Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

836 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67578

⸱

24 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Physiology, Chair of Biomedical Sciences, Institute of Physiotherapy, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, 2Department of Clinical Immunology, Wroclaw Medical University, 3Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Samenvatting

De huid, als het grootste orgaan in het menselijk lichaam dat in wisselwerking staat met de externe omgeving, speelt cruciale fysiologische rollen, waaronder (1) het beschermen van het organisme tegen xenobiotica en micro-organismen, (2) het vergemakkelijken van thermoregulatie, (3) het handhaven van de water- en elektrolytenbalans, (4) het synthetiseren van vitamine D en (5) deelnemen aan de immuniteit. Dit artikel belicht de cruciale betrokkenheid van de huid bij immunologische mechanismen en toont het vermogen om te immunomoduleren door de immuunrespons te onderdrukken of te versterken. Eerdere bevindingen tonen aan dat bij muizen epicutane (EC) immunisatie met een antigeen, alleen of in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's), respectievelijk immuunresponsen kan onderdrukken of versterken. In het bijzonder werd waargenomen dat EC-immunisatie met een antigeen immuunresponsen kan onderdrukken in verschillende muizenmodellen van auto-immuunziekten of allergische contactdermatitis. De resultaten geven aan dat EC-immunisatie met een antigeen in combinatie met PAMP's zou kunnen dienen als een effectieve strategie om de immuniteit tegen ziekteverwekkers te versterken of T-helper type 2 lymfocyten (Th2)-afhankelijke allergieën te verlichten. Dit protocol schetst een methode voor het induceren van huidsuppressie via de epicutane toepassing van een antigeen in een muizenmodel van menselijke allergische contactdermatitis (ACD)-contactovergevoeligheid (CHS) gemedieerd door Th1-cellen. Het kan echter ook worden toegepast op verschillende modellen voor muizenaandoeningen. Het artikel presenteert EC-geïnduceerde immunomodulatie als een aantrekkelijk muizenmodel voor naaldloze immunotherapie bij verschillende aandoeningen.

Inleiding

Dit artikel presenteert een methode voor het induceren van tolerantie (in deze tekst 'onderdrukking' genoemd) in een muismodel van contactovergevoeligheid (CHS) en voor het omkeren van deze tolerantie (in deze tekst 'contrasuppressie' genoemd) via epicutane (EC) toepassing van een antigeen alleen of in combinatie met liganden voor pathogene herkenningsreceptoren (PRR's), respectievelijk1. In het beschreven protocol worden (a) gehapteniseerde muisimmunoglobulinen (TNP-Ig) gebruikt als antigeen om contactovergevoeligheid te onderdrukken of (b) antigeen met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's), liganden voor Toll-like receptoren (TLR) en nucleotide-bindende oligomerisatiedomein-bevattend eiwit (NOD)-achtige receptoren (NLR's), om huidgeïnduceerde onderdrukking om te keren 2,3,4. De bevindingen geven aan dat EC-geïnduceerde immunomodulatie wordt gemedieerd door antigeen-niet-specifieke T-suppressor (Ts)-cellen en antigeen-specifieke T-contrasuppressor (Tcs)-cellen. Deze cellen kunnen worden onderzocht in een muismodel van adoptieve celoverdracht om het mechanisme van de geteste reacties te bepalen. Het huidige protocol beschrijft twee modellen van celoverdracht, "adoptieve overdracht IN" en "adoptieve overdracht UIT". Adoptieve overdracht IN is nuttig voor het testen van de immunomodulatie in de afferente en efferente fasen van CHS. Aan de andere kant weerspiegelt "adoptieve overdracht OUT" het effect van immunomodulatie alleen in de efferente fase van CHS.

Het artikel beschrijft een methode van huidgeïnduceerde onderdrukking via de epicutane toepassing van een antigeen in een muizenmodel van menselijke allergische contactdermatitis (ACD) - contactovergevoeligheid (CHS) gemedieerd door T-helper type 1 lymfocyten (Th1)5. Deze benadering werd echter ook getest op zijn werkzaamheid bij het reguleren (onderdrukken, tolerantie) van T-cytotoxische lymfocyten type 1 (Tc1)-gemedieerde CHS 6,7, auto-immuunziekten zoals collageen-geïnduceerde artritis (CIA)8,9, experimentele auto-immuun encefalomyelitis (EAE)10,11 en colitis ulcerosa12. Bovendien beschrijft het protocol de methode van huidgeïnduceerde contrasuppressie (omgekeerde suppressie) via EC-toepassing van een antigeen samen met PRR-liganden in een muizenmodel van CHS 13,14,15,16. De gepresenteerde resultaten geven aan dat EC-geïnduceerde antigeen-niet-specifieke onderdrukking kan worden teruggedraaid door TLR2-, TLR3-, TLR4-, TLR9- en NOD2-liganden te zuiveren. De methode van door de huid geïnduceerde contrasuppressie werd ook gebruikt in een diermodel van atopische dermatitis (AD), wat aantoont dat EC-behandeling met een antigeen in aanwezigheid van synthetische enkelstrengs DNA-moleculen die niet-gemethyleerde oligodeoxynucleotiden (CpG) bevatten - ligand voor TLR9 Th2-gemedieerde reacties op een antigeenspecifieke manier kan onderdrukken (verschuift de immuunrespons naar een Th1/Th17-fenotype)17. De beschreven methode werd ook getest bij pneumokokkenpneumonie, wat aantoont dat EC-immunisatie met pneumokokkenpolysacharide geconjugeerd aan runderserumalbumine (PC-BSA), samen met CpG, de immuniteit tegen Streptococcus pneumoniae18 mogelijk zou kunnen versterken.

