Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Bereiding van Mycobacterium tuberculosis Kweekfiltraat om de pathogenese van tuberculose te begrijpen

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

28 maart 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

In dit artikel

Samenvatting

Hier demonstreren we de bereiding van Mtb-cultuurfiltraat (CF), het bacteriegroeimedium dat bestaat uit eiwitten die door de bacteriën worden uitgescheiden. Mtb scheidt eiwitten af om gastheersignalering en immuunrespons te moduleren, die cruciaal zijn voor pathogenese. De bereide CF's worden geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie om alle secretoire factoren te identificeren.

Samenvatting

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) scheidt veel eiwitten af in de gastheer om verschillende cellulaire processen te moduleren, zoals gastheersignalering, immuunrespons, apoptose, enz., om de overleving te verbeteren. Hoewel de functie van enkele secretoire factoren is opgehelderd, moeten er nog veel worden gekarakteriseerd. Daarom is het onderzoeken van het Mtb-secretoire eiwit een essentieel onderzoeksgebied. Mtb scheidt eiwitten af in de extracytoplasmatische ruimte met behulp van drie verschillende secretiesystemen: algemeen, twin-arginine en gespecialiseerd Type VII-secretiesysteem. Men moet het secretoom voorbereiden om nieuwe secretoire moleculen te identificeren en de bekende factoren functioneel te karakteriseren. Hier schetsen we de methode voor het voorbereiden van het secretoom en de monstervoorbereiding voor massaspectrometrie. Secretoombereiding vereist de grootste zorg om besmetting van cytosolische eiwitten te voorkomen, wat kan worden gecontroleerd door te sonderen met antilichamen tegen goed gekarakteriseerde membraan-, secretoire en cytosolische eiwitten. Het aldus bereide kweekfiltraat kan voor verschillende doeleinden worden gebruikt, waaronder het onderzoeken van de immunomodulatie-eigenschappen van de gastheer.

Inleiding

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), een van de dodelijkste ziekteverwekkers ter wereld, infecteert gezonde personen via aerosolen die worden overgedragen door een geïnfecteerde persoon tijdens niezen of hoesten1. Zodra het de longen binnendringt, wordt het overspoeld door de alveolaire macrofagen, waardoor het immuunsysteem van de gastheer wordt gekaapt om te overleven. Van de verschillende modulerende mechanismen van de gastheer die Mtb heeft om te overleven, zijn secretoire virulentiefactoren er een van. De eiwitten die tijdens de groei door de bacillen in de kweekmedia worden uitgescheiden, worden cultuurfiltraat (CF) -eiwitten2 genoemd. Deze cultuurfiltraateiwitten helpen bacteriën om te overleven onder barre omstandigheden in de gastheercellen. Mtb is uitgerust met drie verschillende soorten secretiesystemen: een gespecialiseerd Type VII-secretiesysteem (T7SS), een algemeen Sec-secretiesysteem (Sec-systeem) en een twin-arginine-secretiesysteem (Tat-systeem). T7SS is het meest exclusieve secretiesysteem in actinobacteriën, in tegenstelling tot type I-VI in Gram-negatieve bacteriën3. De secretie van ongevouwen eiwit over het membraan is voornamelijk betrokken bij het Sec-systeem en de eiwitten worden herkend door een N-terminale signaalsequentie 4,5. Gevouwen of gedeeltelijk gevouwen eiwitten worden door het Tat-systeem getransporteerd, geïdentificeerd door een N-terminale signaalsequentie met een twin-argininemotief 6,7. Hoe het Sec- en Tat-systeem de eiwitsecretie reguleert, moet nog worden bepaald.

Enkele bekende cultuurfiltraateiwitten in Mtb die helpen de oxidatieve aanval van de gastheer bij infectie te weerstaan en te overleven, zijn enzymen zoals KatG en SodA 8,9, die nodig zijn voor het afbreken van reactieve zuurstofsoorten. Bovendien speelt CFP10-ESAT6, een heterodimer eiwitcomplex, een cruciale rol bij het reguleren van cytokineresponsen, bacteriële ontsnapping, ROS-productie, enz.10. RD1-locus is betrokken bij het moduleren van het Type VII-secretiesysteem, dat de secretie van CFP10-ESAT6 omvat, en de genetische deletie van cpf10-ESAT6 brengt de overleving van bacteriën in ex vivo en in vivo infectiemodellen in gevaar. Mycobacterium bovis De BCG-vaccinstam mist RD1-locus die verantwoordelijk is voor de secretie van virulentiefactoren en kan daarom worden gebruikt als het levende verzwakte vaccin11. Verschillende onontgonnen cellulaire processen reguleren het secretieproces strak. De cultuurfiltraateiwitten bevatten reanimatiebevorderende factoren (RpF's) die de bacteriën helpen terug te groeien uit de latente toestand. Reanimatiebevorderende factoren (Rpfs) zijn peptidoglycaan hydrolyserende enzymen waarvan bekend is dat ze een rol spelen bij kiemrust. Mtb codeert voor vijf rpf-achtige genen (rpf A-E) die de bacteriën helpen terug te groeien uit de rustperiode, hetzij solo, hetzij door interactie met andere eiwitten12. Rpf's worden aangetroffen in bacteriecultuurfiltraat en het is bekend dat ze betrokken zijn bij de virulentie van Mtb en de immuniteit van de gastheer13,14. De veel bestudeerde rpf-genen rpfE en rpfB vertonen beschermende immuniteit in vitro13 en versterken de immuunrespons in vivo. Daarom kunnen rpfE en rpfB worden gebruikt als kandidaat-vaccins voor MTB.

