Methodenartikel

High-throughput geautomatiseerde multiplex immunofluorescentietesten voor translationeel onderzoek

DOI:

10.3791/67584

⸱

10 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Ultivue, Inc.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport beschrijft een geautomatiseerd protocol voor multiplex immunofluorescentie (mIF)-assays op een geautomatiseerde objectglaaskleuring. Het demonstreert de hoge reproduceerbaarheid van ruimtelijke proteomics op standaard high-throughput weefselautostainers en fluorescentiebeeldvormers met hele objectglaasjes, wat ideaal is voor aangepaste mIF-assays op een groot aantal weefselglaasjes in translationeel onderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiplex-immunofluorescentie (mIF) is een geavanceerde techniek die gedetailleerde, ruimtelijk opgeloste analyse van weefselmonsters mogelijk maakt door meerdere eiwitbiomarkers binnen een enkele sectie te visualiseren. De meeste mIF-technologieën hebben echter te maken met aanzienlijke compromissen tussen gevoeligheid en doorvoer bij multiplexing, wat een kritieke beperking vormt voor het robuust detecteren van biomarkers met een lage abundantie in meerdere weefselsecties. Een nieuwe benadering voor mIF maakt gebruik van unieke DNA-barcodes die zijn gekoppeld aan antilichamen, die worden geamplificeerd via een parallel amplificatiemechanisme met één molecuul. Deze methode bereikt een kleuringskwaliteit die sterk vergelijkbaar is met immunohistochemie van klinische kwaliteit (IHC), terwijl ze hoge multiplexingmogelijkheden en beeldvorming met een hoge doorvoer van hele objectglaasjes biedt. Deze test omvat het amplificeren van een cocktail van DNA-gecodeerde antilichamen op het weefsel, gevolgd door opeenvolgende detectierondes om vier fluorescerend gelabelde oligonucleotiden per cyclus te visualiseren. Dit proces maakt het dus mogelijk om acht of meer biomarkers per weefselmonster te detecteren. De belangrijkste stappen in deze methode zijn onder meer geautomatiseerde weefselpreparatie, toepassing van primaire antilichamen geconjugeerd met DNA-barcodes, signaalversterking en iteratieve cycli van detectie, beeldvorming en signaalverwijdering. Beeldacquisitie wordt gevolgd door beeldregistratie en analyse van één cel met behulp van een AI-verbeterd datawetenschapsplatform voor ruimtelijke beelden. Voor deze studie werd het protocol toegepast op formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) multi-weefsel micro-arrays (TMA's), waaronder amandel-, melanoom-, colon- en lymfeklierkernen in drievoud. Geavanceerde mIF-technologieën bieden meer inzicht in de tumorrespons, de micro-omgeving van de tumor en het immuunlandschap. Door de inherente afwegingen tussen gevoeligheid, multiplexingmogelijkheden en beeldvormingsdoorvoer te overwinnen, kunnen onderzoekers nu proberen de heterogeniteit van uitdagende moleculaire handtekeningen en biomarkers van therapeutische responsen te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Highly multiplexed immunofluorescentie (mIF) is een geavanceerde techniek die een revolutie teweegbrengt op het gebied van weefselanalyse door de gelijktijdige visualisatie van meerdere eiwitbiomarkers binnen een enkele weefselsectiemogelijk te maken 1,2. Deze mogelijkheid biedt een ongeëvenaard niveau van detail en ruimtelijke resolutie, wat vaak cruciaal is voor het begrijpen van de interacties tussen celtypen met complexe morfologieën binnen de weefselmicro-omgeving op meerdere ruimtelijke schalen3. De techniek is vooral waardevol in oncologisch onderzoek, waar het kan worden gebruikt om tumorbiomarkers, eiwitgeneesmiddeldoelen, de lokale immuun- en checkpointstatus, de interacties tussen verschillende celtypen en zelfs de subcellulaire colokalisatiepatronen die verband houden met het geneesmiddelmetabolisme in het weefselte co-lokaliseren 4,5,6.

Ondanks het potentieel staan de meeste mIF-technologieën nog steeds voor aanzienlijke uitdagingen, met name bij het balanceren van gevoeligheid en doorvoer met multiplexingmogelijkheden. Deze beperking is vooral van cruciaal belang voor de detectie van klinische biomarkers die een zeer lage expressie kunnen vertonen, zoals HER2 en PD-L1 7,8,9. Om te zien waarom dit zo is, is het essentieel om andere modaliteiten van mIF te begrijpen. Deze traditionele methoden hebben de weg vrijgemaakt voor meer geavanceerde mIF-platforms, maar ze hebben hun eigen voordelen en beperkingen.

Directe immunofluorescentie (DIF) maakt gebruik van antilichamen die direct zijn geconjugeerd aan fluoroforen, of aan een oligonucleotide dat in staat is fluoroforen te rekruteren10. Deze methode is eenvoudig te multiplexen, maar lijdt aan een lagere gevoeligheid en moeite met het oplossen van signalen van weefselachtergrond of kleuringsartefacten.

