide identification and characterisation of human DNA replication origins by initiation site sequencing (ini-seq). Nucleic Acids Res. 44 (21), 10230-10247 (2016).
  18. Besnard, E., et al. Unraveling cell type-specific and reprogrammable human replication origin signatures associated with G-quadruplex consensus motifs. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 837-844 (2012).
  19. Zhao, P. A., Sasaki, T., Gilbert, D. M. High-resolution Repli-Seq defines the temporal choreography of initiation, elongation and termination of replication in mammalian cells. Genome Biol. 21 (1), 176(2020).
  20. Koyanagi, E., et al. Global landscape of replicative DNA polymerase usage in the human genome. Nat Commun. 13 (1), 7221(2022).
  21. St Germain, C. P., Zhao, H., Sinha, V., Sanz, L. A., Chédin, F., Barlow, J. H. Genomic patterns of transcription-replication interactions in mouse primary B cells. Nucleic Acids Res. 50 (4), 2051-2073 (2022).
  22. Edwards, D. S., et al. BRD4 prevents R-Loop formation and transcription-replication conflicts by ensuring efficient transcription elongation. Cell Rep. 32 (12), 108166(2020).
  23. Meng, F., et al. Base-excision repair pathway regulates transcription-replication conflicts in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep. 43 (10), 114820(2024).
  24. Pirona, A. C., Oktriani, R., Boettcher, M., Hoheisel, J. D. Process for an efficient lentiviral cell transduction. Biol Methods Protoc. 5 (1), bpaa005(2020).
  25. Ramirez, P., Crouch, R. J., Cheung, V. G., Grunseich, C. R-Loop analysis by dot-blot. J Vis Exp. 167, e62069(2021).
  26. Gómez-González, B., Aguilera, A. Transcription-mediated replication hindrance: a major driver of genome instability. Genes Dev. 33 (15-16), 1008-1026 (2019).
  27. Einig, E., Jin, C., Andrioletti, V., Macek, B., Popov, N. RNAPII-dependent ATM signaling at collisions with replication forks. Nat Commun. 14 (1), 5147(2023).
  28. Zardoni, L., et al. Elongating RNA polymerase II and RNA:DNA hybrids hinder fork progression and gene expression at sites of head-on replication-transcription collisions. Nucleic Acids Res. 49 (22), 12769-12784 (2021).
  29. Xiao, Y., et al. Profiling of RNA-binding protein binding sites by in situ reverse transcription-based sequencing. Nat Methods. 21, 247-258 (2024).
  30. Tang, J., et al. Enhancing transcription-replication conflict targets ecDNA-positive cancers. Nature. 635, 210-218 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GenoominstabiliteitRNA polymerase IIPCNA antilichaamfluorescentiemicroscopieDNA replicatiePCR amplificatiestabiliteit van het kankersgenoomdetectie van endogeen TRC

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.