Omkeerbare fosforylering15 is een posttranslationele modificatie die verschillende cellulaire processen, celhomeostase, celdeling, enz. verandert. Fosforylering van CFP10 speelt bijvoorbeeld een belangrijke regulerende rol, waarbij zowel fosfoablatieve als mimetische mutanten van CFP10 er niet in slagen het waargenomen fenotype in de CFP10-ESAT6-deletiestam 16 te herstellen. SecA2 daarentegen is een secretoir eiwit dat betrokken is bij DNA-schade van de gastheercel17. Het secretoom van de SecA2-mutant is voldoende om de immuunrespons en signaalcascade van de gastheer te veranderen18,19. Het is dus essentieel en opwindend om het secretoom van H37Rv en de Mtb-mutanten te onderzoeken, waarbij de genen van de secretoire eiwitten worden verwijderd (niet-gepubliceerde gegevens), om inzicht te krijgen in hoe ze de immunomodulatie en overleving van de gastheer beïnvloeden.

Dit rapport richt zich op drie aspecten: de stappen die nodig zijn bij het bereiden van Mtb-kweekfiltraat, het verwerken van de monsters voor massaspectrometrie en het uitvoeren van ex vivo experimenten met kweekfiltraten om immunomodulerende functies te onderzoeken. Eerdere studies toonden de identificatie van kweekfiltraateiwitten aan door middel van 2D-gelelektroforese, gevolgd door massaspectrometrische analyse8. Kweekfiltraateiwitten van geneesmiddelgevoelige en resistente stammen werden geïdentificeerd met behulp van massaspectrometrie om inzicht te krijgen in de secretoomveranderingen en virulentiefactoren te identificeren die een rol kunnen spelen bij resistentie tegen geneesmiddelen20. We hebben eerder het secretoom en fosfosecretoom van Mtb onderzocht met behulp van massaspectrometrie16. Technieken zoals 2D-gelelektroforese hebben een lage doorvoer en worden niet gebruikt om globale veranderingen in het proteoom of secretoom te onderzoeken. De cultuurfiltraateiwitten zouden variëren van bacteriestammen, stadia van de groeiende cellen en zelfs in verschillende stressomstandigheden. Afhankelijk van de verschillende situaties zou de verandering in de secretoire eiwitpools in de cellen het mogelijk maken om het hele secretoom holistisch te onderzoeken en meer informatie te geven over het bacteriële secretiesysteem voor therapeutische interventies. Het zou nog aantrekkelijker zijn om te kijken naar het secretoom in de knock-out- of uitputtingsstammen van secretoire systemen om meer inzicht te krijgen in de routes en doelen van elke secretoire route. Door cellen te behandelen met kweekfiltraateiwitten in plaats van bacteriën, veranderen de cytokinespiegels en andere immunomodulerende factoren17. Met behulp van het secretoomonderzoek kan men nieuwe virulentiefactoren en hun rol in virulentie identificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

LET OP: Hier gebruiken we de H37Rv pathogene laboratoriumstam van Mtb. Men moet de stappen uitvoeren die nodig zijn om de bacteriecultuur te laten groeien en het bovenliggende kweekmiddel te isoleren in Biosafety Laboratory niveau 3 (BSL-3). Van de revival van de cultuur tot de filtraatbereiding wordt de BSL-3-faciliteit gebruikt.

