Zoutoplossing neusspoeling kan worden gebruikt om de nasale immuunmicro-omgeving van honden te bemonsteren. Omdat de aanpak relatief niet-invasief is en het neusweefsel niet verstoort, kan deze serieel worden uitgevoerd. Cellen en eiwitten die zijn verzameld uit de neusspoeltechniek kunnen worden verwerkt voor verschillende laboratoriumanalyses.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Zoutoplossing voor bemonstering van de nasale immuunmicro-omgeving van honden
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het evalueren van de lokale immuunmicro-omgeving van de neusholte van de hond kan belangrijk zijn voor het onderzoeken van normale weefselgezondheid en ziektetoestanden, met name die welke verband houden met lokale ontstekingen. We hebben een techniek geoptimaliseerd om de lokale nasale immuunmicro-omgeving van honden te evalueren via seriële neusspoeling. In het kort, met honden onder narcose en in sternale lighouding, wordt voorverwarmde steriele zoutoplossing in het aangetaste neusgat gespoeld met behulp van een flexibele katheter van zacht rubber. De terugstroom van de vloeistof wordt opgevangen in conische buizen en dit proces wordt herhaald. De vloeistoffen die losgeraakte cellen en eiwitten bevatten, worden samengevoegd en de gepoolde neusspoelingsmonsters worden gefilterd door een celzeef om groot vuil en slijm te verwijderen. Monsters worden gecentrifugeerd en de celpellets worden geïsoleerd voor analyse. Nadat de monsters zijn verwerkt, omvatten analyses die kunnen volgen op nasale spoeling flowcytometrie, transcriptomische analyse van cellen via bulk- of eencellig RNA-seq en/of kwantificering van cytokines die aanwezig zijn in de spoelvloeistof.
Inleiding
Honden ontwikkelen hun hele leven routinematig inflammatoire neusaandoeningen. De onderliggende oorzaak van acute of chronische rhinitis bij honden kan variëren van infectieus (viraal: bijv. griep, para-influenza, herpesvirussen; bacterieel [bijv. Bordetella, mycoplasma's], schimmel [bijv. aspergillose, cryptokokkose]; parasitair [bijv. neusmijten]) tot neoplastisch (bijv. sinonasale maligniteiten, meestal carcinoom of sarcoomhistotypes) tot vreemd materiaal (bijv. vreemd lichaam, intranasale migratie van verplaatste tanden) tot parodontitis, evenals idiopathische inflammatoire rhinitisbij honden 1,2,3,4,5,6,7.
Naast een lichamelijk onderzoek worden verschillende benaderingen gebruikt om de toestand van de sinonasale holte bij honden met neusontsteking te evalueren. Beeldvormingsprocedures kunnen bestaan uit röntgenfoto's (tandheelkunde, schedel), computertomografie (CT) of magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Een andere benadering voor het in beeld brengen van de neusholte is rhinoscopie. Weefselbemonstering kan bestaan uit het verkrijgen van neusuitstrijkjes, borstelmonsters of weefselbiopsieën, waaruit cytologische en/of histopathologische evaluatie kan worden uitgevoerd, evenals het indienen van monsters voor schimmel- of bacteriecultuur. Deze monsters kunnen op verschillende manieren worden verkregen, variërend van "blinde" bemonstering tot beeldgeleide met rhinoscopie of geavanceerde beeldvorming, en verkregen via de neusgaten, van de nasopharynx, of met een chirurgische benadering van trephination, rhinotomie of sinusotomie.
Neusspoeling, waarbij steriele zoutoplossing in de neusholte wordt toegediend, is ook gebruikt voor het bemonsteren van de neusholte van de hond voor diagnostische en therapeutische doeleinden. Een alternatieve versie van de nasale spoeltechniek die is gebruikt voor nasale tumoren wordt nasale hydropulsie genoemd, beschreven als krachtige neusspoeling, die grote tumormonsters kan losmaken voor diagnostische evaluatie en therapeutische verlichting kan bieden voor de verbetering van klinische symptomen geassocieerd met de neuskanker8.
We presenteren hier een andere versie van de nasale spoeltechniek voor het beoogde doel om cellen en eiwitten van de nasale immuunmicro-omgeving te verzamelen en te analyseren. Door middel van een zachte, relatief niet-invasieve benadering hebben we deze nasale spoelingstechniek geoptimaliseerd voor seriële bemonstering van de nasale immuunmicro-omgeving. In onderzoeken met honden met niet-ontstoken neusholten, actieve herpesvirusinfectie en sinonasale tumoren, hebben we het nut van neusspoeling aangetoond voor het verzamelen en verwerken van monsters voor stroomafwaartse toepassingen 9,10.
