Extractie en identificatie van micronuclei uit humane perifere bloedlymfocyten

Samenvatting

Dit protocol schetst een methode voor het extraheren en zuiveren van micronuclei uit menselijke lymfocyten met behulp van centrifugatie met sucrosedichtheidsgradiënt. Het biedt een experimentele basis voor het onderzoeken van de samenstelling en functie van micronuclei.

Samenvatting

Een micronucleus (MN) is een abnormale nucleaire structuur die zich vormt in cellen, met name beenmerg of bloedcellen, wanneer deze wordt blootgesteld aan externe schade, zoals straling, als gevolg van onopgeloste DNA-schade of mitotische fouten. Eenmaal gevormd, kunnen MN's actief bijdragen aan verschillende kankerverwekkende processen, waaronder ontstekingssignalering en chromosomale genetische herschikkingen. MN's bevatten nucleair DNA, histonen, nucleoproteïnefragmenten en andere actieve eiwitten, die nauw verbonden zijn met hun functies. Het bestuderen van de vorming en componenten van MN's is cruciaal voor het begrijpen van hun rol bij het aansturen van kankerverwekkende processen. De winning en zuivering van MN's zijn essentieel om deze onderzoeksdoelstellingen te bereiken. De instabiliteit van het MN-kernmembraan en de gevoeligheid voor scheuren maken deze processen echter technisch uitdagend. Momenteel hebben slechts enkele studies het gebruik van dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor MN-scheiding gerapporteerd. Deze studie vat de processen van MN-scheiding en -zuivering samen en vereenvoudigt deze. Menselijke lymfocyten in perifeer bloed die aan straling werden blootgesteld, werden geïsoleerd en MN's werden gescheiden en gezuiverd met behulp van sucrosebuffers van verschillende concentraties in een proces in twee stappen. De integriteit en zuiverheid van de MN's werden geverifieerd, wat een duidelijke en praktische demonstratie opleverde van de experimentele procedure voor onderzoekers die de oorzaken en functies van MN's onderzoeken.

Inleiding

De micronucleus (MN) is een subcellulaire structuur in het cytoplasma die nucleair DNA, histonen en nucleoproteïnefragmenten bevat, omgeven door membraanstructuren ^1,2. De MN staat volledig los van de hoofdkern en verschijnt meestal in de buurt ervan in een ovale of ronde vorm, met een grootte variërend van 1/16 tot 1/3 van de diameter van de hoofdkern. De vorming van MN's wordt voornamelijk geassocieerd met acentrische chromosoomfragmenten, chromosomale missegregatie, dicentrische chromosoombreuk, chromosoominstabiliteit en de aggregatie van dubbele minuten (DB's)³. MN's komen zelden voor in gezonde cellen en worden voornamelijk veroorzaakt door blootstelling aan exogene genotoxinen, die leiden tot DNA-schade of mitotische fouten ^4,5. Stralingsschade levert een belangrijke bijdrage aan de vorming van MN, en de blootstelling van de mens aan ioniserende straling (IR) is toegenomen met de vooruitgang in klinische en technologische toepassingen ^6,7. IR-blootstelling induceert enkelstrengsbreuken (SSB's) en dubbelstrengsbreuken (DSB's) in cellulair DNA, wat kan leiden tot celdood of apoptose ^8,9,10. MN's zijn fragmenten van chromosomen, hele chromosomen of chromatiden die worden geproduceerd als gevolg van niet-gerepareerde of niet-overeenkomende DSB-reparatie. Ze dienen als kritische indicatoren voor de mate van schade veroorzaakt door IR ^7,11,12. Een uitgebreid begrip van de componenten in MN's is essentieel voor het verminderen van de bijwerkingen van bestralingstherapie en het minimaliseren van de blootstelling van het publiek aan ongewenste straling ^6,13. De eiwitten en nucleïnezuren in MN's blijven tot op heden echter onvolledig gekarakteriseerd.

