Efficiënte methode voor het in beeld brengen van muizenlongen die de ruimtelijke dynamiek van schimmelsporen in de luchtwegen behoudt

Samenvatting

We presenteren een methode voor een schimmelpathogenesemodel dat de natuurlijke positionering van schimmelsporen in de longluchtwegen behoudt voor analyse via fluorescentiemicroscopie.

Samenvatting

Schimmels infecteren mensen wanneer sporen uit de omgeving in de longen worden ingeademd. De long is een heterogeen orgaan. Geleidende luchtwegen, inclusief bronchiën en bronchiolen, vertakken zich totdat ze eindigen in het alveolaire luchtruim waar gasuitwisseling plaatsvindt. Infecties die hun oorsprong vinden in de bronchiolen of longblaasjes lokken verschillende gastreacties en ziektemanifestaties uit. Daarom vergroot het precies begrijpen waar sporen van nature in de longen zich bevinden, vooral kort na infectie, de mogelijkheden voor onderzoek naar interacties tussen gastheer en ziekteverwekker. Hierin beschrijven we een in-situ analyse van longen van muizen die besmet zijn met Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Conventionele methoden voor histologische conservering omvatten het vloeibaar opblazen van de luchtwegen met een fixatieve oplossing, die de natuurlijke locatie van opgezogen schimmeldeeltjes verplaatst en sporen van proximale bronchiolen naar terminale luchtruimten duwt.

Omgekeerd behoudt deze methode van luchtinflatie met perfusiefixatie van het bloedvaatstelsel de fysiologische positie van schimmelsporen in de bronchiolen. Bovendien beschrijven we een eenvoudige benadering voor het cryopreserveren, inbedden en in beeld brengen van longmonsters. We delen ook high-throughput computationele technieken via het open-source QuPath-programma om de ruimtelijke verdeling van schimmelsporen in de long te analyseren. De hier gepresenteerde methode is eenvoudig en snel, vereist minimale apparatuur om uit te voeren en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met veel modellen van respiratoire schimmelinfecties.

Inleiding

Mensen kunnen tot miljarden sporen per dag inademen van een verscheidenheid aan schimmels uit de omgeving¹. Om onze barrièreafweer tegen deze ingeademde sporen te begrijpen, moeten we de precieze micro-anatomische omgevingen waarderen waar deze sporen in de luchtwegen en het longparenchym terechtkomen. De cellulaire samenstelling van de luchtwegen (d.w.z. epitheelcellen) transformeert aanzienlijk langs de luchtpijp, bronchiën, bronchiolen en longblaasjes. Elk van deze verschillende regio's is samengesteld uit verschillende celtypen met discrete functies die gebruik maken van een arsenaal aan verdedigingsmechanismen om pathologische infectie te voorkomen.

De precieze locatie van de afzetting van pulmonale schimmelsporen kan variëren tussen de luchtweglumen van zuilvormige epitheelbeklede bronchiolen, alveolaire kanalen of longblaasjes². De meeste klinisch relevante schimmelsoorten produceren sporen tussen 1 μm en 10 μm in diameter³. De afzetting van deze sporendeeltjes in de longen hangt af van verschillende factoren, zoals aerodynamica, dichtheid, elektrische lading en phoretische krachten, die het mechanisme van sedimentatie na inademing kunnen beïnvloeden⁴. Over het algemeen zetten grote deeltjes (> 6 μm) zich af in de bovenste luchtwegen, middelgrote deeltjes (2-6 μm) kunnen zich afzetten in kleinere luchtwegen en kleine deeltjes (<2 μm) bereiken het alveolaire gebied⁵. Er is gemeld dat aspergillussporen (2-3 μm) de alveolaire ruimten bereiken, maar klinische pathologierapporten wijzen ook op een aanzienlijke last van bronchiale en bronchiolaire aandoeningen⁶. Er is ook een toenemende erkenning van endobronchiale schimmelinfecties van Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis, Candida-soorten, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum en Zygomyceten als gevolg van de toenemende populariteit van flexibele bronchoscopie⁷. Recente ontwikkelingen in microscopische beeldvorming van Aspergillus-infecties bij muizen hebben ook aangetoond dat meer proximale luchtruimen zoals bronchiën en bronchiolen de hoogste last kunnen dragen voor pathologische schimmelproliferatie⁸. Onderzoek naar de reactie van de gastheer op pulmonale schimmelinfecties heeft aangetoond dat zowel bronchiolaire epitheelcellen als alveolaire epitheelcellen een belangrijke rol spelen als immuunschildwachten, dus het ophelderen van de exacte plaatsen van sporenafzetting en epitheliale interactie zal van vitaal belang zijn voor toekomstig werk ^2,9,10.

