Methodenartikel

Transplantatie van bio-engineered long met behulp van gedecellulariseerde muizenlongen en primaire menselijke endotheelcellen

DOI:

10.3791/67565

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, Institute of Development, Aging and Cancer, Tohoku University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft hoe bio-engineered muizenlongen kunnen worden gemaakt met behulp van decellularisatie- en recellularisatiemethoden. Het beschrijft ook de daaropvolgende orthotope longtransplantatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longtransplantatie is een cruciale behandeling voor patiënten met longziekten in het eindstadium, zoals idiopathische longfibrose, maar uitdagingen zoals donortekorten en complicaties na transplantatie blijven bestaan. Bio-engineered longen, die patiëntspecifieke cellen integreren in gedecellulariseerde dierensteigers, vormen een veelbelovend alternatief. Ondanks de vooruitgang in het gebruik van bio-engineered longen in diermodellen, blijven functionaliteit en structuur onvolwassen. Dit protocol pakt een kritieke barrière in orgaanbio-engineering aan: de behoefte aan een kosteneffectief experimenteel platform. Door muismodellen te gebruiken in plaats van grotere dieren zoals ratten of varkens, kunnen onderzoekers de middelen die nodig zijn voor elk experiment aanzienlijk verminderen, waardoor de voortgang van het onderzoek wordt versneld.

Het protocol schetst een gedetailleerde procedure voor longbio-engineering met behulp van hart-longblokken van muizen en menselijke primaire cellen, met de nadruk op isolatiestrategie voor het hart-longblok van de muis, decellularisatie, bioreactoropstelling, op perfusie gebaseerde orgaancultuur en orthotope transplantatie van bio-engineered longen. Dit platform op muisschaal verlaagt niet alleen de experimentele kosten, maar biedt ook een levensvatbaar kader voor het optimaliseren van celtypen en aantallen voor recellularisatie, het testen van verschillende celtypen met behulp van histologische en moleculaire methoden, en het waarborgen van de bloedstroom na transplantatie. De methode heeft potentieel voor brede toepassingen, waaronder het bestuderen van celinteracties in driedimensionale kweekomstandigheden, cel-matrixinteracties en ex vivo kankermodellering, waardoor het gebied van orgaanbio-engineering wordt bevorderd.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Longtransplantatie is de doorslaggevende remedie geweest voor patiënten met longziekte in het eindstadium1, zoals idiopathische longfibrose, waarbij medicamenteuze behandeling niet effectief is om de verslechtering van de ademhalingsfunctie te stoppen. Elk jaar komen er meer in aanmerking komende patiënten op de wachtlijst; Het aantal orgaandonaties van overleden donoren blijft echter achter bij het toenemende aantal wachtende patiënten 2,3. Zelfs na het ondergaan van een longtransplantatie zouden nogal wat problemen de functie van getransplanteerde longen aantasten, waaronder primaire orgaandisfunctie, reactief allogene syndroom en infecties, die de 5-jaarsoverleving van de ontvangers van de longtransplantatie aanzienlijk verlagen4.

Er zijn verschillende opties om de huidige problemen bij orgaantransplantatie tegen te gaan, waaronder het gebruik van marginale donoren5, herstel van donorlongen in een ex vivo longperfusiesysteem6 en xenotransplantatie met behulp van gen-bewerkte varkens7. Deze alternatieven kunnen de pool van donororganen vergroten; Geen enkele kan echter de schaarste, immunogeniciteit en functionele heterogeniteit van de donororganen volledig aanpakken.

Het is verre van de realiteit, maar bio-engineered kunstmatige organen waar patiëntspecifieke cellen zijn geïntegreerd in de gedecellulariseerde dierlijke orgaansteiger zijn een fascinerende potentiële bron van solide orgaantransplantatie8. Sinds 2010 zijn er verschillende baanbrekende onderzoeken gerapporteerd die het potentiële nut van bio-engineered longen hebben aangetoond 9,10. In deze onderzoeken werden de longen van ratten of varkens gedecellulariseerd door wasmiddelen, werden dierlijke of menselijke cellen uit de luchtpijp of het longvaatstelsel geïnjecteerd om het longweefsel te regenereren in de op perfusie gebaseerde bioreactor, en sommige werden orthotopisch getransplanteerd in de borstholten van dieren 11,12,13,14,15. De functie en structuur van de bio-engineered longen waren echter voorbarig, vermoedelijk vanwege het ontoereikende aantal cellen dat in de bioreactor werd gekweekt of minder geïntegreerde intercellulaire juncties.

Een obstakel voor het bevorderen van onderzoek in orgaanbio-engineering is het ontbreken van een kleinschalig experimenteel platform. Hoewel ratten of varkens de meest gebruikte dieren op dit gebied zijn, hebben ze > 108 longcellen per long16 nodig, wat zeer kostbaar is voor academische laboratoria. Als er muizen beschikbaar zijn voor bio-ingenieursonderzoek naar organen, kunnen we de kosten van elk experiment drastisch verlagen en het onderzoeksprogramma versnellen. Hoewel er anatomische verschillen bestaan tussen muizen- en menselijke longen17, is de basisarchitectuur van de long bij zoogdieren vergelijkbaar18. Daarom kunnen de resultaten van experimenten op muisschaal van toepassing zijn op grotere dieren door simpelweg het aantal te vermenigvuldigen op basis van de lichaamsgrootte.