Een cruciaal aspect van EC-geïnduceerde immunomodulatie is de selectie van het model en de aard van het antigeen. Het artikel bevat een tabel met details over de gebruikte antigenen, de duur van de blootstelling aan antigeen en de T-celspecificiteit van de geteste modellen (zie tabel 1). De beschreven methode voor immunomodulatie is gericht op ziekten waarbij antigeenspecifieke T-lymfocyten betrokken zijn. De doeltreffendheid van deze methode werd beoordeeld door daarbij gebruik te maken van een compatibel door de EG toegepast antigeen. De compatibiliteit van het antigeen is cruciaal om ervoor te zorgen dat het effectief interageert met de T-lymfocyten die betrokken zijn bij het ziekteproces. Het aanbrengen van een eiwit- of peptidepleister op een intacte huid vergemakkelijkt de penetratie van antigeen door de opperhuid19,20. Deze verhoogde antigeenpenetratie wordt toegeschreven aan verhoogde transpiratie onder het verband. Veranderingen in de epidermale permeabiliteit treden op binnen 4-10 uur na het aanbrengen van de pleister, terwijl EC-geïnduceerde immunomodulatie tot twee weken effectief kan blijven 5,14.

Hoewel de EC-behandeling veel wordt gebruikt, kan het bestaan van vele variaties op deze methode vragen oproepen. De huidige inzichten suggereren dat de mate van epidermale schade voorafgaand aan toediening van antigeen de aard van de resulterende immuunrespons kan beïnvloeden21. Oppervlakkige epidermale beschadiging veroorzaakt de afgifte van ontstekingsremmende cytokines door Langerhans-cellen, wat de initiatie van de Th2-respons bevordert22. Daarentegen bevordert uitgebreidere epidermale beschadiging de afgifte van pro-inflammatoire cytokines en vergemakkelijkt het de afgifte van antigeen aan dermale dendritische cellen23. Het gepresenteerde protocol benadrukt (a) de erkenning van uitdagingen bij het toepassen van deze methode bij kleine en actieve dieren, met name muizen; (b) rekening houden met factoren zoals de huidconditie na het scheren van scheermessen, correct contact van stoffen met de huid, blootstellingstijd en hygiënische omstandigheden van de huid tijdens EC-behandeling die de effectiviteit van de behandeling kunnen bepalen. Het is van cruciaal belang om na te denken over de methode van huidontharing, fysisch of chemisch, voordat het antigeen wordt aangebracht, aangezien verschillende huidpreparaten de conditie van de huid op verschillende manieren kunnen beïnvloeden. Het wordt erkend dat al deze procedures de immuuncellen van de huid kunnen activeren, wat mogelijk kan leiden tot huidinfecties of de ziekteprogressie kan beïnvloeden. De mogelijke bijwerkingen op de huidaandoeningen na ontharing moeten een primaire overweging zijn bij het selecteren van de ontharingsmethode. De onderzoekers beschreven een methode van T-cel-gemedieerde immuunsuppressie geïnduceerd via de EC-toepassing van een antigeen op de geschoren dorsale huid, waarbij het effect ervan op verschillende muismodellen van immuunresponsen werd aangetoond. De EC-toepassing van het antigeen, samen met PAMP's, induceert antigeenspecifieke T-contrasuppressorcellen. Bovendien veroorzaakt de voorgestelde methode van EC-toepassing, met name bij herhaalde blootstelling aan antigenen of PAMP's, geen zorgwekkende bijwerkingen.

Het beschreven protocol onderstreept het belang van verschillende factoren om met deze methode tot betrouwbare en herhaalbare resultaten te komen, vooral bij kleine dieren zoals muizen. Het niet-invasieve karakter van deze benadering resulteert doorgaans in een lager risico op bijwerkingen (zoals pijn, infectie of littekens) in vergelijking met intradermale of injecteerbare immunisatietechnieken. Epicutane immunisatie is gebruiksvriendelijk en kan gemakkelijk worden toegediend in niet-klinische omgevingen, waardoor de toegankelijkheid en therapietrouw worden verbeterd in vergelijking met meer invasieve methoden.

Tabel 1: EC-geïnduceerde modulatie van de immuunrespons in verschillende muisziektemodellen. Afkortingen: ACD = allergische contactdermatitis; AD = atopische dermatitis; Ag = antigeen; CIA = door collageen geïnduceerde artritis; CHS = overgevoeligheid bij contact; CFA = volledig Freund's adjuvans; COLL II = collageen type II; DNFB = 2,4-dinitrofluorbenzeen; DNP-BSA = dinitrofenyl geconjugeerd aan runderserumalbumine; EAE = experimentele auto-immuun encefalomyelitis; EC = epicutaan; LPS = lipopolysacharide; OVA = ovoalbumine; PAMP = pathogeen-geassocieerd moleculair patroon; PC-BSA = pneumokokkenpolysacharide geconjugeerd aan runderserumalbumine; Th1 = T helper type 1 lymfocyt; Tc1 = T cytotoxische lymfocyt type 1; TNCB = 2,4,6-trinitrochloorbenzeen; TNP-Ig = 2,4,6-trinitrofenyl-geconjugeerde immunoglobulinen bij muizen; Ts = T-suppressorcellen; Tcs = T contrasuppressieve cellen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten die in dit artikel worden gepresenteerd, zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de1e en2e Lokale Ethische Commissie voor Dierproeven in Krakau, Polen. De procedures voldeden aan de lokale aanbevelingen, met name met betrekking tot de toediening van ketamine/xylazine of isofluraan als anesthetica, het scheren van de muizenhuid met scheermesjes, het aanbrengen van stoffen/haptenen op de geschoren huid en beide oorzijden, en het verzamelen van perifere immuunorganen. De studie gebruikte CBA/J (H-2k) mannelijke en vrouwelijke muizen, 6-12 weken oud, met een lichaamsgewicht variërend van 20-25 g. Details over de gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Huismuizen samen; Het is belangrijk om de negatieve effecten van isolatie op hun humeur te voorkomen. Gebruik voor statistische significantie 10-12 dieren per groep.

2. Voorbereiding van het operatiegebied

  1. Reinig de operatietafel voor en na alle procedures met een oplossing van 70% ethanol. Als het gebruik van muizen steriele omstandigheden vereist, voer dan alle handelingen uit in een bioveiligheidskast.

3. Inductie van suppressorcellen (Ts) voor Th1-gemedieerde CHS-reactie

OPMERKING: Deze procedure wordt weergegeven in figuur 1A.