Het bestuderen van deze dynamiek van de pathogenese van de proximale luchtwegen is moeilijk omdat standaard longfixatie- en sectievoorbereidingstechnieken sporen van deze proximale posities in epitheel beklede luchtwegen kunnen verplaatsen en ze naar distale terminale alveolaire gebieden kunnen duwen. Gewoonlijk wordt 10% formaline of 4% paraformaldehyde gebruikt om de longen op te blazen en de hele long snel bloot te stellen aan fixeermiddel. Bij het voorbereiden van de longen op cryosectie dienen sommige groepen een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding toe in de longen om de cryosectieprestaties te verbeteren¹¹. Deze praktijken zijn nuttig in de juiste context, maar zijn door ons laboratorium en andere groepen gevonden om sporen en deeltjes van proximale locaties te verplaatsen, waardoor interpretaties over de aan sporen blootgestelde celtypen en de daaropvolgende gastheerrespons worden verstoord¹².

Om de microanatomische lokalisatie van ingeademde schimmelsporen nauwkeurig vast te stellen, hebben we een snelle, resourcearme methode ontwikkeld voor het behoud van de locatie van schimmelsporen in de luchtwegen van muizen. We hebben een muriene luchtopblazende vasculaire perfusie-fixatiemethode van Thomas et al. (2021) aangepast, waarbij we de hoeveelheid apparatuur, tijd en technische vaardigheden hebben verminderd die nodig zijn om een bevredigend resultaat te bereiken¹³. Uit de hier beschreven methode hebben we waargenomen dat Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia (3-5 μm groot) proximaal meer accumuleren dan eerder werd aangetoond, namelijk in distale bronchiolen en broncho-alveolaire juncties in plaats van terminale longblaasjes. Deze informatie kan zich richten op biologische vragen over de kritieke celtypen die verband houden met deze longgebieden en hun invloed op de vroege reacties op ingeademde schimmelsporen.

Protocol

Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Rutgers Biomedical Health Sciences.

1. Label sporen met intracellulaire fluorescentie

1. Kleur 1 x 10⁶ sporen in carboxyfluoresceïne-succinimidylester (CFSE), Cell Tracker Orange of Cell Tracker Red (of intracellulaire kleurstof naar keuze) bij 5 μM gedurende 30 minuten bij 30 °C, was vervolgens met PBS en draai de sporen op 12.000 x g. Herhaal deze wasbeurt een keer.
2. Bereid het sporeninoculum voor in de juiste concentratie, zodat 25 μl de juiste sporendosis voor één muis bevat.

2. Muis inoculeren met sporen door aspiratie-inhalatie met behulp van isofluraan-anesthesie

LET OP: Isofluraan is een vluchtig verdovingsmiddel en moet worden gebruikt in een bioveiligheidskast of zuurkast met kanalen.

1. Om de isofluraan-blootstellingspot voor te bereiden, plaatst u een gevouwen servet in een Nalgene-pot met schroefdop van 1 liter en plaatst u een plastic gaascirkel over het servet als platform voor de muizen. Voeg 2 ml isofluraan toe aan het servet, sluit de pot en wacht 1-2 minuten totdat het gas in de container in evenwicht is.

