Methodenartikel

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

DOI:

10.3791/67559

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  , 
1IIPROSAM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP), 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3IQUIBIM, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata (UNMdP)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De afscheiding van extracellulaire blaasjes door cestoden is cruciaal voor het mogelijk maken van cellulaire communicatie, niet alleen tussen parasieten, maar ook met gastheerweefsels. In het bijzonder fungeren kleine extracellulaire blaasjes (sEV's) als nanodragers die natuurlijke antigenen overdragen, die cruciaal zijn voor de immunomodulatie van de gastheer en de overleving van parasieten. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol om sEV's te isoleren uit larvale stadiumculturen van Echinococcus granulosus en analyseert hun opname door dendritische cellen verkregen uit muizenbeenmerg, die adhesie en antigeenpresentatiecapaciteit verwerven tijdens hun rijping na een week in vitro kweek. Dit artikel biedt uitgebreide informatie voor het genereren, zuiveren en kwantificeren van sEV's met behulp van ultracentrifugatie, naast parallelle analyses van dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. Daarnaast wordt een gedetailleerd experimenteel protocol opgesteld voor het isoleren en kweken van beenmergcellen van muizen en het aandrijven van hun differentiatie in dendritische cellen met behulp van Flt3L. Deze dendritische cellen kunnen antigenen presenteren aan naïeve T-cellen, waardoor het type immuunrespons in vivo wordt gemoduleerd. Daarom worden alternatieve protocollen voorgesteld, waaronder confocale microscopie en flowcytometrie-analyse, om het verworven rijpingsfenotype van dendritische cellen die eerder zijn blootgesteld aan parasitaire sEV's te controleren. Ten slotte is het vermeldenswaard dat het beschreven protocol in zijn geheel of in afzonderlijke delen kan worden toegepast om parasiet-in-vitrocultuur uit te voeren, extracellulaire blaasjes te isoleren, van beenmerg afgeleide dendritische celculturen te genereren en opnametests uit te voeren met deze cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Echinococcus granulosus is een zoönotische parasitaire worm die verantwoordelijk is voor een langdurige infectie die bekend staat als cystische echinokokkose1. Bij tussengastheren, zoals vee en mensen, tast de parasitaire infectie vooral de lever en de longen aan, waar het larvale stadium zich ontwikkelt als met vloeistof gevulde cysten of metacestoden die protoscoleces bevatten (zelf een larve). Zoals alle cestoden mist deze parasiet zowel spijsverterings- als uitscheidingssystemen en heeft daarom actieve endocytische en exocytische cellulaire processen ontwikkeld om de opname en uitscheiding van metabolieten te reguleren, evenals de afgifte van extracellulaire blaasjes2,3. Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn lipide, dubbellaags, omsloten deeltjes die door blijkbaar alle celtypen worden uitgescheiden. Met name kleine extracellulaire blaasjes (sEV's), gedefinieerd als EV's kleiner dan 200 nm, ongeacht hun biogenese-oorsprong4, kunnen fungeren als intercellulaire immuunmediatoren. Deze functie is vooral belangrijk bij parasieten, die afhankelijk zijn van immunomodulatie van de gastheer om hun overleving te garanderen3. Immuunmanipulatie wordt bereikt door de opname van sEV's door dendritische cellen van de gastheer, de enige cellen die in staat zijn om naïeve T-cellen in vivo te activeren en een adaptieve immuunrespons te initiëren die zal leiden tot chronische infectie door deze parasitaire wormen. Dendritische cellen, professionele antigeenpresenterende cellen van het aangeboren immuunsysteem, verwerken en laden antigene peptiden op Major Histocompatibility Complex Klasse I en Klasse II (MHC I en MHC II) en stellen ze tentoon op hun membranen voor exclusieve naïeve T-celpriming (respectievelijk CD8+ en CD4+ T-cellen)5. Na dendritische cellen induceren ze hun rijping door inductie van expressie van de co-stimulerende markers CD80/CD86 en CD40 en MHC-II en migreren ze van perifere weefsels naar secundaire lymfoïde organen bij het herkennen van vreemde antigenen, waardoor ze worden geladen voor exclusieve naïeve T-celpriming6. Het algemene doel van dit protocol is dus om de worm-parasiet-gastheercommunicatie op een realistische manier te bestuderen, waarbij de verpakking en afgifte van parasitaire componenten in de vorm van sEV's worden geanalyseerd, die, bij het bereiken van de immuuncellen van de gastheer, de ontwikkeling van infectie en de progressie van de chronische parasitaire ziekte beïnvloeden.

Het aanpakken van de analyse van de helminth-host-interface door middel van de studie van sEV's heeft verschillende voordelen. Ten eerste is het omhulsel, de buitenste laag van platwormen, een dubbele membraanstructuur die een belangrijk kruispunt vormt tussen de parasiet en zijn gastheer, waardoor sEV's gemakkelijk kunnen worden gegenereerd of doordrongen van deze structuur7. Ten tweede zijn sEV's sterk beladen met eiwitantigenen uit alle stadia van de levenscyclus van de parasiet, die de natuurlijke manier vertegenwoordigen waarop het immuunsysteem van de gastheer antigenen bemonstert tijdens worminfectie 8,9. Door hun biologische productie, gemakkelijke zuivering (zonder weefselverstoring of eiwitfractionering) en directe interactie met gastheercellen, maken worm-sEV's de ontwikkeling mogelijk van in vitro experimenten om de in vivo omstandigheden van parasiet-gastheerinteractie te simuleren. Ten slotte vertegenwoordigen sEV's de mogelijkheid om parasitaire structuren te hebben die kunnen worden gefagocyteerd of geïnternaliseerd door gastheercellen, waardoor de onmogelijkheid wordt overwonnen om dit te doen met hele parasieten, vooral in het geval van ingekapselde wormen.

Gezien de vermelde voordelen en het feit dat helminthiases veel voorkomende en typisch chronische ziekten zijn waarbij parasieten vermoedelijk het immuunsysteem van de gastheer manipuleren als overlevingsstrategie, biedt de isolatie van van parasieten afgeleide EV's en hun studie in interactie met dendritische cellen een waardevol kader om deze immunomodulatie te onderzoeken10. In die zin is beschreven dat de internalisatie van EV's uit wormen, waaronder nematoden en platyhelminten zoals Schistosoma mansoni, Fasciola hepatica, Brugia malayi en E. granulosus, de rijping en activering van dendritische cellen induceert 9,11,12,13,14,15.