1. Inenting van Mtb-cultuur

  1. Voorbereiding van het werkgebied in BSL-3
    1. Schakel voor gebruik het UV-licht van de bioveiligheidskast 10 minuten in. Reinig de bioveiligheidskast voor en na gebruik met 75% ethanol. Gooi de gebruikte materialen weg in de daarvoor bestemde afvalbakken volgens de bioveiligheidsrichtlijnen.
  2. Bereiding van primaire en secundaire Mtb H37Rv culturen
    1. Neem de glycerolbouillon van -80 °C en ontdooi de bouillon op kamertemperatuur. Gebruik vier onafhankelijke voorraden voor biologische vierlingen.
    2. Neem 10 ml 7H9-medium (tabel 1) met 10% ADC (9 ml 7H9-medium en 1 ml ADC) in een geautoclaveerde conische kolf van 100 ml met een schroefdop.
      OPMERKING: 7H9 + ADC: 7H9 is een voedingsrijk medium dat commercieel wordt verkregen, waaraan we ADC toevoegen (ADC: Albumine, Dextrose en Catalase; Tabel 2). Zowel ADC als OADC kunnen worden gebruikt om de cultuur te laten groeien. Conische kolven zorgen voor meer beluchting van de cultuur; Men kan echter ook een weefselkweekkolf gebruiken om de bacteriecellen te laten groeien.
    3. Inoculeer de hele glycerolvoorraad aan de media om de cultuur nieuw leven in te blazen, die de primaire cultuur wordt. Neem een600~0.8 groeiende Mtb-cultuur voor het maken van glycerolvoorraden. Meng 15% glycerol en de groeiende Mtb-cultuur in een cryovial en bewaar bij -80 °C.
    4. Incubeer de kweekkolven bij 37 °C in een incubator shaker gedurende 3-4 dagen bij 100 tpm.
    5. Meet op de 5edag de absorptie bij 600 nm (A600). Wanneer de culturen A600~0,8-1 bereiken, gebruik de cultuur dan voor het inoculeren van secundaire cultuur bij A600 ~0,2 in 100 ml 7H9 +10% ADC-media in een kolf van 500 ml. Voer dezelfde stappen uit voor de replicaten.
      1. Meet de A600 van de primaire cultuur. Als de A600 ~ 0,8 is, pellet de cultuur dan door centrifugeren op 2100 x g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg, suspendeer de pellet in 5 ml 7H9 + 10% ADC-media en meet de A600. Bereken hoeveel inoculum wordt toegevoegd aan 100 ml secundaire cultuur van A600 ~ 0,2. Als bijvoorbeeld de A600 ~ 4 wordt gebruikt, moet 5 ml van die cultuur worden toegevoegd aan 100 ml verse 7H9 + 10% ADC secundaire cultuur van A600 ~ 0,2.
    6. Kweek ze bij 37 °C in een incubator shaker bij 100 tpm gedurende 2-3 dagen tot OD A600 ~0,8.
    7. Zuig 10 μL op met behulp van een pipetman voorzien van een filtertip en spot de cultuur op een LB Agar-plaat die geen antibiotica bevat in de bacteriekap. Incubeer de plaat gedurende 12-16 uur bij 37 °C om de bacteriële besmetting (indien aanwezig) zichtbaar te maken. Gooi de culturen weg en blaas de nieuwe culturen van het experiment nieuw leven in als er een bacteriële besmetting wordt gedetecteerd.
  3. Bacteriegroei in de media van Sauton
    1. Bij de A600~0,8, inoculeer bacteriën bij A600 ~0,2 in 100 ml Sauton's media in een kolf van 500 ml (tabel 3) en groei gedurende 3-4 dagen nadat de OD ~0,8 heeft bereikt.
    2. Gebruik culturen die zijn gekweekt tot A600 ~ 0,8 in de media van Sauton (de primaire cultuur van Sauton) voor inoculatie van culturen die moeten worden gebruikt voor de bereiding van cultuurfiltraat.
      OPMERKING: 7H9 + ADC is een voedingsrijk medium dat albumine bevat. Albumine kan niet worden gebruikt bij secretoomanalyse, omdat albumine de cultuurfiltraateiwitten kan maskeren. Daarom worden de media van Sauton gebruikt om kweekfiltraat te bereiden. De media van Sauton worden bereid door de in tabel 3 genoemde componenten te reconstrueren.

