Isolatie van menselijke BAMBIhogeMFGE8hoge navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale cellen

Samenvatting

De isolatie van BAMBI^hogeMFGE8^hoge MSC's, een van de drie belangrijkste subgroepen die heterogene menselijke UC-MSC's vormen, is nuttig voor een volledig begrip van de kenmerken en functies van dit subtype voor de toekomstige toepassing ervan om de klinische werkzaamheid bij specifieke ziekten te verbeteren. Hier presenteren we een methode voor het sorteren van BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC's.

Samenvatting

Navelstreng-afgeleide mesenchymale stromale/stamcellen (UC-MSC's) vertonen een lage immunogeniciteit en krachtige immunomodulerende effecten voor de behandeling van verschillende ziekten. Menselijke UC-MSC's zijn een heterogene populatie die bestaat uit drie hoofdsubpopulaties met verschillende celvormen, proliferatiesnelheden, differentiatievermogen en immuunregulerende functies. Eerder bleek dat BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC's, de eerste subgroep die met succes werd geïsoleerd uit UC-MSC's, er niet in slaagden lupus-nefritis te verlichten. Daarom blijft de functie en het onderliggende mechanisme van deze subgroep in MSC-therapie voor ziekten onbekend. Het is noodzakelijk om BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC's te isoleren en verder te onderzoeken in termen van hun fenotype, metabolisme en functie om de aard van deze MSC-subgroep volledig te begrijpen. In dit protocol beschrijven we een gedetailleerde methode voor het isoleren van de BAMBI^hogeMFGE8^hoge subpopulatie van menselijke UC-MSC's. De subpopulatie van UC-MSC's wordt gelabeld met twee oppervlaktemarkers, BAMBI en MFGE8, door middel van flowcytometriesortering. De geïsoleerde cellen worden gekweekt en geverifieerd door middel van flowcytometrie-analyse. De specifieke genen die tot expressie komen in de BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC's worden geïdentificeerd door RT-qPCR. Dit protocol resulteert in een zeer efficiënte en zuivere celsortering en beschrijft de markerprofielen van de BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC's.

Inleiding

Menselijke mesenchymale stromale stamcellen (MSC's) zijn somatische voorlopercellen die in staat zijn te differentiëren in osteocyten, adipocyten, chondrocyten en andere celtypen¹. MSC's werden voor het eerst geïsoleerd uit het beenmerg en zijn op grote schaal afgeleid van de navelstreng, vetweefsel en andere weefsels². Omdat UC-MSC's gemakkelijk te verkrijgen zijn en een lage immunogeniciteit en immunosuppressieve effecten vertonen, worden ze op grote schaal toegepast in klinische onderzoeken om verschillende ziekten te behandelen ^3,4,5. Hoewel MSC-therapie een veelbelovend potentieel heeft voor de behandeling van ziekten, zijn de therapeutische effecten inconsistent bij individuen⁶. De reden voor de instabiliteit van de MSC-therapie is echter nog onduidelijk.

Moleculaire fluctuaties, morfologie, differentiatiecapaciteit en therapeutische functie omvatten MSC-heterogeniteit. Sommige studies hebben ook gepostuleerd dat MSC's subpopulaties vormen met verschillende functies ^7,8 en hebben MSC-heterogeniteit onderzocht via single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq)^9,10. De resultaten toonden aan dat menselijke UC-MSC's verschillende subpopulaties hebben met specifieke transcriptomische kenmerken, terwijl weinig studies met succes zogenaamde MSC-subpopulaties hebben geïsoleerd. Eerder hebben we menselijke UC-MSC's ontleed in drie subgroepen op basis van hun handtekeningen via scRNA-seq en bio-informatica-analyse, waarin de BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC-subpopulatie verder werd gezuiverd en functioneel werd getest¹¹. Deze subgroep slaagde er echter niet in om lupus-nefritis te verlichten. Het is dus noodzakelijk om de therapeutische effecten van BAMBI^hogeMFGE8^hoge MSC's bij andere aandoeningen te testen om hun authentieke functies te begrijpen.

