Kweek- en verwerkingstechnieken voor de vorming van myometriale en baarmoederfibromen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een handmatig uitgevoerde techniek voor het creëren van collageenhoudende hydrogels die zijn ingebed met 3D-organoïde kweken van stamcellen uit myometrisch en baarmoederfibroomweefsel.

Samenvatting

Baarmoederfibromen zijn de meest voorkomende goedaardige, monoklonale, gynaecologische tumoren in de baarmoeder van een vrouw. Om de veelvoorkomende obstakels te overwinnen die verband houden met de methoden die worden gebruikt bij het bestuderen van deze pathologieën, wilden we een strategie ontwikkelen om driedimensionale organoïde modellen van myometrium- en baarmoederfibroïden stamcellen te genereren met collageenhoudende hydrogels als inbeddingssteigers. Specifiek werden collageenhoudende hydrogels in een platen met een laag aanhechting V-bodem 96-well-platen geëxploiteerd. Deze methode maakte de ontwikkeling mogelijk van 3D-organoïden van twee stamceltypen uit normaal myometrium en myometrium met baarmoederfibromen door ze in collageenhoudende hydrogels te plaatsen en organoïden te vormen in een geschikt stamcelproliferatiemedium. De organoïden hebben zich succesvol onderscheiden, vermeerderd en zichzelf georganiseerd tot complexe structuren, waardoor een duurzaam systeem ontstond. Het belang van dit model is het begrijpen van pathofysiologie en etiopathogenese, evenals het testen van nieuwe medicijnen om baarmoederfibromen te voorkomen of te behandelen.

Inleiding

Baarmoederfibromen, of leiomyomen, zijn de meest voorkomende goedaardige tumoren van de baarmoeder¹. Ze treffen een aanzienlijk deel van de vrouwen tijdens hun vruchtbare jaren, waarbij onderzoek suggereert dat ongeveer 77% van de vrouwen ze op enig moment ervaart. Hoewel veel vrouwen vleesbomen zonder symptomen hebben, ervaart een aanzienlijke 25% symptomen zoals abnormale baarmoederbloedingen, bekkenpijn of onvruchtbaarheid^. De ontwikkeling en groei van vleesbomen worden beïnvloed door verschillende factoren, waaronder geslachtshormonen, groeifactoren, genetische veranderingen en andere^{biologische mechanismen}.

Om pathogenese te bestuderen en de effectiviteit van geneesmiddelen te testen, zijn in vitro - en diermodellen ontwikkeld. Cellen in 2D-culturen worden gedwongen op een vlak oppervlak te groeien, waardoor hun vorm vervormd wordt en hun gedrag verandert ten opzichte van hoe ze zich zouden gedragen in een 3D-weefselomgeving. Het grootste nadeel van 2D-culturing ten opzichte van 3D-culturing is dat het de natuurlijke celomgeving binnen een weefsel slecht weergeeft, waardoor het complexe cel-cel- en cel-matrixinteracties die in een levend organisme plaatsvinden niet nauwkeurig nabootst, wat leidt tot mogelijk onnauwkeurige resultaten bij het bestuderen van celgedrag en respons op stimuli⁴. Bovendien verliezen UF- en myometriecellen snel hun hormoonrespons in 2D-kweek⁵. Over het algemeen hebben de verschillende diermodellen relevante informatie opgeleverd over de pathofysiologie van UF⁶. In vergelijking met diermodellen bieden 3D-organoïden verschillende voordelen: ze vereenvoudigen experimenten, zijn compatibel met realtime beeldvorming en maken het mogelijk om mensspecifieke ontwikkelings- en ziekteaspecten te bestuderen die niet goed vertegenwoordigd zijn in diermodellen⁷. Aan de andere kant zijn experimenten met meer geavanceerde dieren, zoals primaten, zeer ethisch te rechtvaardigen, naast de hoge kosten⁸. Het 3D-organoïdemodel is over het algemeen superieur aan de 2D-celculturen doordat het de in vivo weefselarchitectuur nauwer nabootst en tegelijkertijd beter gecontroleerd, efficiënter en kosteneffectiever is dan diermodellen. Daarom is het essentieel om effectievere alternatieve modellen te ontwikkelen die natuurlijke celgroei en de complexiteit van ziek weefsel nauwkeurig repliceren.

