We beschrijven een eenvoudig protocol voor het verwijderen van de statocyst en bijbehorende weefsels in de ctenofoor Mnemiopsis leidyi, die vatbaar is voor live beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Chirurgische verwijdering van een complex sensorisch orgaan bij sterk regeneratieve ctenoforen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De ctenofoor Mnemiopsis leidyi is een klassiek diermodel voor regeneratie van het hele lichaam. Verhoogde traceerbaarheid voor veel laboratoriumtechnieken en hun fylogenetische plaatsing als de waarschijnlijke zustergroep van de resterende Metazoa heeft geleid tot een recente hernieuwde wetenschappelijke interesse in het werken met ctenoforen. Ze kunnen elk ontbrekend orgaan of celtype regenereren, inclusief volledige regeneratie van het hele lichaam uit een fragment zo klein als ~ 15% van het lichaam, in de loop van een paar dagen. Zoals de meeste ctenoforen, M. leidyi hebben een aboraal gelegen, zwaartekrachtgevoelig orgaan dat sensorische input koppelt aan motorische output om hun lichaamspositie en oriëntatie te regelen. Dit protocol demonstreert chirurgische verwijdering van het aborale orgaan (AO) complex en bijbehorende structuren in M. leidyi , samen met kweek-, behandelings- en montagemethoden die geschikt zijn om de processen van wondgenezing en regeneratie in beeld te brengen die plaatsvinden in de volgende uren tot dagen. Deze eenvoudige technieken zijn in grote lijnen aanpasbaar aan verschillende experimentele paradigma's en laboratoriumcontexten.
Inleiding
Ctenoforen, ook bekend als kamgelei, zijn kosmopolitisch voor het mariene milieu van de aarde en kunnen belangrijke spelers zijn in ecosystemen, met name als onderdeel van het voedselweb. De ctenofoor Mnemiopsis leidyi is een historisch en steeds populairder wordend diermodel voor regeneratie van het hele lichaam 1,2. Hun vermogen om een ontbrekend orgaan of celtype te regenereren ontstaat tegen het einde van de embryogenese en blijft gedurende hun postembryonale levenbestaan 3,4 (~0,1 tot >1.000 mm in lichaamsgrootte). Ze zijn ook gedurende hun hele leven transparant en zijn vatbaar voor diverse live en vaste beeldvormingstechnieken. De meest recente gemeenschappelijke voorouder van alle ctenoforen had vele celtypen en complexe organen; De meeste bestaande ctenoforen bezitten de meeste hiervan tijdens ten minste één levensfase: een aboraal, zwaartekrachtgevoelig orgaan (historisch het apicale orgaan genoemd en hier het aborale orgaan, AO genoemd), gespecialiseerde locomotorische structuren die zijn samengesteld uit sterk georganiseerde macrocilia die op een gecoördineerde manier kloppen (kamrijen), intrekbare voedingstentakels en fotocyten die bioluminesceren als reactie op schadelijke stimuli (Figuur 1).
Ondanks hun talrijke celtypen en complex, contextafhankelijk gedrag, ondersteunt een robuuste hoeveelheid genomische gegevens de plaatsing van ctenoforen als de waarschijnlijke zustergroep van alle andere levende dieren 5,6,7,8. Grote verschillen in de cellulaire en functionele basis van het ctenofoor zenuwstelsel van andere dieren met een zenuwstelsel (bilaterianen en cnidarians) hebben de hypothese gesuggereerd dat het ctenofoor zenuwstelsel een onafhankelijke oorsprong vertegenwoordigt; Dit blijft echter onzeker 9,10,11,12.
Het aborale sensorische orgaancomplex omvat de statocyst, die vele celtypen omvat, waaronder meerdere soorten vermeende neurosensorische cellen 13,14,15,16,17,18, en wordt constant onderhouden in niet-gemanipuleerde ctenoforen. Mechanosensorische cellen dragen grote ciliaire bundels, die worden afgebogen door een statoliet die bestaat uit gebiomineraliseerde cellen (lithocyten genoemd) om de zwaartekracht te detecteren. Twee "polaire velden", die vermeende sensorische structuren met onbekende functie14 en waarschijnlijke fotosensorische cellen16 bevatten, grenzen aan de statocyst.