Indirecte immunofluorescentie (IIF) maakt gebruik van een secundair antilichaam dat zich bindt aan het primaire antilichaam. Dit heeft een verhoogd signaal in vergelijking met primaire DIF. In combinatie met verbeterde flowcelontwerpen kan sequentiële IIF tot 40 biomarkers detecteren in één test 2,11. Deze lijden echter nog steeds aan een relatief gebrek aan gevoeligheid in vergelijking met op enzymen gebaseerde strategieën voor signaalversterking, zoals die worden aangetroffen in immunohistochemie (IHC) -technieken.

Op enzymkatalyse gebaseerde immunofluorescentie wordt het vaakst gezien bij IHC-methoden waarbij mierikswortelperoxidase (HRP) wordt gebruikt voor chromogene (DAB) of fluorescerende kleurstofafzetting (bijv. tyramidesignaalamplificatie (TSA)). Aangezien deze testen gebaseerd zijn op hetzelfde katalytische enzym, is hun detectiegevoeligheid vergelijkbaar, waardoor multispectrale TSA-gebaseerde mIF-testen geschikt zijn voor klinische toepassingen 2,12. Het voordeel van op DNA gebaseerde signaalversterking is de hoge mate van multiplexing die mogelijk is met behoud van een uitstekende signaalversterking en modulariteit. Op HRP gebaseerde methoden zijn daarentegen minder modulair en moeilijk te optimaliseren, waardoor extra paneelontwikkelings- en testcycli nodig zijn.

Immunofluorescentie van antilichamen met DNA-streepjescode
De hier gedemonstreerde mIF-test maakt gebruik van een DNA-polymerase om tegelijkertijd DNA-antilichamen met barcode te amplificeren, gevolgd door cycli van kleuring en kleuring van de reportersonde met behulp van vier fluorescerende oligonucleotiden per beeldvormingsronde (Figuur 1).

figure-introduction-1
Figuur 1: Grafische illustratie van het multiplex-immunofluorescentietestprotocol. Barcode-geconjugeerde antilichamen worden in één stap toegevoegd en de barcodes worden tegelijkertijd geamplificeerd. In elke cyclus worden groepen van vier fluorescerende sondes toegevoegd, waardoor vier markeringen tegelijk kunnen worden gevisualiseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze toevoeging van antilichamen in één ronde en versterking in één stap vereenvoudigt het testprotocol aanzienlijk. Het proces wordt gefaciliteerd door geautomatiseerde kleurings- en scansystemen met hoge doorvoer, die zorgen voor reproduceerbare resultaten van dia tot dia en van batch tot batch voor een groot aantal monsters die in klinische onderzoeken worden gebruikt13.

Een van de belangrijkste voordelen van deze technologie is het vermogen om een hoge gevoeligheid te behouden en tegelijkertijd uitgebreide multiplexing mogelijk te maken2. De workflow zorgt er ook voor dat de beeldvormingsdoorvoer hoog blijft, waardoor een van de belangrijkste beperkingen van sterk gemultiplexte mIF-technologieën (bijv. > 8 biomarkers) voor klinische studies wordt aangepakt. Dit is vooral belangrijk in klinisch onderzoek, waar subtiele variaties in de doelwitten van geneesmiddelen met een lage abundantie (bijv. lage HER2) bij patiënten kritische inzichten kunnen verschaffen in de therapeutische respons.

Naast deze belangrijke kenmerken biedt deze test ook configureerbaarheid van het paneel, beeldvormingsmogelijkheden met hoge doorvoer en optische resolutie die nodig is om subcellulaire processen en compartimenten te onderzoeken, evenals cellulaire uitsteeksels geassocieerd met macrofagen en dendritische cellen. Het vermogen om complexe cellulaire fenotypes op meerdere ruimtelijke schalen te onderzoeken, is een cruciaal voordeel van optische beeldvorming versus op beeldvorming gebaseerde massacytometrie (IMC)-gebaseerde methoden2.

In dit werk wordt een protocol voor een 8-plex mIF-test gepresenteerd met behulp van een autostainer en een scanner voor hele dia's. Deze test omvat een panel van acht primaire antilichamen: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 en pan-cytokeratine14. Dit panel van markers maakt immunoprofilering van tumorweefsel en identificatie van cellen in de tumor- of stroma-omgeving mogelijk. Dit protocol maakt gebruik van een geautomatiseerde objectglaaskleuringskleuring voor de eerste kleurings- en sondewisselrondes, en de kleuring en beeldvorming kunnen binnen 2 dagen worden voltooid. Methoden voor het valideren van een mIF-test en het uitvoeren van analyse van de resulterende beelden worden ook getoond.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten moeten de richtlijnen van de institutionele ethische commissie voor menselijk onderzoek volgen. Alle weefselsecties die in dit protocol worden gebruikt, zijn verkregen van een externe weefselleverancier.