We wilden de procedure opzetten om 3D-kweekorganoïden van myometriale en baarmoederfibromenstamcellen uit te voeren met behulp van collageenhoudende hydrogels met een handmatige procedure, waarbij de belangrijkste voordelen en beperkingen werden benadrukt.

Protocol

Het protocol werd goedgekeurd door de University of Chicago Ethnics Committee, met goedkeuringsnummer IRB#20-1414. Volgens de weefselbank van de Universiteit van Chicago werd geïnformeerde toestemming verkregen van alle proefpersonen van wie het weefsel was verzameld.

1. 3D cultuur van organoïde

1. Kwek en onderhoud de geïsoleerde en gezuiverde myometrische en UF-stamcellen (SC) zoals eerder beschreven⁹.
2. Verkrijg SC's uit vloeibare stikstof en laat ze ontdooien. Een stroomdiagram van het kweekproces is weergegeven in Figuur 1.
3. Voeg 5 ml van het attachment factor-eiwit toe om de voorgecoate flesjes voor te bereiden. Incubeer minstens 4 uur bij 37 °C. Gooi dan het overtollige attachment factor-eiwit weg.
4. Kwek de SC's in de voorgecoate 75 cm 2-flesjes met 10 mL van het medium, bestaande uit zowel Dulbecco's aangepaste Eagle's medium (DMEM) als F12, aangevuld met 12% foetaal runderenserum (FBS). Incubeer de fles in een hypoxie-incubator van 37 °C met een zuurstofconcentratie van 2% totdat ze 90% confluentie bereiken, zoals weergegeven in Figuur 2A.
   OPMERKING: Hypoxie kan een belangrijke rol spelen bij stamcelgroei, omdat het de proliferatie en overleving van stamcellen kan bevorderen.
5. Bij het bereiken van confluentie scheid je de cellen met 25% trypsine-0,1% EDTA-oplossing in HBSS zonder calcium of magnesium.
   1. Om dit te doen, verwijder je het celkweekmedium. Was de cellen met 1x PBS. Voeg 1 ml trypsine toe aan één cel van 25 cm² en incubeer 2-3 minuten.
   2. Zodra de cellen beginnen los te komen, voeg je medium met serum toe om de trypsine-reactie te stoppen. Aspireer de celoplossing in een buis van 15 mL en centrifugeer 5 minuten op 500 x g bij kamertemperatuur.
   3. Gooi voorzichtig het supernatant weg, zodat het pelletje intact blijft.
6. Sussen de celpellet vervolgens opnieuw in 1 mL serumvrije stamcelproliferatiemedium. Verstoor eventuele klonten door zacht te pipetten.
7. Voer celkwantificatie uit met een hemocytometer.
   1. Meng 100 μL celsuspensie met 10 μL 0,4% Trypan Blue-oplossing.
   2. Vortex het mengsel kort en pipetteer 10 μL Trypan Blue-cell suspension in de hemocytometerkamer tussen de kamerinkeping en de glazen deklaag ( Figuur 2B).
   3. Tel cellen in vakken 1-4, gebruik de volgende vergelijkingen om het aantal cellen te berekenen:
      Cellen/mL = (totaal aantal geteld cellen/totaal aantal getelde boxen) x verdunningsfactor x 10.000
      Totale cellen in monster = cellen/mL x totaal monstervolume
8. Meng ongeveer 10.000 cellen met 2 μL collageenhoudende hydrogels en 98 μL serumvrije stamcellen proliferierend medium, wat resulteert in een eindvolume van 100 μL per put⁵voor een V-bodem 96-put plaat.
9. Pipette 100 μL van het celmengsel in elke put van een laag-hechting V-bodemplaat met 96 putjes. Centrifugeer op kamertemperatuur gedurende 5 minuten op 100 x g.
10. Plaats de plaat 30 minuten in een broedmachine van 37 °C met 5%_CO2 .
11. Voeg een extra volume van 100 μL serumvrije stamcellen toe dat zich vermeerdert, zonder collageenhoudende hydrogels aan elke put om de voedingsstoffen te leveren die nodig zijn voor de groei van de organdijen.
12. Compenseer de verdamping van het medium door 10-20 μL serumvrije stamcellen toe te voegen die in elk put prolifereren in geval van overmatige verdamping, wat zelden voorkomt.
13. Kwek de cellen gedurende 7 dagen voor volledige groei van de organoïden. Figuur 2C-H. Vervang het prolifererende medium van de serumvrije stamcellen twee keer per week (aspiratief het oude medium voorzichtig en voeg dan een nieuw medium toe) om de kweek van SCs-afgeleide organoïden tot 21 dagen te kunnen verlengen.