Experimenteel onderzoek naar het regeneratieve vermogen van M. leidyi heeft zich uitsgetrokken van de kleinste dieren bij de overgang van embryo naar jongen (~100 μm) tot de vrijlevende macroscopische volwassenen (>2 cm). M. leidyi met een lichaamsdiameter van ~1 mm zijn groot genoeg om handmatige chirurgische manipulatie mogelijk te maken zonder speciale instrumenten zoals micromanipulatoren, maar zijn klein genoeg om op een standaard microscoopglaasje te worden gemonteerd voor beeldvorming met krachtige objectieven. Dit protocol demonstreert chirurgische verwijdering van het aborale sensorische orgaan en de bijbehorende structuren, samen met kweek- en beeldvormingsmethoden die geschikt zijn om de processen van wondgenezing en regeneratie te documenteren die plaatsvinden in de volgende uren tot dagen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereid gereedschappen en benodigdheden voor
- Trek met behulp van een standaard bunsenbrander met de hand glazen dissectienaalden uit glazen capillaire micropipetten. Gebruik voor dieren groter dan 1 mm gekalibreerde micropipetten van natronkalkglas die bedoeld zijn voor het hanteren van vloeistoffen.
OPMERKING: De grootte van 100 μl werkt goed over het brandpuntsbereik van 0.5-3 mm.- Zorg voor een scherpe blauwe vlamkegel in de bunsenbrander.
- Houd het middelpunt van de glazen pipet in de vlam totdat deze zacht genoeg is om onder lichte druk te bewegen.
- Haal de pipet van de vlam en trek de twee kanten onmiddellijk recht uit elkaar om een korte, sterke naald te maken.
OPMERKING: Het glasnaaldwerk kan opnieuw worden gesmolten als bij de eerste poging geen bevredigend resultaat is verkregen, en gebroken naalden kunnen worden bewaard en opnieuw worden getrokken. Zie figuur 2 voor voorbeelden van bruikbare en onbruikbare naalden die met deze methode worden getrokken.
ALTERNATIEF: Naalden van 26 G 1/2 inch werken ook goed, vooral aan de grotere kant van het brandpuntsbereik.
- Bereid steriel zeewater door natuurlijk of kunstmatig zeewater door een filter van 0,22 μm te leiden.
- Maak meetpipetten.
- Knip met een scherpe schaar of een scheermesje een plastic transferpipet af om een opening te maken met de inwendige diameter van de gewenste maat. Houd ten minste één pipet bij de hand voor de bovenkant van het gewenste bereik en één voor de onderkant van het gewenste bereik. Zie Figuur 3 voor een voorbeeld van een set meetpipetten.
OPMERKING: Deze pipetten werken goed tot ~8 mm. Het is ook mogelijk om de grootte te schatten met een micrometer of meetinstrumenten aan de hand van foto's.
- Knip met een scherpe schaar of een scheermesje een plastic transferpipet af om een opening te maken met de inwendige diameter van de gewenste maat. Houd ten minste één pipet bij de hand voor de bovenkant van het gewenste bereik en één voor de onderkant van het gewenste bereik. Zie Figuur 3 voor een voorbeeld van een set meetpipetten.
2. Bereid dieren voor op het experiment
- Selecteer morfologisch normale individuen van de gewenste grootte en stadium.
OPMERKING: We vinden dieren met een diameter van ~ 0,5-3 mm optimaal voor montage op dia's. Controleer of dieren niet in de ondermaatpipet passen, maar wel in de topmaatpipet. - Verhonger proefdieren gedurende 8-16 uur.
OPMERKING: Hoewel M. leidyi optisch transparant zijn en niet sterk autofluorescerend, is voedsel dat door hun spijsverteringsstelsel circuleert over het algemeen ondoorzichtig en vaak autofluorescerend.
3. Snijwonden uitvoeren
- Gebruik een transferpipet die breder is dan de lichaamsgrootte van het proefdier om het over te brengen naar een polystyreenschaal van 35 mm die steriel zeewater bevat.