Dit protocol heeft tot doel de gedetailleerde experimentele procedure van longbio-engineering te beschrijven met behulp van hart-longblokkades van muizen en menselijke primaire cellen19. We hebben voor deze studie een eerder gerapporteerd en veelgebruikt longdecellularisatieprotocol bij muizen aangenomen 20,21,22. Het uitdagende deel van longbio-engineering is de recellularisatie van het gedecellulariseerde capillaire vaatstelsel20; Daarom zullen in dit protocol endotheelcellen van de menselijke navelstrengader worden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten volgden de Voorschriften voor dierproeven en aanverwante activiteiten aan de Tohoku University (15e editie), gepubliceerd door Tohoku University23. Deze studie werd goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Tohoku University (#2020AcA-041-01).

1. Voorbereiding van materialen voor decellularisatie

  1. Bereiding van decellularisatieoplossingen (formaat van 1.000 ml in een autoclaveerbare glazen fles van 1 l)
    1. Steriel gedeïoniseerd (DI) water: Voeg 1.000 ml gedestilleerd of DI-water toe aan autoclaveerbare glazen flessen van 1 l. Autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 °C.
    2. Triton X-100: Voeg 1 ml Triton X-100 toe aan 1.000 ml steriel DI-water in een autoclaveerbare glazen fles van 1 L. (Optioneel) Voeg 10 ml penicilline en streptomycine-oplossing toe (eindconcentratie, 500 eenheden/ml penicilline en 500 μg/ml streptomycine).
      OPMERKING: Niet autoclaveren.
    3. Natriumdeoxycholaat: Voeg 20 g natriumdeoxycholaatpoeder toe aan 1.000 ml steriel DI-water in een autoclaveerbare glazen fles van 1 L. Sluit de dop en draai de fles om om het poeder op te lossen. (Optioneel) Voeg 10 ml penicilline en streptomycine-oplossing toe.
      OPMERKING: Niet autoclaveren.
    4. 1 M NaCl: Voeg 58,44 g NaCl toe aan 1.000 ml gedestilleerd of DI-water in een autoclaveerbare glazen fles van 1 L. Autoclaaf gedurende 20 minuten bij 121 °C.
    5. DNase I stockoplossing: Verdunnen met een concentratie van 10 mg/ml in Medium A.
      1. Medium A: Bereid 5 mM CaCl2 (5 mg CaCl2 in 9 ml steriel DI-water) en 1:10 verdunning met steriel DI-water.
    6. DNase I werkoplossing: Voeg 33 μL DNase I stockoplossing toe aan 10 ml Medium B.
      1. Medium B: Bereid 10x Medium B (155 mg MgSO4 + 220 mg CaCl2 in 100 ml steriel DI-water) en 1:10 verdunning met steriel DI-water.
  2. Voorbereiding van de katheters voor de longslagader (PA) en de luchtpijp (steriele procedure)
    1. Knip de PA-katheter (katheter voor de halsader van de rat) af op een lengte van ongeveer 15 mm.
    2. Verplaats de halsband naar het einde van de katheter.
    3. Steek een katheterconnector in de PA-katheter en bevestig deze aan een injector. Voorbereide PA-katheters worden weergegeven in figuur 1A.
    4. Bewaar de PA-katheter tot gebruik in 70% ethanol.
    5. Knip de 20 G i.v. katheter af op een lengte van ongeveer 15 mm. Dit wordt gebruikt voor een tracheale katheter.
  3. Muizenoperatie voor het oogsten van hart-longblokkade
    1. Euthanaseer een mannelijke muis (C57BL/6, gewicht > 28 g) met een overdosis kooldioxide of isofluraan.
    2. Plaats de muis in rugligging op een operatietafel en fixeer de ledematen. Steriliseer door 70% ethanol op het oppervlak van de borstkas en de buik te spuiten.
    3. Open de buikholte in de mediaanlijn naar de nek met een roestvrijstalen schaar en splits het borstbeen met de schaar. Reseceer het middenrif van de thoracale wand, snijd de ventrale borstwand door om de borstholten volledig bloot te leggen en verwijder de thymus. Ligate de inferieure vena cava en de rechter superior vena cava met een 4-0 zijde om de regurgitatie van PBS in stap 1.3.5 te voorkomen, waardoor de uitspoeling van het bloed in de longvasculatuur wordt versterkt.
    4. Knip de abdominale aorta af met een roestvrijstalen schaar voor drainage. Als de abdominale aorta niet te onderscheiden is, snijd dan de inferieure vena cava en de abdominale aorta helemaal door.
    5. Injecteer 3 ml steriele PBS uit de rechterventrikel met een steriele spuit van 5 ml met een naald van 27 G door de rechterventrikelwand te doorboren.
    6. Lus de hoofd-PA met een 4-0 zijde met behulp van een Dumont-tang.
      OPMERKING: De hoofd-PA en de aorta ascendensa kunnen aan elkaar worden gelust.
    7. Open een venster van 2 mm onder de PA-kleppen door de rechterventrikelwand door te knippen met een veerschaar.
    8. Breng de PA-katheter door het venster en zet de eerder geluste 4-0 zijde vast (Figuur 1B).