Figuur 1: Apparaat voor isofluraan open druppel methode voor sporeninoculatie. Een gevouwen servet wordt op de bodem van een pot met schroefdop van 1 liter geplaatst en vervolgens wordt een rond plastic gaas ingebracht om als platform voor de muizen te fungeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voordat de muis wordt blootgesteld aan anesthesie, moet u een pipet met 25 μl van het inoculum bereiden. Plaats de muis in de isofluraancontainer en kantel de container om te controleren of de oprichtreflex verloren gaat, waar de muis het bewustzijn heeft verloren en ondersteboven ligt. Dit duurt meestal ongeveer 10 s.
3. Controleer de ademhalingsfrequentie (RR) totdat deze vertraagt tot een consistente 50-80 ademhalingen per minuut (bpm), ongeveer 50% van de RR in rust. Dit duurt meestal nog eens 10 seconden. Haal op dit moment de muis uit het isofluraanpotje.
   OPMERKING: Dit is een hoge concentratie isofluraan, die een snelle inductie van anesthesie zal veroorzaken, en de muis moet zeer nauwlettend worden gecontroleerd. Een dodelijke overdosis isofluraan is een risico, aangezien de concentratie isofluraan variabel kan zijn en de dosis-responscurve voor isofluraan erg steil is. Als de ademhalingsfrequentie onder de 50 slagen per minuut daalt en/of onregelmatig is, verwijder dan de muis uit isofluraan, laat hem 3-5 minuten herstellen en probeer het opnieuw (maximaal twee herhaalde pogingen).
4. Bevestig de diepte van de verdoving door niet te reageren op het beknellen van de teen. Plaats vervolgens de muis in rugligging in één hand en laat de muis 3-5 regelmatig naar adem snakken met toenemende snelheid (beginnend bij 50-60 slagen per minuut) en kracht. Als dit begint, plaatst u de pipetpunt aan de achterkant van de orofarynx van de muis en laat u het inoculum los tijdens een inademing.
   OPMERKING: Deze hijgen door de mond schokken het hoofd inferieur door de rekrutering van bijkomende spieren voor de ademhaling. Wanneer de pipet tijdens deze hijgen wordt ingebracht, moet de mond bij elke hijg opengaan. Als de mond niet opengaat, is de muis onvoldoende verdoofd en zal hij waarschijnlijk de inhoud van de orofarynx niet inademen. Het pipet moet de tong indrukken en naar de bodem en de voorkant van de mond duwen om te voorkomen dat het entmateriaal wordt ingeslikt. Wanneer de pipet in de mond zit en de muis voldoende verdoofd is, zal de muis bij elke hijg zijn mond openen.
5. Terwijl de hand en duim de muis vasthouden, voelt u of er gekraak optreedt op de achterste en voorste aspecten van de borstkas van de muis om het inademen van het entmateriaal te bevestigen.

3. Euthanasie van muizen

1. Injecteer de muis intraperitoneaal met een cocktail van 200 mg/kg ketamine en 24 mg/kg xylazine 10 minuten voor het offertijdstip.
2. Wacht 10 minuten na de injectie totdat de muis een chirurgisch vlak van anesthesie binnengaat, bevestigd door een gebrek aan reactie op het beknellen van de teen.

4. Perfusie van de longen met PBS en formaline

1. Spuit de verdoofde muis in met 70% ethanol. Gebruik een schaar om de huid van de muis af te knippen en trek de huid uit elkaar om het buikvlies aan alle kanten bloot te leggen. Trek de huid van de bovenste helft van de muis over zijn hoofd en trek de armen uit de huid.
2. Snijd het peritoneale membraan bij het borstbeen en langs het onderste deel van de ribbenkast, waardoor het buikvlies bloot komt te liggen. Verplaats de lever inferieur, waardoor het middenrif zichtbaar wordt. Gebruik een schaar om het middenrif voorzichtig weg te prikken van het longparenchym om te voorkomen dat u een gat in de longen zelf doorboort.
   OPMERKING: Als u per ongeluk de longen doorboort, wordt het opblazen van de lucht onmogelijk.
3. Nadat het middenrif is doorboord, komt er lucht in de borstkas, waardoor de longen instorten. Snijd de ribbenkast aan de linkerkant af om het hart te onthullen. Injecteer 5-10 ml PBS in de rechterventrikel met een naald van 30 G met een snelheid van 1 ml per 5 s (om beschadiging van de bloedvaten te voorkomen), waardoor de longen snel witter worden.
   LET OP: Formaline is een gevaarlijke vluchtige stof die moet worden behandeld in een bioveiligheidskast of zuurkast.
4. Als u klaar bent, verwijdert u de naald en gebruikt u een nieuwe naald om 5 ml 10% neutraal gebufferde formaline (NBF) in dezelfde snelheid in de rechterventrikel te injecteren.

5. Luchtopblazen van de geperfundeerde long

1. Verwijder de voorste helft van de ribbenkast. Om de luchtpijp bloot te leggen, snijdt u de bovenste ribben en sleutelbeenderen rechts en links van de nek door. Zorg ervoor dat u niet in de buurt van de middellijn snijdt waar de luchtpijp zal liggen. Klem met een tang de resterende bovenste ribben en sleutelbeenderen op de middellijn van de nek en trek naar boven totdat de luchtpijp bloot komt te liggen.
2. Maak een hechtdraad van 10 cm lang, trek deze onder de luchtpijp en leg een losse knoop aan het onderste uiteinde van de blootliggende luchtpijp. Bereid een spuit van 1 ml met lucht voor met een katheter van 18 G. Gebruik een naald van 18 G om een gat in de luchtpijp te maken aan het bovenste uiteinde van het blootgestelde gebied.
3. Plaats de katheter in dat gat en zorg voor een relatief strakke pasvorm om te voorkomen dat er lucht ontsnapt. Injecteer langzaam de 1 ml lucht in de longen in de loop van 10 s, waarbij u let op het opblazen van de longen van alle lobben. Volledig opgeblazen zorgt ervoor dat de longen zich iets om het hart wikkelen en het volume vullen dat ze in het niet-doorboorde middenrif innemen.
4. Trek de knoop strak rond de luchtpijp en verwijder de katheter. Houd de luchtpijp vast en gebruik een botte schaar om de longen uit de muis te verwijderen, zorg ervoor dat u de long niet doorboort.