- Visualiseer het monster met behulp van de ontleedmicroscoop. Rol een dier op zijn slokdarmzijde (Figuur 1). Deze weergave geeft de gemakkelijkste toegang om het aborale orgaan te verwijderen. Focus op het buikorgaan.
OPMERKING: De meest bruikbare vergroting kan variëren afhankelijk van de grootte van het dier en de voorkeur van de gebruiker. Over het algemeen werkt een vergroting van 12-20x goed. - Houd het dier voorzichtig op zijn plaats met een glazen naald en gebruik de niet-dominante hand.
- Steek met de dominante hand de punt van een naald iets onder het aborale orgaan. Ga schuin naar binnen om een snede te maken van een zichtbare rand van het aborale orgaan tot onder de basis. Trek de naald terug en maak een tweede snede om een wigvormig stuk weefsel te verwijderen dat alle structuren van het aborale orgaan bevat (zie afbeelding 4, bovenpaneel). Onderzoek het dier en het weggesneden weefsel zorgvuldig om er zeker van te zijn dat de operatie is geslaagd.
- Gebruik dezelfde transferpijp om het vers gesneden dier in een verse schaal met steriel zeewater te verplaatsen.
OPMERKING: De wond zal snel sluiten, dus afhankelijk van experimentele doelen (zoals voor meerdere synchroon regenererende monsters of om vroege stadia van genezing en regeneratie in beeld te brengen), moet men snel bewegen om meerdere monsters te genereren. Gebruik een timer om de operatietijd te beperken om cohorten regenererende dieren dichter bij elkaar te houden.
4. Controleer of de sneden correct zijn
OPMERKING: Zelfs als u het zorgvuldig onder de ontleedmicroscoop controleert, is het af en toe mogelijk om chirurgische fouten over het hoofd te zien.
- Volg de onderstaande montagestappen om elke postoperatieve persoon tijdelijk op een glasplaatje te monteren om onder een samengestelde microscoop met DIC te controleren of alle bedoelde structuren correct zijn verwijderd. Voer deze controle uit, zelfs als u op dit moment geen verdere beeldvorming uitvoert.
OPMERKING: De uitstekende genezende eigenschappen van ctenoforen lenen zich goed voor entexperimenten; we verwijderen altijd de uitgesneden aborale organen uit het kweekvat om te voorkomen dat de afgesneden zijkanten van een verwijderde AO en de rest van het dier waaruit het is verwijderd, aan elkaar plakken en versmelten.
Als u niet direct overgaat tot langdurige beeldvorming, sluit de objectglaasje dan niet af. Dit zal het snelle herstel en de terugkeer naar de cultuur van dit proefdier vergemakkelijken. Het wordt aanbevolen om de chirurgische nauwkeurigheid onder hoge vergroting te controleren. In het bijzonder kan de statoliet uit de koepel worden geslagen zonder de operatie te voltooien.
5. Live beeldvorming
- Montage
- Behandel een standaard glazen microscoopglaasje met een silanisatiemiddel, zoals een waterafstotend middel voor glasbehandeling, en laat volledig drogen.
- Breng een postoperatief dier over naar een geprepareerd glaasje met een transferpipet. Controleer of het water parelt met het dier erin.
- Plaats een kleine hoeveelheid boetseerklei (~1,5 mg) op elke hoek van een dekglas om "voeten" te vormen die dienen als afstandhouder om het dekglas van het dier af te tillen.
- Plaats het dekglas voorzichtig met klei naar beneden op het dier. Houd elke hoek van het dekglas vast en rol het dier in positie voor beeldvorming. Druk naar beneden om het dier iets samen te drukken en op zijn plaats te houden. Verplaats het monster zo ver als nodig is om een bevredigend beeld te krijgen.
- Voor beeldvorming langer dan ~30 min, brengt u een dunne laag vaseline aan op elke rand van het dekglas om uitdroging van het monster te voorkomen.
