Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Mechanische mapping van sferoïden met behulp van Brillouin-spectroscopie

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67538

⸱

12 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een protocol voor mechanische karakterisering van levende sferoïden binnen een 3D-matrix met behulp van Brillouin-microspectroscopie. Deze volledig optische methode maakt sferoidvisualisatie mogelijk met microschaalresolutie en kwantitatieve mechanische eigenschappen. Deze benadering heeft implicaties voor mechanische fenotypering; bijvoorbeeld het bepalen van pathologische toestanden van tumorsferoïden binnen een 3D-microomgeving.

Samenvatting

Brillouinspectroscopie, een opkomende techniek die grote belangstelling krijgt in de biomedische wetenschap, stelt onderzoekers in staat informatie te verzamelen over mechanica en structuur door de visco-elastische en architectonische eigenschappen van monsters op een niet-destructieve, contactloze manier te onderzoeken. Deze benadering evalueert de mechanische eigenschappen van 3D-monsters door de interactie van zichtbaar licht met thermisch geïnduceerde akoestische golven/fononen te meten. De informatie die Brillouin-spectroscopie biedt, heeft potentie voor in vivo beoordeling van biofysica en mogelijke diagnose van ziektepathologieën. Een belangrijk voordeel van Brillouin-spectroscopie is het vermogen om microschaalmechanica binnen een biologisch monster te beoordelen; andere conventionele technieken die deze resolutie kunnen bereiken, zoals atoomkrachtmicroscopie, kunnen alleen monsters in 2D onderzoeken omdat ze direct contact vereisen. Dit werk beschrijft de toepassing van Brillouin-microspectroscopie om de biomechanica van levende sferoïden te onderzoeken die zijn ingebed in een 3D-hydrogelmatrix. Het inkapselen van cellulaire sferoïden binnen een 3D-microomgeving vestigt een sferoïde dat de interface tussen cellen en de extracellulaire matrix in vivo nauwkeurig recapituleert. In ons protocol beschrijven we de voorbereiding van sferoidmonsters en metingen van Brillouin-spectra met sequentiële fluorescentiebeeldvorming. Daarnaast bespreken we procedures voor spectrale data-analyse en technische details over het optische systeem.

Inleiding

Het cultiveren van cellen in 3D-modellen is voordelig vergeleken met de gebruikelijke 2D-celkweekmethoden, omdat het beter weefselstructuren en cel-celinteracties in vivo reproduceert. Sferoïden zijn 3D-celaggregaten die complexe cel-celinteracties mogelijk maken; Deze interacties worden aangetast in cellen die als monolaag op weefselcultuurplastic zijn gekweekt. Sferoïden kunnen worden gekweekt binnen een steiger die de microomgeving nabootst waar de cel vandaan komt. Zo zijn hydrogels een populair biomateriaal dat wordt gebruikt om cellen/sferoïden in te kweken, omdat ze een nauwkeurige controle mogelijk maken van parameters zoals stijfheid, afbreekbaarheid, poriegrootte en de opname van groeifactoren1 (Figuur 1A). Mechanische aanwijzingen gaan vaak vooraf aan biochemische veranderingen in ziektepathologieën zoals kanker en fibrose 2,3, daarom is het verkrijgen van de biomechanische signatuur in klinisch relevante 3D-modellen van ziekte essentieel voor het ontwikkelen van diagnostische interventies om de therapeutische praktijk te informeren en de onderliggende pathofysiologiete begrijpen 4.