Aangenomen wordt dat MN's het gevolg zijn van de inductie van verschillende soorten DNA-schade. Hun replicatiemechanismen en DNA-herstelvermogen zijn aangetast, wat leidt tot uitgebreide DNA-schade binnen een korte periode ^3,14,15. MN's zijn ook belangrijke indicatoren van chromosomale instabiliteit, die consequent aanwezig is in precancereuze cellen 3,14,16,17,18,19. MN's worden al lang gebruikt als biomarkers voor genotoxiciteit, tumorrisico en tumorgraad ^3,20,21. Eenmaal gevormd, kunnen MN's actief tal van kankerverwekkende processen aansturen, waaronder ontstekingssignalering^22,23 en chromosomale genetische herschikking 24,25,26. MN's initiëren bijvoorbeeld een inflammatoire cascade door de virale patroonherkenningsreceptor (PRR) cyclisch GMP-AMP-synthase (cGAS) uit het cytoplasma 4,22,23,27 te rekruteren. Andere eiwitten die aanwezig kunnen zijn in MN's zijn exonucleasen²⁸, transcriptiemechanismen⁴ en translatiecofactoren. Het blijft onduidelijk of MN's een uniek, bevooroordeeld eiwitprofiel samenstellen uit de cytoplasmatische eiwitbibliotheek of passief eiwitten met een hoge abundantie uit de kern en het cytoplasma verwerven tijdens hun vorming. Afgezien van individuele eiwitten zoals cGAS, is de mate waarin specifieke omgevingen de algehele MN-samenstelling beïnvloeden nog niet bepaald. Het begrip van het hele landschap van micronuclei is beperkt, omdat er geen openbaar beschikbare datasets voor exploratie zijn. Daarom is het extraheren van volledige en gezuiverde MN's dringend nodig voor diepgaande en uitgebreide analyses van hun componenten.

Een van de redenen voor vertraagde DNA-replicatie in MN's kan replicatiestress zijn die wordt veroorzaakt door een gebrek aan enzymen en cofactoren die nodig zijn voor DNA-synthese en -herstel. Deze tekortkoming kan het gevolg zijn van een defecte assemblage van de MN-nucleaire envelop, wat leidt tot de afwezigheid van een nucleair poriecomplex²⁰. Bijgevolg zijn MN's niet in staat om belangrijke eiwitten te importeren die essentieel zijn voor het behoud van de integriteit van het kernmembraan en de genoomstabiliteit 2,29,30,31. Het onvolledige MN-kernmembraan is vatbaar voor scheuren, waardoor MN-extractie zeer uitdagend is.

Momenteel worden MN's voornamelijk geëxtraheerd met behulp van sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie ^27,32,33 en gezuiverd door flowcytometrie³⁴. In deze studie werd het scheidings- en zuiveringsproces van MN's samengevat en vereenvoudigd. Perifere bloedlymfocyten van mensen die aan straling waren blootgesteld, werden geïsoleerd en MN's werden tweemaal gezuiverd met behulp van sucrosebuffers van verschillende concentraties. De integriteit en zuiverheid van de MN's werden geverifieerd, waardoor onderzoekers een praktische en intuïtieve experimentele demonstratie kregen voor het bestuderen van de oorzaken en functies van MN's.

Protocol

Alle experimenten met menselijke perifere bloedmonsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften. Deze studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van de Nucleaire Industrie 416 Hospital, China (2020 Review [nr. 48]), en van alle deelnemers werd geïnformeerde toestemming verkregen. De uitsluitingscriteria omvatten personen met ernstige chronische ziekten, zoals tumoren, jicht of bloedaandoeningen, evenals personen die in hun beroep zijn blootgesteld aan radioactieve of genotoxische stoffen. Voor deze studie werd 10 ml perifeer bloed verzameld van een gezonde 28-jarige man in een bloedafnamebuisje met heparinenatrium als antistollingsmiddel. Het monster werd in vitro bestraald met ⁶⁰Co γ-stralen bij 37 °C met behulp van een standaardapparaat op therapeutisch niveau met gamma-luchtkinetische energie. De bestralingsdosis werd vastgesteld op 4,0 Gy, met een dosistempo van 0,6350 Gy/min. Na bestraling werd het monster gedurende 2 uur bij 37 °C geïncubeerd, geïnoculeerd in RPMI-1640-medium en gedurende 60 uur bij 37 °C gekweekt. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Bereiding van micronucleus en kern

