Dit protocol beschrijft een handmatig uitgevoerde techniek voor het creëren van collageenhoudende hydrogels die zijn ingebed met 3D-organoïde kweken van stamcellen uit myometrisch en baarmoederfibroomweefsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kweek- en verwerkingstechnieken voor de vorming van myometriale en baarmoederfibromen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Baarmoederfibromen zijn de meest voorkomende goedaardige, monoklonale, gynaecologische tumoren in de baarmoeder van een vrouw. Om de veelvoorkomende obstakels te overwinnen die verband houden met de methoden die worden gebruikt bij het bestuderen van deze pathologieën, wilden we een strategie ontwikkelen om driedimensionale organoïde modellen van myometrium- en baarmoederfibroïden stamcellen te genereren met collageenhoudende hydrogels als inbeddingssteigers. Specifiek werden collageenhoudende hydrogels in een platen met een laag aanhechting V-bodem 96-well-platen geëxploiteerd. Deze methode maakte de ontwikkeling mogelijk van 3D-organoïden van twee stamceltypen uit normaal myometrium en myometrium met baarmoederfibromen door ze in collageenhoudende hydrogels te plaatsen en organoïden te vormen in een geschikt stamcelproliferatiemedium. De organoïden hebben zich succesvol onderscheiden, vermeerderd en zichzelf georganiseerd tot complexe structuren, waardoor een duurzaam systeem ontstond. Het belang van dit model is het begrijpen van pathofysiologie en etiopathogenese, evenals het testen van nieuwe medicijnen om baarmoederfibromen te voorkomen of te behandelen.
Inleiding
Baarmoederfibromen, of leiomyomen, zijn de meest voorkomende goedaardige tumoren van de baarmoeder1. Ze treffen een aanzienlijk deel van de vrouwen tijdens hun vruchtbare jaren, waarbij onderzoek suggereert dat ongeveer 77% van de vrouwen ze op enig moment ervaart. Hoewel veel vrouwen vleesbomen zonder symptomen hebben, ervaart een aanzienlijke 25% symptomen zoals abnormale baarmoederbloedingen, bekkenpijn of onvruchtbaarheid. De ontwikkeling en groei van vleesbomen worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder geslachtshormonen, groeifactoren, genetische veranderingen en ander....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het protocol werd goedgekeurd door de University of Chicago Ethnics Committee, met goedkeuringsnummer IRB#20-1414. Volgens de weefselbank van de Universiteit van Chicago werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen van wie het weefsel was verzameld.
1. 3D cultuur van organoïde
- Kwek en onderhoud de geïsoleerde en gezuiverde myometrische en UF-stamcellen (SC) zoals eerder beschreven9.
- Verkrijg SC's uit vloeibare stikstof en laat ze ontdooien. Een stroomdiagram van het kweekproces is weergegeven in Figuur 1.
- Vo....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Al op de eerste dag na het zaaien begonnen SC's zichzelf te aggregeren, waarbij organoïden werden gevormd, zoals afgebeeld. We bepaalden de optimale zaaidichtheid op 10.000 SC's, die consequent organoïden vormden wanneer ze in een gedefinieerd kweeksysteem werden gekweekt. Dit systeem gebruikte collageenhoudende hydrogels als ECM-steiger voor de ingebedde stamcellen en stamcelproliferatiemedium gedurende 7 dagen in een ultralow attachment 96-well plaat
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Organoïden zijn driedimensionale structuren die lijken op miniaturiseerde organen en bestaan uit zelfgeorganiseerde cellen afkomstig van stamcellen of weefselmonsters11. De weefselafgeleide stamcelorganoïden van de patiënten hebben het potentieel om biomedisch onderzoek en klinische toepassingen te revolutioneren dankzij hun opmerkelijke vermogen om UF-fysiologie en ziekte12 nauwkeurig te repliceren. Hier probeert deze studie deze kloof te .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben. De National Institutes of Health leverden rapporten aan Dr. Ayman Al-Hendy. Ayman Al-Hendy meldde een relatie met Myovant Sciences Ltd. en Pfizer, waaronder advies- of adviesrelaties. Daarnaast is Dr. Ayman Al-Hendy de oprichter van het INOFFA Company.