2. Bereiding van Mtb-cultuurfiltraateiwitten

  1. Centrifugatie voor cultuursupernatans
    1. Gebruik de primaire cultuur van Sauton voor het inoculeren van 300 ml secundaire cultuur van Sauton bij A600 ~0,2. Kweek culturen tot OD A600 ~ 0,4-0,5 is. Gebruik actief groeiende vroege logfaseculturen om besmetting door dode cellen te voorkomen.
      1. Meet de OD van de secundaire cultuur. Als de OD A600 ~0,8 bereikt, pellet de cultuur dan door centrifugeren op 2.100 x g gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg, suspendeer de pellet opnieuw in 10 ml Sauton's media en neem de OD opnieuw. Bereken hoeveel inoculum er wordt toegevoegd aan een cultuur van 300 ml van 0,2 OD van de gemeten OD. Als de OD bijvoorbeeld 8 is, moet 7,5 ml van die cultuur worden toegevoegd aan 300 ml verse Sauton's media van 0,2 OD.
        OPMERKING: Houd u aan de genoemde OD om cellyse en GroEL-besmetting te verminderen. GroEL is een chaperonne en komt constitutief tot expressie in de bacteriecellen. Een deel van de literatuur toonde de aanwezigheid van GroEL in cultuurfiltraten aan als gevolg van stress tijdens de groei. Hier gebruiken we de media van Sauton voor de bereiding van kweekfiltraat, wat zorgt voor milde stress van de cellen; vandaar dat GroEL aanwezig kan zijn in het cultuurfiltraat. Bovendien, als de kweek-OD meer dan 1 is, zou cellyse optreden, wat zou leiden tot de GroEL-contaminatie in kweekfiltraat.
    2. Pellet 300 ml teeltculturen in tubes van 6,50 ml bij 2.100 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C (Figuur 1A).
    3. Zuig 45 ml supernatant op, laat de pellet onaangeroerd, met een serologische pipet van 25 ml in elk geval in een nieuw buisje. Houd de pellet opzij voor de bereiding van het lysaat van de hele cel (WCL).
    4. Herhaal de centrifugatie bij 2.100 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Zuig 40 ml supernatans op (laat 5 ml cultuur onaangeroerd) met een serologische pipet van 25 ml in een nieuwe buis en herhaal de centrifugatiestap.
    5. Zuig 35 ml van het bovenstaande op in een nieuwe buis en filtreer het kweekmiddel met behulp van een spuitfilter van 0,2 μm. Filtreer in een verse tube om pathogene bacteriële besmetting te elimineren. Van 300 ml cultuur wordt 210 ml cultuurfiltraat per replicaat teruggewonnen.
      LET OP: Het filter dat hier is gebruikt om kweekfiltraat te filteren is een steriel spuitfilter van 0,22 μm (type SY25PL-S).
    6. Inoculeer na filtratie van het kweekfiltraat 1 ml aliquoot van het gefilterde cultuurfiltraat op een agarplaat en incubeer in de incubator 37 °C gedurende 4 weken om de aanwezigheid van andere pathogene bacteriële besmetting in het kweekfiltraat te garanderen. Neem 1 ml aliquot van het Whole Cell Lysate (WCL) en volg dezelfde veiligheidsmaatregelen.
    7. Veeg de monsterbuisjes af met 75% ethanol en haal ze uit BSL-3 via een passbox.
  2. Bereiding van hele cellysaat (WCL)
    1. Resuspendeer de pellet in 1 ml 1x PBSG met fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 1x proteaseremmercocktail, en breng het lysaat over in 2 ml schroefdopkralenbuisjes met 1/3e volume van 0,1 mm zirkoniumoxidekorrels.
      LET OP: De 1x PBSG bestaat uit 1x PBS + 5% glycerol. Neem een pellet-tot-buffer gewichtsverhouding van 1:3.
    2. Zeef de monsters door ze met een mini-kralenklopper te kloppen: 1 minuut kralen kloppen gevolgd door 2 minuten incubatie op ijs. Herhaal dit 8x.
    3. Centrifugeer de buisjes 15 minuten bij 18.000 x g bij 4 °C. Verzamel het bovenstaande in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml en bewaar het op ijs.
    4. Herhaal de centrifugatiestap. Leid het bovenstaande door een spuitfilter van 0,2 μm om pathogene bacteriële besmetting te elimineren.
      LET OP: Het filter dat hier wordt gebruikt om kweekfiltraat te filteren is een steriel spuitfilter van 0,22 mm (type SY25PL-S).
    5. Veeg monsters af met 75% ethanol en haal ze uit BSL-3 via een passbox. Controleer de concentraties van lysaten met behulp van de BCA-testkit, zoals hieronder vermeld. Bewaar de lysaten bij -80 °C.
  3. Concentreer de cultuurfiltraateiwitten met behulp van centrifugaalfiltereenheden.
    1. Concentraat 210 ml Mtb-kweekfiltraateiwitten met behulp van centrifugaalfiltereenheden. Gebruik 3 kDa 15 ml centrifugaalfilterbuisjes (centricons) om het cultuurfiltraat te concentreren in ~1 ml (Figuur 1A). De buisjes van de centrifugaalfiltereenheid van 3 kDa houden eiwitten van dezelfde grootte of groter dan 3 kDa vast.
    2. Voeg ongeveer 15 ml van elke replicaat van het cultuurfiltraat toe in een centriconbuis en centrifugeer bij 2.100 x g gedurende 1 uur bij 4 °C.
    3. Gooi de doorstroom weg volgens de normen en herhaal stap 2.3.2 15x–16x totdat 210 ml van het kweekfiltraatconcentraat tot ~1 ml is.
    4. Aliquot 100 μL van de geconcentreerde cultuur filtraat eiwitten in tien microcentrifugebuisjes met een lage eiwitbinding en schat de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-kit.
  4. Schatting van geconcentreerde eiwitten
    1. Schat de eiwitconcentratie ten opzichte van BSA als standaard. Gebruik 1 μg, 2 μg, 3 μg en 4 μg BSA in een volume van 25 μl in duplicaten. Als het monster onverdund was, gebruik dan een 5x verdund (in PBS) monster in volume van 25 μL in duplicaten voor de schatting. De schattingen worden uitgevoerd in platen met 96 putjes. Gebruik een controle zonder monster (Blanco) met 25 μL PBS.
    2. Voeg 175 μL gemengd reagens toe volgens de instructies van de fabrikant. Meng de monsters met behulp van een meerkanaalspipet en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Meet de meetwaarden bij 562 nm met behulp van een ELISA-lezer. Trek de waarden af van de lege waarden om waarden voor BSA en de monsters te verkrijgen.
    3. Pas de standaardcurve aan op de lineaire regressiecurve en schat de steekproeven ten opzichte van de standaard. Volg de BCA-kit voor de handleiding voor het schatten van eiwitten.