2. Bevroren sneden

1. Verzamel cellen van de 96-wellplaat in een 1,5 mL microcentrifugebuis.
2. Voor cryosectie was organoïden 2x met fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS; 1x). Voeg 500 μL PBS toe aan de organoïden, centrifugeer dan en gooi het supernatant weg.
3. Fixeer de organoïden met 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 60 minuten bij 4 °C en was opnieuw met 1x PBS.
4. Susseer de organoïden opnieuw in 100 μL van 2% methyleenblauw om 20 minuten te kleuren. Was met 1x PBS en cryoprotect 's nachts door suspensie in 500 μL van 30% sucrose.
5. De volgende dag verwijder je de sucroseoplossing door centrifugatie. Inbed de organoïden in een Optimal Cutting Temperature-verbinding (OCT) en vries snel af bij −80 °C.
6. Snijd de organoïden die in OCT zijn ingebed met een cryostaat, de optimale doorsnedediepte is 10 μm, en plaats de secties direct op de glaas, één sectie per preparat.
7. Bewaar de preparaten bij 4 °C totdat immunofluorescentiekleuring volgens de volgende methode is uitgevoerd.
8. Was de slide 3x met 100 μL 1x PBS. Voeg vervolgens 100 μL 0,1% Triton toe in PBS (1x) gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
9. Blokkeer de organoïden met 5% BSA in 1x PBS gedurende 60 minuten en incubeer ze 's nachts met primaire antilichamen voor Sox-2 met verdunning (1:500) en α-gladde musculus actine (α-SMA) met een eindconcentratie van 1 μg/mL.
10. Was de organoïden met 100 μL 1x PBS 3x en incubeer dan 1 uur in het donker met Alexa Fluor-gelabelde fluorescerende kleurstof secundaire antilichamen (1:1000).
11. Was met 100 μL 1x PBS 2x en monteer dan in Antifade Mounting Medium aangevuld met DAPI (1 ng/mL).
12. Maak beelden met een fluorescentiemicroscoop met 20x vergroting. Zie Figuur 3A en analyseer de beelden met software voor bioimaginganalyse.

3. Immunofluorescentiekleuring van whole-mount organoïden

1. Haal de organoïden uit het medium (stap 1.11) in een microcentrifugebuis en was 2x met 500 μL 1x PBS.
2. Fixeer de organoïden met 500 μL 4% PFA gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Daarna verwijder je de PFA en spoel je 3x met 500 μL PBS.
3. Permeabiliseer de gefixeerde organoïden met 0,5 mL blokkerende buffer 's nachts bij 4 °C.
4. De volgende dag verwijder je de blokkeringsbuffer, voeg je primaire antilichamen (300-500 μL) van collageen III (COL3A1) met verdunning (1:500) en AHR met verdunning (1:1000) toe, en incubeer je de monsters bij 4 °C een nacht.
5. Was de organoïden 3x met 500 μL 1x PBS en incubeer vervolgens met secundaire antilichamen (594 geitenantikonijn IgG en 488 geitenanti-muizen IgG) een nacht bij 4 °C in het donker.
6. Was de organoïden 3x met 500 μL 1x PBS, en incubeer vervolgens met 5 μg/mL 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) in 1x PBS (300-500 μL per monster) op kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
7. Was de organoïden drie keer met 500 μL 1x PBS en beeld af met een confocale microscoop (Figuur 3B).

4. Organoïde dissociatie

1. Reconstrueren 100 mg papain in filtergesteriliseerde activatieoplossing tot een voorraadconcentratie van 250 U/mL, en de oplossing 30 minuten incuberen bij 37 °C om het enzym te activeren
   OPMERKING: Het kan tot 2 weken worden bewaard op 2 - 8 °C.
2. Bereid een dissociatieoplossing voor (direct voor gebruik) met 30 U/mL papain en 125 U/mL DNase I in Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS).
3. Overbreng de organoïden (stap 1.11) naar 24-wellplaten en voeg 500 μL dissociatieoplossing toe.
4. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 30-60 minuten op een orbitale shaker ingesteld op 90 rpm.
5. Tritureer intermitterend 5x-6x met een 1 mL pipettor bij kamertemperatuur om een suspensie te verkrijgen die voornamelijk uit enkele cellen bestaat.
6. Voeg de celsuspensie toe aan een 15 mL centrifugebuis met een protease-remmeroplossing (1 mL van 10 mg/mL) en centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten aan de pelletcellen en gooi het supernatant af.
7. Suspendeer de cellen opnieuw in de juiste buffer, en de resulterende single-cel suspension wordt weergegeven in Figuur 2I.