6. Onderdompeling, fixatie en uitdroging

1. Plaats de longen op de bovenrand van een conische buis van 50 ml gevuld met 20 ml 10% NBF. Houd de hechtdraden buiten de conische, schroef de dop vast en keer de conische om zodat de longen ondersteboven in 20 ml NBF hangen. Zet het 24-48 uur op 4 °C.
2. Spoel de longen met PBS en plaats ze vervolgens 72-96 uur bij 4 °C in een 30% sucrose-PBS (m/v) oplossing om de longen uit te drogen ter voorbereiding op cryopreservatie. Verwijder de longen van sucrose, plaats de longen in een cryomold met een optimale snijtemperatuur (OCT) en vries het monster in bij -80 °C.

7. Cryosectie

1. Breng de monsters in OCT-cryoblokken in evenwicht met de -20 °C-temperatuur van de cryostaat gedurende 1 uur voorafgaand aan de secties. Snijd de blokken in diktes van 20-100 μm.
   OPMERKING: Het opblazen van lucht kan leiden tot een grotere kwetsbaarheid van het monster, en snijden met een grotere dikte kan weefselbreuk tijdens het snijden voorkomen.
2. Verzamel secties op glazen objectglaasjes en laat 30 minuten tot 1 uur drogen om ervoor te zorgen dat het weefsel aan het glaasje blijft hechten.
   OPMERKING: Dia's kunnen in dit stadium bij -80 °C worden gehouden.

8. Voorbereiding en blokkering van dia's

1. Plaats de dia's 30 minuten in het PBS-bad (in een schaal of Coplin-pot) bij kamertemperatuur (RT) om OCT van de dia's te verwijderen.
   OPMERKING: Dikkere delen (40-100 μm) hechten mogelijk niet zo goed aan glazen dia's als dunnere delen, dus het is het beste om ze plat en rechtop in een schaal te houden in plaats van op hun kant in een Coplin-pot.
2. Droog de objectglaasjes nadat OCT is opgelost uit het weefsel. Gebruik een doekje om overtollige druppels van de omtrek van het objectglaasje rond het weefselmonster te drogen.
3. Gebruik een hydrofobe Pap-pen om een omtrek rond het monster te tekenen en laat het 5 minuten drogen.
4. Bereid een blokkeerbuffer van diervrije blokkeeroplossing voor met 0,3% Tween-20 en 1:100 Fc Blok in 300 ml per glaasje.
   OPMERKING: Voor intracellulaire doelen kan 1% Tween-20 worden gebruikt. Een volume van 300 μL is meestal voldoende, maar het benodigde volume om het weefsel volledig te bedekken hangt af van de omtrekgrootte van de hydrofobe marker. Het weefsel mag vanaf dit punt niet meer uitdrogen.
5. Laat de blokkeeroplossing 1 uur op de objectglaasjes zitten bij RT.

9. Immunokleuring

1. Was het objectglaasje door de vloeistof af te pipetteren en 300-500 μL PBS toe te voegen. Herhaal de wasbeurt één keer.
2. Bereid primair AlexaFluor-647 geconjugeerd ratten anti-muis EpCAM (kloon G8.8) antilichaam (luchtwegepitheliale marker) in diervrije blockeroplossing met 0,33% Tween-20 (of 1% voor intracellulaire doelen). Voeg 300 μl van deze oplossing per objectglaasje toe en kleur 's nachts bij 4 °C.
   OPMERKING: Antilichamen moeten empirisch worden getest op kleuringsconcentratie, tijd en temperatuur. Dunne secties (8-20 μm) worden gedurende 30 minuten bij 37 °C gekleurd en dikkere secties (20-100 μm) 's nachts bij 4 °C met verdunningen van 1:100 voor de meeste antilichamen. Als u ongeconjugeerde antilichamen gebruikt, was dan 2x (zoals hierboven) en breng een secundair fluorescerend antilichaam aan gedurende een empirisch bepaalde tijd en temperatuur. Over het algemeen wordt secundaire antilichaamkleuring gedaan bij RT gedurende 1 uur bij 1:1000 verdunning.
3. Verwijder de antilichaamoplossing uit het monster en was het objectglaasje gedurende 5 minuten met 300 ml PBS. Herhaal deze wasbeurt één keer. Droog de objectglaasjes en verwijder al het overtollige vocht uit het preparaat en het omringende glas.
4. Voeg een druppel RT soft set montagemedia (bijv. SlowFade Glass) toe aan elk stuk tissue. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan door het flesje ondersteboven te laten bezinken en elke druppel langzaam op de tissues te laten vallen. Plaats een dekglaasje van de juiste grootte dat het buiten het monster en de hydrofobe markeringsomtrek uitsteekt.