3. Bevestiging van kweekfiltraateiwitten met behulp van verschillende markers

  1. Detectie van eiwitten door Coomassie-kleuring
    1. Om de aanwezigheid van de eiwitten in kweekfiltraat te bevestigen, neemt u 30 μg eiwit en lost u op met 10% natriumdodecylsulfaat - polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE; Tabel 4).
      OPMERKING: Volg de tabelbeschrijving om de SDS-PAGE, Coomassie kleuring en kleuringsoplossingen buffers te maken.
    2. Voeg 20 ml Coomassie kleuringsoplossing (tabel 5) toe aan de gel en incubeer gedurende 30 minuten op rockers bij kamertemperatuur. Gooi de kleuroplossing weg.
    3. Voeg 30 ml kleuroplossing (tabel 6) toe aan de gel en incubeer gedurende 30 minuten op een wip bij kamertemperatuur. Gooi de kleuroplossing weg en voeg een verse kleuroplossing toe. Herhaal dit totdat de gel goed bevlekt is.
    4. Controleer de eiwitstreep op de trans-illuminator (Figuur 1B). Omdat het kweekfiltraateiwit verschillende eiwitten bevat, is er na het kleuren een streep eiwitbanden in de gel te zien (Figuur 1B).
  2. Western blot-bevestiging voor uitgescheiden eiwitmarker
    1. Gebruik het antilichaam van het uitgescheiden eiwit om de aanwezigheid van het uitgescheiden eiwit in kweekfiltraat te controleren. Ag85B (ab43019) is een bekend Mtb-uitgescheiden eiwit in kweekfiltraat en is aanwezig in het cytosol; het Ag85B-antilichaam (concentratie 5 mg/ml) (verdunning 1:5000 in 5% BSA) wordt gebruikt als positieve controle voor het uitgescheiden eiwit.
    2. Laad een WCL met de kweekfiltraateiwitten om onderscheid te maken tussen de cytosolische/membraan- en uitgescheiden eiwitfracties. Ag85B is cytosolisch en wordt uitgescheiden, dus dit zou in beide fracties aanwezig moeten zijn; aan de andere kant is bekend dat PknB gelokaliseerd is in het membraan en niet aanwezig is in het kweekfiltraat.
    3. Bepaal de concentratie van eiwitten in WCL/kweekfiltraat met behulp van een BCA-kit. Meng 30 μg WCL/cultuurfiltraat met 2x-lamellibuffer in een volume van 30 ml (tabel 7). Los de monsters op in 10% SDS-PAGE voor PknB en 12% SDS-PAGE voor Ag85B totdat het verffront de bodem bereikt met behulp van de SDS-gel runnimg-buffer (Tabel 8). Laat de kleurstof niet van de gel afvloeien.
      LET OP: De grootte van de Ag85B is ~35 kDa, dus er wordt 12 % SDS-PAGE gebruikt.
    4. Snijd 9 cm x 6 cm 0,2 μm nitrocellulosemembraan voor de overdracht (tabel 9) van het eiwit van de gel naar het membraan. Stel de overdracht in met behulp van een transfercassette en week de cassettes, schuimkussens, vloeipapier, gel en membraan in 1x ijskoude transferbuffer.
    5. Plaats het schuimkussen aan één kant van de cassette, plaats vervolgens een vloeipapier, plaats de gel, plaats het nitrocellulosemembraan op de gel, plaats opnieuw een vloeipapier en plaats ten slotte nog een schuimrubberen pad en sluit de cassettehouder. Plaats de cassettehouder in de transfertank zodat de membraanzijde naar de anode is gericht en de gelzijde naar de kathode.
    6. Sluit de kathode en anodekabel aan op de tank om de opstelling te sluiten en stel deze in op 120 mA stroom gedurende 120 min. Begin met het uitvoeren van de transfer in een koude kamer.
    7. Plaats het membraan in een kleine plastic doos nadat de overdracht is voltooid. Blokkeer het membraan met 10 ml 5% BSA-oplossing gemaakt in 1x PBST20 om niet-specifieke binding gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op de tuimelaar te verminderen.
    8. Verwijder de blokkerende oplossing, voeg 5-10 ml primair antilichaam toe, dat is anti-muis Ag85B-antilichaam (1:5.000 verdunningen in 5% BSA-oplossing), en incubeer een nacht bij 4 °C in een wipstoel. Bewaar het antilichaam bij -20 °C en hergebruik tot 3x.
    9. Verwijder het primaire antilichaam, voeg 5-10 ml 1x PBST20 toe en was het membraan 8 minuten op kamertemperatuur door krachtig te schudden. Verwijder de eerste wasbeurt, voeg opnieuw 5-10 ml 1x PBST20 toe en was. Herhaal dit 2x.
    10. Voeg 5-10 ml 1x PBST20 met secundair antilichaam toe, namelijk anti-muis Horse redox peroxidase (HRP) geconjugeerd antilichaam (1:10.000 verdunning), en incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een wip.
    11. Was het membraan na het secundaire antilichaam volgens stap 3.2.9. Voeg een gelijke hoeveelheid HRP-substraat en -versterker toe om het membraan te ontwikkelen onder een chemiluminometer (Figuur 1C).
      OPMERKING: Om de afwezigheid van cytosolische eiwitbesmetting te bevestigen, hebben we de Western blot onderzocht met een anti-PknB-antilichaam (Figuur 1C). Het antilichaam werd gekweekt in het National Institute of Immunology, een dierenfaciliteit, tegen het gezuiverde extracytoplasmatische domein van PknB. Men kan de PknB-band waarnemen in de WCL, niet in de kweekfiltraten, en PknB is uitsluitend cytosolisch en membraangebonden en zou niet aanwezig moeten zijn in het kweekfiltraat.