Brillouin-microscopie (BM) is een beeldvormingstechniek waarmee de mechanische eigenschappen van biologische materialen kunnen worden gemeten in 2D-vlakken 5,6,7. BM heeft enkele belangrijke voordelen ten opzichte van andere, meer gebruikte methoden, zoals atoomkrachtmicroscopie (AFM) en elastografie. Het is goed gedocumenteerd dat AFM een hoge ruimtelijke mechanische resolutie kan bereiken en dat elastografie mechanica in monsters 8,9 kan onderzoeken. BM vereist geen direct contact met het onderzochte materiaal, waardoor het een ideale techniek is ten opzichte van AFM voor monsters/cellen die moeilijk toegankelijk zijn, zoals sferoïden in hydrogels. Een ander belangrijk voordeel van BM is dat het geen labeling van monsters vereist en microschaalresolutie binnen biologische monsters kan bieden, wat bij veelgebruikte elastografiemethoden geen7 kunnen bereiken; Meer geavanceerde optische elastografietechnieken kunnen werken op microschaalresolutie10. Het moet worden opgemerkt dat de precieze effectieve resolutie in Brillouin-beeldvorming van heterogene biologische monsters niet eenvoudig is om te bepalen. Ten eerste hangt voor een gegeven verlichtingsgolflengte af van de optische eigenschappen die de grootte van de brandpuntspunt beschrijven (numerieke apertuur, NA, van de objectieflens en de opaciteit van het monster). Daarnaast wordt de nauwkeurigheid waarmee de mechanische eigenschappen van het monster kunnen worden onderzocht, evenals de vorm van het Brillouin-spectrum, beïnvloed door de akoestische eigenschappen van het materiaal (fonongolflengte en propagatielengte)11,12. Het onderliggende fenomeen achter Brillouin-spectroscopie is Brillouinverstrooiing, waarbij het invallende monochromatische laserlicht interageert met spontane, thermisch geïnduceerde akoestische fononen binnen het biologische medium. Dit resulteert in inelastische verstrooiing van licht en (Brillouin-frequentieverschuiving, BFS) in Figuur 1B en is typisch in de orde van enkele GHz en afhankelijk van of het foton energie verliest of wint, worden Brillouin Stokes- en anti-Stokes-pieken respectievelijk in het spectrum van het verstrooide licht gedetecteerd. Door zijn afhankelijkheid van de lokale geluidssnelheid in het medium is de BFS gerelateerd aan de elastische longitudinale modulus, die op zijn beurt empirisch gecorreleerd is met de Young's modulus 7,13; echter, er moet voorzichtigheid worden betracht bij het maken van vergelijkingen tussen deze moduli, omdat (i) ze niet direct met elkaar gerelateerd zijn, (ii) de Young-modulus meestal in het Pa-kPa-bereik ligt voor biologische monsters en zachte materie, terwijl de longitudinale modulus verkregen uit Brillouin binnen het GPa-bereik ligt, en (iii) parameters zoals veranderingen in brekingsindex en materiaaldichtheid rekening moeten houden met7. De Brillouin-lijnbreedte (in Figuur 1B) is een andere maat verkregen uit BM. Het is gerelateerd aan de longitudinale verliesmodulus, wat inzicht geeft in de viscositeit van het monster; Deze eigenschappen kunnen worden gecorreleerd met viscoelasticiteit14. BM maakt het dus mogelijk om de visco-elastische eigenschappen te beoordelen, waarbij een grotere BFS een stijver materiaal impliceert, en een grotere lijnbreedte een meer viskeuze materiaal (Figuur 1B). Het moet worden opgemerkt dat elastische (Rayleigh) verstrooiing, waarbij de fotonen geen frequentieverschuiving ondergaan, een aanzienlijk grotere kans heeft om op te treden vergeleken met Brillouin-verstrooiing. Daarom moeten Brillouin-spectrometers uitgerust zijn om het Rayleigh-signaal te onderdrukken.

BM is gebruikt om de mechanische eigenschappen van diverse weefsels, biomaterialen en 3D-celkweekmodellen te karakteriseren. Zo werd BM gebruikt om melanoom te onderscheiden van het omliggende gezonde weefsel, waarbij bleek dat het niet-kankerachtige weefsel significant zachter was dan melanoom15. Rad et al. toonden aan dat het verhogen van de polymerconcentratie van hydrogels resulteerde in een grotere BFS en lijnbreedte. Bij de laagste polymeerconcentraties vertoonden hydrogels met cellen grotere afnames in Brillouin-frequentieverschuivingen over zeven dagen vergeleken met lege hydrogels, wat werd voorgesteld te komen door cellulaire herstructurering van de hydrogel. Dit werd niet waargenomen bij 10% polymeerconcentratie, wat een mogelijke gebrek aan cellevensvatbaarheid in deze hydrogels16 onderstreepte.