OPMERKING: M. leidyi die op deze manier is gemonteerd, kan gemakkelijk worden teruggevonden voor verdere kweek- of andere tests. Dieren zullen zich echter over het algemeen binnen 1-2 uur bevrijden en herpositioneren, dus een continue time-lapse-opname langer dan 2 uur zou een andere beeldvormingsbenadering vereisen.
6. Kweken
- Cydippide cultuur omstandigheden
- Cultuur chirurgisch gemanipuleerde dieren en controles in gefilterd natuurlijk of kunstmatig zeewater in de buurt van kamertemperatuur. Gebruik een broedmachine die is ingesteld op 20-22 °C om consistente resultaten te garanderen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
M. leidyi in het cydippide stadium is doorgaans binnen ~20 minuten na verwonding volledig gesloten (Figuur 4 en Figuur 5), terwijl volledige regeneratie van het orgaan 1-3 dagen kan duren. Deze timing heeft enige biologische variabiliteit, maar is bijna altijd voltooid 72 uur na de operatie (Figuur 6).
De chirurgische verwijdering van cellen en mesoglea uit het a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Soortgelijke experimenten kunnen worden uitgevoerd op elke gewenste grootte van M. leidyi; De morfogenese van het orgaan wordt gelijktijdig voltooid met het begin van het regeneratief vermogen4. Dieren kunnen in het wild worden verzameld19 of in het laboratorium worden grootgebracht20,21. Als een bepaalde lichaamsgrootte gewenst is, kunnen dieren worden toegestaan om te paa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn dankbaar voor Jovita Joseph.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm SFCA spuitfilter | Thermo/Nalgene | 723-2520 | steriele zeewater maken |
| 35 mm polystyreen petrischaaltje | Falcon/Corning | 351008 | sneden uitvoeren; kleine dieren kweken |
| 60 mL wegwerpspuit met luer-lock | BH Supplies | BH60LL | steriele zeewater maken |
| Gekalibreerde glazen pipetten, 100 μL | Drummond | 2-000-100 | sneden uitvoeren |
| dekglasjes, #1.5, 18 mm vierkant | VWR | 16004-326 | montage voor beeldvorming |
| ctenophores | Gulf Specimens | levende dieren | |
| Dubbele holte glazen depressorschuifjes, 1,3 mm | VWR | 470200-930 | montage voor beeldvorming |
| glasmicroscoopglaasjes | VWR | 16004-398 | montage voor beeldvorming |
| Instant Ocean Zeezout | Instant Ocean | dierkweekmedium | |
| mini liniaal | Ted Pella | 13623 | plastic pipetten meten |
| plastiek klei (plasticine) | Pepy Plastilina | montage voor beeldvorming | |
| petroleumgel | Vaseline | montage voor beeldvorming | |
| plastiek overdrachtspijpjes (diverse maten) | Cole-Parmer | 06226-13, 06226-12, 06226-01 | kleine dieren verplaatsen |
| Rain-X glasbehandeling | Rain-X | microscoopglaasjes silaniseren | |
| liniaal | Westcott | 10564 | plastic pipetten meten |
| schaar | OXO | plastic pipetten snijden |
Referenties
- Edgar, A., Mitchell, D. G., Martindale, M. Q. Whole-body regeneration in the lobate ctenophore Mnemiopsis leidyi. Genes. 12 (6), 867(2021).
- Martindale, M. Q., Henry, J. Q. Ctenophora. Evolutionary Developmental Biology of Invertebrates 1. , Springer. 179-201 (2015).
- Martindale, M. Q. The onset of regenerative properties in ctenophores. Curr Opin Genet Dev. 40, 113-119 (2016).
- Martindale, M. Q. The ontogeny and maintenance of adult symmetry properties in the ctenophore, Mnemiopsis mccradyi. Dev Biol. 118 (2), 556-576 (1986).
- Dunn, C. W., et al. Broad phylogenomic sampling improves resolution of the animal tree of life. Nature. 452 (7188), 745-749 (2008).
- Ryan, J. F., et al. The genome of the ctenophore Mnemiopsis leidyi and its implications for cell type evolution. Science. 342 (6164), 1242592-1242592 (2013).
- Whelan, N. V., et al. Ctenophore relationships and their placement as the sister group to all other animals. Nat Ecol Evol. 1 (11), 1737-1746 (2017).