Dit protocol beschrijft methoden voor het isoleren van de BAMBI^hogeMFGE8^hoge subgroep van menselijke UC-MSC's via fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) door middel van flowcytometrie en de kenmerken van de BAMBI^hogeMFGE8^hoge subgroep.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de principes die zijn uiteengezet in de Verklaring van Helsinki van 1989 en goedgekeurd door de ethische commissie van het Affiliated Drum Tower Hospital van de Nanjing University Medical School (goedkeuringsnummer: 202019701). Menselijke navelstrengen werden verkregen van gezonde moeders in het Affiliated Drum Tower Hospital van de Nanjing University Medical School na natuurlijke bevalling, die hun geïnformeerde toestemming gaven voor het gebruik ervan in dit werk. Primaire UC-MSC's werden geïsoleerd uit menselijke navelstrengen, zoals eerder gerapporteerd¹¹.

1. UC-MSC-cultuur en identificatie vóór isolatie

1. Zodra de MSC's 70-80% samenvloeiing (P0) bereiken, wast u de cellen eenmaal met PBS en voegt u 1 ml 0,25% trypsine-EDTA toe gedurende 2 minuten bij 37 °C. Voeg vervolgens 9 ml volledig medium toe om de trypsine te neutraliseren, breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 × g om de cellen te verzamelen. Gooi het bovenstaande weg en voeg het juiste volledige medium toe om de cellen opnieuw te suspenderen. Breng de cellen in elk schaaltje over in drie T75-kolven (P1) en kweek ze in een cellenincubator bij 37 °C en 5% CO₂.
2. Na het 2x passeren van de UC-MSC's via trypsinisatie, oogst je op P3 de cellen via dezelfde stappen als beschreven in stap 1.1. Gooi na het centrifugeren het bovenstaande weg. Resuspendeer de cellen in de FACS-kleuringsbuffer (1x PBS met 2% FBS) en tel ze. Voeg de FACS-kleuringsbuffer toe aan een eindconcentratie van 5-10 × 10⁶ cellen/ml en houd de celsuspensie op ijs.
3. Verdeel 100 μL per tube van deze celsuspensie over verschillende tubes van 1,5 ml. Voeg isotypecontroles en FACS-antilichamen tegen CD29, CD73, CD90, CD105, CD14, CD34, CD45, CD79 en HLA-DR (allemaal bij 1:200) toe aan de cellen bij 4 °C gedurende 30 minuten.
4. Was de cellen 2x met de FACS-kleuringsbuffer en centrifugeer op 300 × g gedurende 5 min. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de precipitaten opnieuw in 200 μL FACS-kleuringsbuffer voor flowcytometrieanalyse om MSC-markers te identificeren.

2. Isolatie van BAMBI^hoge MFGE8^hoge UC-MSC's door middel van flowcytometrie

1. Kweek UC-MSC tot een dichtheid van ongeveer 5-10 × 10⁶ cellen bij het isoleren van BAMBI^hogeMFGE8^hoge UC-MSC's. Dissocieer de cellen met 0,5 mM EDTA gedurende 5 minuten totdat ze een ronde morfologie beginnen te krijgen, voeg het volledige medium om de cellen over te brengen over naar een conische buis van 15 ml en pipileer de celsuspensie meerdere keren op en neer om een eencellige suspensie te bereiden. Gebruik 10 μL van de celsuspensie om de cellen te tellen en het totale aantal geoogste cellen te berekenen. Centrifugeer de conische buis met de celsuspensie bij 300 × g gedurende 5 minuten om de cellen te verzamelen.
2. Resuspendeer de cellen in 1 ml volledig medium tot een uiteindelijke concentratie van 5-10 × 10⁶ cellen/ml en bewaar de celsuspensie op ijs.
3. Verdeel de cellen in vier microcentrifugebuisjes van 1,5 ml (alleen lege cellen; BAMBI-gelabelde cellen; MFGE8-gelabelde cellen; en zowel BAMBI- als MFGE8-gelabelde cellen).
4. Voeg primaire antilichamen in de juiste concentraties (MFGE8 en BAMBI, beide bij 1:100) toe aan de buisjes, meng en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was de gelabelde cellen één keer met 1x PBS en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300×g. Gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de cellen in 1 ml volledig medium, voeg geconjugeerde fluorescerende secundaire antilichamen (geitenanti-konijn IgG H&L Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 647, allemaal bij 1: 1.000) toe aan de cellen, meng en incubeer de cellen gedurende 15 minuten in het donker.
6. Was de gelabelde cellen één keer met 1x PBS, zoals beschreven in stap 2.5. Resuspendeer de cellen in 500 μl volledig medium, filtreer door een celzeef van 70 μm om klonten en vuil te verwijderen en breng het filtraat over in een buis van 15 ml voor het sorteren van flowcytometrie.
7. Laat de lege celbuis draaien zonder een antilichaam toe te voegen (negatieve controle) en pas de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) aan om de schaal van de negatieve populatie met antilichaamkleuring te poorten.
8. Voer de celbuisjes met één antilichaam (d.w.z. MFGE8 + geit anti-konijn IgG H&L Alexa Fluor 488, of BAMBI + geit anti-konijn IgG H&L Alexa Fluor 647) uit als een poortcontrole om te bepalen waar de positiviteit begint in de plot.
9. Laat de experimentele monsterbuis(nen) draaien om de BAMBI^hogeMFGE8^hoogcellige populatie te sorteren en te verzamelen.
10. Plaat de gesorteerde BAMBI^highMFGE8^high MSC's in een plaat met 24 putjes en kweek de cellen in een celincubator bij 37 °C en 5% CO_{2 .}
11. Wanneer de gesorteerde BAMBI^hogeMFGE8^hoge MSC's gedurende twee passages zijn gegroeid om voldoende cellen te verkrijgen, dissocieert u de cellen en voert u een analyse na het sorteren uit om de zuiverheid van de gesorteerde celpopulaties te garanderen door middel van flowcytometrie, zoals beschreven in de stappen 2.1-2.9. Als alternatief kunt u de zuiverheid van de gesorteerde cellen onderzoeken met conventionele immunofluorescentie tegen menselijke BAMBI- en MFGE8-expressie als het aantal verzamelde cellen te klein is.