De isolatie van van wormen afgeleide EV's maakt niet alleen de studie van immunologische interacties mogelijk, wat mogelijk kan leiden tot de ontwikkeling van beschermende vaccins of immunotherapeutische middelen voor allergische of auto-immuunziekten, maar vergemakkelijkt ook de verkenning van andere biologische interacties en functies 8,16,17. In deze context kunnen EV's, die een rol spelen in de natuurlijke geschiedenis van parasitaire infecties, worden gebruikt om de ontwikkeling van parasieten en interacties met specifieke gastheercellen te onderzoeken. Bovendien kunnen ze potentiële toepassingen hebben als vroege of differentiële biomarkers voor de diagnose van parasitaire ziekten, het monitoren van therapeutische responsen en het bijdragen aan de controle en behandeling van parasitaire infecties17,18.

Bovendien, zoals eerder aangetoond, is het larvale stadium van E. granulosus gevoelig voor veranderingen in de cytosolische calciumconcentratie, die niet alleen een rol speelt bij de levensvatbaarheid van parasieten, maar ook de exocytosesnelheid regelt19,20. In deze context, en wetende dat intracellulaire calciumverhoging de afgifte van EV's verbetert, zou het gebruik van een intracellulaire calciumversterker als loperamide een cruciale strategie kunnen zijn om het aantal EV's te verhogen. Deze benadering is vooral interessant voor cellulaire systemen die grote populaties nodig hebben om een voldoende hoeveelheid EV's te genereren voor vracht- en functionele analyse 11,21,22. Het huidige protocol (Figuur 1) beschrijft de methoden voor het verkrijgen van zuivere culturen van het larvale stadium van E. granulosus en de omstandigheden die de productie van sEV bevorderen. Het beschrijft ook de workflow voor de isolatie en karakterisering van deze blaasjes, evenals hun opname door muizendendritische cellen, een essentiële stap in de eerste studie van de modulatie van het immuunsysteem van de gastheer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, werden geëvalueerd en goedgekeurd door de Dierexperimentele Commissie van de Faculteit der Exacte en Natuurwetenschappen, Mar del Plata (vergunningsnummers: RD544-2020; RD624-625-2021; RD80-2022). In dit protocol werden muizen geëuthanaseerd, volgens de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals", gepubliceerd door de NIH en de richtlijnen van de National Health Service and Food Quality (SENASA).

1. Teelt van het larvale stadium van Echinococcus

OPMERKING: Alle procedures werden uitgevoerd onder aseptische omstandigheden.

  1. E. granulosus protoscoleces obtentie
    1. Aspireer met een naald van 21 g en een spuit van 10 ml een deel van de hydatidvloeistof uit de long of lever van geïnfecteerd vee om cysteturgor te verminderen (Figuur 2A).
      OPMERKING: Geïnfecteerde longen en levers zijn afkomstig van runderen die in het slachthuis worden aangeboden voor routinematige slacht. Ze moeten bij 4 °C worden bewaard en binnen 24 uur vóór de slacht worden verwerkt.
    2. Open de cyste met een schaar en verwijder de laminaire en kiemlagen van de cyste met behulp van een tang. Plaats ze op een steriel petrischaaltje, samen met de resterende hydatid-vloeistof (Figuur 2B,C).
      OPMERKING: Op dit punt wordt aanbevolen om de petrischaal onder een omgekeerde microscoop te observeren om de kwaliteit van protoscoleces en broedkapsels te beoordelen. Vermijd het samenvoegen van het biologische materiaal van cysten met meer dan 50% van de ingeklapte protoscoces, die worden geïdentificeerd door hun samengetrokken soma, donkerdere kleur en ongeorganiseerd rostellum met verlies van haken.
    3. Was de lagen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met antibiotica (100 μg/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 100 μg/ml gentamicine 100 μg/ml) om de protoscoleren te verwijderen.
      OPMERKING: Alle wasbeurten worden uitgevoerd met PBS aangevuld met antibiotica.
    4. Breng de protoscolexuspensie over in een steriel glazen Khan-buisje met behulp van een pasteurpipet.
    5. Was de protoscoleces met gesupplementeerde PBS bij 4 °C met behulp van een pasteurpipet om dode parasieten te verwijderen. Resuspendeer de suspensie krachtig om de broedkapsels te breken en de afgifte van protoscolex te vergemakkelijken. Laat de protoscoleces 1-2 minuten op de bodem van de tube bezinken; Gooi vervolgens het bovenstaande met de dode protoscoletiën weg.
      OPMERKING: Door een verschil in dichtheid nestelen levende protoscoleces zich sneller dan dode parasieten.
    6. Herhaal het wasproces totdat alle dode en zwevende protoscoleces zijn verwijderd.
      OPMERKING: De dode parasieten worden verwijderd wanneer ze allemaal in hetzelfde tempo bezinken.
    7. Bepaal de levensvatbaarheid van protoscoleces met behulp van de methyleenuitsluitingstest.
      1. Resuspendeer de gewassen protoscoleces met een pipet en plaats een druppel op een glaasje. Voeg een druppel van 0,1 mg/ml methyleenblauw toe en dek af met een dekglaasje. Wacht 2-3 minuten en observeer onder de microscoop.
      2. Tel het totale aantal levende (onbevlekte) en dode (blauwgekleurde) protoscoleren en bereken het percentage levensvatbare protoscoleces (Figuur 2D en inzet).
        OPMERKING: De levensvatbaarheid van protoscoleces moet ongeveer 98% zijn voordat de culturen worden vastgesteld. De kleuringstijd mag niet langer zijn dan 10 minuten, omdat langere duur kan leiden tot het verkleuren van levende parasieten.
  2. E. granulosus metacestodes obtentie
    1. Produceer een experimentele secundaire hydatidische ziekte door intraperitoneale infectie van vrouwelijke CF1-muizen (lichaamsgewicht 25 ± 5 g) met 1500 protoscoleces (overeenkomend met 10 μl van de protocolex-pellet) gesuspendeerd in 0,5 ml gesupplementeerde PBS (Figuur 2E).
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de protoscoleces in PBS aangevuld met antibiotica gedurende 24 uur bij 4 °C of 3-5 dagen voorafgaand aan infectie in kweek te houden.
    2. Metacestoden ontwikkelen zich binnen 4-6 maanden na infectie (Figuur 2F). Huisvesting van de dieren in deze periode onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden (temperatuur 20 ± 1 °C, 12 uur licht/donkercyclus en water en voer ad libitum verstrekt). Zodra de cysten zich hebben ontwikkeld, verdooft u de muizen met ketamine-xylazine (50 mg/kg/muis-5 mg/kg/muis) en euthanaseert u ze door cervicale dislocatie.
    3. Reinig het ventrale oppervlak van de muis met 70% alcohol en open de peritoneale holte operatief om de ontwikkelde metacestoden te verwijderen met een schaar en tang.
    4. Breng de metacestodenmassa's over naar een steriel petrischaaltje.
      OPMERKING: De metacestodemassa's bestaan uit meerdere interne cysten omgeven door bindweefsel.
    5. Maak de cysten los van de metacestodemassa's door indien nodig voorzichtig het bindweefsel te verwijderen dat de metacestoden bedekt, met behulp van een tang.
      OPMERKING: Deze stap zorgt ervoor dat de parasieten vrij zijn van gastheerweefsel.
    6. Was de verkregen metacestoden met gesupplementeerd PBS bij 4 °C (figuur 2G).
  3. E. granulosus protoscoleces en metacestoden teelt
    1. Bereid het kweekmedium als volgt voor: Voeg 100 μg/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 100 μg/ml gentamicine, 4 mg/ml glucose, 50 mM Hepes buffer pH 7,5 en medium 199 toe om het gewenste eindvolume te bereiken en meng voorzichtig door inversie.
    2. Breng 5 ml van het voorbereide kweekmedium over in elke Leighton-buis (Figuur 2H-I).
    3. Voeg de parasieten toe aan het kweekmedium en incubeer gedurende 5 dagen bij 37 °C zonder het medium te veranderen. Incubeer de Leighton-buizen in een hoek van 15° om een gelijkmatige verdeling van het biologische materiaal over het vlakke oppervlak te garanderen. Dit maximaliseert de blootstelling van parasieten aan het kweekmedium en voorkomt contact met de rubberen stop.
      OPMERKING: Voeg 9.000-10.000 protoscoleces of 50 metacestoden toe (met diameters variërend tussen 5 mm en 15 mm, verdeeld als 10 cysten per buisje).
    4. Voeg eventueel 20 μM loperamide (een subletale concentratie) opgelost in dimethylsulfoxide gedurende 16-24 uur toe aan het parasietkweekmedium om het cytosolische calciumgehalte te verhogen en de EV-afgifte door het larvale stadium van E. granulosus te verbeteren.
      OPMERKING: Aangezien een toename van de intracellulaire calciumconcentraties de EV-productie verbetert, zal de behandeling van de parasiet met verbindingen die de calciumhomeostase beïnvloeden de EV-afgifte verhogen.