  1. Op de dag "0" verdooft u de muizen met 30% isofluraan in propyleenglycol. Houd de muis in de linkerhand en laat de dorsale kant van zijn lichaam zien. Schuim met de rechterhand de grijze zeep in met veel water en breng het aan op de huid.
    1. Scheer met een steriel scheermesje voorzichtig een huidgebied van 2 cm². Vermijd beschadiging van de huid. Eventuele huidlaesies zullen de muizen diskwalificeren voor verdere procedures.
      LET OP: De grijze zeep is een natuurlijk en hypoallergeen product gemaakt van een zachte plantaardige basis. Het regenereert en hydrateert effectief de droge en gevoelige huid. Deze zeep bevat geen kunstmatige kleurstoffen, synthetische geurstoffen of ingrediënten van dierlijke oorsprong. De ingrediënten zijn onder meer natriumpalmaat, natriumpalmpitaat, aqua (water), glycerine, Taraxacum officinale (paardenbloem) bloem-/blad-/stengelextract, palmzuur, palmpitzuur, natriumchloride, propyleenglycol, tetranatrium-EDTA, etidroninezuur. De grijze zeep is ontworpen voor de gevoelige en tere huid die gevoelig is voor irritatie en psoriasis. Het reinigt de problematische huid effectief en voorkomt overmatige uitdroging en een trekkerig gevoel. Deze zeep verzacht ook irritaties, hydrateert en bevordert een snellere regeneratie van de huid. Belangrijk is dat het de beschermende barrière van de huid niet in gevaar brengt.
  2. Plaats de muizen in de kooi. Wacht na het scheren minimaal zes uur voordat u het antigeen aanbrengt, zodat de huid kan drogen en door het dier kan worden gereinigd.
  3. Bereid op dag "+1" een oplossing van 1 mg/ml antigeen-2,4,6-trinitrofenylgeconjugeerd muisimmunoglobuline (TNP-Ig) in de steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) van Dulbecco. Bereid het volume van een antigeen 1200 μL voor tien muizen. Meng de oplossingen vlak voor gebruik in een injectieflacon van 2 ml. Bescherm TNP-Ig tegen licht door de injectieflacon af te dekken met aluminiumfolie.
    OPMERKING: Voeg een CHS-controlegroep toe van muizen die alleen met het vehiculum zijn behandeld (DPBS) om niet-specifieke ontstekingsreacties te beoordelen die worden veroorzaakt door scheren en het aanbrengen van het oplosmiddel op de geschoren plek. Voor Ts-inductie moet een ander type antigeen worden gebruikt om hun antigeenspecificiteit te testen. Immunoglobulinen (Ig) bij muizen werden bereid uit sera bij muizen en geconjugeerd met TNP-hapteen (aanvullend bestand 1). Een enkel preparaat met een substitutieniveau van 40 TNP per Ig-molecuul (TNP40-Ig) werd gedurende 24,25 gebruikt.
  4. Verdoof muizen op dezelfde dag met 30% isofluraan in propyleenglycol. Breng het antigeen aan op de eerder geschoren plek door een gaasje van 1 cm2 gedrenkt in 100 μL van het antigeen te plaatsen (bereid in stap 3.3). Bedek dit met een dunne plastic pleister (2 cm²) en zet het vast met stoffen plakband. Pas in de CHS-controlegroep alleen DPBS toe.
    OPMERKING: 30 μm transparante documenthoezen kunnen worden gebruikt voor de plastic patch. Het textiel plakband moet gemakkelijk te verwijderen en flexibel zijn, zich aanpassen aan lichaamsvormen en lucht- en waterdampdoorlaatbaarheid mogelijk maken.
  5. Verdoof de muizen op de dag "+5" met 30% isofluraan in propyleenglycol. Knip de pleister voorzichtig af met een veiligheidsschaar met afgeronde hoeken en verwijder vervolgens voorzichtig het plakband. Laat de muizen vrij bewegen en reinig hun huid op natuurlijke wijze gedurende minstens 4 uur. Scheer indien nodig teruggegroeid haar op de plaats van het aanbrengen van het antigeen, hoewel dit meestal niet nodig is.
    OPMERKING: Knip het plakband alleen af op het gebied waar het antigeen wordt toegediend (gaas en plastic gebied), waar het alleen stevig hecht aan de randen van het verband. Wacht minimaal 4 uur voordat u het antigeen aanbrengt, zodat de huid kan drogen en door het dier kan worden gereinigd.
  6. Herhaal op de dag '+5' stap 3.3 en stap 3.4.
  7. Herhaal stap 3.5 op de dag '+8'. Dit markeert de voltooiing van een week durende blootstelling van de huid aan het antigeen. Gebruik de muizen na deze periode om de onderdrukking van de CHS-reactie-in vivo actieve modellen te testen (stap 6) of euthanaseer ze om te dienen als donor van Ts-cellen bij "adoptieve overdracht IN" (stap 8) of bij "adoptieve overdracht UIT" (stap 9).

4. Inductie van contrasuppressieve T-cellen (Tcs) voor Th1-gemedieerde CHS-reactie

OPMERKING: Deze procedure wordt weergegeven in afbeelding 1B.