3. Karakterisering van de BAMBI^hoge MFGE8^hoge MSC's

1. Kweek de gesorteerde BAMBI^hogeMFGE8^hoge MSC's in een plaat met 12 putjes, onderzoek hun celmorfologie onder een microscoop en vergelijk ze met die van ongesorteerde MSC's.
   OPMERKING: Over het algemeen groeien BAMBI^hogeMFGE8^hoge cellen sneller dan ongesorteerde UC-MSC's.
2. Wanneer de cellen voor ongeveer 90% samenvloeien in de plaat met 12 putjes, zuigt u het celkweekmedium op, wast u de cellen eenmaal met 1x PBS en voegt u 500 μL RNA-extractiereagens toe aan de cellen. Schud de plaat langzaam op kamertemperatuur (RT) gedurende 5 minuten.
3. Pipetteer het mengsel en breng het over in een RNase- en DNase-vrije buis. Voeg 100 μL chloroform toe, sluit de buis af en schud het mengsel krachtig door 15 s te vortexen. Laat de buis vervolgens 3 minuten op RT staan.
4. Centrifugeer de buis gedurende 15 minuten bij 11.000 × g en 4 °C.
5. Breng ongeveer 200 μl van de bovenste waterige laag over in een nieuwe buis. Voeg dezelfde hoeveelheid isopropanol toe en pipetteer meerdere keren grondig op en neer. Laat het mengsel vervolgens 10 minuten op RT staan.
6. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 11.000 × g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg.
7. Voeg 500 μL 75% ethanol toe aan de pellet in de tube en keer de tube meerdere keren voorzichtig om.
8. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 6.000 × g en 4 °C. Gooi het bovenstaande weg. Herhaal de centrifugatie eenmaal gedurende 10 s bij 6.000 × g, zuig de resterende vloeistof voorzichtig op via een pipet en droog de buis bij RT.
9. Voeg 10 μL RNase-vrij water toe om de RNA-pellet op te lossen en meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
10. Volg de instructies van de fabrikant om first-streng cDNA te synthetiseren uit maximaal 1 μg totaal RNA.
11. Gebruik een qPCR-kit om genexpressie te detecteren en te kwantificeren, volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De sequenties van de gebruikte DNA-primers staan vermeld in tabel 1.

Resultaten

Figuur 1 toont de expressieprofielen van de markers op het celoppervlak van menselijke UC-MSC's. Gekweekte MSC's waren sterk positief voor CD44-, CD73-, CD90- en CD105-expressie en negatief voor CD14-, CD34-, CD45-, CD79- en HLA-DR-expressie. De BAMBI^hogeMFGE8^hoge MSC's werden gesorteerd uit gecultiveerde menselijke UC-MSC's en hun BAMBI- en MFGE8-expressie werd opnieuw geanalyseerd door middel van flowcytometrie na expansie gedurende 3...

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe de BAMBI^hogeMFGE8^hoge subpopulatie kan worden geïsoleerd en verrijkt met menselijke UC-MSC's. De methode is belangrijk voor verdere studie van de morfologie, groei en functie van deze MSC-subgroep. Sommige stappen zijn van vitaal belang voor de succesvolle isolatie en hoge opbrengst van BAMBI^hogeMFGE8^hoge cellen.