4. Voorbereiding van monsters voor massaspectrometrie

  1. Voer de eiwitvertering in oplossing uit door trypsine.
    1. Neem 100 μg kweekfiltraateiwit, voeg 6x volume ijskoude aceton toe en houd het een nacht op -20 °C.
      OPMERKING: Gebruik glaswerk om alle reagentia voor het massaspectrometriemonster voor te bereiden. Gebruik microcentrifugebuisjes met een laag eiwitgehalte en eiwitarme bindingstips. Gebruik geen plastic materiaal om polymeerverontreiniging bij massaspectrometrieanalyse te voorkomen.
    2. Sla de eiwitten neer door centrifugeren bij 18.000 x g bij 4 °C gedurende 30 min. Gooi het bovenstaande weg.
    3. Was de korrel met 500 μL aceton, korrel naar beneden op 18.000 x g gedurende 10 minuten op 4 °C. Gooi het bovenstaande weg. Verwijder de achtergebleven aceton met behulp van een vacuümconcentrator.
    4. Voeg 20 μL 8 M ureum opgelost in 25 mM ammoniumbicarbonaat toe (2 M bouillon bereid in water van MS-kwaliteit). Draai de monsters en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Ad 60 μL 25 mM ammoniumbicarbonaat om 8 M ureum te verdunnen tot 2 M. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Voeg 4 μL TCEP toe (10 mM eindconcentratie gemaakt in 25 mM ammoniumbicarbonaat) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur, schuddend op 1.800 x g.
    6. Voeg 4 μl IAZ toe (25 mM eindconcentratie gemaakt in 25 mM ammoniumbicarbonaat) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, schuddend bij 1.800 x g in het donker. Voeg 110 μL 25 mM ammoniumbicarbonaat toe.
    7. Voeg trypsine toe (1:20; Trypsine: eiwit in μg) aan de oplossing en houd deze op 37 °C, schudden bij 300 tpm, voor een nachtelijke spijsvertering (figuur 2). Stop de spijsverteringsreactie door 10% TFA (trifluorazijnzuur) toe te voegen. Snelvacuüm de monsters volledig om te drogen.
  2. Ontzouten van het monster
    1. Voeg 100 μL 5% ACN + 0,1% TFA toe aan de verteerde peptiden. Vortex gedurende 30 minuten bij 1.500 tpm bij kamertemperatuur.
    2. Centrifugeer bij 18.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Neem het bovenstaande (peptide) zonder de pellet aan te raken in verse microcentrifugebuisjes en ga verder met ontzouten. Maak alle was- en elutieoplossingen voor de ontziltingsstap.
    3. Breng de C-18 kolomtip in evenwicht met 100 μL 100% ACN + 0,1% TFA door de oplossing te pipetteren en het proces 5x te herhalen.
    4. Voeg 100 μL 50% ACN + 0,1% TFA toe en herhaal het proces 5x. Voeg 100 μL 5% ACN + 0,1% TFA toe en herhaal het proces 5x.
    5. Laat de peptidebinding plaatsvinden in de C-18 kolomtip door 30x te pipetteren. Houd de oplossing bij -20 °C totdat het monster wordt verwerkt voor massaspectrometrie. Nu is het peptide gebonden aan de C-18-kolom.
    6. Was de C-18 kolom met 100 μL water van MS-kwaliteit + 0,1% TFA door te pipetteren en herhaal het proces 5x.
    7. Was de C-18 kolom met 100 μL 5% ACN + 0,1% TFA door te pipetteren en herhaal het proces 5x. Eluteer de peptiden uit de C-18 kolom in 100 μL 50% ACN + 0,1% TFA door 30x te pipetteren (Figuur 2).
      OPMERKING: Na de elutie kan de C-18-kolomtip worden opgeslagen bij 4 °C totdat de massaspectrometrie is voltooid.
    8. Vacuüm het geëlueerde peptide volledig met snelheid en bewaar het bij -20 °C totdat het monster wordt gegeven voor massaspectrometrie.
  3. Injectie van de peptidemonsters in een massaspectrometrie.
    1. Voeg 20 μl oplossing A (geleverd door de massaspectrometriefaciliteit) toe aan de gedroogde peptidemonsters. Draai de monsters gedurende 30 minuten en centrifugeer gedurende 90 minuten bij 4 °C.
    2. Injecteer 20 μL van het monster in de massaspectrometriemachine voor een gradiëntrun van 90 minuten.