2. Zuivering van extracellulaire blaasjes

  1. Verzamel het parasietkweekmedium uit elke Leighton-buis en breng deze over in een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Het kweekmedium kan 24 uur worden bewaard voordat het voor het eerst wordt gecentrifugeerd met een minimale impact op de concentratie of grootteverdeling van de blaasjes. Protoscoleces kunnen drie keer worden gewassen met PBS-buffer, geoogst en bewaard bij -20 °C in tubes van 1,5 ml.
  2. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C en breng het bovenstaande met behulp van een pipet over in een nieuwe conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Met deze stap worden dode protoscoletiën verwijderd. Zorg er na elke centrifugatiestap voor dat er ten minste 0,5 cm supernatans boven de pellet achterblijft om besmetting te voorkomen.
  3. Centrifugeer het bovenstaande gedurende 10 minuten bij 2.000 x g bij 4 °C en breng het met behulp van een pipet over in nieuwe buisjes van 1,5 ml.
    OPMERKING: Met deze stap verwijdert u grotere celresten.
  4. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C om kleinere celresten te verwijderen.
  5. Breng het bovenstaande met behulp van een pipet over in een buisje dat geschikt is voor de ultracentrifugerotor. Markeer een kant van elke buis met een markering voordat u deze in de ultracentrifugerotor plaatst. Plaats vervolgens de buis in de rotor met de gemarkeerde kant naar boven.
    OPMERKING: De markering dient als referentiepunt voor het lokaliseren van de pellet na ultracentrifugatie. De buizen moeten voor driekwart gevuld en precies uitgebalanceerd zijn; voeg daarom, indien nodig, PBS toe. Als het volume van het bovenstaande de capaciteit van een enkele buis overschrijdt, verdeel de monsters dan in meerdere buisjes en combineer deze tijdens de resuspensie.
  6. Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C en giet het bovenstaande in een snelle beweging af. Laat de tube 1 minuut ondersteboven rusten. Het is mogelijk dat de pellet in dit stadium niet zichtbaar is.
    OPMERKING: De k-factor voor de gebruikte rotor is 103.
  7. Was de pellet met minimaal 3 ml PBS om verontreinigende eiwitten te verwijderen. Resuspendeer de pellet door meerdere keren op en neer te pipetteren vanaf de bovenkant van de buis naar de bodem op alle buisvlakken, maar voornamelijk aan de gemarkeerde kant waar de pellet zich naar verwachting zal bevinden.
    OPMERKING: Indien van toepassing, voeg de geresuspendeerde pellet afgeleid van hetzelfde bovenstaande in een enkele buis.
  8. Centrifugeer bij 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C en giet het bovenstaande in een snelle beweging af. Laat de tube 1 minuut ondersteboven rusten.
    OPMERKING: De k-factor voor de gebruikte rotor is 103.
  9. Resuspendeer de pellet in 30 μl PBS volgens het proces beschreven in stap 2.7.
    OPMERKING: Op dit punt wordt aanbevolen om de totale eiwitconcentratie in de geresuspendeerde pellet te meten om de hoeveelheid uitgescheiden sEV's te schatten. De eiwitconcentratie kan worden bepaald door de extinctie bij 280 nm te meten met behulp van een microvolumespectrofotometer.
  10. Breng het monster over in een tube van 1,5 ml. Vries de extracellulaire blaasjes in bij -80 °C.
    OPMERKING: Om de integriteit van de blaasjes voor stroomafwaartse toepassingen te behouden, vriest u de geresuspendeerde pellet zo snel mogelijk in en vermijdt u herhaalde vries-dooicycli.