Het meest relevant voor deze studie is BM gebruikt om de mechanische eigenschappen van sferoïden 17,18,19,20 te onderzoeken. In het bijzonder kan het effect van de lokale micro-omgeving op de sferoïde mechanica worden gedetecteerd met BM20. In vergelijking met tumorsferoïden die in compilatieve hydrogels zijn gekweekt, vertoonden sferoïden gekweekt in stijve hydrogels een hogere BFS, wat wijst op een verhoogde elasticiteitsmodulus20. Ruimtelijke variatie van mechanische eigenschappen binnen een sferoïde kan ook worden gekarakteriseerd met BM. Zo is bijvoorbeeld vastgesteld dat de BFS van tumorsferoïden toeneemt richting de sferoïdekern 20,21. Bovendien correleert een afname van BFS met een verhoogde invasieve invasieve tumor sferoïden20. BM is gebruikt om de mechanische veranderingen van tumorsferoïden als reactie op osmotische shock22 te onderzoeken. In de studie werd de groei van de sferoïden gedurende 5 dagen gemonitord, waarbij werd vastgesteld dat de aanvankelijke mechanische verschillen tussen kanker en gezonde sferoïden die bij de ontlasting werden waargenomen, na verloop van tijd verloren gingen. Een andere studie vond een toename van de BFS van de sferoïde na 7 dagen, wat werd toegeschreven aan een toename van de grootte en het aantal cellen16.

Daarnaast zijn multimodale onderzoeken uitgevoerd, waarbij Brillouin-microscopie wordt gebruikt naast AFM en reologie, om de mechanische eigenschappen van cellen en hydrogelste onderzoeken. Rad et al. gebruikten reologie om de trends gemeten met BM in context te plaatsen, waarmee een sterke positieve correlatie werd vastgesteld tussen de longitudinale modulus en de opslagschuifmodulus ten opzichte van de polymeerconcentratie van hydrogels16. Brillouinmicroscopie en optische pincetmicro-rheologie werden gebruikt om de mechanica van kankercellen te meten die in 3D-hydrogels23 zijn gekweekt. In deze studie werd een verminderde mechanische heterogeniteit gevonden onder cellen in sferoïden vergeleken met enkele cellen die in hydrogels zijn gekweekt.

In dit werk wordt een protocol beschreven om de mechanische eigenschappen van levende sferoïden in hydrogels te onderzoeken met een commerciële Brillouin-microscoop (Figuur 1). Berghaus et al. beschreven een protocol dat de stappen beschrijft om een hoogresolutie Brillouin-spectrometer te bouwen en een methode om deze te kalibreren met referentiematerialen25. Verder beschrijft een protocol van Shi et al. het gebruik van Brillouin-microscopie om de veranderingen in de mechanische eigenschappen van embryonaal weefselte monitoren. We gebruiken mesenchymale stamcel (MSC's) sferoïden in poly(ethyleen) glycol (PEG)-maleimide hydrogels om de beenmergnis na te bootsen en de mechanische eigenschappen van deze omgeving te onderzoeken. Dit 3D-model heeft het potentieel om de mechanische signatuur van beenmergziekten te onthullen, waaronder leukemie, multipel myeloom en secundaire botkanker. Het protocol is daarom direct overdraagbaar naar 3D-modellen van andere ziekten waarbij verstoorde mechanobiologie een belangrijke rol kan spelen in de pathologie. De sferoid- en hydrogelvoorbereiding, fluorescentiebeeldvorming en Brillouin-microscopietechnieken worden toegelicht. De aanbevolen procedures, mogelijke nadelen en mogelijke verbeteringen van de techniek worden besproken. De gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling wordt weergegeven in Figuur S1 en in de sectie Aanvullende Materialen en methoden die gerelateerd zijn aan de experimentele opstelling.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. 2D-celkweek

OPMERKING: Waar mogelijk, zorg ervoor dat al celkweekwerk in een steriele omgeving plaatsvindt met een standaard laminaire flowkap van een weefselkweek om besmetting te voorkomen. MSC's werden gebruikt in het huidige protocol, maar andere celtypen kunnen worden gebruikt om sferoïden te creëren, afhankelijk van de specifieke doelstellingen van de studie.

  1. Kweek MSC's in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) celkweekmedium, met voldoende volume om de cellen te bedekken, met 4,5 g/L D-glucose + L-glutamine aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS), 100 μM natriumpyruvat, 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1% penicilline en streptomycine. Incubeer cellen bij 37 °C en 5%CO2.
  2. Cellen passeren bij 70-80% confluentie door te incuberen met 0,05% trypsine ethylenediamine tetraazijnzuur (EDTA) (het volume trypsine moet 1/3 van het DMEM-volume zijn) gedurende 3 minuten bij 37 °C en 5%CO 2 om cellen van de plaat los te maken. Om de reactie te stoppen, voeg cultuurmedia toe met FBS (minstens evenveel als het volume van toegevoegde trypsine). Tel cellen met een hemocytometer.