5. Gegevensanalyse voor uitgescheiden eiwitten die aanwezig zijn in kweekfiltraat

  1. Eiwit identificatie
    1. Analyseer proteomics-monsters met behulp van de Quadrupole-massaspectrometer. Vraag de verkregen spectra op aan de hand van de Mtb H37Rv UniprotKB-database.
    2. Stel de toleranties voor de voorloper en de fragmentmassa in op 10 ppm en 0,5 Da. Stel het enzym in op trypsine met een maximale waarde voor gemiste splitsing van twee.
    3. Gebruik de proteoomsoftware met Sequest als zoekalgoritme met de carbamidomethylering van cysteïne als vaste modificatie.
    4. Identificeer alle peptide-spectrum matches (PSM) met een false discovery rate van 1%. Pas de standaardinstellingen toe voor alle andere parameters.
    5. Breng de ruwe massaspectrometriebestanden van de peptidesequentie in kaart met de UniProt-ID van de respectievelijke Mtb-eiwitten. Maak een lijst van alle Mtb-eiwitten, hun Uniprot-ID's en functionele classificatie met behulp van de Mycobrowser-database.
    6. Breng voor verdere analyse de UniProt-ID's van geïdentificeerde eiwitten in kaart op hun respectievelijke Rv-nummer . Deponeer de massaspectrometriesecretoomgegevens bij het ProteomeXchange Consortium via de PRIDE-partner.