      NOTITIE: Raak de PA tijdens deze procedure niet aan, dit kan de PA-wand beschadigen. De hoofd-PA en de aorta ascendens kunnen worden afgebonden en aan elkaar worden vastgezet.
    9. Injecteer 2 ml PBS langzaam door de PA-katheter met een steriele spuit van 5 ml. Zorg ervoor dat beide longen iets uitzetten terwijl de PBS wordt geïnjecteerd.
    10. Kanuleer de luchtpijp met een tracheale katheter en bind deze op zijn plaats met 4-0 zijden hechtdraad (Figuur 1C).
    11. Injecteer langzaam 2 ml lucht door de tracheakatheter met een lege steriele spuit van 5 ml en houd deze 10 seconden vast. Zorg ervoor dat er geen lucht uit de longen lekt.
    12. Verwijder het hart en de long en bloc. Pak de luchtpijp vast met de Dumont-tang en met de tracheale katheter erin, snijd de cervicale slokdarm door en ontleed deze vanaf de wervels. Snijd de bilaterale subclavia-aders en slagaders door. Snijd ten slotte de slokdarm en de infra vena cava ter hoogte van het middenrif.
      OPMERKING: Raak het longoppervlak niet aan met instrumenten. Elke lichte aanraking kan leiden tot luchtlekkage.
  4. Decellularisatie van de muizenlongen (3-daagse procedure)
    OPMERKING: Alle procedures in paragraaf 1.4 moeten worden uitgevoerd in een schone bioveiligheidskast.
    1. Dag 1
      1. Breng het gereseceerde hart-longblok over naar een plastic petrischaaltje met een diameter van 10 cm en incubeer de hart-longblokken gedurende 1 uur bij 4 °C in steriel DI-water.
      2. Injecteer 3x 2 ml steriel DI-water door de luchtpijpkatheter en 2 ml steriel water door de PA-katheter met een steriele spuit van 5 ml. Pauzeer na elke injectie zodat de vloeistof naar buiten kan komen terwijl de long terugdeinst (Figuur 1C).
        OPMERKING: Injecteer water met ongeveer 0,5 ml/s.
      3. Injecteer 2 ml 0,1% Triton X-100-oplossing in de tracheakatheter en 2 ml in de PA-katheter.
      4. Plaats het hart-longblok in het petrischaaltje en incubeer statisch in Triton X-100 oplossing gedurende een nacht bij 4 °C.
    2. Dag 2
      1. Verwijder de Triton X-100-oplossing uit de longen met steriel DI-water zoals beschreven in stap 1.4.1.2.
      2. Injecteer 2 ml 2% natriumdeoxycholaatoplossing in de tracheakatheter en 2 ml in de PA-katheter. Incubeer in deoxycholaatoplossing gedurende 24 uur bij 4 °C.
    3. Dag 3
      1. Verwijder de natriumdeoxycholaatoplossing uit de longen met steriel DI-water zoals beschreven in stap 1.4.1.2.
      2. Injecteer 2 ml 1 M NaCl-oplossing in de tracheakatheter en 2 ml in de PA-katheter. Incubeer gedurende 1 uur in NaCl-oplossing bij RT.
      3. Verwijder uit de NaCl-oplossing met steriel DI-water zoals beschreven in stap 1.4.1.2.
      4. Injecteer 2 ml DNAse I-werkoplossing in de tracheakatheter en 2 ml in de PA-katheter. Incubeer in DNase werkoplossing gedurende 1 uur bij RT.
      5. Verwijder de DNase-oplossing uit de longen zoals beschreven in stap 1.4.1.2, maar met steriel PBS. Controleer of de longen wit en transparant zijn aan de rand na de decellularisatieprocedure.
        OPMERKING: Naarmate de decellularisatieprocedure vordert, wordt de long kwetsbaarder. Behandel het hart-longblok altijd met voorzichtigheid en vermijd het aanraken van het longoppervlak. Na decellularisatie kunnen de hart-longblokkades tot 3 weken worden bewaard in PBS/antibiotica bij 4 °C.

2. Cultuur van menselijke primaire cellen

  1. Meng de Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM2) en Bullet Kit met foetaal runderserum (eindconcentratie, 2%), hydrocortison (eindconcentratie, 0,2 μg/ml), humane basische fibroblastgroeifactor (eindconcentratie, 4 ng/ml), vasculaire endotheliale groeifactor (2 ng/ml), R3-insuline-achtige groeifactor-1 (eindconcentratie, 5 ng/ml), ascorbinezuur (eindconcentratie, 75 μg/ml), humane epidermale groeifactor (eindconcentratie, 10 ng/ml), gentamicine/amfotericine-1000 (eindconcentratie, gentamicine: 30 μg/ml, amfotericine: 15 ng/ml) en heparine (eindconcentratie, 1 ng/ml).
  2. Ontdooi 2 × 106 menselijke navelstrengader endotheelcellen (HUVEC's) in bevroren flesjes in een waterbad bij 37 °C.
  3. Meng de cellen met EGM2 in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g .
  4. Tel de cellen en subkweek ze met een geschikte celdichtheid (2,0 x 104 cellen/cm2 wordt aanbevolen). Begin met platen met 6 putjes en breng ze vervolgens over naar T75-kolven.
  5. Laat de cellen door totdat het vereiste aantal cellen is verkregen.
    OPMERKING: Voor volledige pulmonale vasculaire dekking met behulp van HUVEC's zijn 3 × 107 HUVEC's vereist19.