2. Sferoïden bereiding

OPMERKING: Waar mogelijk, zorg ervoor dat al celkweekwerk in een steriele omgeving plaatsvindt met een standaard laminaire flowkap van een weefselkweek om besmetting te voorkomen. In deze studie werden microwellplaten gebruikt om MSC-sferoïden te creëren. Deze platen bestaan uit 24 putten, en elke put bevat 1200 microputten met een diameter van 400 μm. Dit maakt de bereiding van een groot aantal sferoïden mogelijk (Figuur 2).

  1. Om de microwell-plaat voor te bereiden, behandel je de putten vooraf door 500 μL anti-hechtingsspoeloplossing aan elke put toe te voegen. Centrifugeplaat op 1.300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Controleer onder een microscoop met 20x vergroting of er luchtbellen aanwezig zijn. Als die er zijn, herhaal dan de centrifugatiestap. Verwijder de anti-hechtingsspoeloplossing.
  2. Om de plaat te wassen, voeg je 1 ml fosfaatgebakken zoutoplossing (PBS) toe en aspireer je. Doe dit twee keer om zeker te zijn dat de spoeloplossing volledig is verwijderd.
  3. Bepaal het aantal cellen per sferoïde en het aantal sferoïden per gel. Dit hangt af van individuele onderzoeksvragen. We gebruikten bijvoorbeeld 100 cellen per sferoïde en 100 sferoïden per gel. Daarom was voor dit protocol slechts één put van de microwellplaat nodig, omdat dit in totaal 1200 sferoïden oplevert. Om het aantal cellen dat nodig is voor één put te berekenen, hebben we de volgende berekening gedaan: 1200 x 100 = 1,2 x 105. Bereken het volume celsuspensie met 1,2 x 105 cellen. Centrifugeer de celsuspensatie op 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en verwijder het supernatantant.
  4. Sussen de cellen opnieuw in 1 mL DMEM (+4,5 g/L D-glucose, + L-Glutamine) aangevuld met 100 μM natriumpyruvat, 1% NEAA, 1% penicilline en streptomycine. Voeg 1 ml celsuspensie toe aan één put van de microwellplaat en pipetteer voorzichtig op en neer om cellen gelijkmatig door de put te verspreiden. Wees voorzichtig dat je geen luchtbellen introduceert. Centrifugeer de plaat op 100 g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur.
    OPMERKING: Op dit moment voegen we FBS niet toe aan de media. Dit is om te voorkomen dat de cellen zich hechten aan het weefselkweekplastic.
  5. Bekijk de plaat onder de microscoop om te controleren of de cellen gelijkmatig verdeeld zijn en naar de bodem van de microwells zijn gezonken. Incubeer cellen bij 37 °C en 5%CO2. Bekijk de vorming van de sferoiden 24 uur later.
    OPMERKING: Sferoïden kunnen tot 48 uur in de plaat blijven zitten, afhankelijk van het celtype en de gewenste compactheid van de bol.
  6. Om de sferoïden van de plaat te oogsten, verwijder eerst langzaam en voorzichtig het kweekmedium, met als doel de sferoïden niet te verstoren. Om te voorkomen dat sferoïden aan plastic materiaal blijven plakken, behandel pipettips en tubes met PBS en 1% FBS. Om te voorkomen dat de sferoïden vast komen te zitten in de pipettoppen, knip je de punt af om de opening te verbreden. Maximum recovery tips kunnen tijdens deze stappen worden gebruikt als extra maatregel om het verlies van sferoïden te voorkomen. Voeg 500 μL PBS toe aan elke put van de microwellplaat en pipette op en neer om sferoïden los te maken. Verzamel de PBS met suspende sferoïden in een buis (Figuur 2).
  7. Bekijk de plaat onder de microscoop met 20x vergroting en herhaal deze stap totdat de meeste sferoïden succesvol zijn verwijderd.
  8. Om het aantal sferoïden in de suspensie te tellen, breng je 50 μL van de suspensie over in een put van een 96-put plaat. Tel het aantal sferoïden in de 50 μL. Om het tellen te vergemakkelijken, kan een kruis op de bodem van de put worden getekend met een permanente stift. Bereken het aantal sferoïden met behulp van vergelijking (1):
    figure-protocol-1

3. Bereiding van PEG-hydrogels

OPMERKING: Waar mogelijk, zorg ervoor dat al celkweekwerk in een steriele omgeving plaatsvindt met een standaard laminaire flowkap van een weefselkweek om besmetting te voorkomen. In deze studie werden PEG-maleimide hydrogels gebruikt, maar ook andere typen kunnen worden toegepast. PEG-maleimide hydrogels werden gevormd met behulp van de thiol-Michael additiereactie27. De gebruikte crosslinks waren een mengsel van PEG-dithiol en protease-afbreekbaar peptide, geflankeerd door twee cysteïneresiduen (VPM-peptide, GCRDVPMSMRGGDRCG). De gels in de huidige studie gebruikten 70% PEG-dithiol en 30% afbreekbaar VPM-peptide.