3. Karakterisering van de geïsoleerde blaasjes

  1. Bepaling van de EV-grootte met behulp van dynamische lichtverstrooiing (DLS)
    OPMERKING: Dynamische lichtverstrooiing is een betrouwbare en gevoelige methode voor het evalueren van de grootte (gebaseerd op de hydrodynamische straal, Rh) en de vorm van nanodeeltjes in complexe vloeistoffen, ongeacht hun type. DLS- en zeta-potentiaalmetingen werden uitgevoerd met behulp van een He-Ne monochromatische laserstraal bij 633 nm. Als de analyse op de dag van de bemonstering niet mogelijk is, kunnen de monsters vóór opslag in een voorgefilterde buffer worden ingevroren.
    1. Ontdooi de monsters en bewaar ze op ijs totdat de metingen zijn uitgevoerd.
      OPMERKING: Het invriezen van de monsters kan de deeltjesverdeling en integriteit van sEV's beïnvloeden. Vermijd daarom vries- en dooicycli, omdat deze kunnen leiden tot een afname van het LS-signaal met verminderde piekhoogtes.
    2. Filtreer de waterige monsters die voor DLS worden gebruikt door een filter met een poriegrootte van 0,2 μm.
      OPMERKING: Bij LS-experimenten is het essentieel om alle oplossingen, buffers en waterige monsters te filteren om grote deeltjes en stof te verwijderen, die de metingen kunnen verstoren.
    3. Verdun de monsters 1:10 tot 1:50 in voorgefilterd PBS.
    4. Meng de monsters vóór elke meting door zachte inversie om sedimentatie te voorkomen, aangezien de LS-intensiteit kan afnemen als gevolg van een langere verwerkingstijd van het monster.
    5. Voeg 1 ml van het monster toe aan een schone cuvet en plaats de niet-berijpte kant in het laserpad aan de linkerkant in het instrument. Sluit het deksel en wacht 2-3 minuten voordat u het monster meet.
    6. Meet de grootte in termen van de hydrodynamische straal (Rh) voordat u de zètapotentiaalmeting uitvoert. Registreer metingen bij een enkele verstrooiingshoek (θ = 90° tot 150°) bij 25 °C ± 1 °C.
    7. Klik op Configuratiescherm om de metingen te controleren en de gegevensverzameling te starten .
      OPMERKING: Op basis van de gemiddelde Rh-waarden en de beoordeelde grootteverdelingen voor sEV's moet een piek tussen 30 nm en 200 nm worden waargenomen (Figuur 3). Pieken onder 15 nm in Rh worden toegeschreven aan nucleïnezuren en eiwitten in suspensie. Doorgaans worden grootteverdelingen berekend op basis van de gemiddelde hydrodynamische straal. Het Z-gemiddelde (gemiddelde deeltjesgrootte in het monster), de polydispersiteitsindex (PDI, die de heterogeniteit van de grootte van een monster bepaalt) en de hoekafhankelijkheid van de intensiteit van verstrooid licht kunnen echter ook worden gerapporteerd.
  2. Bepaling van structuur en deeltjesgrootte door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)
    OPMERKING: Voer elektronenmicroscopie met negatieve kleuring uit om de grootte, structuur en zuiverheid van sEV's te beoordelen, met behulp van een standaardprotocol dat fixatie, uitdroging, harsinbedding en contrastering omvat voor sEV-preparaten voor de hele montage.
    1. Ontdooi de geconcentreerde sEV-monsters uit stap 2.10 en bewaar ze op ijs.
    2. Bevestig sEV's in buizen van 1,5 ml. Breng voorzichtig 5-10 μl 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer (pH 7) aan op ~5 μl van de sEV-monsterpellet (vereiste sEV-concentratie ≈ 1 x 108–1 x 109 ml-1) en incubeer gedurende 2 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: sEV's kunnen tot 1 week worden bewaard bij 4 °C in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer voordat ze verder worden verwerkt. Daarom, als externe technische diensten nodig zijn voor TEM-analyse, stuur dan de vaste sEV-monsters gekoeld in buizen van 1,5 ml.
    3. Deponeer 5 μL van de geresuspendeerde pellets op de 300-mesh Formvar-koolstof gecoate EM koperen roosters. Bereid twee of drie roosters voor elk monster voor.
    4. Laat het monster 20 minuten adsorberen in een droge omgeving en verwijder het overtollige monster met filtreerpapier van het rooster.
    5. Plaats 100 μL druppels PBS op een vel film. Breng met een schone tang de roosters (met het geadsorbeerde monster naar beneden) over in de PBS-druppels om te wassen.
    6. Droog de andere kant van het geadsorbeerde monster en zorg ervoor dat de monsterzijde van de roosters niet droogt tijdens een van de volgende stappen.
      OPMERKING: Plaats voor alle volgende stappen druppels reagentia op een platte film en breng de roosters met een tang over op de druppels.
    7. Breng de roosters gedurende 5 minuten over naar een druppel van 50 μL van 1% glutaaraldehyde.
    8. Was de roosters met een druppel van 100 μL gedestilleerd water en laat ze 3 minuten staan. Herhaal negen keer voor een totaal van tien wasbeurten.
    9. Vergelijk de monsterroosters met een druppel van 50 μl van 1% m/v uranyl-acetaatoplossing, pH 7, gedurende 1 min.
    10. Contrasteer en veranker de roosters in een mengsel van 100 μL 4% uranylacetaat en 900 μL 2% methylcellulose.
    11. Laat de roosters 5-10 minuten aan de lucht drogen terwijl ze in de lus blijven en observeer ze met een elektronenmicroscoop bij 80-100 kV met een resolutie van 0,2 nm en een vergroting van 100.000x.
    12. Bewaar de roosters in droge opbergdozen voor langdurige opslag.

4. Generatie van dendritische cellen uit het beenmerg

OPMERKING: Deze procedure moet worden uitgevoerd met jonge muizen, die worden gekenmerkt door robuuste hematopoëtische systemen met actieve proliferatie- en differentiatiecapaciteiten. Daarentegen vertonen oudere muizen een afname van de hematopoëtische functie, verminderde stamcelreserves, veranderde niche-interacties en een meer ontwikkeld geheugenreservoir dat cruciaal is voor immuniteit op lange termijn en respons op ziekteverwekkers of leeftijdsgerelateerde veranderingen zoals immunosenescentie.