  1. Op de dag "0" voert u de stappen 3.1-3.2 uit.
  2. Bereid op de dag "+1" een mengsel van 100 μg antigeen TNP-Ig en 100 μg LPS (voorbeeld van PAMP) in 100 μL DPBS. Bereid de oplossing onmiddellijk voor gebruik in een injectieflacon van 2 ml en bescherm deze tegen licht door de injectieflacon in aluminiumfolie te wikkelen als het antigeen lichtgevoelig is.
    OPMERKING: Om contrasuppressie (omkering van door de huid geïnduceerde onderdrukking) te evalueren, moet een controle voor onderdrukking (Ts-controlegroep) worden opgenomen, waarbij muizen alleen worden behandeld met het antigeen TNP-Ig. Bovendien moeten muizen die uitsluitend worden behandeld met DPBS (CHS-controle) en alleen LPS (PAMP-controle) worden opgenomen om de mate van niet-specifieke modulatie van immuunresponsen te bepalen. LPS is een voorbeeld van een immuunstimulerend deeltje26. De specifieke kenmerken van een immuunstimulator zijn afhankelijk van het gebruikte muismodel, de soorten immuuncellen die betrokken zijn bij de onderzochte immuunrespons en de farmacokinetiek van de onderzochte stoffen.
  3. Verdoof muizen op dezelfde dag met 30% isofluraan in propyleenglycol. Plaats een gaasje van 1 cm2 op de vorige geschoren huid, verzadigd met een oplossing die 100 μl van het mengsel bevat (bereid in stap 4.2). Zet het gaas vast met een dunne plastic pleister (2 cm²) en bevestig het op zijn plaats met textielpleister. Pas in de controlegroepen DPBS (CHS-regeling) of LPS (PAMP-regeling) of alleen TNP-Ig (TS-controlegroep) toe.
    OPMERKING: 30 μm transparante documenthoezen kunnen worden gebruikt voor de plastic patch. Het textiel plakband moet gemakkelijk te verwijderen en flexibel zijn, zich aanpassen aan lichaamsvormen en lucht- en waterdampdoorlaatbaarheid mogelijk maken.
  4. Voer op de dag '+5' stap 3.5 uit.
  5. Herhaal op de dag "+5" de stappen 4.2-4.3.
  6. Herhaal stap 3.5 op de dag '+8'. Een week van blootstelling van de huid aan het antigeen gemengd met LPS is voltooid. Na deze periode testen muizen in CHS-reactie - in vivo actieve modellen (stap 6), of euthanaseren om te dienen als donoren van Tcs-cellen in "adoptieve overdracht OUT" (stap 10).

5. Inductie van T-effectorcellen (Teff) voor Th1-gemedieerde CHS-reactie (sensibilisatiefase van CHS)

  1. Scheer op dag "0" de borst en buik van de muizen (2 × 2 cm) met grijze zeep met water, gevolgd door een scheermesje. Laat de huid 6 uur rusten voordat u het hapteen aanbrengt om irritatie te voorkomen.
  2. Bereid op dezelfde dag, net voor gebruik, de hapteenoplossing (5%) in een glazen injectieflacon en dek deze af met aluminiumfolie om deze tegen licht te beschermen: 2,4,6-trinitrochloorbenzeen (TNCB) in een aceton-ethanolmengsel (verhouding 1:3).
  3. Sensibiliseer de muizen op dezelfde dag door 150 μL hapteen aan te brengen op de eerder geschoren plek. Breng alleen het vehiculum (aceton-ethanolmengsel) aan in de negatieve controlegroep om de niet-specifieke ontstekingsreactie te beoordelen. Voordat u het dier terugbrengt naar de kooi, wacht u 30 seconden om de huid te laten drogen.
    LET OP: Gebruik handschoenen; TNCB veroorzaakt bij de meeste mensen ernstige allergische reacties.

6. Actief model: Testen van Ts- of Tcs-cellen in Th1-gemedieerde CHS

OPMERKING: Deze procedure wordt weergegeven in afbeelding 2.

  1. Induceer de Ts- of Tcs-cel door stap 3 en stap 4 te volgen. Deze procedure duurt van dag "0" tot dag "+8".
  2. Begin op de dag "+8" met het induceren van Teff-cellen door stap 5 te volgen.
  3. Evalueer vier dagen later de CHS-respons door de elicitatiefase (challenge) uit te voeren. Kortom, breng TNCB aan op beide zijden van de oren. Kwantificeer vervolgens de dikte van de oren door ze te meten met een micrometer. Een gedetailleerde beschrijving van deze test en andere mogelijke eindpunten wordt elders gerapporteerd (Zemelka-Wiacek M. et al.27).

7. Isolatie van Teff-, Ts- of Tcs-cellen uit donormuizen

  1. Steriliseer de operatietafel zowel voor als na elke procedure met een oplossing van 70% ethanol. Voer alle procedures uit in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden en gebruik gesteriliseerde instrumenten. Om Ts-, Tcs- en Teff-cellen op de dag "+8" te isoleren, gebruikt u EC-geïmmuniseerde muizen die respectievelijk in stap 3, 4 en 5 worden beschreven.
    OPMERKING: Houd u aan een donor-tot-ontvanger-verhouding van 1:1.
  2. Verdoof donoren met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg). Zorg ervoor dat de muis gedurende ten minste 5 minuten volledig verdoofd is.
  3. Desinfecteer de hele buikstreek van de verdoofde muis met 70% ethanol en snijd vervolgens de buiklaag (3-4 cm) in om de buikholte bloot te leggen. Isoleer de hulp- en lieslymfeklieren (ALN's) en de milt (SPL) met de steriele tang in buisjes gevuld met steriel DPBS dat wordt aangevuld met 1% foetaal runderserum (FBS). Verzamel de ALN's van alle donoren in de ene injectieflacon en SPL's in de andere en bewaar de injectieflacons op ijs. Elke oksel bevat twee oksellymfeklieren, terwijl een enkele lieslymfeklier zich in het heupgebied bevindt, grenzend aan drie bloedvaten. SPL's bevinden zich aan de linkerkant van het lichaam, achter de darm en maag.
    NOTITIE: Werk met steriel gereedschap onder de bioveiligheidskast om steriele omstandigheden te behouden. Na deze procedure moeten muizen worden geëuthanaseerd volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
    1. Pureer weefsel tussen de matte uiteinden van twee microscoopglaasjes. Zeef de celsuspensie door een celzeef met een poriegrootte van 70 μm.
  4. Spoel de cellen met 30 ml DPBS aangevuld met 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de celpellet opnieuw in 1-5 ml DPBS.
  5. Tel de levensvatbaarheid van de cel met behulp van een hemocytometer en Trypan Blue. Meng 10 μL celsuspensie met 90-990 μL Trypan Blue en pas het volume aan op basis van het aantal cellen. Neem deze verdunningsfactor mee in de haalbaarheidsberekening.
  6. Bereid een mengsel van ALN's en SPL's (verhouding 1:1). Houd je aan het aantal cellen: gebruik 1 tot 5 x 107 Ts of Tcs cellen per ontvanger in 1 ml DPBS aangevuld met 1% FBS en 7 x 107 Teff cellen/ontvanger in 1 ml DPBS. Houd de donor-ontvangerverhouding voor alle celpopulaties 1:1 en ook de donor-DPBS-verhouding 1:1. Bewaar de flesjes met cellen op het ijs.
    OPMERKING: De uitvoering van verdere in vitro experimenten vereist een evenredige toename van het aantal celdonoren.
    OPMERKING: Bovendien kunnen geïsoleerde Teff-, Ts- en Tcs-cellen aanvullende zuivering of analyses ondergaan met behulp van flowcytometrie, zoals fenotypering of beoordeling van cytokinesecretie. Het is ook mogelijk om celculturen te initiëren om de celproliferatiecapaciteit te onderzoeken of cytokineniveaus in kweeksupernatanten te kwantificeren. Het uitvoeren van verdere experimenten vereist een evenredige toename van het aantal celdonoren.