Dankbetuigingen
De auteurs willen zowel Erin Sullivan als Julian Romano van de University of Chicago erkennen voor hun hulp bij deze videoproductie. De auteurs willen Somayeh Vafaei, Tao Bai, Winston E. Thompson en Qiwei Yang erkennen voor hun hulp bij de stabilisatie van de technieken. University of Chicago Geïntegreerde Lichtmicroscopiekern. Deze studie werd deels ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) RO1 ES028615, RO1 HD094378, U54 MD007602, RO1 HD087417, RO1 HD106285 (AAH) en de Society of Endometriosis and Uterine Disorders (SUED) onderzoeksbeurs (MA).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2-foton confocal Microscoop | Leica, USA | ||
| Agarose I | VWR Corporation, USA | 97062-248 | |
| Akura 96 Spheroid Microplates | InSphero | CS-09-004-03 | low attachment V-bottom platen |
| Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG | Life Technologies, CA, USA | (A11029) | (1:1000) |
| Alexa Fluor 594 goat anti rabbit IgG | Life Technologies, CA, USA | (A11037) | (1:1000) |
| Anti-Ahr [RPT] | GeneTex, Taiwan | (GTX227700a) | (1:1000) |
| Anti-alpha gladde spier Actin antilichaam | Abcam, MA, USA | (ab7817) | 1 µg/mL |
| Anti-Collagen III antilichaam | Abcam, MA, USA | (ab7778) | (1:500) |
| Anti-SOX1 antilichaam | Abcam, MA, USA | ab242125 | (1:500) |
| Bevestigingsfactor | Gibco, USA | S-006-100 | |
| Blokbuffer | Dako | X0909 | 5% paardenserum + 0,5% Triton X-100 in 1X PBS |
| Cryostat | Fisher Scientific, Waltham, MA | Microm HM 550 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole ) | Thermo Scientific, Duitsland | 62248 | 1 mg/mL |
| DNase I | Thermo-Scientific, Litouwen | EN0521 | |
| Dullbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium DMEM en F12 | Gibco, USA | 21041-025 | |
| Fetaal bovien serum | Omega Scientific, Waltham, MA | NC0471611 | |
| Matrigel (collageen-bevattende hydrogels ) | Corning, Corning, NY | 356237 | |
| MesenCult-ACF Plus Medium (serumvrij Stamcellen proliferend Medium ) | Stemcell Technologies, Vancouver, Canada | 5446 | |
| OCT-compound (Optimale snijtemperatuur compound ) | Sakura, USA | 4583 | |
| Olympus BX41 microscoop | Olympus America, Center Valley, PA | ||
| Ovomucoïde proteaseremmeroplossing | Worthington Biochemical Corporation, USA | LK003182 | |
| Papaine | Worthington Biochemical Corporation, USA | LK003176 | activeringsoplossing (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoethanol, 5,5 mM L-cysteïne HCl) |
| PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing) | Gibco, USA | 70011 | pH 7,4 |
| PFA (paraformaldehyde) 4% | Invitrogen, USA | FB002 | |
| Qupath | Bankhead, P. et al. QuPath: Open source software voor digitale pathologie beeldanalyse. Wetenschappelijke Berichten (2017). | https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5 | software voor bio-imaging analyse |
| Time Lapse Microscoop | |||
| Weefselkweekflessen | Fisher Scientific, Waltham, MA | FB012937 | |
| Trypsine | Gibco, USA | A12859-01 | 0,25% trypsine en 0,1% EDTA in HBSS zonder calcium of magnesium |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium aangevuld met DAPI | Vector Laboratories, CA, USA | # UX-93952-24 | 1 ng/mL |
Referenties
- Walker, C. L., Stewart, E. A. Uterine fibroids: the elephant in the room. Science. 308, 1589-1592 (2005).
- Cramer, S. F., Patel, A. The frequency of uterine leiomyomas. Am J Clin Pathol. 94, 435-438 (1990).
- Islam, M. S., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