  1. Maak een 200 mg/mL stockoplossing van VPM-peptide en voeg 2,4 μL peptide per gel toe. Maak een 200 mg/mL bouillonoplossing van PEG-dithiol en voeg 5,6 μL per gel toe.
  2. Suspendeer de sferoïden opnieuw in PBS voordat je ze mengt met de crosslinkers (Figuur 2). Meng de sferoide ophanging met de PEG-dithiol (5,6 μL per gel) en VPM (2,4 μL per gel). Deze oplossing wordt Oplossing B genoemd.
    OPMERKING: In dit protocol werden per gel 100 sferoïden toegevoegd.
  3. Maak een 250 mg/mL PEG-Maleimide-bouillonoplossing. Voeg 50 μg fibronectine per gel toe. Meng de PEG-Maleimide en fibronectine-oplossing; dit wordt Oplossing A. Pipetoplossing A genoemd (40,3 μL voor 100 μL gels) op de onderkant van een 12-wells weefselkweekplaat. Voeg Oplossing B toe (59,7 μL voor 100 μL gels) bij een molaire verhouding van 1:1 maleimide:thiol om volledige crosslinking te garanderen; Zorg ervoor dat de gelatie onmiddellijk plaatsvindt. Het uiteindelijke volume van de hydrogels is 100 μL.
  4. Incubeer gels 30 minuten bij 37 °C en 5%CO2 om gelatie mogelijk te maken. Voeg complete kweekmedia (DMEM aangevuld met 10% FBS, 100 μM natriumpyruvat, 1% NEAA en 1% penicilline en streptomycine) toe aan de put, zodat de gel volledig ondergedompeld is (Figuur 2). Incubeer de gel bij 37 °C en 5%CO-2 totdat het klaar is om metingen te verrichten onder de Brillouin-microscoop.
    OPMERKING: De duur van de sferoidkweek binnen de hydrogels voorafgaand aan de metingen van Brillouin hangt af van het celtype en de onderzoeksvraag. In deze studie worden de sferoïden bijvoorbeeld meestal tot 7 dagen in hydrogels gekweekt, waarna ze worden gecontroleerd met een Brillouin-microscopie. De visco-elastische eigenschappen van de hydrogels met/zonder sferoïde encapsulatie werden gekarakteriseerd en tonen geen significante impact van sferoïden op de gelmechanica (Figuur S2).

4. Fluorescentiekleuring en beeldvorming van sferoïden in hydrogels

OPMERKING: In deze studie werden celkernen en actinefilamenten die het cytoskelet vormen, fluorescerend gekleurd en gefotografeerd vóór de metingen van Brillouin.

  1. Om actine te beitsen, voeg live actine kleuring toe aan cultuurmedia bij 1 op 500 verdunning 3 uur voor beeldvorming. Houd het monster uit het licht door het in folie te wikkelen. Incubeer de gel bij 37 °C en 5%CO2.
  2. Om de kernen te kleuren, voeg je 40 minuten voor beeldvorming 2 druppels/ml levende nucleaire kleuring toe aan het kweekmedium rondom de gel. Breng de monsters terug naar de broedmachine.
  3. Maak zo snel mogelijk fluorescentiebeelden nadat de kleurincubatietijd is voltooid. Controleer of het juiste optische pad (waarbij de microscoopcamera wordt belicht) en de juiste positie van het filterwiel zijn geselecteerd. Dim de lichten in de kamer en leg de achtergrond vast. Schakel de lichtdiode (LED) lichtbron aan en kies de golflengte afhankelijk van het kleuringsprotocol (hier werd 385 nm gebruikt voor kernen en 621 nm voor actinebeeldvorming). Maak fluorescerende beelden van sferoïden met 20x vergroting met de voorkeurssoftware. Zet de LED-bron uit als je klaar bent.