3. Opstelling van de bioreactor en perfusie-orgaancultuur

  1. Voorbereiding van een orgaankamer en een celreservoir
    1. Snijd gaten in een siliconen stop met behulp van een kurkboor, zoals weergegeven in afbeelding 2A. De gatmaten zijn 5 mm (i, ii en iii) en 7 mm (iv en v). Elk gatnummer (i-v) in Figuur 2A komt overeen met de holenummers in Figuur 2B.
    2. Steek de pompslang door de siliconenstop zoals aangegeven in afbeelding 2B.
    3. Snijd een gat van 5 mm in een siliconen septum van een open schroefdop met behulp van een kurkboorder. Steek een L/S 14 platina-uitgeharde slang in het gat (Figuur 2B,C).
    4. Autoclaveer de bovenstaande materialen, inclusief de siliconen stop met slang, de glazen bus, de GL-45 schroefdop met slang, een autoclaveerbare glazen fles van 250 ml en een L/S 14-slang met lokfittingen (slang B en slang C in afbeelding 3A) gedurende 20 minuten bij 121 °C. Selecteer de juiste fittingen voor kunstaas om ervoor te zorgen dat buizen B en C een lus maken.
      OPMERKING: De glazen bus wordt gebruikt voor een orgelkamer en de glazen fles van 250 ml wordt gebruikt voor een celreservoir.
  2. Assemblage van een op perfusie gebaseerd bioreactorcircuit
    OPMERKING: De volgende procedures moeten op een schone bank worden uitgevoerd.
    1. Voeg 70 ml kweekmedia toe aan de glazen bus en plaats vervolgens de siliconen stop op de glazen bus.
    2. Monteer een siliconen stop, een glazen bus, een GL-45 schroefdop met slang, een autoclaveerbare glazen fles van 250 ml en een L/S 14-slang met lokfittingen met behulp van driewegkranen zoals beschreven in afbeelding 3A. Steek een naald van 20 G in een siliconen septum van een GL-45 schroefdop.
    3. Vul de media in slang A, B en C met een spuit van 10 ml die is aangesloten op de kranen i) en iii) (~3-5 ml media is nodig om 1 m slang te vullen). Herhaal de injectie en opzuiging van de media met behulp van een spuit van 10 ml via een driewegkraan om ervoor te zorgen dat er geen luchtbel in de slang zit.
    4. Bevestig de PA-katheter van het gedecellulariseerde hart-longblok via een lokfitting die is aangesloten op slang C. Vermijd luchtbellen in de katheter of de slang.
    5. Oogst en suspendeer HUVEC's met een dichtheid van 0,5-1 × 106 cellen/ml in EGM2. Voeg de celsuspensie uit stap 2.5 toe aan het celreservoir.
      OPMERKING: De celsuspensie wordt bij voorkeur bereid tussen stap 3.2.4 en 3.2.5. Doe een roerstaaf in het cellenreservoir.
  3. Door zwaartekracht aangedreven injectie van endotheelcellen
    1. Plaats het cellenreservoir met HUVEC's op een magnetische roerder. Zorg ervoor dat de bodem van het celreservoir zich 30 cm boven de orgaankamer bevindt (Figuur 2D en Figuur 3A).
    2. Zet de magneetroerder aan met een snelheid van ongeveer 120 tpm.
    3. Open de kraan i) en ii) zodat de celsuspensie via slang A, slang C en de PA-katheter in de gedecellulariseerde steiger kan worden geïnjecteerd.
      OPMERKING: Bij het injecteren van 3 × 107 cellen met een celdichtheid van 1 × 106 cellen/ml, moet het volume van de celsuspensie 30 ml zijn. Een typische injectiesnelheid is 1-2 ml/min.
    4. Nadat de celsuspensie volledig is geïnjecteerd, maakt u slang A los van de kraan ii).
      OPMERKING: Het celgetal kan in deze stap worden uitgevoerd om de celretentiesnelheid in de gedecellulariseerde steiger te meten. De typische celretentiesnelheid is 80-90%, ongeacht het aantal geïnjecteerde cellen19.
      De kwaliteit van de gedecellulariseerde longsteiger bepaalt strikt de celretentiesnelheid. Elke lekkage uit de gedecellulariseerde long (bijv. van de hoofd-PA, longoppervlak) resulteert in een lagere celretentiesnelheid. Zorg ervoor dat er geen duidelijke lekkage is uit de gedecellulariseerde long door 2-3 ml kweekmedia te injecteren met een steriele spuit die is aangesloten op een van de kranen in de op perfusie gebaseerde bioreactor en bevestig dat de gedecellulariseerde longen iets uitzetten terwijl de media worden geïnjecteerd.
  4. Perfusie orgaancultuur
    1. Plaats de orgaankamer in een CO2 -couveuse.
    2. Bevestig slang B aan een pompkop die is aangesloten op een pulserende pomp.
    3. Sluit de glazen deur van de CO2 -couveuse. Zorg ervoor dat de slang goed tussen de glazen deur en de rubberen afdichting is geplaatst (Figuur 3B).
    4. Incubeer de gedecellulariseerde steiger gedurende 3 uur bij 37 °C om de geïnjecteerde endotheelcellen in de steiger te laten bezinken.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de pulserende pomp altijd uit staat tussen stap 3.4.1 en 3.4.4.
    5. Start de pomp met een snelheid van 6 tpm, wat resulteert in mediaperfusie van 2 ml/min met behulp van een L/S 14-slang. Kijk hoe de gedecellulariseerde long iets wordt uitgezet met de mediaperfusie.
    6. Sluit de deur van de couveuse (afbeelding 3C).
    7. Voer de mediawissel uit via Stopcock iii). Vervang elke 2 of 3 dagen de helft van de media.
      1. Stop de pompaandrijving, bevestig een steriele spuit van 50 ml aan de kraan iii) en zuig 50 ml media uit de kamer.
      2. Vul nog een steriele spuit van 50 ml met 50 ml voorverwarmde media en breng de media via de kraan iii in de kamer over. Schakel de kraan op de juiste manier om en start vervolgens de pulserende pomp.
    8. Oogst het gerecellulariseerde hart-longblok na ten minste 2 dagen perfusieorgaancultuur.
      OPMERKING: In onze studie was 2 dagen perfusiecultuur voldoende om de gedecellulariseerde longsteiger homogeen te revasculariseren met behulp van 3 × 107 HUVEC's. Bij gebruik van minder dan 3 × 107 HUVEC's kan een langere incubatie nodig zijn om de efficiëntie van recellularisatie te verbeteren.