8. Adoptieve overdracht IN: Testen van Ts in Th1-gemedieerde CHS

OPMERKING: Deze procedure wordt weergegeven in afbeelding 3. Werk steriel en gebruik zowel voor als na elke procedure een 70% ethanoloplossing. Zorg ervoor dat alle celbewerkingen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden en gebruik gesteriliseerde instrumenten.

  1. Induceer en isoleer T-cellen (donoren) door stap 3 en stap 7 te volgen. Spoel de cellen af met 30 ml DPBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de celpellet opnieuw in 200 μL DPBS per recipiënt (donor-ontvanger verhouding 1:1).
  2. Ontvangers (naïeve syngene muizen): verdoving ontvangers met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg). Zorg ervoor dat de muis gedurende ten minste 5 minuten volledig verdoofd is.
  3. Dien een intraveneuze (i.v.) injectie toe van een bereid mengsel van 1-5 x 107 Ts-cellen (stap 8.2) in 200 μL in de verdoofde ontvanger.
  4. Induceer op dezelfde dag een Th1-gemedieerde CHS-reactie. Kortom, induceer Teff-cel (sensibilisatiefase) beschreven in de stappen 5.1-5.3). Evalueer vier dagen later de CHS-respons door de elicitatiefase (challenge) uit te voeren die wordt beschreven in stap 6.3.

9. Adoptieve overdracht OUT: Testen van Ts in Th1-gemedieerde CHS

  1. Induceer en isoleer T- en Teff-cellen (donoren) door de stappen 3, 5 en 7 te volgen. Bewaar de geïsoleerde Ts en Teff in twee afzonderlijke flesjes. Verdeel de Teff-cellen in twee flesjes: één voor de "Ts-testgroep" en één voor de "CHS-controle".
    OPMERKING: Werk steriel en gebruik zowel voor als na elke procedure een 70% ethanoloplossing. Zorg ervoor dat alle celbewerkingen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden en gebruik gesteriliseerde instrumenten. Neem een controlegroep op van ontvangers aan wie alleen Teff-cellen worden toegediend ("CHS-controle"). Voor deze groep moeten extra donateurs worden ingezet om de donor-ontvanger ratio van 1:1 aan te houden. Om de kwaliteit van de resultaten te verbeteren, moeten ontvangers die controlecellen ontvangen die zijn overgebracht van donors die met een EC-behandeling zijn behandeld, worden toegevoegd. De beslissing om een extra groep ontvangers en donoren toe te voegen moet zorgvuldig worden gepland, omdat voor deze aanpak veel muizen nodig zijn, wat niet voldoet aan het 3V-principe (Reduce, Refine, Replace).
  2. Voeg Ts-cellen toe aan Teff-cellen voor de "Ts-testgroep". Voeg voldoende DPBS toe aan de Teff-cellen in de injectieflacon "CHS-controle".
    OPMERKING: Bewaar het aantal 1-5 x 107 Ts-cellen en 7 x 107 Teff-cellen per ontvanger.
  3. Meng alle injectieflacons voorzichtig. Bewaar de injectieflacons 30 minuten in het waterbad (37 °C) en meng voorzichtig om de 5 minuten.
  4. Spoel elke injectieflacon met cellen met 30 ml DPBS aangevuld met 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovenstaande en suspendeer de celpellet in 200 μl DPBS/recipiënt.
  5. Laat elke celsuspensie door een poriëncelzeef van 70 μm lopen. Pas indien nodig het volume van 200 μL DPBS/ontvanger aan.
  6. Ontvangers (naïeve syngene muizen): verdoving ontvangers met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg). Zorg ervoor dat de muis gedurende ten minste 5 minuten volledig verdoofd is.
  7. Dien een intraveneuze (i.v.) injectie van geprepareerde cellen toe.
  8. Induceer op dezelfde dag de elicitatiefase van CHS (provocatie) zoals beschreven in stap 6.3. Neem "negatieve controle" op, waarbij alleen de CHS-uitdaging wordt uitgevoerd.