10. Beeldvorming via fluorescentiemicroscopie

1. Gebruik een meerkanaals fluorescerende microscoop om hele longsecties op een onbevooroordeelde manier te scannen met behulp van een objectief met voldoende resolutie om individuele sporen en gastheercellen op te lossen (bijv. Zeiss Axioscan 7 met 20x olie-objectief met NA = 0.8 of iets dergelijks).
   NOTITIE: Zorg ervoor dat laservermogen en PMT-voltage versterking zijn ingesteld om de signaal-ruisverhoudingen van het doel over de achtergrond te maximaliseren, bepaald met een fluorescentie minus één (FMO) regeling.
2. Verzamel voldoende afbeeldingstegels om de hele longkwab vast te leggen (bijv. ~200 tegels met een grootte van 400 μm x 400 μm). Gebruik het microscoopsoftwareprogramma (bijv. Zeiss ZEN 3.7 of iets dergelijks) om de samengevoegde tegelafbeelding te exporteren voor downstreamverwerking.

11. Ruimtelijke analyse via QuPath

1. In QuPath, een gratis open-source software¹⁴, maak een projectbestand en voeg de fluorescerende afbeeldingen toe aan het bestand.
2. Classificeer de EpCAM+-pixels als epitheel door op de bovenste menuoptie Classificeren te klikken en vervolgens op Pixelclassificatie > Drempelwaarde maken. Selecteer de resolutie, het kanaal, de afvlakkingssigma en de drempelwaarde die het doelgebied het beste identificeert. Sla de classificatie op onder een unieke naam en selecteer Objecten maken.
3. Selecteer in het nieuwe venster Objecten maken de optie Nieuw objecttype als Annotatie. Stel voor longepitheel de minimale objectgrootte en minimale gatgrootte in op 100 mm². Het is niet nodig om hier Gesplitste objecten te selecteren. Nadat u OK hebt geselecteerd, worden de annotaties gemaakt en kunnen ze met het oog worden gewijzigd met het penseel in de linkerbovenhoek.
4. Om sporen te classificeren, herhaalt u de stappen van 11.3-11.4 met behulp van het kanaal waarin de sporen zijn vastgelegd en maakt u het nieuwe objecttype Detectie in plaats van Annotatie. Stel de minimale objectgrootte en de minimale gatgrootte in op 0 mm² en selecteer Objecten splitsen.
5. Om een ruimtelijke analyse van de sporen uit te voeren, selecteert u de optie in het bovenste menu Analyseer > ruimtelijke analyse > Bereken de ondertekende afstand tot annotaties 2D. De afstanden tot het EpCAM+-epitheel worden berekend voor elke gedetecteerde spore. Exporteer deze via het bovenste menu-optie Meten > Metingen exporteren.

Resultaten

Deze methode produceert uiteindelijk immunofluorescerende beelden van muizenlongen met behulp van fysiologische luchtinflatie om de luchtwegen ongestoord te laten. Belangrijk is dat meerdere controlepunten onderweg bevestigen dat onderdelen van het protocol met succes zijn uitgevoerd. Tijdens de inoculatie is het belangrijk om te bevestigen dat het entmateriaal is opgezogen door te voelen of er "gekraak" op de achterste borstwand van de muis is die erop wijzen dat de vloeistof de luchtwegen is binnengekomen. Als er geen gevoel van gekraak is, is het mogelijk dat de muis het inoculum heeft ingeslikt. De perfusie van de longen van de muis met PBS zou moeten resulteren in witte vlekken van de longen, gevolgd door volledige bleking van de hele long (Figuur 2A). Als er onvolledig wit wordt, zal de daaropvolgende formalineperfusie niet alle delen van het longparenchym bereiken (Figuur 2B). Bij het opblazen van de long met lucht, moeten de longen langzaam uitzetten totdat ze fysiologische grootte bereiken. Na het vastbinden van de tracheale hechting om de lucht in de longen veilig te stellen, mogen de longen niet in omvang samentrekken. Als ze dat doen, is de long waarschijnlijk tijdens de procedure doorboord.