5. Brillouin-microscopie van sferoïden

  1. Inschakelen van de apparaten en laseremissie
    1. Schakel de apparaten aan: de computer, spectrometer, microscoopcamera's, de microscoop, de laserkoelventilator en laseremissie door de sleutel van de controller aan te draaien. Zorg ervoor dat dit 15 minuten vóór spectrometeroptimalisatie gebeurt om te verzekeren dat de laser is gethermaliseerd. Controleer met een vermogensmeter dat het uitgezonden laservermogen is zoals verwacht (100 mW in ons experiment).
  2. Zet de temperatuurregelingsapplicatie in (zie Materiaaltabel) en controleer dat de etalontemperatuur geoptimaliseerd is door het bundelvermogen na de etalon te meten. Als deze aanzienlijk lager is dan verwacht (na rekening te houden met het gebruikte optische dichtheidsfilter (OD), verander dan de doeltemperatuur met 1 °C en let op of het vermogen in de tijd toeneemt. Als er een afname is, keer dan de richting van verandering om. Zodra het vermogen dicht bij het verwachte niveau ligt, kun je het in kleine stappen (0,1 °C) afstemmen tot het maximum is bereikt.
  3. Het focuspunt van de objectieflens in de acrylkubus plaatsen
    OPMERKING: De onderdrukking van elastische verstrooiing en koppeling van de "pompkiller" naar de spectrometer wordt geoptimaliseerd met een monster van stijf, homogeen referentiemateriaal voorafgaand aan elk experiment. In deze studie wordt een acrylkubus gebruikt.
  4. Open de SpectraLok-software en wacht tot alle apparaten zijn gedetecteerd. Aan de linkerkant van het hoofdraam (Figuur 3) selecteer je de spectrometercamera.
    1. Plaats de acrylkubus op de microscoopmonsterhouder met de doorzichtige kant naar de objectieflens. Laat de objectieflens zo ver mogelijk zakken en centreer de kubus eronder. Zorg ervoor dat het optische pad in de microscoop zo is gekozen dat de spectrometercamera wordt belicht (stel de draaipoortselector in op L).
      OPMERKING: In onze opstelling is de L-poort verbonden met de confocale circulator, terwijl de R verbonden is met de microscoopcamerapoort.
    2. Stel in het SpectraLok Camera-venster de sensorbelichtingstijd in op 500 ms en de softwareversterking op 100. De software-versterkingsinstelling verbetert alleen het contrast voor visualisatiedoeleinden.
  5. Maak de lasersluiter vrij.
    OPMERKING: Aangezien de laseremissie aanstaat, zorg ervoor dat je nooit het hoofd of de ogen in het laserstraalpad plaatst.
    1. Druk op capture en beweeg de objectieflens omhoog. Er zal een aanzienlijke toename zijn in signaalintensiteit en er zal een verzadigd patroon (Figuur 4A) verschijnen. Dit wordt veroorzaakt door een sterke reflectie van laserlicht op het lucht-acryl kubusinterface. Als je de lens verder omhoog beweegt, neemt de signaalintensiteit af en worden Brillouin-pieken duidelijk. Blijf de objectieflens herpositioneren totdat de intensiteit van de Brillouin-pieken constant is (Figuur 4B). Dit komt overeen met het brandpunt dat zich volledig in de acrylkubus bevindt.
  6. Het optimaliseren van de etalondruk om het resterende elastisch verstrooide licht te minimaliseren
    OPMERKING: Het doel van de volgende stappen is het elastisch verstrooide Rayleigh-signaal te onderdrukken zodat alleen het frequentieverschoven Brillouin-licht de spectrometercamera bereikt.
  7. Open in de SpectraLok-software het Pump Killer (PK) bedieningsvenster (Figuur 5).
  8. Zoom in op een van de helderste Brillouin-orders en pas de positie van de drukactuator in stappen van 100 μm aan door op 'beweeg relatie' te klikken om de piekintensiteit van Rayleigh te minimaliseren. Als het Rayleigh-signaal toeneemt, draai dan de richting van de verandering om door op terugkeren te klikken. Vervolgens wordt de etalondruk fijn afgestemd in stappen van 10 μm.
    OPMERKING: In de acrylkubus kan het Rayleigh-licht volledig worden onderdrukt; Dit hoeft niet het geval te zijn bij een heterogeen biologisch monster.
  9. Het optimaliseren van de stripe-overlay om spectrale data te "unwrappen"
    OPMERKING: De volgende procedure zorgt ervoor dat de (x, y) pixelcoördinaten van de camerasensor correct worden toegewezen aan golflengte via toepassing van de look-up table LUT.
  10. Zoom in het cameravenster in op een van de Brillouin-bestellingen.
  11. Druk op s om strepen te visualiseren waarover de LUT is aangebracht op het camerabeeld (Figuur 6A). Open het Instellingen-venster en druk op snel-kalibreren om de optimale horizontale offset van de strepen opnieuw te berekenen. Als de sensor verzadigd is, verkort dan de belichtingstijd vóór deze stap.