1. Voorbereiding van weefselmonsters

  1. Selecteer het FFPE-weefselblok dat moet worden gekleurd met behulp van de mIF-test. Als u FFPE-weefselglaasjes gebruikt, zorg er dan voor dat de monsters tussen de 3-5 μm dik zijn, op positief geladen glasplaatjes zijn gemonteerd en vrij zijn van rimpels of andere scheuren die een negatieve invloed kunnen hebben op het eindresultaat.
    OPMERKING: Vermijd voor het beste resultaat het kleuren van weefselmonsters die meer dan 2 maanden eerder zijn doorgesneden. Vermijd bovendien blokken die langer dan 10 jaar zijn opgeslagen of die visueel droog lijken te zijn.
  2. Als u met FFPE-weefselblokken werkt, gebruik dan een microtoom om het vereiste aantal weefselglaasjes met een dikte van 4 μm te snijden en monteer de objectglaasjes op een positief geladen glasplaatje. Om de meest consistente resultaten te bereiken, monteert u alle dia's in dezelfde richting. Zorg ervoor dat het weefsel vrij is van rimpels en scheuren.
  3. Als monsters niet onmiddellijk moeten worden gekleurd, bewaar ze dan maximaal 2 maanden in een diadoos onder stikstof.

2. Registratie van aanvullende reagentia en primaire antilichamen voor de eerste installatie

  1. Navigeer in de autostainer-software naar het tabblad Reagent-instellingen bovenaan het scherm. Klik op Toevoegen om nieuwe reagentia toe te voegen.
  2. De kleurings- en uitwisselingstesten zullen gebruik maken van negen reagenscontainers, volgens de informatie in tabel 1. Om ze bijvoorbeeld te gebruiken voor het eerste reagens met de naam Wash Buffer, met de afgekorte naam ISPWsh1, volg je de stappen. Selecteer het type als Aanvullend en controleer of zowel *BWash als DI worden vermeld onder Compatibele bulks. Vink het vakje Voorkeur aan voordat u opslaat.
  3. Herhaal dit proces voor de overige aanvullende reagentia met behulp van de namen en afkortingen in tabel 1.
    1. Het reagens van de versterkingsoplossing (ULTAmp1) is niet compatibel met Bond Wash. Selecteer hiervoor in het installatievenster van het reagens *BWash en klik op de knop << om dit reagens uit de lijst met compatibele reagentia te verplaatsen naar het gedeelte met beschikbare reagentia. Het niet verwijderen van Bond Wash als compatibel reagens voor het reagens van de amplificatieoplossing kan leiden tot aanzienlijk verminderde kleuringsprestaties van de test.
  4. Zodra alle reagenscontainers zijn geregistreerd, maakt u een Research Detection Kit voordat u met de eerste uitvoering begint. De detectiekit heeft één titratiecontainer van 30 ml nodig.
  5. Voeg de titratiecontainer van 30 ml toe aan de detectiekit. Om te voorkomen dat de twee worden gescheiden, plakt u de titratiecontainer op de staaf.
  6. Scan de barcode aan de linkerkant van de detectiekit. Geef in het volgende pop-upvenster de detectiekit een naam (bijv. InSituPlex Kit). Stel de vervaldatum in op 10 jaar vanaf de datum van registratie.
    OPMERKING: De hier ingestelde vervaldatum is niet de datum die op het reagens staat, maar de vervaldatum van het reagens in de titratiecontainer. Door de houdbaarheidsdatum ver in de toekomst in te stellen, zorgt u ervoor dat de kit niet onnodig vervalt.
  7. Selecteer voor de eerste reagenspositie van de kit Wasbuffer als reagens in het vervolgkeuzemenu.
  8. Klik op het streepjescodeveld voor deze reagenspositie en scan de streepjescode van de getapete titratiecontainer van 30 ml om deze container te registreren als wasbuffer en de reagenscontainer te koppelen aan de detectiestaaf.
  9. Zodra de titratiecontainer aan de kit is gekoppeld, klikt u op de knop Toevoegen om op te slaan en het pop-upvenster te sluiten.
  10. Vul de titratiecontainer met 30 ml 1x Bond Wash en bewaar tussen de kleurruns door gekoeld bij 4 °C.