4. Orthotope transplantatie van de bio-engineered long

  1. Voorbereiding van geneesmiddelen
    1. Bereid MMB-combinatie-anestheticum door midazolam (eindconcentratie, 4 mg/kg), medetomidine (eindconcentratie, 0,75 mg/kg) en butorfanoltartraat (eindconcentratie, 5 mg/kg) te mengen met normale zoutoplossing van klinische kwaliteit.
    2. Bereid de heparineoplossing door deze te mengen met normale zoutoplossing van klinische kwaliteit (eindconcentratie 1000 E/ml).
    3. Bereid cefazoline-natrium door het te mengen met normale zoutoplossing van klinische kwaliteit (één dosis, 30 mg/kg).
  2. Chirurgische ingreep
    1. Voorbereiding van manchetten
      1. Wrijf de drie soorten angiokatheter lichtjes in met fijn schuurpapier om ervoor te zorgen dat de bloedvaten gecuffd blijven.
      2. Bereid een bronchiale manchet voor van een 20 G Teflon angiokatheter van 1 mm lang met behulp van een #11 scalpel. Voordat u de angiokatheter doorsnijdt, gebruikt u de achterkant van het #11 scalpel om een inkeping in de angiokatheter te maken om het 10-0 nylon af te binden.
      3. Bereid de longadermanchet (PV) voor met een 22 G Teflon-angiokatheter met een lengte van 0,8 mm en de PA-manchet met een 24 G Teflon-angiokatheter met een lengte van 0,6 mm.
        OPMERKING: Deze voorbereiding kan vóór de dag van het experiment worden gedaan.
    2. Bevestiging van de manchet aan de bio-engineered long
      1. Plaats het hart-longblok op een stuk steriel gaasje bevochtigd met koude zoutoplossing, leg er nog een stuk droog, schoon gaasje onder en zet een petrischaaltje in een piepschuimdoos gevuld met schoon ijs.
        LET OP: Het plaatsen van het droge gaasje voorkomt dat de hart-longblokkade per ongeluk bevriest.
      2. Plaats een aneurysmaclip om de luchtpijp en het gaas vast te zetten (Figuur 4A). Leg een klein stukje gaasje op het hart, dat ook de rechterlong bedekt. Plaats nog een gaasje op de linkerlong. Pas deze terugtrekking aan met het bevochtigde gaasje om het linker hihilum zo duidelijk mogelijk bloot te leggen.
      3. Ontleed de hilaire structuren zorgvuldig van elkaar met behulp van een rechte of schuine microtang, afhankelijk van de voorkeur (Figuur 4B). Begin met het ontleden van de longband langs de nervus vagus. Snijd de viscerale pleura onder de PV in en beweeg de dalende aorta en nervus vagus samen door de achterkant van het linker longhilum naar de schedelzijde.
      4. Ontleed de linker hoofd-PA van de longstam tot de uiterste rand van de linkerlong (Figuur 4C). Verdeel vervolgens de PA ter hoogte van de longstam om voldoende lengte te verkrijgen.
      5. Ontleed de linker PV vanaf de linkerkant van het linker atrium tot aan de uiterste rand van de linkerlong (Figuur 4D). Verdeel de linker PV ter hoogte van het linker atrium om voldoende lengte te verkrijgen.
      6. Hang de PA-manchet net boven de PA op met behulp van de stabilisatieklem en steek de PA in de manchet (Figuur 4E). Vouw de PA over de manchet), waardoor het endotheeloppervlak bloot komt te liggen. Zet vast rond de manchet met een 10-0 nylon stropdas (Figuur 4F). Plaats de manchet op dezelfde manier op de PV (Figuur 4G,H).
      7. Verdeel de linker bronchiën ter hoogte van de carina. Plaats de manchet op dezelfde manier op de bronchiën (Figuur 4I).
    3. Procedure voor de ontvangende muis
      1. Verdoof de ontvangende muis met een mengsel van MMB i.p. met een naald van 27 G en intubeer door een angiokatheter van 20 G polyurethaan onder een microscoop in te brengen. Plaats de ontvangermuis op een temperatuurregelbare elektrische verwarmer in de rechter laterale decubituspositie en sluit de angiochatheter aan op het ademhalingsapparaat. Stel de instelling van de beademingsmachine als volgt in: zuurstof 2 l/min, ademhalingsfrequentie 120 bpm, ademvolume 0,5 ml. Steriliseer de borstwand met 70% ethanol en injecteer het cefazolinemengsel s.c.
      2. Snijd de huid in met een schaar. Snijd het onderhuidse weefsel en de spieren door met een cauterisatie. Open de kist door de3e intercostale ruimte en plaats de kistoprolmechanismen.