In dit manuscript beschrijven we een techniek van zoutoplossing neusspoeling voor seriële bemonstering van de nasale immuunmicro-omgeving van honden. We bieden protocoldetails voor het effectief verkrijgen van het neusspoelingsmonster met minimale verstoring van de weefsels en vervolgens het verwerken van de monsters voor een verscheidenheid aan analyses.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze neusspoelingsprocedure is goedgekeurd door de Colorado State University Institutional Animal Care and Use Committee en Clinical Review Board (IACUC #2425). Een schema van de neusspoelingsmethode wordt weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding op de neusspoeling
- Vul de dag voor de neusspoeling vijf spuiten van 20 ml met steriele fysiologische zoutoplossing (0,9% natriumchlorideoplossing) en sluit af met een dop. Plaats de spuiten in een couveuse die is ingesteld op 37 °C, zodat ze een nacht kunnen opwarmen.
2. Positionering van de hond voor de neusspoeling
- Verdoving de hond voor de procedure (bijv. met intraveneuze (IV) injectie van dexmedetomidine (1-4 μg/kg) en butorfanol (0,2-0,5 mg/kg) via een IV-katheter), gevolgd door toediening van propofol IV (2-5 mg/kg) getitreerd voor intubatie; Handhaaf de anesthesie met 1-2% inhalatiemiddel isofluraan.) Bevestig de juiste diepte van de anesthesie door te controleren op ooglidrespons en kaaktonus.
- Smeer de ogen in om uitdroging tijdens de procedure te voorkomen.
- Bewaak cardiale telemetrie, bloeddruk, capnografie en pulsoximetriewaarden tijdens de procedure.
- Plaats de verdoofde hond in sternale lighouding. Plaats het hoofd van de hond zo dat het op een natuurlijke en comfortabele manier in een neerwaartse hoek staat vanaf de rand van de behandeltafel voor een optimale afname van neusspoelingsmonsters.
- Blaas de manchet van de endotracheale tube op om een goede afdichting van de luchtweg te garanderen.
3. Het uitvoeren van de neusspoeling
- Knip een 8 FR steriele, rode rubberen katheter aan de basis af, zodat deze goed past op een van de voorgevulde spuiten van 20 ml die de warme zoutoplossing bevatten. Meet een steriele rode rubberen katheter zo af dat de distale punt van de katheter ongeveer halverwege de neusholte uitsteekt wanneer deze door het neusgat wordt ingebracht. Als u een neustumor bemonstert, gebruik dan beeldvorming of rhinoscopische begeleiding om de locatie van het rostrale aspect van de neustumor te schatten voor het meten van de lengte van de rode rubberen katheter, zodat de punt zich uitstrekt tot het rostrale aspect van de tumor.
- Knip vervolgens de katheter aan de punt af voor de gedefinieerde intranasale katheterlengte, zodat de punt op de juiste plaats terechtkomt wanneer deze in de neusholte wordt ingebracht. Houd echter rekening met een extra lengte voor de basis van de katheter die buiten het neusgat uitsteekt (katheterlengte van het fixatiepunt van de spuit tot de ingang van het neusgat, ongeveer 3-5 cm). Breng een markering met een permanente marker aan op het onderste uiteinde van de katheter om het startpunt aan te geven, dat overeenkomt met de ingang van het neusgat; De vooraf bepaalde katheterlengte strekt zich intranasaal uit, waarbij de katheterpunt op de gewenste plaats in de neusholte wordt geplaatst.
- Voor het uitvoeren van de neusspoelingsprocedure is de deelname van twee personen vereist. Maak één persoon (persoon A) verantwoordelijk voor het inbrengen van de katheter in de neusholte en het toedienen van de spoeling en de andere persoon (persoon B) voor het verzamelen van het monster wanneer het de neus verlaat.
- Laat persoon A zich voor en onder het hoofd van de hond positioneren. Laat persoon A met gehandschoende handen de punt van de rode rubberen katheter voorzichtig in het mediale deel van de neusholte leiden en deze naar voren brengen totdat de markering op de katheter op één lijn ligt met de buitenkant van het neusgat. Zorg er tijdens dit proces voor dat de katheter is aangesloten op de spuit met de verwarmde steriele zoutoplossing. Laat persoon B een conische slang van 50 ml onder het neusgat houden met de katheter op zijn plaats.
- Persoon A sluit voorzichtig het contralaterale neusgat af en begint de zoutoplossing in de neusholte te brengen met langzame, constante druk of met een gepulseerd infuus. Terwijl het hoofd van de hond in een neerwaartse hoek wordt geplaatst, verzamelt persoon B de vloeistof die via de zwaartekracht uit de neusholte wegvloeit in de conische buis van 50 ml.
- Herhaal deze neusspoelingstechniek voor een totaal van in totaal vijf zoutoplossingspoelingen van 20 ml, waarbij u indien nodig conische buizen vervangt om de gepoolde monsters te verzamelen. Noteer het totale volume van de verzamelde neusspoelvloeistof in verhouding tot de hoeveelheid met zoutoplossing toegediende oplossing na voltooiing van de procedure.