Tabel 1: Aanvullende reagentia voor de opstelling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Eerste opzet van het protocol

  1. Nadat alle reagenscontainers met succes zijn geregistreerd, navigeert u naar het tabblad Protocol instellen bovenaan het scherm van de autostainer-software.
  2. Controleer welke softwareversie momenteel wordt uitgevoerd door op het logo rechtsboven in het scherm te klikken. In de pop-up die wordt weergegeven, wordt de softwareversie weergegeven die momenteel is geïnstalleerd onder het kopje Software-informatie.
  3. Als de software versie 7.0 of hoger is, is er een vooraf geïnstalleerd sjabloon van het kleuringsprotocol. Controleer onder aan het scherm of de selectie Voorkeursstatus is ingesteld op Alle. Noem het sjabloonprotocol *ISP Staining Assay. Voor eerdere versies van software is het protocol te vinden in Tabel 2.
  4. Klik met de rechtermuisknop op de *ISP Staining Assay en kopieer het protocol. Wijzig in het resulterende pop-upvenster de naam van het protocol Staining Assay 1 met de afgekorte naam (ISP_IHC1)
  5. Selecteer onder het gewenste detectiesysteem het systeem dat is gemaakt tijdens de eerste installatie van het reagens in stap 2.6.

Tabel 2: Protocol voor het protocol voor multipleximmunofluorescentiekleuring. *MARKER komt overeen met de antilichaamoplossing en Wash Buffer komt overeen met de BOND Wash-oplossing. Alle andere hulpreagentia hebben dienovereenkomstig genoemde kitcomponenten. Dit protocol is compatibel met softwareversie 7.0 en hoger, BXD 39 en hoger. Klik hier om deze tabel te downloaden.

4. Instellen van het reagens

  1. Ontdooi alle kitreagentia behalve de antilichaamconjugaten, het amplificatie-enzym, de uitwisselingsinitiator en de uitwisselingsneutralisator bij kamertemperatuur. Bewaar de rest van de kitcomponenten tot gebruik bij -20 °C.
  2. Als dit nog niet is gebeurd, registreer dan een nieuwe titratiecontainer voor elk van de reagentia die in stap 2.3 zijn gedefinieerd. Plaats in elk van deze elementen een nieuw titratie-inzetstuk.
  3. Neem het in stap 2.6 geregistreerde Research Detection System en zorg ervoor dat de bijbehorende wasbuffercontainer tot 30 ml gevuld is met 1x Bond wash solution. Plaats de titratiecontainers voor elk reagens in het systeem.
  4. Bereid het Ab verdunningsmiddel in de bijbehorende container. Het vereiste volume is 350 + (150 μL x aantal objectglaasjes) en bestaat uit het meegeleverde antilichaamverdunningsmiddel. Draai de buffer om te mengen na het ontdooien.
  5. Bereid de antilichaamkleuringsoplossing in de antilichaamkleuringsoplossing 1 container. Voeg alle antilichamen toe in een verdunning van 1:100 in het meegeleverde verdunningsmiddel voor antilichamen. Het vereiste volume is 350 + (150 μL x aantal dia's). Draai de antilichaamvoorraden of de volledige antilichaamkleuringsoplossing niet door, maar meng alleen door te pipetteren.
  6. Bereid het voorversterkingsmengsel voor in de container voor het voorversterkingsmengsel. Het vereiste volume is 350 + (150 μL x aantal dia's) en bestaat uit een voorversterkingsmix zoals meegeleverd. Vortex deze oplossing na ontdooien.
  7. Bereid de amplificatieoplossing voor in de container met amplificatieoplossing. Het vereiste volume is 350 + (150 μL x aantal objectglaasjes) en bestaat uit amplificatie-enzym verdund 1:10 in amplificatiebuffer. Draai het amplificatie-enzym of de voltooide amplificatieoplossing niet door, maar meng alleen door te pipetteren.
  8. Bereid de nucleaire tegenkleuring voor in een nucleaire tegenkleuringscontainer. Het vereiste volume is 350 + (300 μL x aantal dia's) en bestaat uit de meegeleverde nucleaire contrakleuringsoplossing verdund 1:100 in ultrapuur water. Mengen door vortexing.
  9. Bereid het mengsel van fluorescerende sondes voor dat overeenkomt met de eerste beeldvormingsronde in de fluorescerende sondecontainer. Het vereiste volume is 350 + (450 μL x aantal dia's), bestaande uit de fluorescerende sondes 1 oplossing verdund 1:20 in de sondebuffer. Vortex de componenten na het ontdooien, evenals het uiteindelijke volledige mengsel.
  10. Zodra alle reagentia zijn voorbereid en in de bijbehorende containers zijn geplaatst, plaatst u de volledige reagensstaaf in de software om het reagensvolume te kunnen meten.