  1. Euthanaseer een vrouwelijke CF-1-muis van 5-8 weken oud volgens institutionele ethische richtlijnen, waarbij dierenleed tot een minimum wordt beperkt.
  2. Spuit de muis in met ethanol voordat u deze in een weefselkweekkap plaatst.
    OPMERKING: De volgende stappen moeten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd.
  3. Plaats de muis in rugligging op een snijbord. Maak met een tang en een ontleedschaar een verticale "T" -incisie boven de urethra en verleng deze horizontaal naar de bovenkant van de onderste ledematen, waarbij u ervoor zorgt dat het buikvlies niet breekt of organen doorboort, vooral de darm.
  4. Scheid de huid langs beide achterpoten om beenbotten en weefsels bloot te leggen met behulp van een tang. Verwijder met de handen de huid van elk been dat van de enkel naar de buik duwt en de huid naar de andere kant trekt. Beide benen zijn dan vrij van huid.
    OPMERKING: Gooi het lichaam van de muis weg in de zak met residuen van ziekteverwekkers.
  5. Verwijder met een schaar en een tang voorzichtig het dijbeen en scheenbeen en vermijd breuk. Bevestig de punt van elk bot met een tang en snijd pezen door om spierfascia's rond botten te verwijderen. Voltooi het reinigen van het spierweefsel met papieren servetten.
  6. Terwijl elk bot wordt verwijderd, plaatst u het in een steriele tube van 50 ml met 2 ml compleet medium bereid met RPMI-medium aangevuld met 5% FBS, 100 E/ml penicilline, 100 E/ml streptomycine en 10 μg/ml gentamicine om vuil te verwijderen. Daarna, aspireer en gooi het kweekmedium weg en was de botten twee keer met 70% ethanol gedurende 5 minuten.
  7. Breng de botten over naar een steriel petrischaaltje.
  8. Knip de twee botepifysen af met een scherpe snijschaar om toegang te krijgen tot beenmergcellen.
  9. Spoel de beenmergcellen van elk van de vier botten voorzichtig in een steriel petrischaaltje met behulp van een naald van 25 g die is bevestigd aan een spuit van 20 ml met volledig medium. De botten worden transparanter naarmate het beenmerg wordt geëxtraheerd.
    OPMERKING: Een volume van 20 ml van het volledige medium zou voldoende moeten zijn om de beenmergcellen uit de twee dijbenen en het scheenbeen te elueren.
  10. Homogeniseer het medium voorzichtig met het geëlueerde merg door te pipetteren om botbindweefsel en celknobbels te verwijderen. Breng het monster vervolgens over naar een steriele conische buis van 50 ml en passeer de cellen door een steriele polypropyleen celzeef van 70 μm om bindweefsel en botresten te verwijderen.
  11. Centrifugeer de cellen bij 450 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant voorzichtig en gooi het weg, zodat de pellet aan de buiswand blijft kleven.
  12. Incubeer de cellen gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT) en suspendeer ze vervolgens opnieuw in 500 μL lysisbuffer van rode bloedcellen (RBC). Neutraliseer de lysisbuffer door 3 ml volledig medium toe te voegen.
  13. Centrifugeer de cellen bij 450 x g gedurende 7 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in 5 ml volledig medium.
  14. Leid de celsuspensie door een steriele polypropyleen celzeef van 70 μm in een steriele conische buis van 50 ml om celaggregaten uit gelyseerde erytrocyten te verwijderen.
  15. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
  16. Voeg 300 ng/ml recombinant muizen Fms-gerelateerd tyrosinekinase 3-ligand (Flt3L) toe aan het kweekmedium.
  17. Plaat de cellen in een concentratie van 1 x 106 cellen/ml in een multiwell-plaat.
  18. Incubeer de cellen gedurende 7 dagen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 .
    OPMERKING: Vermijd het schudden van de cellen terwijl ze differentiëren en groeien om spontane rijping te voorkomen.
  19. Verwijder op dag 3 1 ml medium uit elk putje (vermijd verstoring van de cellen) en vervang het door 1 ml voorverwarmd vers compleet medium aangevuld met 150 ng/ml recombinant muizen Flt3L.