- Eenmaal voltooid, indien verdoofd met dexmedetomidine, intramusculair hetzelfde volume atipamezol toedienen als gebruikt voor dexmedetomidine, en laat de hond herstellen van anesthesie. Om voorzichtig te zijn, houdt u de hond in sternale lighouding met het hoofd naar beneden gericht om extra afvoer van eventuele resterende zoutoplossing uit de neusspoeling te vergemakkelijken.
4. Verwerking van het neusspoelingsmonster
- Draai en/of pipetteer voorzichtig de neusspoelingsmonsters in de conische buisjes om klonten puin en cellen te breken. Haal de gepoolde neusspoelingsmonsters door een 70 μm celzeeffilter om groot vuil en slijm te verwijderen. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 5-10 minuten om een celpellet te vormen.
- Verzamel het bovenstaande via aspiratie met een pipet en deponeer het in een schone buis voor analyse van interessante eiwitten.
- Resuspendeer celpellets in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of voorkeursoplossing voor interessante celtesten.
- Om rode bloedcellen uit de monsters te verwijderen, voert u ammoniumchloride-kalium (ACK) lysis uit om genucleeerde cellen te verzamelen uit neusspoeling 11,12.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Bij deze neusspoelmethode zal het afgenomen monster er enigszins troebel uitzien, mogelijk met zichtbare stukjes celresten en slijm wanneer de buis wordt rondgedraaid. Een monster wordt als besmet met perifeer bloed beschouwd als de spoelingsprocedure per ongeluk bloedingen veroorzaakt en het monster rood getint is. Hoewel een deel van de geïnfuseerde zoutoplossing tijdens de procedure verloren zal gaan, wordt een negatieve spoeling overwogen als de geïnfuseerde zoutoplossing niet terug ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er zijn verschillende cruciale stappen in het protocol voor neusspoeling. Met betrekking tot de hond die de neusspoelingsprocedure ondergaat, moet de hond zich binnen een voldoende diep vlak van anesthesie bevinden zodat hij niet reageert op het plaatsen van de katheter of het toedienen van de spoeling. Als ze onder narcose reactief zijn, kan dit de kwaliteit en kwantiteit van de afname van spoelmonsters in gevaar brengen, en mogelijk ook het risico op acuut neusweefselletsel als gevolg ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
De neusspoelingstechniek voor honden die hierin wordt beschreven, is geoptimaliseerd door middel van projecten die worden ondersteund door K01 OD03109, CCTSI Colorado Pilot Grant Award, CSU CVMBS College Research Council Shared Resources Program en CO HNC SPORE CA261605: Career Enhancement Program. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL Tubes | Eppendorf | 05-402 | |
| 1000 µL Pipette | VWR | 89079-974 | |
| 1x PBS | Corning | 21-040-CV | |
| 20 mL Syringes | VWR | BD302830 | |
| 50 mL Conical Tubes | VWR | 89039-656 | |
| 70 µm Cell Strainer | Fisherbrand | 22-363-548 | |
| 8FR Sterile Red Rubber Catheter | Med Vet International | 50-252-2428 | |
| ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 366816 | |
| Physiological Saline (0.9%) | Vetivex | 17033-492-01 | |
| Vortex | VWR | 10153-838 |
Referenties
- Cohn, L. A. Canine nasal disease: An update. Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).
- Mortier, J., Blackwood, L. Treatment of nasal tumours in dogs: A review. J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).
- Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases. J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).
- Windsor, R. C., Johnson, L. R. Canine chronic inflammatory rhinitis. Clin Tech Small Anim Practice. 21 (2), 76-81 (2006).
- Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. Pathogenesis and treatment of canine rhinitis. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).
- Hazuchova, K., Neiger, R., Stengel, C. Topical treatment of mycotic rhinitis-rhinosinusitis in dogs with meticulous debridement and 1% clotrimazole cream: 64 cases (2007-2014). JAVMA. 250 (3), 309-315 (2017).
- Lobetti, R. Idiopathic lymphoplasmacytic rhinitis in 33 dogs. JS Afr Vet Assoc. 85 (1), 1-5 (2014).
- Ashbaugh, E. A., Mckiernan, B. C., Miller, C. J., Powers, B. Nasal hydropulsion: A novel tumor biopsy technique. JAAHA. 47 (5), 312-316 (2011).
- Wheat, W., et al. Local immune and microbiological responses to mucosal administration of a liposome-tlr agonist immunotherapeutic in dogs. BMC Vet Res. 15 (1), 330(2019).
- Darragh, L. B., et al. Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors. Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).
- Pinard, C. J., et al. Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients. Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).
- Choi, J. W., et al. Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function. PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