5. Installatie uitvoeren

  1. Zodra alle reagentia zijn voorbereid, navigeert u naar het tabblad Dia-instellingen bovenaan de software en selecteert u de knop Nieuwe studie . Voeg naar wens studie-ID, studienaam en studieopmerkingen toe. Zie afbeelding 2 als voorbeeld.
  2. Selecteer onder doseervolume 150 μL en *Dewax 4 stappen als bereidingsprotocol. Als *Dewax 4 steps niet in het dropdown menu verschijnt, zoek dan dit protocol in het menu Protocol Setup en vink het vakje Voorkeur aan. Druk op OK.
  3. Nadat het onderzoek is gemaakt, selecteert u de knop Dia toevoegen aan de rechterkant van het scherm voor het instellen van dia's. Geef de dia onder Diaopmerkingen een unieke naam.
  4. Stel voor de extra velden in dit scherm Weefseltype in op Weefsel testen en stel het doseervolume in op 150 μL, waarbij de kleuringsmodus Single is in de linker vervolgkeuzelijst en Routine in de rechtervervolgkeuzelijst. Selecteer tijdens het proces IHC, met als marker Antibody Staining Solution.
  5. Selecteer in het protocolgedeelte van het venster Dia Toevoegen de optie Kleuringstest 1 voor kleuring, * Dewax 4 stappen als voorbereiding en *HIER 20 minuten met ER2 als HIER. Het enzymprotocol blijft *----. Zodra dit is voltooid, klikt u op Dia toevoegen. Zie afbeelding 2 als voorbeeld.
  6. Herhaal dit proces indien nodig voor het aantal dia's dat in het onderzoek moet worden uitgevoerd, en zorg ervoor dat het veld Diaopmerkingen wordt bijgewerkt voor elke toegevoegde dia, zodat ze later op unieke wijze kunnen worden geïdentificeerd. Nadat alle dia's zijn toegevoegd, sluit u het venster Dia toevoegen en drukt u alle labels af en plakt u ze op de bijbehorende weefselsecties.
  7. Plaats elke dia op de lade en plaats afdektegels op elk gedeelte voordat u de lade op de software plaatst. Zodra reagentia en objectglaasjes zijn toegevoegd, selecteert u de bijbehorende autostainer aan de rechterkant van de software. Zodra dit is geselecteerd, zijn alle drie de diabakken en informatie voor alle reagentia op de software zichtbaar, inclusief bulkreagentia en reagentia die tijdens de bereiding van reagentia zijn toegevoegd.
  8. Zorg ervoor dat de bulkreagenscontainers gevuld zijn en dat de afvalcontainers voldoende volume over hebben om de run te voltooien en druk vervolgens op de afspeelknop om de run te starten.
  9. Elke run duurt ongeveer 5 uur en 15 minuten om te voltooien. Noteer de stoptijd en zorg ervoor dat de dia's onmiddellijk uit de autostainer worden verwijderd zodra het protocol is voltooid.

figure-protocol-1
Figuur 2: Prompts voor de software. (A) Nieuwe studieprompt over Autostainer-software, met de juiste instellingen voor het kleuringsprotocol voor multiplexed immunofluorescentie (mIF). (B) Voeg een diaprompt toe aan de software, met de juiste instellingen voor het mIF-kleuringsprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Beeldvorming

  1. Nadat het kleuringsprotocol is voltooid, verwijdert u de bevlekte objectglaasjes en het dekglaasje in het montagemedium. Laat het montagemedium in het donker uitharden totdat het dekglaasje stevig op zijn plaats zit (meestal 1 uur of meer, pauzepunt).
  2. Afbeeldingsdia's op een fluorescentiemicroscoop of een scanner voor het hele objectglaasje met de juiste filters voor de test. De kleurstoffen die in deze test worden gebruikt, zijn doorgaans compatibel met filters voor DAPI, FITC, TRITC, Cy5 en Cy7.
  3. Afbeeldingen zien er ongeveer zo uit als die in Figuur 3A. Zorg er visueel voor dat alle delen van het weefsel goed scherp zijn en dat signalen op het juiste intensiteitsniveau verschijnen (niet over/onderbelicht). Maak indien nodig dia's opnieuw in beeld met verschillende belichtingsinstellingen.
  4. Als na de beeldvorming een extra beeldvormingsronde nodig is, laat u de objectglaasjes in 1x PBS weken totdat de dekglaasjes er vanzelf af vallen. (pauzepunt)

7. Initiële instelling van het uitwisselingsprotocol

  1. Als de software versie 7.0 of hoger is, is er een vooraf geïnstalleerde sjabloon van het autostainer-protocol. Controleer onder aan het scherm of de selectie Voorkeursstatus is ingesteld op Alle. Het sjabloonprotocol krijgt de naam *ISP Signal Exchg. Voor eerdere versies van software is het protocol te vinden in Tabel 3.
  2. Klik met de rechtermuisknop op *ISP Signal Exchg en kopieer het protocol. Wijzig in het pop-upvenster dat verschijnt de naam van het protocol Exchange Protocol 1 met de afgekorte naam ISPEXCH1. Zorg ervoor dat het vakje Voorkeur is aangevinkt voordat u verder gaat en wijs dezelfde kitnaam toe als vastgesteld in stap 2.6.