        OPMERKING: Hoewel de thoracotomie groot genoeg moet zijn voor implantatie, mag u de interne borstslagader niet beschadigen, wat kan leiden tot enorme bloedingen.
      3. Ontleed de longband met een wattenstaafje en een grote veerschaar. Plaats een gebogen arteriële reiniger op de linkerlong van de ontvanger om de long gemakkelijk terug te trekken. Ontleed met een schuine microtang het mediastinale borstvlies rond het linker longhilum.
        OPMERKING: De basis van het ontleden van het borstvlies is vergelijkbaar met de anatomische longresectie van een mens.
      4. Ontleed de PA van de bronchiën met behulp van een gebogen microtang van het mediastinum tot aan de uiterste rand van de linkerlong (Figuur 5A). Ontleed de bronchiën van PV op een vergelijkbare manier.
        OPMERKING: Dissectie kan gemakkelijk worden uitgevoerd wanneer het borstvlies bij de vorige manoeuvre wordt ontleed (stap 4.2.3.3).
      5. Plaats een schuifknoop van 10-0 zijde aan de basis van de PA om af te sluiten (Figuur 5B). Plaats een slanke, schuine aneurysmaklem aan de basis van de PV en bronchiën (Figuur 5C).
      6. Lus 10-0 nylon rond de bronchiën, PA en PV en laat los om de manchetten bij de volgende stappen vast te zetten.
      7. Snijd de PA, bronchiën en PV van de ontvanger in aan de rand van de linkerlong van de ontvanger met behulp van een microveerschaar (Figuur 5D). Verwijd de PA en PV voorzichtig met behulp van een rechte microtang. Verwijder het bloed in de PA en PV met zoutoplossing met behulp van een spuit van 1 ml en een angiocathater van 24 G.
        OPMERKING: De incisies van PA, bronchiën en PV zijn ongeveer een derde van de weg. De rechte microtang is zacht en geschikt voor dilatatie.
      8. Plaats de bio-engineered long, die bedekt is met bevochtigd gaasje, bovenop de linkerlong van de ontvanger (Figuur 5E), zo dicht mogelijk bij het mediastinum van de ontvanger.
      9. Het inbrengen van de donor-PA-manchet in de ontvangende PA (Figuur 5F).
        OPMERKING: Er zal enige rek zijn op de donor-PA. Als de grootte van de PA-incisie geschikt is, is de kans kleiner dat de manchet van de donor losraakt. Door de bio-engineered long dicht bij het mediastinum te plaatsen, wordt ook voorkomen dat de manchet van de donor losraakt.
      10. Zet vast rond de manchet met een 10-0 nylon stropdas (Figuur 5G). Breng op dezelfde manier de donorbronchus (Figuur 5H) en PV-manchetten (Figuur 5I,J) in en zet ze vast.
      11. Verwijder de slanke aneurysmaklem (Figuur 5L). Observeer dat het bloed terugstroomt voorbij de PV-manchet en verwijder de zijden stropdas op PA om de antegrade bloedtoevoer naar de bio-engineered long te hervatten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het decellularisatieprotocol zijn de longen van muizen zichtbaar wit en doorschijnend (Figuur 6A). Cellulaire componenten moeten volledig worden verwijderd, maar de alveolaire structuur blijft intact in de histologische observatie (Figuur 6B,C). Gecellulariseerde muizenlongen met behulp van 3 × 107 HUVEC's met 2-daagse perfusie-gebaseerde bioreactorcultuur vertonen een homogene verdeling van H...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orgaanbio-engineering is een veeleisende onderneming. Het kostbare screeningproces heeft de onderzoeks- en ontwikkelingscyclus van dit vakgebied belemmerd. Door muizen als experimenteel platform te gebruiken, worden ruimte, cellen en media aanzienlijk verkleind in vergelijking met het eerder gebruikte rattenplatform. Hoewel het meten van gedetailleerde fysische parameters zoals gasuitwisseling, vasculaire weerstand of longcompliantie nog niet is bereikt, maakt het muislongmodel versnelde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten met betrekking tot dit manuscript.