    1. Controleer in het cameravenster of de paarse strepen goed overdekt zijn met het centrale gebied van de Brillouin-pieken (Figuur 6B).
  12. Optimalisatie van de PK-spectrometerkoppeling
  13. Afstelling van de assen van de collimatorlens maakt het mogelijk de efficiëntie van de koppeling van licht van de PK naar de spectrometer te maximaliseren.
  14. Open het spectrumvenster en klik op uitpakken om het spectrum op te halen (Figuur 7).
  15. Open het PK-controlevenster . Met stappen van 0,0005° wordt de collimatorassen 1 en 2 iteratief aangepast om het Brillouin-signaal te maximaliseren. Indien nodig kan de etalondrukregeling verder worden geoptimaliseerd. In een homogene acrylkubus kan het Rayleigh-signaal volledig worden onderdrukt (Figuur 7A). Hoewel nauwkeurige Brillouin-metingen met enig restant Rayleigh-signaal mogelijk zijn (Figuur 7B), verduistert elastisch verstrooid licht bij slechte onderdrukking (Figuur 7C) het Brillouin-signaal.
  16. Controleer of het bereikte Brillouin-signaal vergelijkbaar is met de referentieamplitude. Bijvoorbeeld, in ons systeem, bij blootstelling van 500 ms en met OD 0,3, is de Brillouin-piekintensiteit amplitude ongeveer 3000 tellingen. Om wijzigingen in de PK-parameters in het configuratiebestand op te slaan, klik je in het PK-venster op ' alles verversen ' en 'sla alles op'. Verder drukt u in het hoofdvenster op opslaan in het Bestand I/O-gedeelte .
  17. Overschakelen naar scansoftware en controleren of de parameters nog steeds geoptimaliseerd zijn
  18. Sluit SpectraLok en open de scansoftware. In het huidige protocol werd op LabVIEW gebaseerde software gebruikt en wordt deze in meer detail beschreven in Figuur S3. Om de scangeometrie in te stellen, wordt deze propriëtaire gebruikersinterface (UI) gebruikt om de Prior XY-Z vertaalfase te besturen; echter, andere methoden kunnen worden toegepast.
    1. Installeer de glasbodem petrischaal met het hydrogel-sferoidmonster in plaats van de acrylcube (Figuur 8). Om uitdroging van de gel te voorkomen, staat de broedmachine op 37 °C en 95% relatieve luchtvochtigheid. Verwijder het deksel van de petrischaal en voeg het medium toe om de gel onder te dompelen. Voeg een coverslip aan de bovenkant van de gel om beweging van de gel te voorkomen.
    2. Zoek de bol. Met de laserstraal geblokkeerd, schakel het optische pad van de microscoop over naar het oculair. Doe het witte licht aan. Met de joystick bedien je handmatig de samplestage, lokaliseer en focus je op de sferoid.
    3. Maak een brightfield-afbeelding van de bol. Stel de verlichtingshelderheid aan door het bedieningswiel te draaien. Stel het optische pad in op R, waardoor de microscoopcamera wordt belicht. De belichtingstijd kan indien nodig worden aangepast om een beeld met hoog contrast te verkrijgen (d.w.z. 50 ms).
    4. Controleer of de spectrometer- en unwrapping-parameters nog steeds geoptimaliseerd zijn. Zet de microscooppoort op L en leg de achtergrond vast met de laser geblokkeerd. Ontgrendel de laser door het wiel te draaien om te vuren. Op basis van de gewenste signaal-ruisverhouding selecteer je de belichtingstijd. De belichtingstijd die typisch is voor deze metingen is 200-500 ms.
    5. Als er enige tijd is verstreken (d.w.z. enkele uren) sinds de eerste kalibratie of er is sprake van een mechanische storing in het systeem, kan de etalondrukinstelling of de koppeling van de PK-spectrometer niet langer optimaal zijn. Herhaal stappen 5.3-5.5 om de eerder genoemde stappen indien nodig opnieuw te optimaliseren.
    6. Kies uit het onverpakte spectrum het Brillouin peak fitting range. Stel de drempelwaarde aan tot ongeveer de helft van de intensiteit van de Brillouin-pieken. Negeer de Brillouin-pieken met amplitude onder deze drempel. Corrigeer de lasergolflengte volgens alle geïdentificeerde Brillouin-piekparen.
  19. Het instellen van de multidimensionale scangeometrie
  20. Kies de rasterscangeometrie door de breedte van het scangebied en de stapgrootte aan te passen.
    OPMERKING: Voor sferoïden van ongeveer 70 μm gebruiken we voor een laagresolutie-scan doorgaans een scangebied van 150 μm × 150 μm en een stapgrootte van 10 μm. Dit levert een 2D-kaart met lage resolutie op in ongeveer 3,4 minuten.
    1. Start de scan.
  21. Het Brillouin-systeem uitschakelen