Tabel 3: Protocol voor het multiplex-immunofluorescentie-signaaluitwisselingsprotocol. Wash Buffer komt overeen met BOND Wash oplossing. Alle andere hulpreagentia hebben dienovereenkomstig genoemde kitcomponenten. Dit protocol is compatibel met softwareversie 7.0 en hoger, BXD 39 en hoger. Klik hier om deze tabel te downloaden.

8. Exchange-protocol instellen en uitvoeren

  1. Ontdooi de wisselbuffer bij kamertemperatuur. Houd de vervangingsneutralisator en de vervangingsinitiator tot gebruik op -20 °C. Er zijn twee reagenstitratiecontainers en de detectiekit nodig om het uitwisselingsprotocol uit te voeren.
  2. Bereid de vervangingsoplossing voor in de bijbehorende container. Het vereiste volume is 350 + (450 μL x aantal dia's) en bestaat uit een uitwisselingsinitiator die 1:500 is verdund in de uitwisselingsbuffer. Draai het uitwisselingsenzym of de voltooide uitwisselingsoplossing niet in een werveling, maar meng alleen door te pipetteren.
  3. Bereid het mengsel van de tweede fluorescerende sondes voor in de container van de fluorescerende sondes 2. Het vereiste volume is 350 + (450 μL x aantal objectglaasjes) en bestaat uit de fluorescerende sondes 2-oplossing verdund 1:20 en de uitwisselingsneutralisator verdund 1:40 in sondebuffer 2. Het fluorescerende sondemengsel en de sondebuffer mogen worden gevortext, maar de uitwisselingsneutralisator en de uiteindelijke gecombineerde oplossing mogen alleen met pipetten worden gemengd.
  4. Zodra alle reagentia zijn voorbereid, plaatst u de volle staaf op de autostainer en laat u de reagentia door de machine onderdompelen.
  5. Voeg alle dia's toe volgens stap 5. Verander tijdens het toevoegen van dia's de markering in *Negatief. Selecteer voor Preparaat, HIER en Enzym de optie *----, omdat er geen dewax of antigeenverzameling nodig is voor het uitwisselingsprotocol. Zodra dit is voltooid, klikt u op Dia toevoegen.
  6. Herhaal dit proces indien nodig voor het aantal dia's dat in het onderzoek moet worden uitgevoerd, en zorg ervoor dat het veld Diaopmerkingen wordt bijgewerkt voor elke toegevoegde dia, zodat ze later op unieke wijze kunnen worden geïdentificeerd.
  7. Nadat alle dia's zijn toegevoegd, sluit u het venster Dia toevoegen en drukt u alle labels af en plakt u ze op de bijbehorende weefselsecties.
  8. Plaats elke dia op de lade en plaats afdektegels op elk gedeelte voordat u de lade op de software plaatst.
  9. Zodra alle reagentia en objectglaasjes zijn toegevoegd, selecteert u de bijbehorende Autostainer in de software; Dit zal aan de rechterkant zijn. Zodra dit is geselecteerd, zijn alle drie de diabakken en informatie voor alle reagentia op de software zichtbaar, inclusief bulkreagentia en reagentia die tijdens de bereiding van reagentia zijn toegevoegd.
  10. Zorg ervoor dat de bulkreagenscontainers gevuld zijn en dat de afvalcontainers voldoende volume over hebben om de run te voltooien.
  11. Nadat dit is bevestigd, drukt u op de afspeelknop om de run te starten. Het protocol duurt ongeveer 90 minuten om te voltooien. Noteer de stoptijd en zorg ervoor dat de dia's onmiddellijk worden verwijderd zodra de run is voltooid.

9. Beeldvorming

  1. Herhaal de beeldvorming voor de nieuwe ronde sondes, zoals in stap 5. Afbeeldingen worden weergegeven zoals in afbeelding 3B.

10. Stapelen (voor >4-plex eiwitbeeldvorming)

  1. Er bestaan nu meerdere afbeeldingen voor dezelfde dia. Combineer de afbeeldingen in de software voor co-registratie van afbeeldingen om een gestapeld 8-plex beeld te genereren.
  2. Registreer de afbeeldingen van elke ronde als volgt.
    1. Elke ronde afbeelding heeft de volgende naam: _ waarbij de unieke naam van de dia (streepjescode) is en een tekenreeks is die, indien alfabetisch gesorteerd, de afbeelding van ronde 1 eerst en de afbeelding van ronde 2 als tweede plaatst. Voor = 1234ABC kunnen bestanden bijvoorbeeld de naam 1234ABC_Round1 en 1234ABC_Round2 hebben, waarbij alle bestanden de juiste extensie (bijv. .czi) van de scanner hebben. Plaats alle ronde afbeeldingen in een enkele map met de naam bijvoorbeeld Bronafbeeldingen.
    2. Klik in de co-registratiesoftware op de knop Instellen in het mapgedeelte met bronafbeeldingen van de gebruikersinterface en selecteer desgevraagd de map Hierboven gemaakt.
    3. Stel het bestandstype in de sectie Bronafbeeldingen in op de extensie van de bronafbeeldingen (bijv. .czi, .qptiff, enz.). De software geeft nu de twee ronde afbeeldingen samen weer in een tabel die aangeeft dat dia 1234ABC 2 ronde afbeeldingen heeft.
    4. Stel desgewenst de locatie van de gestapelde uitvoerafbeeldingen in op een andere map dan de map met bronafbeeldingen met behulp van de knop Set in de mapsectie gestapelde afbeeldingen van de gebruikersinterface en kies desgevraagd de map Gewenste uitvoer . Anders wordt standaard de map met bronafbeeldingen gebruikt.
    5. Standaard wordt alleen een .afi-bestandsweergave van de stapel gemaakt. Vink de optie aan om een OME.tif bestand van de hele stapel op te slaan in het gedeelte met verwerkingsopties van de interface.
    6. Om de nauwkeurigheid van de co-registratie over het gehele monster te valideren, controleert u de optie Validatie in het uitvoergedeelte van de interface.
    7. Druk op de START-knop om de co-registratie van afbeeldingen te starten.