Hier tonen we representatieve afbeeldingen van secties met gelabelde Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ-sporen (groen) en EpCAM+ zuilvormig bronchiolair epitheel (magenta) in zowel luchtopgeblazen als formaline-vloeistofopgeblazen longen (respectievelijk Figuur 3A,B). Deze sporen hopen zich voornamelijk op in distale bronchiolen en in de alveolaire ruimtes direct naast die distale bronchiolen, waarschijnlijk in alveolaire kanalen. De met lucht opgeblazen fixatief geperfundeerde longen bevatten sporen die vaker voorkomen in bronchiolen en dichter bij bronchiolen clusteren (Figuur 3A), in plaats van het vloeibare fixatief waar sporen iets meer verspreid lijken vanuit het bronchiolaire epitheel (Figuur 3B). Door middel van de QuPath ruimtelijke analyse meten we de afstand van individuele sporen tot het dichtstbijzijnde EpCAM+ bronchiolaire epitheel om het niveau van dispersie van de sporen weg van de bronchiol en in meer distale alveolaire ruimtes aan te geven. We laten zien dat vloeistofinflatie sporen verder van de bronchiolen verspreidt in vergelijking met fysiologische luchtinflatie (Figuur 4A,B). De luchtopblazende vasculaire perfusie behoudt de natuurlijke positionering van deze sporen in distale bronchiolen en voorkomt de kunstmatige verspreiding van deze sporen in meer distale alveolaire ruimtes door intratracheale fixatieve instillatie.

Figuur 2: Indicatie van het succes van longperfusie. (A) Succesvol geperfundeerde longen zullen volledig wit zijn. (B) Onvolledig geperfuseerde longen zien er roze of gevlekt uit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van sporenverdeling in met lucht opgeblazen met formaline geperfuseerde longen versus met formaline opgeblazen longen. Intracellulaire fluorescerende sporen (groen) worden gezien als gedistribueerd in nauwere nabijheid van EpCAM+ bronchiolair epitheel (magenta) in (A) luchtopgeblazen longen dan in (B) met formaline opgeblazen longen. Beelden werden verkregen van secties met een diepte van 1,2 mm vanaf het achterste oppervlak van de linkerlobben van muizen in elke behandelingsgroep op een meerkanaals fluorescerende microscoop met een vergroting van 20x, en tegels werden gehecht met behulp van microscopiesoftware. Schaalbalk = 800 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 4: Vergelijking van de sporenafstand (mm) tot het bronchiolaire epitheel tussen met lucht opgeblazen en met formaline opgeblazen poriënbehandelde longen. Longen van 3 muizen per behandelingsgroep werden geoogst, verwerkt en gedurende 1,5 uur na inoculatie in beeld gebracht met 1 x 10⁶ Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. Vier secties per muis werden bemonsterd op 0,8 mm, 1,2 mm, 1,6 mm en 2,0 mm van het achterste oppervlak van de linkerkwab, gekleurd en afgebeeld op een meerkanaals fluorescerende microscoop. Alle sporen van elke groep werden gedetecteerd en ruimtelijk geanalyseerd in QuPath om de (A) afstand tot het dichtstbijzijnde EpCAM+ zuilvormige bronchiolaire epitheel te bepalen, en (B) de mediane en 95% betrouwbaarheidsintervallen worden weergegeven in eenheden van micrometers. Luchtopblazende sporen, n = 11.673. Sporen voor vloeistofinflatie, n = 9.837. De Mann-Whitney t-test werd uitgevoerd vanwege een gebrek aan normaliteit en p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We hebben een pijplijn opgezet voor het inademen van sporen en het analyseren van de ruimtelijke depositie van de ingeademde sporen. Deze pijplijn biedt waardevolle informatie om de relevante stromale gebieden van de long te bepalen die zijn aangetast door inademing van Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidia. We hebben waargenomen dat Coccidioides-sporen en inerte deeltjes van vergelijkbare grootte (gegevens niet weergegeven) zich ophopen in distale bronchiolaire gebieden en broncho-alveolaire overgangen in plaats van volledig verspreid over alveolaire luchtweglumen. Dit model vereist een relatief laag niveau van apparatuur en technische vaardigheden om cryosecties voor immunofluorescentie (of andere stroomafwaartse pijpleidingen zoals immunohistochemie [IHC]) te produceren die de fysiologische integriteit van de luchtweginhoud behouden houden met behoud van de natuurlijke longmorfologie. Zonder luchtinflatie verstoort de ineenstorting van longblaasjes de natuurlijke architectuur van longparenchym rond bronchiolen ^13,15. Verlies van het luchtvolume van de long tijdens histologische verwerking werd aangegeven als een "ernstig probleem" in een gezamenlijke officiële onderzoeksbeleidsverklaring van de American Thoracic Society en European Respiratory Society bij het definiëren van normen voor kwantitatieve beoordeling van de longstructuur¹⁶. Bovendien kan intratracheale instillatie van fixeermiddel de aard en locatie van moleculaire en cellulaire componenten van de proximale luchtwegen, zoals mucines, oppervlakteactieve stof en cilia van de luchtwegen,^verstoren 17,18,19. De hier beschreven methode behoudt voldoende zowel het luchtvolume van de long, als de moleculaire en cellulaire componenten langs de luchtwegen die interageren met ingeademde schimmelsporen.