10. Adoptieve overdracht OUT: Testen van Tcs in Th1-gemedieerde CHS

  1. Induceer en isoleer Ts-, Tcs- en Teff-cellen (donoren) door stap 3-5 en stap 7 te volgen.
    OPMERKING: Werk steriel en gebruik zowel voor als na elke procedure een 70% ethanoloplossing. Zorg ervoor dat alle celbewerkingen worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast om de steriliteit te behouden en gebruik gesteriliseerde instrumenten. Neem twee controlegroepen van ontvangers op: een "CHS-controle" waarin alleen Teff-cellen worden toegediend en een "Ts-controle" waarin Teff-cellen uitsluitend met Ts-cellen worden geïncubeerd. Gebruik voor deze groepen extra donateurs om de donor-ontvangerverhouding van 1:1 aan te houden.
  2. Bewaar de geïsoleerde Ts- en Tcs-cellen in aparte flesjes. Verdeel de Teff-cellen in drie flesjes: één voor de "Tcs-testgroep", één voor de "Ts-controle" en één voor de "CHS-controle".
  3. Eerste incubatie: Voor de (a) "Tcs-testgroep" voeg je Tcs-cellen toe aan Teff-cellen. Voeg voor de (b) "Ts-controle" en (c) "CHS-controle" een voldoende hoeveelheid DPBS toe aan Teff-cellen (zie tabel 2).
    OPMERKING: Bewaar het aantal 1-5 x 107 Tcs-cellen en 7 x 107 Teff-cellen per ontvanger.
  4. Meng alle injectieflacons voorzichtig. Houd 30 minuten in het waterbad (37 °C) en meng voorzichtig om de 5 minuten.
  5. Spoel elke injectieflacon met cellen met 30 ml DPBS aangevuld met 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovenstaande en suspendeer de celpellet in 1 ml DPBS aangevuld met 1% FBS per ontvanger. Houd een celmengsel-DPBS-verhouding van 1:1 aan.
  6. Tweede incubatie: Voor de (a) "Tcs-testgroep" voeg je Ts-cellen toe aan het mengsel van voorgeïncubeerde Teff- en Tcs-cellen. Voor de (b) "Ts-controle" voegt u Ts-cellen toe aan het mengsel van voorgeïncubeerde Teff-cellen met DPBS. Voeg voor de (c) "CHS-controle" voldoende DPBS toe aan de voorgeïncubeerde Teff-cellen.
    OPMERKING: Bewaar het aantal 1-5 x 107 Ts-cellen per ontvanger. Voer incubaties uit in alle experimentele groepen (a, b en c) om uniformiteit in celverlies tijdens de was- en centrifugatieprocedures te garanderen.
  7. Meng alle injectieflacons voorzichtig. Houd 30 minuten in het waterbad (37 °C) en meng voorzichtig om de 5 minuten.
  8. Spoel elke injectieflacon met cellen met 30 ml DPBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Decanteer het bovenstaande en suspendeer de celpellet in 200 μl DPBS/recipiënt.
  9. Laat elke celsuspensie door een poriëncelzeef van 70 μm lopen. Pas indien nodig het volume van 200 μL DPBS/ontvanger aan.
  10. Ontvangers (naïeve syngene muizen): verdoving ontvangers met een intraperitoneale (i.p.) injectie van een mengsel van ketamine (90-120 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg). Zorg ervoor dat de muis gedurende ten minste 5 minuten volledig verdoofd is.
  11. Dien een intraveneuze (i.v.) injectie van geprepareerde cellen toe.
  12. Induceer op dezelfde dag de elicitatiefase van CHS (provocatie) zoals beschreven in stap 6.3. Neem "negatieve controle" op, waarbij alleen de CHS-uitdaging wordt uitgevoerd.

Tabel 2: Schema van celincubaties tijdens Tcs "transfer OUT". Klik hier om deze tabel te downloaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze studie onderzoekt of antigenen die alleen via de huid of in combinatie met PAMP worden aangebracht, respectievelijk T- of Tcs-cellen kunnen induceren, die de CHS-reactie moduleren. De immunisatie van CBA/J-muizen via EC met 100 μg TNP-Ig of TNP-Ig plus 100 μg LPS induceert respectievelijk Ts- of Tcs-cellen. De muizen werden vervolgens gesensibiliseerd met 5% TNCB en 4 dagen later uitgedaagd met hetzelfde hapteen. De reactie werd geëvalueerd door de zwelling van het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De onderzoeken werden uitgevoerd op veel verschillende diermodellen en met behulp van vele muizenstammen zoals BALB/c, C57BL/6, HLADR4-Tg, DBA 1 en B10.PL en SJL tonen aan dat EC-immunisatie met een toegewezen antigeen kan dienen als een veelzijdig en potentieel grenzeloos middel om tolerantie te creëren en ongewenste immuunresponsen te beheersen. Het huidige protocol schetst twee celoverdrachtsmodellen: (1) 'adoptieve overdracht IN', die nuttig is voor het beoordelen van immunomodulatie...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Poolse Comité voor Wetenschappelijke Onderzoeksbeurzen 3 PO5B 091 25, 2PO5A 204 29 en van het National Science Center N N401 3554 33 aan MS. De grafieken zijn getekend met behulp van GraphPad Prism-software 10.2.3 en de figuren 1-3 zijn gemaakt in BioRender. Zemelka-Wiacek, M. (2025): (1) https://BioRender.com/3ux2px ; (2) https://BioRender.com/s0y8zs7 ; (3) https://BioRender.com/0qziglw. De auteurs bedanken Dorota Woźniak voor het verzorgen van de muizenkolonies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,4,6-trinitrochlorobenzeen (TNCB)Tokyo Chemical Industry CO., LTD, JapanC0307
2,4,6-trinitrofenyl-geconjugeerd muis immunoglobuline (TNP-Ig)Leraar Biomedical Sciences, Faculteit Gezondheidswetenschappen, Jagiellonian University Medical College, Krakau, Polen
aceton (ACS reagens, ≥99,5%)Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland179124
aluminiumfolieMerck KGaA, Darmstadt, DuitslandZ185140  
analytische balans Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, DuitslandPRACTUM224-1s, 29105177
runderserumalbumine (BSA)Merck KGaA, Darmstadt, DuitslandA9418
CBA/J (H-2k) Fokkerij van de leerstoel Biomedical Sciences, Faculteit Gezondheidswetenschappen, Jagiellonian University Medical College, Krakau, Polen
celzeef, poriëngrootte 70 μmBIOLOGIX, China15-1070
wegwerppipetten capaciteit: 5 mL, 10 mL, 25 mLMerck KGaA, Darmstadt, DuitslandZ740301, Z740302, Z740303
Dulbecco′s fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, VS14190144
eppendorf Safe-Lock Tubes 1,5mlEppenforf, Duitsland30120086
eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mlEppenforf, Duitsland30120094
ethanol 100% (absoluut alcohol)Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland1.07017
ethanol 96%Merck KGaA, Darmstadt, Duitsland1.59010
foetaal runderserum (FBS)ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, VSA3160802
glas microscoopglaasjes (geblazen enkelzijdig mat)ThermoScientific, Portsmouth, NH, VS421-004T
Graph Pad PrismGraphPad Software Inc.v. 10.2.3
grijs zeep (Bialy jelen zeep)Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o., Sp. K., Polen163057
hemocytometerVWR, Avantor, U.S.A612-5719
incubator Heracell 150iThermo Electron  LED Gmbh, Duitsland41071068
isofluraan (Aerrane)Baxter, Deerfield, IL, VS8AGG9623
ketamine 100 mg/ mL, oplossing voor injectieBiowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polencat.# niet beschikbaar
laboratoriumcentrifuge (Heraeus Fresco 21)Thermo Scientific, Duitsland75002425
laboratoriumcentrifuge (Heraeus Megafuge 1.0R) Thermo Scientific, DuitslandB00013899
lipopolysacharide (LPS)Merck KGaA, Darmstadt, DuitslandL-8274
masker (FFP2)VWR, Radnor, Pennsylvania, Verenigde Staten111-0917
micrometerMitutoyo, Tokyo, Japan193-111
microscoop met objectievenLeica Microsystems CMS GmbH, DuitslandDM1000, 294011-082007
propyleenglycol Chempur, Piekary figure-materials-1 Polen114489005
scheermesjeVWR, Radnor, Pennsylvania, Verenigde StatenPERS94-0462
transparante documentenhoezen 30 µmSCHEMAT5906961126542
trypaanblauwMerck KGaA, Darmstadt, DuitslandT8154
buizen 15 mL sterieleMerck KGaA, Darmstadt, DuitslandCLS430055 (Corninig)
buizen 50 mL, sterieleMerck KGaA, Darmstadt, DuitslandCLS430290 (Corning)
flesjes, schroefdop, helder glas (flesje alleen) 22 mLMerck KGaA, Darmstadt, Duitsland27173
Viscoplast Polovis, zijdekleefstof, 5x0.0125m3M Poland, Nadarzyn, Polen7100231620
waterbad AJL Electronic, PolenLW102
xylazine (xylapan 20 mg/ mL) oplossing voor injectieVetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polencat.# niet beschikbaar