11. Beeldanalyse

  1. Nadat de dia's zijn afgebeeld, visualiseert en analyseert u de dia's met behulp van een analysemethode naar keuze, zoals de STARVUE-beeldverwerkingssuite van Ultivue of QuPath15.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het bovenstaande protocol wordt FFPE-weefsel gekleurd met meerdere doelen en zijn hoogwaardige beelden van alle markers in groepen van vier verkregen (Figuur 3A,B). Met de software voor co-registratie van afbeeldingen kunnen afbeeldingen van dezelfde dia worden gecombineerd en gecoregistreerd, zoals te zien is in afbeelding 3C. Vergelijkbare resultaten worden weergegeven in figuur 4 voor een weefselglaasje van colorectale kanker (CRC).

Het succes van het protocol moet worden bepaald door het verwachte kleuringspatroon te beoordelen. In het getoonde CRC-voorbeeld wordt elk van de gekleurde doelen tot expressie gebracht in het verwachte subcellulaire compartiment, bijv. nucleair FoxP3, membraneuze CD3, cytoplasmatisch CD68 (Figuur 4B-D). Elk van de functionele doelen wordt uitgedrukt op het juiste celtype, zoals blijkt uit het voorbeeld van co-lokalisatie van PD1 en CD3 of van PDL-1 en CD68, die respectievelijk uitgeputte T-cellen en immuunonderdrukkende macrofagen vertonen. Beoordeling van een goede signaal-achtergrondverhouding, waardoor een succesvol onderscheid kan worden gemaakt tussen echt positief signaal en potentiële achtergrondruis, wordt meestal kwalitatief uitgevoerd door pathologen of experts op het gebied van beeldanalyse die de kwaliteit van de kleuring bevestigen, waardoor een succesvolle beeldanalyse mogelijk is. Om de kwaliteit en prestaties van de kleuring verder te bevestigen, kan een vergelijking met de gouden standaard IHC (chromogene DAB) op seriële secties worden toegevoegd (zie voorbeeld in figuur 5), evenals een positief controleweefselmonster zoals menselijke amandelen, dat voor de meeste immuundoelen nuttig kan zijn om het succes van de kleuring te bevestigen. Merk op dat kankers een lagere expressie van doelen kunnen vertonen dan menselijke amandelen16.

Nadat de resultaten kwalitatief zijn bevestigd, kan een kwantitatieve analyse worden uitgevoerd. In dit werk bestaat dit voornamelijk uit het berekenen van de celdichtheid van verschillende fenotypes (aantal cellen/mm2) die een bepaald doel of bepaalde doelen tot uitdrukking brengen, evenals het berekenen van de gemiddelde intensiteitsniveaus van functionele doelen die een breed dynamisch expressiebereik kunnen vertonen. Bij het beoordelen van de precisie van mIF-assays moeten seriële doorsneden die met dezelfde markeringen zijn gekleurd, vergelijkbare signalen tussen objectglaasjes vertonen, wat kwalitatief te zien is in figuur 6. Kwantitatieve resultaten van dichtheden met één marker in verschillende weefseltypen worden bijvoorbeeld weergegeven in figuur 7. Beeldanalyse op deze beelden maakt het mogelijk om positieve cellen te identificeren en een overeenkomstige positieve celdichtheid kan voor elke marker worden berekend, evenals de gemiddelde signaalintensiteit per positieve cel. Hierdoor kan voor elke marker een variabiliteitscoëfficiënt (CV) worden berekend om de precisie van de multiplexing-test te beoordelen (tabel 4).