Immunofluorescentiemicroscopie biedt een krachtig hulpmiddel om de ruimtelijke dynamiek van longcomponenten te ondervragen, en het wordt goed beoordeeld^20,21. Er zijn geen beperkingen aan de doelen die kunnen worden gekleurd via immunofluorescentie van deze secties, behalve dat antilichamen met epitopen die gevoelig zijn voor formalinefixatie hun doelen mogelijk niet voldoende binden. Bij het gebruik van een nieuw antilichaam is het het beste om een fluorescentie minus één (FMO) -controle voor te bereiden om te bepalen of het antilichaam een signaal boven de achtergrond genereert. Als u een secundair antilichaam gebruikt, gebruik dan een behandelingsgroep zonder het primaire antilichaam om te controleren op off-target binding van het secundaire antilichaam. Primaire geconjugeerde monoklonale antilichamen zijn zeer specifiek, dus kleuring bij hogere temperaturen (37 °C) gedurende minder tijd (30 min) is gebruikelijk en bindt over het algemeen specifiek aan hun doelwit. Aan de andere kant zijn ongeconjugeerde polyklonale antilichamen gevoeliger voor het detecteren van antigenen, maar minder specifiek, dus langere incubaties (~16 uur) bij koudere temperaturen (4 °C) optimaliseren de signaal-ruisverhouding. Alle antilichamen vereisen empirische optimalisatie.

Het ruimtelijke analysemodel dat in dit onderzoek is gebruikt voor sporenlokalisatie, meet de afstand van individuele sporen tot het dichtstbijzijnde bronchiolaire epitheel. Dit vereist een passende identificatie van het bronchiolaire epitheel met behulp van het hoge EpCAM-signaal en het morfologisch verschillende uiterlijk als een zuilvormig epitheel dat buisachtige structuren bekleedt. EpCAM kan ook op lagere niveaus tot expressie worden gebracht door alveolair epitheel, dus het is belangrijk om het EpCAM-signaal in QuPath te drempelen om de gedefinieerde annotaties te beperken tot morfologisch bevestigde bronchiolaire gebieden. Omdat bronchiolen een anatomische minimumgrootte hebben, kunnen we de QuPath-definitie van deze regio's beperken tot de minimale oppervlakte van 100 mm², zoals vermeld in stap 11.3. Dit zal geïsoleerde cellen of artefacten met een hoge EpCAM-expressie in alveolaire ruimtes, zoals alveolaire type II-epitheelcellen, uitsluiten van de QuPath-annotaties. Deze stappen stellen ons in staat om uitsluitend bronchiolair epitheel te definiëren als QuPath-annotaties en de nabijheid van sporen tot dit gedefinieerde bronchiolaire epitheel te bepalen.

Het hier beschreven infectiemodel maakt gebruik van isofluraan-anesthesie om bij muizen een orale hapreactie op te wekken voor het opzuigen van de schimmelsporen. De isofluraan open druppelmethode is ontwikkeld als een snelle techniek met weinig middelen om kortdurende anesthesie bij muizen te induceren ^9,22,23. Deze methode vergt enige oefening om consistent uit te voeren. De tijd onder narcose moet lang genoeg zijn om de muis voldoende te verdoven om de farynxinhoud op te zuigen. Als de muis onvoldoende verdoofd is, kan hij het entmateriaal inslikken in plaats van het op te zuigen. Het teken van voldoende verdoving wordt bereikt wanneer de muis een regelmatige orale zucht van toenemende kracht produceert met een snelheid van ongeveer 50-60 hijgen / min. Het hoofd van de liggende muis moet bij elke hap naar voren bewegen. Onvoldoende verdoving kan worden vastgesteld door een gebrek aan hijgen of enige beweging van snorharen, tong of ledematen. Het is het beste om de tong met de pipetpunt in te drukken tijdens het toedienen van het entmateriaal om inslikken te voorkomen. Overdosering van isofluraan kan de dood van de muis tot gevolg hebben en moet worden voorkomen. Een goede vuistregel om dit te voorkomen, is om de muis uit isofluraan te verwijderen na dezelfde tijd die de muis nodig heeft om de oprichtreflex te verliezen. Als de muis er bijvoorbeeld 10 s over doet om de oprichtreflex te verliezen, verwijdert u de muis na nog eens 10 s. Aangezien het isofluraangas in de loop van meerdere muizenbehandelingen ontsnapt, kan dit tijdsbestek toenemen. In onze handen kunnen we 6-8 muizen behandelen zonder meer isofluraan toe te voegen.