Referenties

  1. Szczepanik, M., Majewska-Szczepanik, M. Transdermal immunotherapy: Past, present and future. Pharmacol Rep. 68 (4), 773-781 (2016).
  2. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with hapten-conjugated protein antigen alleviates contact sensitivity mediated by three different types of effector cells. Pharmacol Rep. 64 (4), 919-926 (2012).
  3. Majewska, M., et al. Role of TLR ligands in epicutaneously induced contrasuppression. Pharmacol Rep. 61 (3), 539-549 (2009).
  4. Ptak, W., et al. Toll-like receptor ligands reverse suppression of contact hypersensitivity reactions induced by epicutaneous immunization with protein antigen. Int Arch Allergy Immunol. 139 (3), 188-200 (2006).
  5. Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization induces alphabeta T-cell receptor CD4 CD8 double-positive non-specific suppressor T cells that inhibit contact sensitivity via transforming growth factor-beta. Immunology. 115 (1), 42-54 (2005).
  6. Majewska-Szczepanik, M., Zemelka-Wiącek, M., Ptak, W., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with DNP-BSA induces CD4+ CD25+ Treg cells that inhibit Tc1-mediated CS. Immunol Cell Biol. 90 (8), 784-795 (2012).
  7. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Ptak, W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen induces antigen-non-specific suppression of CD8 T cell mediated contact sensitivity. Pharmacol Rep. 64 (6), 1485-1496 (2012).
  8. Marcińska, K., Majewska-Szczepanik, M., Maresz, K. Z., Szczepanik, M. Epicutaneous Immunization with Collagen Induces TCRαβ Suppressor T Cells That Inhibit Collagen-Induced Arthritis. Int Arch Allergy Immunol. 166 (2), 121-134 (2015).
  9. Marcińska, K., et al. Epicutaneous (EC) immunization with type II collagen (COLL II) induces CD4(+) CD8(+) T suppressor cells that protect from collagen-induced arthritis (CIA). Pharmacol Rep. 68 (2), 483-489 (2016).
  10. Majewska, M., et al. Epicutaneous immunization with myelin basic protein protects from the experimental autoimmune encephalomyelitis. Pharmacol Rep. 59 (1), 74-149 (2007).
  11. Tutaj, M., Szczepanik, M. Epicutaneous (EC) immunization with myelin basic protein (MBP) induces TCRalphabeta+ CD4+ CD8+ double positive suppressor cells that protect from experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J Autoimmun. 28 (4), 208-215 (2007).
  12. Majewska-Szczepanik, M., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig alleviates TNBS-induced colitis in mice. Pharmacol Rep. 64 (6), 1497-1504 (2012).
  13. Majewska, M., et al. TCRalphabeta + CD8+ and TCRgammadelta+ lymphocytes inhibit the capability of peritoneal macrophages to induce contact hypersensitivity. Folia Biol (Krakow). 57 (1-2), 23-27 (2009).
  14. Ptak, W., et al. Epicutaneous immunization with protein antigen in the presence of TLR4 ligand induces TCR alpha beta+CD4+ T contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression of Th1-mediated contact sensitivity. J Immunol. 182 (2), 837-850 (2009).
  15. Majewska-Szczepanik, M., Strzepa, A., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig and Zymosan induces TCRαβ+ CD4+ contrasuppressor cells that reverse skin-induced suppression via IL-17A. Int Arch Allergy Immunol. 164 (2), 122-136 (2014).
  16. Majewska-Szczepanik, M., Dorożyńska, I., Strzępa, A., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with protein antigen TNP-Ig and NOD2 ligand muramyl dipeptide (MDP) reverses skin-induced suppression of contact hypersensitivity. Pharm Rep. 66 (1), 137-142 (2014).
  17. Majewska-Szczepanik, M., Askenase, P. W., Lobo, F. M., Marcińska, K., Wen, L., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with ovalbumin and CpG induces TH1/TH17 cytokines, which regulate IgE and IgG2a production. J Allergy Clin Immunol. 138 (1), 262-273 (2016).
  18. Majewska-Szczepanik, M., Yamamoto, N., Askenase, P. W., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with phosphorylcholine conjugated to bovine serum albumin (PC-BSA) and TLR9 ligand CpG alleviates pneumococcal pneumonia in mice. Pharmacol Rep. 66 (4), 570-575 (2014).
  19. Tan, G., et al. Hydration effects on skin microstructure as probed by high-resolution cryo-scanning electron microscopy and mechanistic implications to enhanced transcutaneous delivery of biomacromolecules. J Pharm Sci. 99 (2), 730-740 (2010).
  20. Mondoulet, L., et al. Epicutaneous immunotherapy on intact skin using a new delivery system in a murine model of allergy. Clin Exp Allergy. 40 (4), 659-667 (2010).
  21. Strid, J., Hourihane, J., Kimber, I., Callard, R., Strobel, S. Disruption of the stratum corneum allows potent epicutaneous immunization with protein antigens resulting in a dominant systemic Th2 response. Eur J Immunol. 34 (8), 2100-2109 (2004).
  22. Callard, R. E., Harper, J. I. The skin barrier, atopic dermatitis and allergy: a role for Langerhans cells. TRENDS Immunol. 28 (7), 294-298 (2007).
  23. Eidsmo, L., Martini, E. Human Langerhans Cells with Pro-inflammatory Features Relocate within Psoriasis Lesions. Front Immunol. 22 (9), 300(2018).