6. Behandeling van H37Rv met kweekfiltraateiwit om de verandering in de gastheersignalering te controleren

  1. Isolatie van peritoneale macrofagen uit muizen.
    OPMERKING: Volg de referentie21 voor peritoneale macrofaagisolatie, het zaaien van de cellen en infectie.
    1. Injecteer Balb/c-muizen (leeftijd 4-6 weken) met 1 ml 4% thioglycolaat en isoleer peritoneale macrofagen uit het buikvlies van de muis op de 4edag van infectie21 (Figuur 3).
    2. Verzamel de macrofaagcellen door 1x PBS in het buikvlies van de muis te injecteren. Centrifugeer de cellen bij 1.800 x g gedurende 5 minuten, gooi de supernatant weg en voeg 5 ml 1640-RPMI-media toe, aangevuld met 10% FBS (Fetaal Bovine Serum; volledige media) en 1x pen-strep (antibiotica).
    3. Zaai 3 x 105 cellen per putje in platen met 24 putjes en broed de platen een nacht uit in een incubator van 37 °C. Verander de media de volgende dag in verse, complete media en de cellen zijn klaar voor infectie of behandeling met kweekfiltraateiwitten.
  2. Behandeling van peritoneale macrofagen met kweekfiltraateiwitten
    1. Breng de macrofaagcellen naar BSL-3 en bewaar ze in de couveuse. Behandel de cellen met 1 mg/ml kweekfiltraateiwitten (Figuur 3). Oogst de cellen op verschillende tijdstippen van 4 uur, 24 uur en 48 uur na de kweekfiltratiebehandeling.
      1. Zaai de geïsoleerde macrofaagcellen in 24 putjes in drievoud op elk tijdstip. Behandel de cellen met 1 mg/ml kweekfiltraateiwitten en incubeer bij 37 °C in de incubator in aanwezigheid van CO2. Oogst de cellen op drie tijdstippen, 4 uur, 24 uur en 48 uur na de behandeling.
      2. Behandel de cellen met i) 2x-lamellenbuffer om de macrofaagcellysaten te maken en controleer op verschillende gastheercelmarkers door Western blotting uit te voeren, en ii) verschillende buffers voor de immunologische tests die door de fabrikanten samen met de kits worden geleverd.
    2. Bereid cellysaten van de gastheer voor en controleer op verschillende markers, cytokineprofilering van de gastheercellen en verschillende eiwitexpressies van de signaalroute op met kweekfiltraat behandelde macrofaagcellen.
      OPMERKING: Als een laboratorium een genvervangende mutant van het eiwit van de secretoire route heeft, kunnen kweekfiltraten bereid uit Mtb H37Rv en de Mtb-mutant worden gebruikt om hun impact op de immunomodulerende parameters van de gastheer te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In dit protocol hebben we de isolatie van kweekfiltraateiwitten uit mycobacteriën aangetoond (Figuur 1A). De kweekfiltraateiwitten werden vervolgens gecontroleerd op de verschillende markers om de isolatie van het kweekfiltraat te bevestigen. Zoals vermeld in het protocol, werd een Coomasie-kleuring uitgevoerd om de eiwitbelasting te controleren. Men kan een gestreepte eiwitband waarnemen in de WCL-fractie (op de laatste baan Fi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een van de kritieke onderzoeksgebieden heeft betrekking op het begrijpen van de pathogenese van Mtb en het ontwikkelen van effectieve diagnostiek en vaccins22,23. Isolatie van kweekfiltraateiwitten uit Mtb-kweekmedia is een proces dat de identificatie van de virulentiefactoren die door de ziekteverwekker worden uitgescheiden, mogelijk maakt. Onderzoek naar de rol van secretoire eiwitten bij het moduleren van de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm SpuitfiltersmdiSYPL0601MNXX204
0.2µm Nitrocellulose membraanAmersham10600001
37% HClMerckH1758
AcetonEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonitrilSigma-Aldrich34851-2L
AcrylamidBIORAD1610107
AlbumineBio Basic CanadaCat No: AD0023
Amicon Ultra-15Merck, MilliporeUFC900396
AmmoniumbicarbonaatSigma-Aldrich09830-500G
AmmoniumpersulphaatSigma-AldrichA3678-100G
anti-Ag85BAbcamAB43019
anti-muis HRP geconjugeerd secundair antilichaamThermo Fischer62-6520
AsparagineSigma-AldrichA0884-500G
bis-acrylamidSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 kolomThermo FischerSEM SS18V
Catalase Sigma-AldrichC1345
CitroenzuurSigma-AldrichC0759-500G
DextroseSigma-AldrichG7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 bouillon  Fisher Scientific271310
Ferric ammonium(III) citraatSigma-AldrichF5879-100G
Formazuur 98-100%MerckZ0823704246
Glasaal azijnzuur 100%MerckCD0C700160
GlycineSigma-AldrichG8898-1KG
GlycineSIGMAG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescent HRP substraatMerckWBKLS0500
IodoaceetamideAmershamRPN6302V
MagnesiumsulfaatSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
OleenzuurSigmaCat No: O1008
Pierce BCA proteïne analysekitThermo Fischer23225
Pierce Trypsine ProtaseThermo Fischer90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (proteomics experimenten - peptide sequentiëring, eiwitidentificatie en kwantificering)Thermo Fischer Scientific
NatriumchlorideSigmaCat No: S3014
NatriumchlorideSigma-AldrichS7773-1KG
NatriumdodecylsulfaatSigma-AldrichL3771-1KG
TCEPSigma-AldrichC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
Tris BaseBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt eiwitgegevensbank
UreaMP Bio194857

Referenties

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Secretie-eiwittensecretiesystemenmassaspectrometrieeiwitconcentratiebacteriële virulentiefactorenimmuunmodulatie van de gastheercentrifugatie
Bereiding van Mycobacterium tuberculosis Kweekfiltraat om de pathogenese van tuberculose te begrijpen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.