Er zijn enkele beperkingen aan de componenten van dit protocol. De inoculatieprocedure maakt gebruik van sporen die zijn gesuspendeerd in 25 μL vloeibaar PBS-medium, wat minder fysiologisch is dan een inoculatie van sporen in verneveling. Een open vraag blijft of het gebruik van opgezogen vloeistof de lokalisatie van sporen/deeltjes verandert in vergelijking met andere inoculatiemethoden, zoals het inademen van sporen in de lucht. Inademing door verneveling vereist echter uitgebreide investeringen in middelen en heeft andere beperkingen (beperkte inoculumgrootte, variabele blootstelling, beroepsrisico) die mogelijk niet optimaal zijn, afhankelijk van de aard van de onderzoeks- en laboratoriumomgeving. Een andere beperking van dit protocol is dat weefselfragiliteit kan optreden tijdens cryosectie, wat te wijten kan zijn aan de aanwezigheid van lucht door het weefsel of aan de verminderde effectiviteit van de vasculaire fixatie in vergelijking met intratracheale fixatie. Deze kwetsbaarheid van cryosectie kan worden overwonnen door dikkere secties van 60-100 μm te snijden en confocale microscopie te gebruiken om tweedimensionale (2D) vlakken in het weefsel in beeld te brengen.

We geloven dat de eenvoud en het aanpassingsvermogen van deze methode andere groepen in staat zal stellen om nut te vinden met de door hen gekozen ingeademde pathogenen en gastreacties van belang.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
18 G, 1 1/2 needle (305185)	Fisher	305185
1 L  Screwtop Jar  (Nalgene)	Fisher Scientific	11-823-33
Air-Tite Bulk Unsterile Syringes 10 mL Luer Lock	Fisher	14-817-175
AnaSed Injection (xylazine steriele oplossing)	Akorn	59399-110-20
Animal-Free Blocker and Diluent, R.T.U.	Vector	SP-5035-100
BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV Catheter with BD Vialon Catheter Material 18 G x 1.88 in	BD	381547
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™)	BD	553142
CellTracker Orange CMRA Dye	Fisher Scientific	NC0873640
CFSE	Labviva	75003
Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ	BEI Resources	NR-166
Corning 70 micron strainers	VWR	10054-456
EpCAM AlexaFluor647 monoklonaal antilichaam	Biolegend	118211
Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"	Labviva	EN3012
Fisherbrand Sterile Syringes for Single Use (1mL, Leur Slip)	Fisher	14-955-462
Glucose Monohydrate	Azer Scientific	ES17530-500G
High Vacuum Grease	VWR	59344-055
Hoechst 33342 Oplossing 20 mM (5 mL)	ThermoFischer	62249
Isoflurane USP	Covetrus	29405
Ketamine Hydrochloride	Dechra	1000001250
KIMWIPES Delicate Task Wipers (4.4'' x 8.4")	VWR	21905-026
Lexer Baby Scissors	FST	14078-10
Micro-Adson Forceps	FST	11018-12
Neutral Buffered Formalin (10%) (Azer Scientific)	Fisher	22-026-350
Nunc EasYFlask tissue culture flasks, T75, filter caps	VWR	15708-134
PBS	VWR	45000-446
Peel-A-Way embedding molds	Sigma	E6032-1CS
QuPath 0.5.1 Software	Open-source	https://qupath.github.io/
Silk Suture thread size 3/0	FST	18020-30
SlidesMicro Slides Superfrost Plus	VWR	48311-703
SlowFade Glass Soft-set Antifade Mountant (2 mL)	ThermoFischer	S36917
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek	VWR	25608-930
Tween 20	ThermoFischer	J20605.AP
Vector Laboratories ImmEDGE Hydrophobic Barrier Pen Set Of 2	Fisher Scientific	NC9545623
VWR Micro Cover Glasses, Rectangular (24 mm x 40 mm #1.5)	VWR	48393-230
White Plastic Wire Mesh	MAPORCH	789862904922
Yeast Extract	Fisher	BP9727-500
Zeiss AxioScan 7	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html	multichannel fluorescente microscoop
ZEN 3.7 Software	Carl Zeiss Microscopy GmbH	https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html	microscoop software