  24. McKinney, M. M., Parkinson, A. A simple, non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid. J Immunol Methods. 96 (2), 271-278 (1987).
  25. Methods in Immunology and Immunochemistry by: Curtis A Williams Merrill W. Chase vol. 2 Physical and chemical methods. , Academic Press. Now York. 359(1968).
  26. Wang, G., Wang, Y., Ma, F. Exploiting bacterial-origin immunostimulants for improved vaccination and immunotherapy: current insights and future directions. Cell Biosci. 14 (1), 24(2024).
  27. Zemelka-Wiacek, M., Majewska-Szczepanik, M., Gajdanowicz, P., Szczepanik, M. Contact Hypersensitivity as a murine model of allergic contact dermatitis. J Vis Exp. 26 (187), e64329(2022).
  28. Thomas, W. R., Watkins, M. C., Asherson, G. L. Differences in the ability of T cells to suppress the induction and expression of contact sensitivity. Immunology. 42 (1), 53-59 (1981).
  29. Walczak, A., Siger, M., Ciach, A., Szczepanik, M., Selmaj, K. Transdermal application of myelin peptides in multiple sclerosis treatment. JAMA Neurol. 70 (9), 1105-1109 (2013).
  30. Juryńczyk, M., et al. Immune regulation of multiple sclerosis by transdermally applied myelin peptides. Ann Neurol. 68 (5), 593-601 (2010).
  31. Beaujean, M., et al. The immunological effects of intradermal particle-based vaccine delivery using a novel microinjection needle studied in a human skin explant model. Vaccine. 41 (13), 2270-2279 (2023).
  32. Prins, M. L. M., Prins, C., de Vries, J. J. C., Visser, L. G., Roukens, A. H. E. Establishing immunogenicity and safety of needle-free intradermal delivery by nanoporous ceramic skin patch of mRNA SARS-CoV-2 vaccine as a revaccination strategy in healthy volunteers. Virus Res. 334, 199175(2023).
  33. Brough, H. A., et al. Epicutaneous sensitization in the development of food allergy: What is the evidence and how can this be prevented. Allergy. 75 (9), 2185-2205 (2020).
  34. Paris, J. L., Vora, L. K., Torres, M. J., Mayorga, C., Donnelly, R. F. Microneedle array patches for allergen-specific immunotherapy. Drug Discov Today. 28 (5), 103556(2023).
  35. Bartnikas, L. M., et al. Epicutaneous sensitization results in IgE-dependent intestinal mast cell expansion and food-induced anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 451-460 (2013).
  36. Leyva-Castillo, J. M., et al. Mechanical skin injury promotes food anaphylaxis by driving intestinal mast cell expansion. Immunity. 50 (5), 1262-1275 (2019).
  37. Amberg, N., Holcman, M., Stulnig, G., Glitzner, E., Sibilia, M. Effects of depilation methods on imiquimod-induced skin inflammation in mice. J Invest Dermatol. 137 (2), 528-531 (2017).
  38. He, X., Jia, L., Zhang, X. The effect of different preoperative depilation ways on the healing of wounded skin in mice. MDPI Animals. 12 (5), 581(2022).
  39. Liu, I. -L., Wang, L. -F. Epicutaneous sensitization with protein antigen. Dermatol Sinica. 30, 154-159 (2012).
  40. Zemelka-Wiącek, M., Majewska-Szczepanik, M., Pyrczak, W., Szczepanik, M. Complementary methods for contact hypersensitivity (CHS) evaluation in mice. J Immunol Methods. 387 (1-2), 270-275 (2013).
  41. Majewska-Szczepanik, M., et al. Obesity aggravates contact hypersensitivity reaction in mice. Contact Dermatitis. 87 (1), 28-39 (2022).
  42. SanMiguel, A. J., Meisel, J. S., Horwinski, J., Zheng, Q., Grice, E. A. Topical antimicrobial treatments can elicit shifts to resident skin bacterial communities and reduce colonization by Staphylococcus aureus competitors. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), e00774-e00817 (2017).
  43. Strzępa, A., Majewska-Szczepanik, M., Lobo, F. M., Wen, L., Szczepanik, M. Broad spectrum antibiotic enrofloxacin modulates contact sensitivity through gut microbiota in a murine model. JACI. 140 (1), 121-133.e3 (2017).
  44. Meisel, J. S., et al. Commensal microbiota modulate gene expression in the skin. Microbiome. 6 (1), 20(2018).
  45. Arildsen, A. W., Zachariassen, L. F., Krych, L., Hansen, A. K., Hansen, C. H. F. Delayed gut colonization shapes future allergic responses in a murine model of atopic dermatitis. Front Immunol. 12, 650621(2021).
  46. Griffin, M. F., desJardins-Park, H. E., Mascharak, S., Borrelli, M. R., Longaker, M. T. Understanding the impact of fibroblast heterogeneity on skin fibrosis. Disease Models & Mechanisms. 13 (6), dmm044164(2020).
  47. Majewska-Szczepanik, M., Strzępa, A., Marcińska, K., Szczepanik, M. Epicutaneous immunization with TNP-Ig antigen induces CD11c+IL-10+ dendritic cells that promote suppression of Th1-mediated contact hypersensitivity in humanized HLA-DR4 transgenic mice. Int Immunopharmacol. 119, 110281(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Epicutane immunisatieimmunomodulatieprotocolcontacthypersensitiviteitT-suppressorcellenT-effectorcellenadoptieve transferhuidimmuniteitallergische contactdermatitispathogeen-geassocieerde moleculaire patronen
Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.