Ten eerste is het meest kritische technische aspect waarmee rekening moet wor...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.6 mL microcentrifuge tube	Corning	Axygen MCT-060-A
1.5 mL microcentrifuge tubes	Beijing Labgic Technology	MCT-001-150
100 mm cell culture dish	Beijing Labgic Technology	12311
12 well plate	Beijing Labgic Technology	11210
15 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00115
24 well plate	Beijing Labgic Technology	11310
50 mL centrifuge tube	Nanjing Vazyme Material Technology	TCF00150
5 mL Round-Bottom Tubes	Corning	FALCON 352003
70 µm cell strainer	Falcon	352350	Verdunning: 1:1000
APC anti-human CD79a (Igα) Antibody	BioLegend	333505	581 Verdunning: 1:200
APC/Cyanine7 anti-human CD73 (Ecto-5'-nucleotidase) Antibody	BioLegend	344022	G46-6 Verdunning: 1:200
APC-Cy7 Mouse IgG1, κ Isotype Control	BD Bioscience	557873	MOPC-31C (Isotype Control) Verdunning: 1:200
BAMBI antibody	Bioss	bs-12418R
Brilliant Violet 510 anti-mouse/human CD44 Antibody	BioLegend	103044	5E10 Verdunning: 1:200
Brilliant Violet 510 Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400646	MOPC-21 (Isotype Control) Verdunning: 1:200
CD105 (Endoglin) Monoclonal Antibody  APC	eBioscience	17-1057-42	HM47 Verdunning: 1:200
Cell Counting Chamber Slides	Shanghai QIUJING	XB-K-25
Centrifuge	Beijing BAIYANG	BY-320C
ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q711-02
Chloroform	XILONG Scientific	13700908
DMEM/F-12 (1:1) basic (1x)	Gibco	C11330500BT
EDTA (0.5 M), pH 8.0, Rnase free	Invitrogen	AM9260G	Verdunning: 1:1000
Ethanol	XILONG Scientific	12803405
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141C
FITC Mouse Anti-Human CD34	BD Bioscience	555821	IM7 Verdunning: 1:200
FITC Mouse Anti-Human CD45	BD Bioscience	555482	AD2 Verdunning: 1:200
FITC Mouse Anti-Human HLA-DR	BD Bioscience	555811	SN6 Verdunning: 1:200
Flow Cytometer	BD Bioscience	FACSAria™ III Cell SorterAria
Flowjo	BD Bioscience	V10
Gentle Cell Dissociation Reagent	STEMCELL Technologies	100-0485
Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	HI30 Verdunning: 1:200
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (AlexaFluor 594)	abcam	ab150080	Verdunning: 1:1000
HiScript II Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)	Vazyme	R223-01
Inverted Microscopes	Nikon	ECLIPSE Ts2
Isopropyl Alcohol	XILONG Scientific	12802505
MFGE8 antibody	Biorbyt	orb388429	Verdunning: 1:100
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	FRESCO 21
Mouse IgG1 kappa Isotype Control APC	eBioscience	17-4714-42	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Verdunning: 1:200
Mouse IgG1 kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4714-42	eBMG2b (Isotype Control) Verdunning: 1:200
Mouse IgG2b kappa Isotype Control FITC	eBioscience	11-4732-42	RTK4530 (Isotype Control) Verdunning: 1:200
PBS (10x)	Sangon Biotech (Shanghai)	E607016-0500
PE-Cy5 Mouse Anti-Human CD90	BD Bioscience	555597	P3.6.2.8.1 (Isotype Control) Verdunning: 1:200
PE-Cy5 Mouse IgG1 κ Isotype Control	BD Bioscience	550618
Penicillin-Streptomycin 100x	Cytiva	SV30010	Verdunning: 1:100
Real-Time PCR System	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Q6
RNase-free water	QIAGEN	129112
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop One(840-317400)
Sterile micropipette tips	Beijing Labgic Technology		Verdunning: 1:100
T75 cell culture flask	Beijing Labgic Technology	13212A
Thermal Cycler	Applied Biosystems byThermo Fisher Scientific	Veriti
Tri reagent	Sigma Aldrich	T9424
Typsin-EDTA Solution	Bio-Channel Biotechnology	BC-CE-005
Water-Jacketed CO2  Incubator	Thermo Fisher Scientific	3111