5. Interactie tussen beenmerg-afgeleide dendritische cellen en extracellulaire blaasjes van E. granulosus

  1. Extracellulaire kleuring van het blaasjesmembraan
    1. Ontdooi de sEV's die in stap 2.10 zijn opgeslagen en bewaar ze op ijs.
    2. Resuspendeer 10 μL gezuiverde sEV's in 10 μL van het labelvoertuig (verdunningsmiddel C).
    3. Voeg 20 μL 2x PKH26 kleurstofoplossing toe om een uiteindelijke concentratie van 2 μM te bereiken. Meng voorzichtig met een pipet en incubeer gedurende 35 minuten bij 37° C in het donker.
      OPMERKING: De 2x PKH26-kleurstofoplossing (4 μM) moet onmiddellijk voor het kleuren worden bereid door 0.5 μL PKH26 ethanolische kleurstofoplossing toe te voegen aan 125 μL verdunningsmiddel C.
    4. Meng voorzichtig om de 3-5 minuten tijdens de incubatie om een homogene kleuring te garanderen.
    5. Voeg 40 μl BSA 1% toe en incubeer gedurende 10 minuten bij RT om het kleuringsproces te stoppen.
    6. Was de sEV's met 1 ml PBS en centrifugeer op 100.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C om overtollige kleurstof te verwijderen.
      OPMERKING: De k-factor voor de rotor is 103.
    7. Resuspendeer de pellet in 90 μl PBS volgens het protocol beschreven in stap 2.7.
  2. Stimulatie van beenmerg-afgeleide dendritische cellen van muizen met extracellulaire blaasjes van E. granulosus
    1. Oogst beenmerg-afgeleide dendritische cellen (BMDC's) goed van de kweekplaat en breng ze over in buisjes van 1,5 ml.
      OPMERKING: Ga voorzichtig te werk om spontane celrijping te voorkomen.
    2. Centrifugeer het medium op 450 x g gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
      OPMERKING: Bewaar de supernatanten van de centrifugatie om de cellen opnieuw te platen in volgende stappen van de flowcytometrie-analyse.
    3. Resuspendeer BMDC's in 30 μl ongekleurde sEV's uit stap 2.10 voor flowcytometrieanalyse of in 90 μl PBS-bevattende gekleurde-sEV's uit stap 5.1.7. voor confocale microscopie. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 . Meng het monster voorzichtig om de 10 minuten.
      OPMERKING: Om een effectief contact tussen BMDC's en sEV's te garanderen, moet de eerste 30 minuten van de incubatie in een minimaal volume worden uitgevoerd met behulp van buisjes van 1,5 ml.
    4. Voor confocale microscopie brengt u de cellen over op een met Alcian-blauw behandeld glazen dekglaasje (12 mm diameter) dat in een plaat met 24 putjes is geplaatst. Incubeer nog eens 30 minuten bij 37 °C in een bevochtigde kamer met 5 % CO2 .
      OPMERKING: De Alcian-blauwe behandeling geeft een positieve lading aan het dekglaasje, waardoor de hechting van de negatief geladen plasmamembranen van BMDC's wordt vergemakkelijkt.
      1. Om de dekglaasjes voor te bereiden, dompel je ze onder in een gefilterde kleurstof van 1% Alcian blue 8 GX en verwarm je ze 1-2 minuten in een magnetron zonder te koken. Incubeer ze 10 minuten in de hete oplossing en draai ze elke 2 tot 3 minuten rond.
      2. Was vervolgens de dekglaasjes met gedeïoniseerd gedestilleerd water om overtollig Alcian-blauw te verwijderen en droog ze af op keukenpapier. Autoclaveer ten slotte de dekglaasjes en bewaar ze in steriele omstandigheden tot gebruik.
    5. Voor de analyse van de flowcytometrie worden de BMDC's-sEV's teruggebracht naar dezelfde put waaruit ze zijn geoogst (zie stap 5.2.1), worden de gereserveerde supernatanten uit stap 5.2.2 toegevoegd en wordt gedurende 18 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5 % CO2 geïncubeerd.
      OPMERKING: Laat ongeveer 500 μL medium in het putje om uitdroging van de resterende cellen na verzameling te voorkomen.
    6. Gebruik positieve en negatieve controles om de BMDC-rijping te beoordelen. Stimuleer de cellen met 100 ng/ml lipopolysaccharide (LPS) gedurende 18 uur als positieve controle. Voor een negatieve controle van endocytose worden BMDC's met sEV's bij 4 °C geïncubeerd. Voeg ook een niet-gestimuleerde dendritische celcontrole toe.
  3. Confocale microscopie van extracellulaire blaasjes van E. granulosus gevangen en geïnternaliseerd door beenmerg-afgeleide dendritische cellen.
    1. Zodra de in stap 5.2.4 beschreven incubatietijd is voltooid, aspireert u de PBS op en gooit u deze weg van het dekglaasje.
    2. Fixeer BMDC's door 100 μL 4% paraformaldehyde (PFA) over het dekglaasje toe te voegen en incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat het volume de oppervlaktespanning op het dekglaasje behoudt.
    3. Zuig de PFA op, gooi deze weg en was het dekglaasje vervolgens drie keer met PBS-BSA 2%.
    4. Voeg 100 μl PBS met anti-MHC klasse II-FITC-antilichaam verdund 1:100 toe en incubeer gedurende 1 uur bij RT in het donker.
    5. Zuig de antilichaamoplossing op en gooi deze weg en was het dekglaasje drie keer met PBS-BSA 2%.
    6. Voeg 100 μl 50 ng/ml DAPI toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een natte kamer om de kernen tegen te gaan.
    7. Zuig de kleurstofoplossing op, gooi deze weg en was het dekglaasje driemaal met PBS-BSA 2 %.
    8. Verwijder het dekglaasje met een tang met gebogen fijne punt en droog het af op een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen.
    9. Monteer het dekglaasje met de bedrukte zijde naar beneden op een glazen dia met behulp van een montagemedium dat is samengesteld uit polyvinylalcohol en glycerol. Laat 2 uur drogen bij 37 °C of een nacht bij 4 °C in het donker.
    10. Verwijder eventuele luchtbellen tussen het dekglaasje en het glasplaatje door het dekglaasje voorzichtig met een tang naar beneden te drukken.
    11. Bekijk de gemonteerde monsters onder een confocale microscoop met behulp van een 60x olie-immersieobjectief met een excitatie-/emissiegolflengte van 485/538 nm voor FITC, 358/461 nm voor DAPI en 551/567 nm voor PKH26.
