Kweek- en verwerkingstechnieken voor de vorming van myometriale en baarmoederfibromen

Summary

Dit protocol beschrijft een handmatig uitgevoerde techniek voor het creëren van collageenhoudende hydrogels die zijn ingebed met 3D-organoïde kweken van stamcellen uit myometrisch en baarmoederfibroomweefsel.

Abstract

Baarmoederfibromen zijn de meest voorkomende goedaardige, monoklonale, gynaecologische tumoren in de baarmoeder van een vrouw. Om de veelvoorkomende obstakels te overwinnen die verband houden met de methoden die worden gebruikt bij het bestuderen van deze pathologieën, wilden we een strategie ontwikkelen om driedimensionale organoïde modellen van myometrium- en baarmoederfibroïden stamcellen te genereren met collageenhoudende hydrogels als inbeddingssteigers. Specifiek werden collageenhoudende hydrogels in een platen met een laag aanhechting V-bodem 96-well-platen geëxploiteerd. Deze methode maakte de ontwikkeling mogelijk van 3D-organoïden van twee stamceltypen uit normaal myometrium en myometrium met baarmoederfibromen door ze in collageenhoudende hydrogels te plaatsen en organoïden te vormen in een geschikt stamcelproliferatiemedium. De organoïden hebben zich succesvol onderscheiden, vermeerderd en zichzelf georganiseerd tot complexe structuren, waardoor een duurzaam systeem ontstond. Het belang van dit model is het begrijpen van pathofysiologie en etiopathogenese, evenals het testen van nieuwe medicijnen om baarmoederfibromen te voorkomen of te behandelen.

Introduction

Baarmoederfibromen, of leiomyomen, zijn de meest voorkomende goedaardige tumoren van de baarmoeder¹. Ze treffen een aanzienlijk deel van de vrouwen tijdens hun vruchtbare jaren, waarbij onderzoek suggereert dat ongeveer 77% van de vrouwen ze op enig moment ervaart. Hoewel veel vrouwen vleesbomen zonder symptomen hebben, ervaart een aanzienlijke 25% symptomen zoals abnormale baarmoederbloedingen, bekkenpijn of onvruchtbaarheid^. De ontwikkeling en groei van vleesbomen worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder geslachtshormonen, groeifactoren, genetische veranderingen en ander....

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door de University of Chicago Ethnics Committee, met goedkeuringsnummer IRB#20-1414. Volgens de weefselbank van de Universiteit van Chicago werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen van wie het weefsel was verzameld.

1. 3D cultuur van organoïde

1. Kwek en onderhoud de geïsoleerde en gezuiverde myometrische en UF-stamcellen (SC) zoals eerder beschreven⁹.
2. Verkrijg SC's uit vloeibare stikstof en laat ze ontdooien. Een stroomdiagram van het kweekproces is weergegeven in Figuur 1.
3. Vo....

Results

Al op de eerste dag na het zaaien begonnen SC's zichzelf te aggregeren, waarbij organoïden werden gevormd, zoals afgebeeld. We bepaalden de optimale zaaidichtheid op 10.000 SC's, die consequent organoïden vormden wanneer ze in een gedefinieerd kweeksysteem werden gekweekt. Dit systeem gebruikte collageenhoudende hydrogels als ECM-steiger voor de ingebedde stamcellen en stamcelproliferatiemedium gedurende 7 dagen in een ultralow attachment 96-well plaat

Discussion

Organoïden zijn driedimensionale structuren die lijken op miniaturiseerde organen en bestaan uit zelfgeorganiseerde cellen afkomstig van stamcellen of weefselmonsters¹¹. De weefselafgeleide stamcelorganoïden van de patiënten hebben het potentieel om biomedisch onderzoek en klinische toepassingen te revolutioneren dankzij hun opmerkelijke vermogen om UF-fysiologie en ziekte¹² nauwkeurig te repliceren. Hier probeert deze studie deze kloof te .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-photon confocal  Microscope	Leica , USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Akura 96 Spheroid Microplates	InSphero	CS-09-004-03	low attachment V-bottom plates
Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 goat anti rabbit IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex , Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anti-alpha smooth muscle Actin antibody	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 µg/mL
Anti-Collagen III antibody	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Anti-SOX1 antibody	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Attachment factor	Gibco, USA	S-006-100
Blocking buffer	Dako	X0909	5% horse serum + 0.5% Triton X-100 in 1X PBS
Cryostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole )	Thermo Scientific, Germany	62248	1 mg/mL
DNase I	Thermo-Scientific, Lithuania	EN0521
Dullbecco’s modified Eagle’s medium DMEM and  F12	Gibco, USA	21041-025
Fetal bovine serum	Omega Scientific ,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (collagen-containing hydrogels )	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (serum-free Stem cells proliferating Medium  )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canada	5446
OCT compound (Optimal cutting temperature compound )	Sakura, USA	4583
Olympus BX41 microscope	Olympus America, Center Valley, PA
Ovomucoid protease inhibitor solution	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papain	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	activation solution (1.1 mM EDTA, 0.067 mM mercaptoethanol, 5.5 mM L-cysteine HCl)
PBS (Phosphate-buffered saline)	Gibco, USA	70011	pH 7.4
PFA (paraformaldehyd) 4%	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	software for bioimaging analysis
Time Lapse Microscope
Tissue culture flasks	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsin	Gibco, USA	A12859-01	0.25% trypsin and 0.1% EDTA in HBSS without calcium or magnesium
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium supplemented with DAPI	Vector Laboratories, CA, USA	# UX-93952-24	1 ng/mL