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd financieel ondersteund door de Grant-in-Aid for Scientific Research / KAKENHI (C) #20K09174, #23K08308, het Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B)) #22KK0132 voor TS, JSPS KAKENHI Grant Number 21K08877 voor TW, Leave a Nest Grant Ikeda-Rika award voor FT, en de Grant-in-Aid for JSPS Fellows #21J21515 voor FT. We waarderen mevrouw Maiko Ueda, technisch personeel in de Biomedical Research Core van de Tohoku University Graduate School of Medicine, zeer voor haar intensieve werk op het gebied van histologische observatie. We waarderen ook het technische advies van mevrouw Yumi Yoshida en de heer Koji Kaji van het Center of Research Instruments van IDAC, Tohoku University, voor hun ondersteuning bij de beeldverwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
DECELLARISATIE
27 G x 1/2 inch BD PrecisionGlide naaldBD305109Of gelijkwaardige 27 G injectienaald
BD Insyte IV katheter 20 GA X 1,8 8INBD381237Of gelijkwaardige 20 G IV katheter
Bladzijde zijde naad (4-0)NescoGA04SBOf gelijkwaardige
CaCl2Sigma-AldrichC5670
Katheter voor rat jugulaire ader, PU 2Fr 10 cmInstechC20PU-MJV1301Aanbevolen voor muizen met een gewicht van 30 g en minder.
Katheter voor rat jugulaire ader, PU 3Fr 10 cmInstechC30PU-RJV1307Aanbevolen voor muizen met een gewicht van meer dan 30 g.
DNase ISigma-AldrichDN25
MgSO4Sigma-AldrichM7506
NaClSigma-AldrichS3014
PinPort injectorsInstechPNP3M
PinPorts, 22 GInstechPNP3F22-50Past op C30PU-RJV1307
PinPorts, 25 GInstechPNP3F25-50Past op C20PU-MJV1301
NatriumdeoxycholaatSigma-AldrichD6750
Steriele spuit, 5 mlGeneric
Triton X-100Sigma-Aldrich9036-19-5
CELKULTURE
EGM-2 Endotheelcelgroeimedium-2 BulletKitLonzaCC-3162
HUVEC – Humane navelstrengvene endotheelcellenLonzaC2519A
PERFUSIE-GEBASEERDE BIOREACTOR
20 G naaldGeneric
3-weg stopkraanGeneric
KurkboorderGenericBoormaat, 6-10 mm
EasyLoad III pompkopCole-Parmer243934
GlasbusHarioSCN-200TBinnendiameter: 80 mm
Verwarmde magnetische roerderGeneric
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9965-01Vrouwelijk, past op slangen met I.D. 1,5 mm (L/S 14)
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9964-01Mannelijk, past op slangen met I.D. 1,5 mm (L/S 14)
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9965-03Vrouwelijk, past op slangen met I.D. 3 mm (L/S 16)
Lure fitting, PVDF, Voor zachte buisNordson Medical2-9964-03Mannelijk, past op slangen met I.D. 3 mm (L/S 16)
Magneet roerpenGeneric
Masterflex L/S Digital Precision Modular Drive met Remote I/O en Benchtop ControllerCole-Parmer07557-00
Masterflex L/S Precision Pump Slang, PharMed BPT, L/S 16Cole-Parmer06508-16
Masterflex L/S Precision Pump Slang, Platinum-Cured Silicone, L/S 14Cole-Parmer96410-14
Millex-GP Spuitfiltereenheid, 0,22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma gesteriliseerdMilliporeSLGPR33RS
Pyrex 250 mL grasfles, GL-45 schroefdopCorning1395-250
Siliconen Septa voor GL45 Open Top PBT SchroefkapCorning1395-455S
Siliconen Licht StopperIMG07763-18Bovenste diameter: 87 mm, Onderste diameter: 75 mm
Steriele spuit, 10 ml, 50 mlGeneric
MUIZEN CHIRURGIE (Isolatie van het hart-longblok | Longtransplantatie)
10-0 Nylon stropdassenKono SeisakushoN/A
10-0 Zijden stropdassenKono SeisakushoN/A
4-0 Zijden stropdassenKono SeisakushoN/A
Arteriële klem, 45 mm gebogen, gegroefdNatsume seisakusyoC-17-45
BD Insyte IV katheter 24GABD381512Of gelijkwaardige 24G i.v. katheter
Bulldog Vaatklem 45mm gebogenNatsume seisakusyoM2
Butorphanol tartraat Meiji Seika PharmaN/A
Cefazoline natriumOtsuka PharmaceuticalN/A
Dumont forceps #5/45Fine Science Tools1251-35
Fijne vannas stijl veerscharenFine Science Tools15403-0845° punt, 0,01 x 0,06 mm
Gemini Cautery KitHarvard ApparatusRS-300
Halsted-Mosquito klem gebogen punt, 125 mmBioresearch center16181670
Hegar naaldhouder, 150 mmB Braun/AesculapBM065R
Heparine oplossingMochida SeiyakuN/A
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoN/A
Micro forceps rechtB Braun/AesculapBD33R
MidazolamSandozN/A
MuizenventilatorHarvard ApparatusModel 687™
Normale zoutoplossing, klinisch graadOtsuka PharmaceuticalN/A
Petrischaal, 60 x 15 mmBD351007