- Schultz, D. T., et al. Ancient gene linkages support ctenophores as sister to other animals. Nature. 618, 110-117 (2023).
- Burkhardt, P. Ctenophores and the evolutionary origin(s) of neurons. Trends Neurosci. 45 (12), 878-880 (2022).
- Sachkova, M. Y., et al. Neuropeptide repertoire and 3D anatomy of the ctenophore nervous system. Curr Biol. 31 (23), 5274-5285.e6 (2021).
- Moroz, L. L., et al. The ctenophore genome and the evolutionary origins of neural systems. Nature. 510 (7503), 109-114 (2014).
- Burkhardt, P., et al. Syncytial nerve net in a ctenophore adds insights on the evolution of nervous systems. Science. 380 (6642), 293-297 (2023).
- Tamm, S. L., Tamm, S. Novel bridge of axon-like processes of epithelial cells in the aboral sense organ of ctenophores. J Morphol. 254 (2), 99-120 (2002).
- Jager, M., et al. New insights on ctenophore neural anatomy: Immunofluorescence study in Pleurobrachia pileus (Müller, 1776). J Exp Zool B Mol Dev Evol. 316B (3), 171-187 (2011).
- Hernandez-Nicaise, M. -L. The nervous system of ctenophores III. Ultrastructure of synapses. J Neurocytol. 2 (3), 249-263 (1973).
- Schnitzler, C. E., et al. Genomic organization, evolution, and expression of photoprotein and opsin genes in Mnemiopsis leidyi: a new view of ctenophore photocytes. BMC Biol. 10 (1), 107(2012).
- Harrison, F. W., Westfall, J. A. Ctenophora. Microscopic Anatomy of Invertebrates. 2: Placozoa, Porifera, Cnidaria, and Ctenophora. , Wiley. New York. 359-418 (1991).
- Horridge, G. A. Presumed photoreceptive cilia in a ctenophore. J Cell Sci. S3-105 (71), 311-317 (1964).
- Ramon-Mateu, J., Edgar, A., Mitchell, D., Martindale, M. Q. Experimental methods to study ctenophore whole-body regeneration. Methods Mol Biol. 2450, 95-119 (2022).
- Soto-Àngel, J. J., et al. Stable laboratory culture system for the ctenophore Mnemiopsis leidyi. Methods Mol Biol. 2757, 123-145 (2022).
- Presnell, J. S., Bubel, M., Knowles, T., Patry, W., Browne, W. E. Multigenerational laboratory culture of pelagic ctenophores and CRISPR-Cas9 genome editing in the lobate Mnemiopsis leidyi. Nat Protoc. 17 (8), 1868-1900 (2022).
- Coonfield, B. R. Apical dominance and polarity in Mnemiopsis leidyi, Agassiz. Biol Bull. 70 (3), 460-471 (1936).
- Freeman, G. Studies on regeneration in the creeping ctenophore, Vallicula multiformis. J Morphol. 123, 71-84 (1967).
- Bading, K. T., Kaehlert, S., Chi, X., Jaspers, C., Martindale, M. Q., Javidpour, J. Food availability drives plastic self-repair response in a basal metazoan-case study on the ctenophore Mnemiopsis leidyi A. Agassiz. Sci Rep. 7 (1), 16419(2017).
- Mateu, J. R., Ellison, S. T., Angelini, T. E., Martindale, M. Q. Regeneration in the ctenophore Mnemiopsis leidyi occurs in the absence of a blastema, requires cell division, and is temporally separable from wound healing. BMC Biol. 17 (1), 80(2019).
- Mitchell, D. G., Edgar, A., Mateu, J. R., Ryan, J. F., Martindale, M. Q. The ctenophore Mnemiopsis leidyi deploys a rapid injury response dating back to the last common animal ancestor. Commun Biol. 7 (1), 203(2024).
- Jokura, K., Anttonen, T., Rodriguez-Santiago, M., Arenas, O. M. Rapid physiological integration of fused ctenophores. Curr Biol. 34 (19), R889-R890 (2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