  4. Fenotypische evaluatie van extracellulaire, door blaasjes gestimuleerde beenmerg-afgeleide dendritische cellen door middel van flowcytometrie
    1. Na de incubatietijd beschreven in stap 5.2.5 oogst u BMDC's door het medium meerdere keren op en neer te spoelen met een pipet.
    2. Verzamel de mediumhoudende BMDC's en plaats deze in buisjes van 1,5 ml.
    3. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
      OPMERKING: Om de cytokinesecretie te analyseren, verwijdert u optioneel de supernatanten met een pipet, brengt u ze over in nieuwe buisjes van 1.5 ml en bewaart u ze bij -20 °C voor verdere enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA) -tests.
    4. Resuspendeer de BMDC's in 100 μl PBS die fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), allophycocyanine (APC) of fycoerythrine-geconjugeerde mAbs bevatten gericht op CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC klasse I en MHC klasse II en incubeer gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker.
    5. Was de BMDC's met PBS en centrifugeer op 450 × g gedurende 5 minuten op 4 °C.
    6. Resuspendeer BMDC's in 500 μl 1% PFA om ze te fixeren en bewaar ze bij 4 °C totdat ze in een flowcytometer worden opgenomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een stroomdiagram met een samenvatting van de belangrijkste stappen voor het behoud van zuivere culturen van het E . granulosus-larvale stadium, de isolatie en karakterisering van sEV's en hun opname door muizendendritische cellen wordt weergegeven in figuur 1. Om een hoge sEV-productie van E. granulosus protoscoleces en metacestoden te bereiken, werd een eerder in het laboratorium ontwikkelde in-vitrokweekmethode gebruikt om de ov...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De protocolworkflow voor het kweken van parasieten, het isoleren van van parasieten afgeleide sEV's, het differentiëren van dendritische cellen uit beenmerg en het analyseren van de opname van sEV's door deze cellen wordt geschetst in figuur 1. Het doel was om elk protocolonderdeel dat in zijn geheel of afzonderlijk kan worden uitgevoerd, in detail te beschrijven, waarbij de belangrijkste overwegingen worden benadrukt om de implementatie van de methodologie ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs erkennen Lic. Cecilia Gutiérrez Ayesta (Servicio de Microscopía Electrónica, CONICET, Bahía Blanca, Argentinië) en Lic. Leonardo Sechi en Lic. Eliana Maza (INIFTA, Universidad Nacional de La Plata, Argentinië) voor de technische assistentie bij respectievelijk transmissie-elektronenmicroscopie en dynamische lichtverstrooiing. We danken ook Dra. Graciela Salerno, Dra. Corina Berón en Dr. Gonzalo Caló voor het gebruik van de ultracentrifuge in de INBIOTEC-CONICET-FIBA, Argentinië. De auteurs zijn dankbaar voor Lic. Kelly (SENASA, Mar del Plata, Argentinië) en Lic. H. Núnez García (CONICET, Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentinië) voor hun medewerking bij de beoordeling van het welzijn van muizen, en Med. Vet. J. Reyno, Med. Vet. S. Gonzalez en Med. Vet L. Netti voor hun bijdrage aan het verkrijgen van parasietmateriaal. Dit werk, inclusief de kosten van experimenten, reagentia en apparatuur, werd ondersteund door de PICT 2020 nr. 1651, gefinancierd door de ANPCyT.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL tubesHensoN14059
24-well plate JetBiofilCAP011024Polystyrene, flat bottom, Sterile
6-well plate  Henso Medical Co. Ltd.N14221Flat-shape bottom, PS material, Sterile
70 mm polypropylene cell strainerBiologix Group Limited15-1070Sterile
Alcian blue 8 GX dye Santa Cruzsc-214517B
Automatic CO2 incubatorNuarireUN-5100E/G DH
Bovine Serum AlbuminWiener lab1443151
CD11c Monoclonal antibody-PECy5   100 µgeBioscience15-0114-82clone (N418)
CD40 Monoclonal antibody-FITC 100 µgeBioscience11-0402-82clone (HM40-3)
CD80 Monoclonal antibody-APC 100 µgeBioscience17-0801-82clone (16-10A-1)
CD86 Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-0862-82clone (GL-1)
CentrifugeThermo ScientificIEC CL31R Multispeed
Confocal MicroscopeNikonNikon Confocal Microscope C1
Conical tubes 15 mL dia.17 x 120 mmCitotest4610-1865
DAPISigma107K4034
D-GlucoseMerk1.78343
Dimethyl Sulfoxide Anedra6646
Fetal Bovine Serum 500 mLSigma-Aldrich  12352207
Flow Cytometry SystemBD BiosciencesBD FACSCanto™ II
Folded Capillary Zeta Cell Malvern PanalyticalDTS1070
Gentamicin sulfate saltSigmaG1264
Glutaraldehyde solutionFluka49630
HepesGibco11344041
Hypodermic  needle 21 G x 1"25/8WeigaoSterile
Hypodermic  needle 25 G x 5/8"WeigaoSterile
Inverted microscope LeicaDMIL LED Fluo 
KetamineHolliday
Lipopolysaccharide  5 mgInvitrogentlrl-rslpsLPS from the Gram-negative bacteria E. coli K12 . TLR2/4 Agonists
Loperamide hydrochlorideSigma-Aldrich5.08162
Medium 199 Gibco11150059
Methylene BlueAnedra6337
MHC class I (H2kb) Monoclonal antibody-PE 100 µgeBioscience12-5958-82clone (AF6-88.5.5.3)
MHC class II (IA/IE) Monoclonal antibody-FITC  100 µgeBioscience11-5321-82clone (M5/114.15.2)
MicroscopeOlympusCX31
Mouse recombinant murine Flt3L.PrepoTech250-31L-10UG
NanodropThermo ScientificND-One
ParaformaldehydeAgar ScientificR1018
Penicillin G sodium saltSigmaP3032-10MU
PKH26Sigma-AldrichMINI26
Potassium Phosphate MonobasicTimperFor Phosphate Buffered Saline (PBS)
RBC lysis buffer 100 mLRoche11814389001
RPMI medium  1640 1x 500 mLSigma-Aldrich (Gibco)11875093
Sodium Cacodylate  Sigma-AldrichC0250
Sodium ChlorideAnedra7647-14-5For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous) p. a.Biopack1639.07For Phosphate Buffered Saline (PBS)
Streptomycin sulfate saltSigmaS9137
Syringe 10 mLBremenSterile
Thickwall polycarbonate tubesBeckman Coulter13 x 55 mm, nominal capacity 4 mL
Transmission Electron MicroscopeJeolJEOL JSM 100CX II
UltracentrifugeBeckmanOptima LE-80k 90 Ti rotor
XylazineRichmond
Zetasizer Nano Malvern Nano ZSizer-ZEN3600To perform Dynamic Light scattering and zeta potential measurements