Resultaten

Al op de eerste dag na het zaaien begonnen SC's zichzelf te aggregeren, waarbij organoïden werden gevormd, zoals afgebeeld. We bepaalden de optimale zaaidichtheid op 10.000 SC's, die consequent organoïden vormden wanneer ze in een gedefinieerd kweeksysteem werden gekweekt. Dit systeem gebruikte collageenhoudende hydrogels als ECM-steiger voor de ingebedde stamcellen en stamcelproliferatiemedium gedurende 7 dagen in een ultralow attachment 96-well plaat

Discussie

Organoïden zijn driedimensionale structuren die lijken op miniaturiseerde organen en bestaan uit zelfgeorganiseerde cellen afkomstig van stamcellen of weefselmonsters¹¹. De weefselafgeleide stamcelorganoïden van de patiënten hebben het potentieel om biomedisch onderzoek en klinische toepassingen te revolutioneren dankzij hun opmerkelijke vermogen om UF-fysiologie en ziekte¹² nauwkeurig te repliceren. Hier probeert deze studie deze kloof te ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-foton confocal  Microscoop	Leica, USA
Agarose I	VWR Corporation, USA	97062-248
Akura 96 Spheroid Microplates	InSphero	CS-09-004-03	low attachment V-bottom platen
Alexa Fluor 488 goat anti mouse IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11029)	(1:1000)
Alexa Fluor 594 goat anti rabbit IgG	Life Technologies, CA, USA	(A11037)	(1:1000)
Anti-Ahr [RPT]	GeneTex, Taiwan	(GTX227700a)	(1:1000)
Anti-alpha gladde spier Actin antilichaam	Abcam, MA, USA	(ab7817)	1 µg/mL
Anti-Collagen III antilichaam	Abcam, MA, USA	(ab7778)	(1:500)
Anti-SOX1 antilichaam	Abcam, MA, USA	ab242125	(1:500)
Bevestigingsfactor	Gibco, USA	S-006-100
Blokbuffer	Dako	X0909	5% paardenserum + 0,5% Triton X-100 in 1X PBS
Cryostat	Fisher Scientific, Waltham, MA	Microm HM 550
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole )	Thermo Scientific, Duitsland	62248	1 mg/mL
DNase I	Thermo-Scientific, Litouwen	EN0521
Dullbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium DMEM en  F12	Gibco, USA	21041-025
Fetaal bovien serum	Omega Scientific,  Waltham, MA	NC0471611
Matrigel (collageen-bevattende hydrogels )	Corning, Corning, NY	356237
MesenCult-ACF Plus Medium (serumvrij Stamcellen proliferend Medium  )	Stemcell Technologies, Vancouver, Canada	5446
OCT-compound (Optimale snijtemperatuur compound )	Sakura, USA	4583
Olympus BX41 microscoop	Olympus America, Center Valley, PA
Ovomucoïde proteaseremmeroplossing	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003182
Papaine	Worthington Biochemical Corporation, USA	LK003176	activeringsoplossing (1,1 mM EDTA, 0,067 mM mercaptoethanol, 5,5 mM L-cysteïne HCl)
PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing)	Gibco, USA	70011	pH 7,4
PFA (paraformaldehyde) 4%	Invitrogen, USA	FB002
Qupath	Bankhead, P. et al. QuPath: Open source software voor digitale pathologie beeldanalyse. Wetenschappelijke Berichten (2017).	https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5	software voor bio-imaging analyse
Time Lapse Microscoop
Weefselkweekflessen	Fisher Scientific, Waltham, MA	FB012937
Trypsine	Gibco, USA	A12859-01	0,25% trypsine en 0,1% EDTA in HBSS zonder calcium of magnesium
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium aangevuld met DAPI	Vector Laboratories, CA, USA	# UX-93952-24	1 ng/mL