Methodenartikel

Transplantatie van bio-engineered long met behulp van gedecellulariseerde muizenlongen en primaire menselijke endotheelcellen

DOI:

10.3791/67565

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft hoe bio-engineered muizenlongen kunnen worden gemaakt met behulp van decellularisatie- en recellularisatiemethoden. Het beschrijft ook de daaropvolgende orthotope longtransplantatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longtransplantatie is een cruciale behandeling voor patiënten met longziekten in het eindstadium, zoals idiopathische longfibrose, maar uitdagingen zoals donortekorten en complicaties na transplantatie blijven bestaan. Bio-engineered longen, die patiëntspecifieke cellen integreren in gedecellulariseerde dierensteigers, vormen een veelbelovend alternatief. Ondanks de vooruitgang in het gebruik van bio-engineered longen in diermodellen, blijven functionaliteit en structuur onvolwassen. Dit protocol pakt een kritieke barrière in orgaanbio-engineering aan: de behoefte aan een kosteneffectief experimenteel platform. Door muismodellen te gebruiken in plaats van grotere dieren zoals ratten of varkens, kunnen onderzoekers de middelen die nodig zijn voor elk experiment aanzienlijk verminderen, waardoor de voortgang van het onderzoek wordt versneld.

Het protocol schetst een gedetailleerde procedure voor longbio-engineering met behulp van hart-longblokken van muizen en menselijke primaire cellen, met de nadruk op isolatiestrategie voor het hart-longblok van de muis, decellularisatie, bioreactoropstelling, op perfusie gebaseerde orgaancultuur en orthotope transplantatie van bio-engineered longen. Dit platform op muisschaal verlaagt niet alleen de experimentele kosten, maar biedt ook een levensvatbaar kader voor het optimaliseren van celtypen en aantallen voor recellularisatie, het testen van verschillende celtypen met behulp van histologische en moleculaire methoden, en het waarborgen van de bloedstroom na transplantatie. De methode heeft potentieel voor brede toepassingen, waaronder het bestuderen van celinteracties in driedimensionale kweekomstandigheden, cel-matrixinteracties en ex vivo kankermodellering, waardoor het gebied van orgaanbio-engineering wordt bevorderd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longtransplantatie is de doorslaggevende remedie geweest voor patiënten met longziekte in het eindstadium1, zoals idiopathische longfibrose, waarbij medicamenteuze behandeling niet effectief is om de verslechtering van de ademhalingsfunctie te stoppen. Elk jaar komen er meer in aanmerking komende patiënten op de wachtlijst; Het aantal orgaandonaties van overleden donoren blijft echter achter bij het toenemende aantal wachtende patiënten 2,3. Zelfs na het ondergaan van een longtransplantatie zouden nogal wat problemen de functie van getransplanteerde lon....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten volgden de Voorschriften voor dierproeven en aanverwante activiteiten aan de Tohoku University (15e editie), gepubliceerd door Tohoku University23. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Tohoku University (#2020AcA-041-01).