1. Voeg cytochalasine B toe aan het perifere bloedcelmedium om een uiteindelijke concentratie van 10 μg/ml te bereiken. Incubeer het mengsel gedurende 45 minuten bij 37 °C.
   OPMERKING: Cytochalasine B is een actinepolymerisatieremmer die de efficiënte scheiding van micronuclei van de kern vergemakkelijkt voorafgaand aan cellyse³⁵.
2. Centrifugeer de bloedcellen bij 200 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
3. Resuspendeer de bloedcellen in 10 ml 0,01 M PBS, voorgekoeld bij 4 °C.

2. Isolatie van lymfocyten

1. Voeg 15 ml oplossing voor het scheiden van menselijke lymfocyten toe aan een conische buis van 50 ml. Leg de zwevende perifere bloedcellen voorzichtig op de scheidingsoplossing.
2. Centrifugeer de buis bij 400 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Na centrifugatie scheiden de bloedcellen in de buis zich van boven naar beneden in vier verschillende lagen: de eerste laag is de plasmalaag (bloedplaatjes), de tweede laag is de melkwitte lymfocytenlaag, de derde laag is de transparante scheidingsvloeistoflaag en de vierde laag is de rode bloedcellaag.
3. Breng de tweede laag (lymfocyten) voorzichtig over in een aparte centrifugebuis. PBS (0,01 M) driemaal het volume van de overgebrachte cellen toevoegen, goed mengen en centrifugeren bij 200 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg met behulp van een pipet.

3. Lysis van lymfocyten

1. Plaats de celpellet die in de conische buis is opgevangen op ijs.
2. Voeg 6 ml koude lysisbuffer toe (tabel 1, aanvullend bestand 1) en suspendeer de celpellet opnieuw in de lysisbuffer.
   OPMERKING: De lysisbuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden aangevuld met de ingrediënten vermeld in Tabel 2, Aanvullend Dossier 1.
3. Breng het cellysaat over naar een glashomogenisator.
4. Gebruik voorzichtig een losse maling om het monster handmatig te homogeniseren door de homogenisator 10 keer op en neer te bewegen.
5. Breng het gehomogeniseerde cellysaat terug naar de conische buis van 50 ml.
   OPMERKING: Voer alle stappen voorzichtig uit en bewaar het monster op ijs.