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. van der Mark, S. C., Hoek, R. A. S., Hellemons, M. E. Developments in lung transplantation over the past decade. Eur Respir Rev. 29 (157), 190132(2020).
  2. Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2022 Annual Data Report: Lung. Am J Transplant. 24 (2S1), S394-S456 (2024).
  3. Hoffman, T. W. Waiting list dynamics and lung transplantation outcomes after introduction of the lung allocation score in the Netherlands. Transplant Direct. 7 (10), e760(2021).
  4. Wilk, A. R., Edwards, L. B., Edwards, E. B. The effect of augmenting OPTN data with external death data on calculating patient survival rates after organ transplantation. Transplantation. 101 (4), 836-843 (2017).
  5. Neizer, H., Singh, G. B., Gupta, S., Singh, S. K. Addressing donor-organ shortages using extended criteria in lung transplantation. Ann Cardiothorac Surg. 9 (1), 49-50 (2020).
  6. Oliveira, P., Yamanashi, K., Wang, A., Cypel, M. Establishment of an ex vivo lung perfusion rat model for translational insights in lung transplantation. J Vis Exp. (199), e65981(2023).
  7. Anand, R. P. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).
  8. Shakir, S., Hackett, T. L., Mostaco-Guidolin, L. B. Bioengineering lungs: An overview of current methods, requirements, and challenges for constructing scaffolds. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1011800(2022).
  9. Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16 (8), 927-933 (2010).
  10. Petersen, T. H. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
  11. Leiby, K. L. Rational engineering of lung alveolar epithelium. NPJ Regen Med. 8 (1), 22(2023).
  12. Kitano, K., et al. Orthotopic transplantation of human bioartificial lung grafts in a porcine model: A feasibility study. Semin Thorac Cardiovasc Surg. 34 (2), 752-759 (2022).
  13. Ohata, K., Ott, H. C. Human-scale lung regeneration based on decellularized matrix scaffolds as a biologic platform. Surg Today. 50 (7), 633-643 (2020).
  14. Ren, X. Engineering pulmonary vasculature in decellularized rat and human lungs. Nat Biotech. 33 (10), 1097-1102 (2015).
  15. Doi, R. Transplantation of bioengineered rat lungs recellularized with endothelial and adipose-derived stromal cells. Sci Rep. 7 (1), 8447(2017).
  16. Stone, K. C., Mercer, R. R., Gehr, P., Stockstill, B., Crapo, J. D. Allometric relationships of cell numbers and size in the mammalian lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 6 (2), 235-243 (1992).
  17. Basil, M. C., Morrisey, E. E. Lung regeneration: a tale of mice and men. Semin Cell Dev Biol. 100, 88-100 (2020).
  18. Hsia, C. C., Hyde, D. M., Weibel, E. R. Lung structure and the intrinsic challenges of gas exchange. Compr Physiol. 6 (2), 827-895 (2016).
  19. Tomiyama, F., et al. Orthotopic transplantation of the bioengineered lung using a mouse-scale perfusion-based bioreactor and human primary endothelial cells. Sci Rep. 14 (1), 7040(2024).
  20. Stoian, A., Adil, A., Biniazan, F., Haykal, S. Two decades of advances and limitations in organ recellularization. Curr Issues Mol Biol. 46 (8), 9179-9214 (2024).
  21. Crabbe, A. Recellularization of decellularized lung scaffolds is enhanced by dynamic suspension culture. PLoS One. 10 (5), e0126846(2015).
  22. Daly, A. B. Initial binding and recellularization of decellularized mouse lung scaffolds with bone marrow-derived mesenchymal stromal cells. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 1-16 (2012).
  23. Regulations for Animal Experiments and Related Activities. , Tohoku University. at https://www.clag.med.tohoku.ac.jp/clar/en/ (2024).
  24. Sokocevic, D., et al. The effect of age and emphysematous and fibrotic injury on the re-cellularization of de-cellularized lungs. Biomaterials. 34 (13), 3256-3269 (2013).
  25. Ren, X., et al. Ex vivo non-invasive assessment of cell viability and proliferation in bio-engineered whole organ constructs. Biomaterials. 52, 103-112 (2015).
  26. Watanabe, T. Mesenchymal stem cells attenuate ischemia-reperfusion injury after prolonged cold ischemia in a mouse model of lung transplantation: a preliminary study. Surg Today. 47 (4), 425-431 (2017).
  27. Watanabe, T., et al. Donor IL-17 receptor A regulates LPS-potentiated acute and chronic murine lung allograft rejection. JCI Insight. 8 (21), e158002(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Lung BioengineeringDecellularized Mouse LungsHuman Endothelial CellsOrgan TransplantationPerfusion Organ CultureBioreactor SetupHeart Lung BlockRecellularization ProtocolHistological AnalysisCapillary Network Formation

Gerelateerde artikelen