1. Voorbereiding van materialen voor decellularisatie

  1. Bereiding van decellularisatieoplossingen (formaat van 1.000 ml in een autoclaveerbare glazen fles van 1 l)
    1. Steriel gedeïoniseerd (DI) water: Voeg 1.000 ml gedestilleerd of DI-water toe aan autoc....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het decellularisatieprotocol zijn de longen van muizen zichtbaar wit en doorschijnend (Figuur 6A). Cellulaire componenten moeten volledig worden verwijderd, maar de alveolaire structuur blijft intact in de histologische observatie (Figuur 6B,C). Gecellulariseerde muizenlongen met behulp van 3 × 107 HUVEC's met 2-daagse perfusie-gebaseerde bioreactorcultuur vertonen een homogene verdeling van H.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orgaanbio-engineering is een veeleisende onderneming. Het kostbare screeningproces heeft de onderzoeks- en ontwikkelingscyclus van dit vakgebied belemmerd. Door muizen als experimenteel platform te gebruiken, worden ruimte, cellen en media aanzienlijk verkleind in vergelijking met het eerder gebruikte rattenplatform. Hoewel het meten van gedetailleerde fysische parameters zoals gasuitwisseling, vasculaire weerstand of longcompliantie nog niet is bereikt, maakt het muislongmodel versnelde.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd financieel ondersteund door de Grant-in-Aid for Scientific Research / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, het Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B)) #22KK0132 voor TS, JSPS KAKENHI Grant Number 21K08877 voor TW, Leave a Nest Grant Ikeda-Rika award voor FT, en de Grant-in-Aid for JSPS Fellows #21J21515 voor FT. We waarderen mevrouw Maiko Ueda, technisch personeel in de Biomedical Research Core van de Tohoku University Graduate School of Medicine, zeer voor haar intensieve werk op het gebied van histologische observatie. We waarderen ook het technische advies va....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DECELLARISATIE
27 G x 1/2 inch BD PrecisionGlide naaldBD305109Of gelijkwaardige 27 G injectienaald
BD Insyte IV katheter 20 GA X 1,8 8INBD381237Of gelijkwaardige 20 G IV katheter
Bladzijde zijde naad (4-0)NescoGA04SBOf gelijkwaardige
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Katheter voor rat jugulaire ader, PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV1301Aanbevolen voor muizen met een gewicht van 30 g en minder.
Katheter voor rat jugulaire ader, PU 3Fr 10 cmInstechC30PU-RJV1307Aanbevolen voor muizen met een gewicht van meer dan 30 g.
DNase ISigma-AldrichDN25
MgSO4Sigma-AldrichM7506
NaClSigma-AldrichS3014
PinPort injectorsInstechPNP3M
PinPorts, 22 GInstechPNP3F22-50Past op C30PU-RJV1307
PinPorts, 25 GInstechPNP3F25-50Past op C20PU-MJV1301
NatriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750
Steriele spuit, 5 mlGeneric
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
CELKULTURE
EGM-2 Endotheelcelgroeimedium-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – Humane navelstrengvene endotheelcellenLonzaC2519A
PERFUSIE-GEBASEERDE BIOREACTOR
20 G naaldGeneric
3-weg stopkraanGeneric
KurkboorderGenericBoormaat, 6-10 mm
EasyLoad III pompkopCole-Parmer243934
GlasbusHarioSCN-200TBinnendiameter: 80 mm
Verwarmde magnetische roerderGeneric
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9965-01Vrouwelijk, past op slangen met I.D. 1,5 mm (L/S 14)
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9964-01Mannelijk, past op slangen met I.D. 1,5 mm (L/S 14)
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9965-03Vrouwelijk, past op slangen met I.D. 3 mm (L/S 16)
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9964-03Mannelijk, past op slangen met I.D. 3 mm (L/S 16)
Magneet roerpenGeneric
Masterflex L/S Digital Precision Modular Drive met Remote I/O en Benchtop ControllerCole-Parmer07557-00
Masterflex L/S Precision Pump Slang, PharMed BPT, L/S 16Cole-Parmer06508-16
Masterflex L/S Precision Pump Slang, Platinum-Cured Silicone, L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP Spuitfiltereenheid, 0,22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma gesteriliseerdMilliporeSLGPR33RS
Pyrex 250 mL grasfles, GL-45 schroefdopCorning1395-250
Siliconen Septa voor GL45 Open Top PBT SchroefkapCorning1395-455S
Siliconen Licht StopperIMG07763-18Bovenste diameter: 87 mm, Onderste diameter: 75 mm
Steriele spuit, 10 ml, 50 mlGeneric
MUIZEN CHIRURGIE (Isolatie van het hart-longblok | Longtransplantatie)
10-0 Nylon stropdassenKono SeisakushoN/A
10-0 Zijden stropdassenKono SeisakushoN/A
4-0 Zijden stropdassenKono SeisakushoN/A
Arteriële klem, 45 mm gebogen, gegroefdNatsume seisakusyoC-17-45
BD Insyte IV katheter 24GABD381512Of gelijkwaardige 24G i.v. katheter
Bulldog Vaatklem 45mm gebogenNatsume seisakusyoM2
Butorphanol tartraat Meiji Seika PharmaN/A
Cefazoline natriumOtsuka PharmaceuticalN/A
Dumont forceps #5/45Fine Science Tools1251-35
Fijne vannas stijl veerscharenFine Science Tools15403-0845° punt, 0,01 x 0,06 mm
Gemini Cautery KitHarvard ApparatusRS-300
Halsted-Mosquito klem gebogen punt, 125 mmBioresearch center16181670
Hegar naaldhouder, 150 mmB Braun/AesculapBM065R
Heparine oplossingMochida SeiyakuN/A
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoN/A
Micro forceps rechtB Braun/AesculapBD33R
MidazolamSandozN/A
MuizenventilatorHarvard ApparatusModel 687™
Normale zoutoplossing, klinisch graadOtsuka PharmaceuticalN/A
Petrischaal, 60 x 15 mmBD351007

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. Developments in lung transplantation over the past decade. Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).
  2. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).
  3. Hoff....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lung BioengineeringDecellularized Mouse LungsHuman Endothelial CellsOrgan TransplantationPerfusion Organ CultureBioreactor SetupHeart Lung BlockRecellularization ProtocolHistological AnalysisCapillary Network Formation

Gerelateerde artikelen