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wen, H., et al. Echinococcosis: advances in the 21st century. Clin Microbiol Rev. 32 (2), e00075-e00118 (2019).
  2. Geary, T. G., Thompson, D. P. Development of antiparasitic drugs in the 21st century. Vet Parasitol. 115 (2), 167-184 (2003).
  3. Drurey, C., Maizels, R. M. Helminth extracellular vesicles: Interactions with the host immune system. Mol Immunol. 137, 124-133 (2021).
  4. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J. Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  5. Cresswell, P. Antigen processing and presentation. Immunol Rev. 207, 5-7 (2005).
  6. Buzas, E. I. The roles of extracellular vesicles in the immune system. Nat Rev Immunol. 23 (4), 236-250 (2023).
  7. Bennett, A. P. S., de la Torre-Escudero, E., Oliver, N. A. M., Huson, K. M., Robinson, M. W. The cellular and molecular origins of extracellular vesicles released by the helminth pathogen Fasciola hepatica. Int J Parasitol. 50 (9), 671-683 (2020).
  8. Drurey, C., Coakley, G., Maizels, R. M. Extracellular vesicles: new targets for vaccines against helminth parasites. Int J Parasitol. 50 (9), 623-633 (2020).
  9. Nicolao, M. C., et al. Characterization of protein cargo of Echinococcus granulosus extracellular vesicles in drug response and its influence on immune response. Parasit Vectors. 16 (1), 255(2023).
  10. Sánchez-López, C. M., Trelis, M., Bernal, D., Marcilla, A. Overview of the interaction of helminth extracellular vesicles with the host and their potential functions and biological applications. Mol Immunol. 134, 228-235 (2021).
  11. Nicolao, M. C., Rodriguez, R. C., Cumino, A. C. Extracellular vesicles from Echinococcus granulosus larval stage: Isolation, characterization and uptake by dendritic cells. PLoS Negl Trop Dis. 13 (1), e0007032(2019).
  12. Kuipers, M. E., et al. DC-SIGN mediated internalisation of glycosylated extracellular vesicles from Schistosoma mansoni increases activation of monocyte-derived dendritic cells. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1753420(2020).
  13. Murphy, A., et al. Fasciola hepatica extracellular vesicles isolated from excretory-secretory products using a gravity flow method modulate dendritic cell phenotype and activity. PLoS Negl Trop Dis. 14 (9), e0008626(2020).
  14. Ricciardi, A., et al. Extracellular vesicles released from the filarial parasite Brugia malayi downregulate the host mTOR pathway. PLoS Negl Trop Dis. 15 (1), e0008884(2021).
  15. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nat Protoc. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  16. Brezgin, S., et al. Basic guide for approaching drug delivery with extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 25 (19), 10401(2024).
  17. Pinheiro, A. A., et al. Potential of extracellular vesicles in the pathogenesis, diagnosis, and therapy for parasitic diseases. J Extracell Vesicles. 13 (8), e12496(2024).
  18. Barnadas-Carceller, B., Del Portillo, H. A., Fernandez-Becerra, C. Extracellular vesicles as biomarkers in parasitic disease diagnosis. Curr Top Membr. 94, 187-223 (2024).
  19. Nicolao, M. C., Denegri, G. M., Carcamo, J. G., Cumino, A. C. P-glycoprotein expression and pharmacological modulation in larval stages of Echinococcus granulosus. Parasitol Int. 63 (1), 1-8 (2014).
  20. Nicolao, M. C., Cumino, A. C. Biochemical and molecular characterization of the calcineurin in Echinococcus granulosus larval stages. Acta Trop. 146, 141-151 (2015).
  21. Savina, A., Furlan, M., Vidal, M., Colombo, M. I. Exosome release is regulated by a calcium-dependent mechanism in K562 cells. J Biol Chem. 278 (22), 20083-20090 (2003).
  22. Ambattu, L. A., et al. High frequency acoustic cell stimulation promotes exosome generation regulated by a calcium-dependent mechanism. Commun Biol. 3 (1), 553(2020).
  23. White, R., et al. Special considerations for studies of extracellular vesicles from parasitic helminths: A community-led roadmap to increase rigour and reproducibility. J Extracell Vesicles. 12 (1), e12298(2023).
  24. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Hernandez, S. In vitro survival of Echinococcus granulosus protoscolices in several media, at +4 degrees C and +37 degrees C. Z Parasitenkd. 72 (2), 273-278 (1986).
  25. Casado, N., Rodriguez-Caabeiro, F., Jiménez, A., Criado, A., de Armas, C. In vitro effects of levamisole and ivermectin against Echinococcus granulosus protoscoleces. Int J Parasitol. 19 (8), 945-947 (1989).
  26. Al-Lamki, R. S., Bradley, J. R., Pober, J. S. Human organ culture: updating the approach to bridge the gap from in vitro to in vivo in inflammation, cancer, and stem cell biology. Front Med. 4, 148(2017).
  27. Rodriguez-Caabeiro, F., Casado, N. Evidence of in vitro germinal layer development in Echinococcus granulosus cysts. Parasitol Res. 74 (6), 558-562 (1988).
  28. Loos, J. A., Cumino, A. C. In vitro anti-echinococcal and metabolic effects of metformin involve activation of AMP-activated protein kinase in larval stages of Echinococcus granulosus. PLoS One. 10 (5), e0126009(2015).
  29. Erwin, N., Serafim, M. F., He, M. Enhancing the cellular production of extracellular vesicles for developing therapeutic applications. Phar. Res. 40 (4), 833-853 (2023).
  30. Sako, Y., et al. Identification of a novel small molecule that enhances the release of extracellular vesicles with immunostimulatory potency via induction of calcium influx. ACS Chem Biol. 18 (4), 982-993 (2023).
  31. He, L. P., Mears, D., Atwater, I., Rojas, E., Cleemann, L. Loperamide mobilizes intracellular Ca2+ stores in insulin-secreting HIT-T15 cells. Br J Pharmacol. 139 (2), 351-361 (2003).
  32. Dalton, J. P., Skelly, P., Halton, D. W. Role of the tegument and gut in nutrient uptake by parasitic platyhelminths. Can J Zool. 82 (2), 211-232 (2004).
  33. Dos Santos, G. B., et al. Excretory/secretory products in the Echinococcus granulosus metacestode: is the intermediate host complacent with infection caused by the larval form of the parasite. Int J Parasitol. 46 (13-14), 843-856 (2016).
  34. Siles-Lucas, M., et al. Isolation and characterization of exosomes derived from fertile sheep hydatid cysts. Vet Parasitol. 236, 22-22 (2017).
  35. Yang, J., et al. Identification of different extracellular vesicles in the hydatid fluid of Echinococcus granulosus and immunomodulatory effects of 110 K EVs on sheep PBMCs. Front Immunol. 12, 602717(2021).
  36. Khosravi, M., et al. Characterisation of extracellular vesicles isolated from hydatid cyst fluid and evaluation of immunomodulatory effects on human monocytes. J Cell Mol Med. 27 (17), 2614-2625 (2023).
  37. Sotillo, J., et al. The protein and microRNA cargo of extracellular vesicles from parasitic helminths–current status and research priorities. Int J Parasitol. 50 (9), 635-645 (2020).
  38. Kuipers, M. E., et al. Optimized protocol for the isolation of extracellular vesicles from the parasitic worm Schistosoma mansoni with improved purity, concentration, and yield. J Immunol Res. 2022 (1), 5473763(2022).
  39. Fernandez-Becerra, C., et al. Guidelines for the purification and characterization of extracellular vesicles of parasites. J Extracell Biol. 2 (10), e117(2023).
  40. Chaiyadet, S., et al. Silencing of Opisthorchis viverrini tetraspanin gene expression results in reduced secretion of extracellular vesicles. Front Cell Infect Microbiol. 12, 827521(2022).
  41. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  42. Szatanek, R., et al. The methods of choice for extracellular vesicles (EVs) characterization. Int J Mol Sci. 18 (6), 1153(2017).
  43. Blundell, E. L. C. J., Mayne, L. J., Billinge, E. R., Platt, M. Emergence of tunable resistive pulse sensing as a biosensor. Anal Methods. 7 (17), 7055-7066 (2015).
  44. Vucetic, A., Filho, A., Dong, G., Olivier, M. Isolation of extracellular vesicles from Leishmania spp. Methods Mol Biol. , 555-574 (2020).
  45. Caputo, F., et al. Measuring particle size distribution and mass concentration of nanoplastics and microplastics: Addressing some analytical challenges in the submicron size range. J Colloid Interface Sci. 588, 401-417 (2021).
  46. Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  47. Trombetta, E. S., Mellman, I. The cell biological basis of antigen presentation in vitro and in vivo. Ann Rev Immunol. 23 (1), 975-1028 (2005).
  48. Hammer, G. E., Ma, A. Molecular control of state dendritic cell maturation and immuno homeostasis. Ann Rev Immunol. 31 (1), 743-791 (2013).
  49. Weigel, B. J., et al. Comparative analysis of murine marrow–derived dendritic cells generated by Flt3L or GM-CSF/IL-4 and matured with immune stimulatory agents on the in vivo induction of antileukemia responses. Blood. 100 (12), 4169-4176 (2002).
  50. March, N., et al. Differences in dendritic cells stimulated in vivo by tumors engineered to secrete granulocyte macrophage colony-stimulating factor or Flt3-ligand. Cancer Res. 60, 3239-3246 (2000).
  51. Heath, W. R., et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunol Rev. 199 (1), 9-26 (2004).
  52. Naik, S., et al. Cutting edge: generation of splenic CD8+ and CD8− dendritic cell equivalents in Fms-like tyrosine kinase 3 ligand bone marrow cultures. J Immunol. 174 (11), 6592-6597 (2005).
  53. Sauter, M., et al. Protocol to isolate and analyze mouse bone marrow derived dendritic cells (BMDC). STAR Protoc. 3 (3), 101664(2022).
  54. Helft, J., et al. GM-CSF mouse bone marrow cultures comprise a heterogeneous population of CD11c(+) MHCII(+) macrophages and dendritic cells. Immunity. 42 (6), 1197-1211 (2015).
  55. Borup, A., et al. Comparison of separation methods for immunomodulatory extracellular vesicles from helminths. J Extracell Biol. 1 (5), e41(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van extracellulaire blaasjesultracentrifugatiebeenmergcellenflowcytometrieconfocale microscopiedynamische lichtverstrooiingantigeenpresentatie

Gerelateerde artikelen