4. Initiële isolatie van MN's via een sucrosedichtheidsgradiënt

1. Meng 5 ml van het cellysaat met een gelijk volume van 1,8 M sucrosebuffer (tabel 3, aanvullend bestand 1) om een verhouding van 1:1 tussen lysaat en sucrosebuffer te verkrijgen.
   OPMERKING: De 1,8 M sucrosebuffer moet onmiddellijk voor gebruik worden aangevuld met de ingrediënten vermeld in Tabel 4, Aanvullend Dossier 1.
2. Bereid de sucrosedichtheidsgradiënt voor: Voeg 15 ml 1,6 M sucrosebuffer (tabel 5, aanvullend bestand 1) toe aan de bodem van een conische buis van 50 ml. Voeg langzaam 20 ml 1,8 M sucrosebuffer toe (Tabel 3, Aanvullend Bestand 1) bovenop de 1,6 M sucrosebuffer.
   OPMERKING: Zowel de 1,6 M sacharosebuffer als de 1,8 M sacharosebuffer moeten onmiddellijk voor gebruik worden aangevuld met de ingrediënten in respectievelijk Tabel 4, Aanvullend Dossier 1. Om de sucrosebuffers toe te voegen, plaatst u de punt van de pipet tegen de bovenkant van de binnenkant van de conische buis en pipeteert u langzaam de oplossing.
3. Piket langzaam 10 ml van het [lysaat 1:1 1,8 M sucrosebuffer]-mengsel bovenop de tweelaagse sucrosedichtheidsgradiënt.
   OPMERKING: Voeg de lagen langzaam toe om ervoor te zorgen dat de middelste bufferlaag van 1.8 M zich niet vermengt met de onderste bufferlaag van 1.6 M en het bovenste 1:1 mengsel van gelyseerde cellen en 1.8 M sucrosebuffer zich niet vermengt met de bufferlaag van 1.8 M.
4. Centrifugeer de buis in een centrifuge met horizontale rotor bij 1000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Na centrifugatie zal de vloeistof zich in drie lagen scheiden: de bovenste laag bevat ongeveer 3 ml celresten, de middelste laag bevat ongeveer 3 ml micronuclei (MN's), de onderste laag bevat ongeveer 39 ml kernen.
5. Verwijder de bovenste 3 ml vloeistof nabij het oppervlak en verzamel de 3 ml ongezuiverde micronuclei uit de middelste laag voor de tweede sucrosedichtheidsgradiënt.

5. Secundaire zuivering van MNs via een sucrosedichtheidsgradiënt

1. Bereid de sucrosedichtheidsgradiënt voor:
   1. Voeg 3 ml 1,8 M sucrosebuffer (Tabel 3, Aanvullend Bestand 1) toe aan de bodem van een conische buis van 15 ml.
   2. Voeg 3 ml 1,5 M sacharosebuffer (Tabel 6, aanvullend bestand 1) toe aan de 1,8 M sacharosebuffer.
   3. Voeg ten slotte 3 ml 1,4 M sucrosebuffer toe (Tabel 7, Aanvullend Bestand 1) bovenop de 1,5 M sucrosebuffer.
      NOTITIE: Plaats de punt van de pipet tegen de bovenkant van de binnenkant van de conische buis en pipetteer langzaam de oplossing.
2. Piket langzaam 3 ml van de middelste laag van de tweede sucrosedichtheidsgradiënt op de bovenkant van de drielaagse sucrosedichtheidsgradiënt.
   OPMERKING: Voeg de lagen langzaam toe om mengen te voorkomen.
3. Centrifugeer de buis in een centrifuge met horizontale rotor bij 500 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Na centrifugatie bevat de bovenste laag 1-4 ml gezuiverde micronuclei (MN) en de onderste laag voornamelijk 8 ml kernen.
4. Bewaar de bovenste 1-4 ml gezuiverde micronuclei voor later gebruik.