    1. Sluit de software en zet de computer uit. Zet de laseremissie uit met de toets op de controller. Laat het sluiterwiel op de geblokkeerde positie staan. Zet de koeling van de laserventilator uit. Zet de microscoop- en spectrometercamera's uit. Zet tenslotte de microscoop uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bestanden die na een scan worden verkregen omvatten spectra, scanfittingparameters (.csv), scanparameters en analyse, BFS- en lijnbreedtekaarten, brightfield-afbeelding met het geïdentificeerde scangebied en een screenshot van het UI-venster. Voor elk punt van de multidimensionale Brillouin-scan wordt een BFS-waarde verkregen. In Figuur 9 wordt een voorbeeld van een scan met hoge resolutie weergegeven naast het brightfield-beeld, en fluorescentiebeelden die ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een protocol opgesteld om Brillouin-microscopie te gebruiken voor biomechanische beeldvorming van sferoïden die zijn ingesloten in hydrogels met microschaalresolutie. De hydrogel kan worden onderscheiden van de levende sferoïde door verschillen in de verkregen BFS-waarden. In de representatieve resultaten gebruikten we MSC-sferoïden en PEG-maleimide hydrogels; Dit protocol is echter breed toepasbaar op andere celtypen (bijvoorbeeld kankercellijnen). De cellen in deze studie wer...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs merken op dat T. Allen en G. Wardle werknemers zijn van LightMachinery, dat de Brillouin-spectrometer produceert en verkoopt die in deze studie wordt gebruikt. Het bedrijf kan profiteren van de publicatie van dit werk. Alle andere auteurs geven geen concurrerende belangen aan.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de financiering die is verkregen uit de MechanoMeds Phase 2-subsidie, UKRI/EPSRC, subsidienummer EP/X033554/1 ter ondersteuning van de ontwikkeling van deze methode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa)Creative PEGWorksPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
AggreWell 400 platesSTEMCELL Technologies34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
Air-spaced etalonLightMachineryHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
Anti-adherence rinsing solutionSTEMCELL Technologies7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
Bold Line Top Stage IncubatorOkolabH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
Cobolt Flamenco-100 660 nm laserHuebner0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
Confocal circulatorLightMachineryHF-13311N/A
D-LEDi Fluorescence illumination system NikonMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
EPI-FL moduleNikonTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
Fibronectin (human)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
Gibco Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)ThermoFisher11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
HyperFine Brillouin spectrometerLightMachineryHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
LED-DA/FI/TR/Cy5-B Quadruple band filter cubeNikonMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
Mesenchymal stem cells (MSCs)PromoCellC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
Motorized translation stage Prior ScientificH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue™ Live ReadyProbes™ reagent (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
Objective, S Plan Fluor 20X NA 0.45, airNikonMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
ORCA-Fusion CMOS cameraHamamatsuC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-dithiol, 2 kDaCreative PEGWorksPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
sCMOS camera Teledyne Vision Solutions01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs 
SPY555-actin SpirochromeCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
TemperatureAppTemperature control software
VPM peptide, GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptN/AN/A
Eclipse Ti-2A microscopeNikonEclipse Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series 

Referenties

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Sfero de mechanica3D hydrogelmatrixcelmechanicaniet invasieve biomechanicafluorescentiebeeldvormingBrillouin verschuivingpreparatie van sfero denspectrale data analyse
Mechanische mapping van sferoïden met behulp van Brillouin-spectroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.