6. Identificatie van MN's

1. Neem de ongezuiverde micronucleusoplossing (verkregen in stap 4) en de gezuiverde micronucleusoplossing (verkregen in stap 5) en maak celuitstrijkjes op het objectglaasje.
2. Voeg 4% paraformaldehydeoplossing toe om het monster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT) te fixeren.
3. Was de dia's twee keer met PBS (0,01 M), 3 minuten per wasbeurt.
4. Voeg 0,1% Triton X-100 toe om de cellen gedurende 5 minuten bij RT te permeeren.
5. Blokkeer de cellen in 5% BSA bij RT gedurende 30 minuten.
6. Voeg het primaire antilichaam tegen anti-γ-H2AX toe (verdund in 5% BSA, 1:200) en incubeer gedurende 1 uur bij RT.
7. Was de dia's twee keer met PBS (0,01 M), 5 minuten per wasbeurt.
8. Voeg het secundaire antilichaam toe (verdund in 5% BSA, 1:500) en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT.
9. Voeg DAPI-kleurstofoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
10. Was de dia's twee keer met PBS (0,01 M), 3 minuten per wasbeurt.
11. Breng een afdichtingsoplossing aan op de objectglaasje om deze af te dichten.
12. Observeer fluorescentie onder een fluorescentiemicroscoop (vergroting: 400×, autofocus en automatische belichting) en tel de micronuclei met behulp van een celtelplaat.
    OPMERKING: 4% paraformaldehyde, 0,1% Triton X-100 en 5% BSA worden verdund met PBS (0,01 M). γ-H2AX (Gamma H2AX) is een gefosforyleerde vorm van het histon H2AX-eiwit, gevormd als reactie op DNA-schade. In de kern is de fosforylering van histon H2AX geconcentreerd in bepaalde regio's, dus anti-γ-H2AX-fluorescentie kan vlekkerig lijken. De fosforylering van histon H2AX is geconcentreerd in de micronucleus, wat resulteert in een algehele helderdere fluorescentie met duidelijke vlekken³⁶. DAPI is een fluorescerende kleurstof die zich sterk bindt aan DNA en wordt vaak gebruikt in fluorescentiemicroscopie. Omdat micronuclei gebroken DNA en histonfragmenten bevatten, kunnen ze worden gekleurd door anti-γ-H2AX fluorescerende antilichamen en DAPI. De fluorescentie geeft het aantal, de grootte en de volledigheid van de micronuclei aan, helpt ze te onderscheiden van de kernen en de effectiviteit van de zuivering te beoordelen³².

Resultaten

Na blootstelling aan straling werd menselijk perifeer bloed gedurende 60 uur geïncubeerd met RPMI-1640 en vervolgens werd cytochalasine B toegevoegd voor de bereiding van micronucleus (MN). Lymfocyten werden geïsoleerd met behulp van een lymfocytenscheidingsoplossing, gevolgd door lysis met een speciaal geconfigureerd cellysaat en zachte homogenisatie in een glashomogenisator. Het homogenaat werd 1:1 gemengd met 1,8 M sucrosebuffer. Ongezuiverde micronuclei werden verkregen na de eerste ...

Discussie

Bij deze methode werden bestraalde humane lymfocyten uit perifeer bloed gebruikt voor de isolatie en zuivering van micronuclei (MN's). Veel eerdere studies hebben de gedetailleerde stappen voor cellyse en primaire scheiding van MN's gerapporteerd 4,32,33,34. De cellysisoplossing bevat doorgaans 0,1% NP-40 om het celmembraan te verstoren terwijl het een minimaal...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mL conische buis	Thermo	339650
4% paraformaldehyde oplossing	Beyotime	P0099
50 mL conische buis	Thermo	339652
Anti-γ-H2AX antilichaam	Bioss	bsm-52163R
Rund serum albumine	Beyotime	ST023
Calciumchloride	Biosharp	BS249
Cytochalasin B	Macklin	14930-96-2
DAPI-kleuringsoplossing	Bioss	S0001
Dithiothreitol (DTT)	Coolaber	CD4941
EDTA	Biosharp	BS107	Ethyleen Diamine Tetra-azijnzuur
Fluorescentiemicroscoop	Nikon	Ti2-U
Homogenisator	Ybscience	YB101103-1(20 mL)
Horizontaal gecontroleerde temperatuurcentrifuge	Thermo	Sorvall ST1R plus	Remsnelheid is ingesteld op "5"
Menselijke lymfocyt scheidingsoplossing	Beyotime	C0025
Magnesiumacetaat	Macklin	M833330
NP-40	Coolaber	SL9320	10% oplossing
Fosfaat bufferoplossing(PBS)	HyClone	SH30256.01B
Protease remmers	Coolaber	SL1086	Cocktail (100×)
Secundair antilichaam	Bioss	Bs-0295G	Geit Anti-Konijn IgG H&L/FITC
Spermidine	Coolaber	CS10431
Spermine	Coolaber	CS10441
Sucrose	Coolaber	CS10581
Tris-HCl	Biosharp	BS157
Triton X-100	Beyotime	P0096