figure-results-1
Figuur 3: Beelden van een weefselmicroarray (TMA)-kern verkregen uit opeenvolgende kleuringsrondes in het 8-plex immunofluorescentieprotocol. (A) Afbeelding verkregen uit de eerste beeldvormingsronde, met markers CD8, PD1, PD-L1 en CD68. Na het uitwisselingsprotocol toont (B) de tweede beeldvormingsronde op hetzelfde glaasje voor de tweede ronde van markers CD3, CD4, FoxP3 en CK/SOX10, en (C) toont een co-geregistreerd beeld dat afbeeldingen (A) en (B) combineert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 4: Representatieve kleuring van colorectale kanker (CRC) weefsel met 8-plex immunofluorescentiekleuring. De figuur toont cellulaire fenotypes die kunnen worden geïdentificeerd door meerdere doelen in dezelfde cel te co-lokaliseren. (boven) Afbeelding van de hele dia van CRC-weefsel. (onder) Gedetailleerde weergaven van weefselgebieden die (A) T-reg-cellen (CD3+/CD4+/FOXP3+), (B) PD-1- en PD-L1-expressiecellen in tumor en stroma benadrukken, (C) uitgeputte cytotoxische T-cellen (CD3+/CD8+/PD-1), (D) immuunontwijkende tumorcellen (PD-L1+/CK+) en immuunonderdrukkende macrofagen (CD68+/PDL1+). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 5: Kwalitatieve vergelijking van immunohistochemie (IHC) met immunofluorescentie (IF) kleuring. Seriële doorsneden gekleurd met immunohistochemische kleuring met één marker (DAB, bovenste rij), immunofluorescentie met één marker (ISP monoplex) en eenkanaalsweergave van multiplex-immunofluorescentie (ISP-multiplex) die kwalitatieve overeenstemming tussen de verschillende kleuringsmethoden aantoont. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 6: Kleuring door seriële doorsneden. (A) Diagram van de lay-out van een multi-tissue TMA. (B) Representatieve 8-plex beelden van weefselkernen van elk weefseltype in de TMA. (C) Representatieve beelden van CD8 in een amandelkern over zes seriële TMA-secties die in één keer zijn gekleurd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 7: Kwantificering van de dichtheid met één marker per weefseltype opgenomen in de TMA. Dichtheden per weefsel zijn de gemiddelde dichtheden over drie representatieve kernen van elk weefseltype op het TMA-objectglaasje. De y-as geeft de enkelvoudige markerdichtheden weer in verschillende weefseltypen op de x-as, in eenheden van positieve cellen/mm2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 8: Analyse van het interessegebied (ROI) van het relatieve fluorescerende signaal, waarbij de versterkte ISP mIF die in dit protocol wordt beschreven, wordt vergeleken met indirecte IF. (A) Representatieve dia gekleurd voor CK (links) of PD-L1 (rechts) met vijf ROI's aangegeven. (B) Representatieve ROI-afbeeldingen voor CK (boven) en PD-L1 (onder). Gemiddelde signaalintensiteit bereikt met versterkte mIF (paars) en indirecte IF (blauw) voor (C) CK en (D) PD-L1 over vijf ROI's, elk met een afmeting van 100 μm x 100 μm en met ongeveer 200 cellen. Y-aswaarden tonen willekeurige fluorescerende eenheden en foutbalken tonen standaarddeviaties (n=3). (E) De relatieve signaalintensiteit die werd bereikt met versterkte ISP mIF (paars) en indirecte IF (blauw) werd berekend door de verhouding tussen het gemiddelde versterkte mIF-signaal en het gemiddelde indirecte IF-signaal over alle ROI's te nemen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 4: Berekende variantiecoëfficiënt (CV). De CV van positieve celdichtheid en gemiddelde signaalintensiteit voor de amandelbeelden worden weergegeven in figuur 6. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport beschrijft een protocol voor high-throughput, high-sensitivity multiplex immunofluorescentiekleuring die wordt uitgevoerd met behulp van een autostainer. Bij het uitvoeren van dit protocol zijn de stappen voor de bereiding van reagentia van cruciaal belang en verdienen ze aandacht. Het is noodzakelijk ervoor te zorgen dat reagentia op de juiste manier worden gemengd en correct worden afgemeten om de kleurvariabiliteit tussen verschillende objectglaasjes in dezelfde run of tussen verschillende runs met dezelfde componenten te minimaliseren.

Veelvoorkomende problemen bij het uitvoeren van dit protocol zijn onder meer het niet goed mengen van reagentia voorafgaand aan het laden en de kans op weefselverlies als gevolg van een onjuiste de-coverslipping-procedure. Hoewel dit kleuringsprotocol van toepassing is op elk FFPE-weefseltype, inclusief kankertypes, kunnen sommige weefseltypen een zorgvuldigere behandeling vereisen (bijv. weefsels met een hoog vetgehalte). Om weefselverlies te voorkomen, laat u de afgeschoofde dia's lang genoeg intrekken zodat het dekglaasje vanzelf loskomt. Forceer het dekglaasje niet om los te komen of wrik het glas niet los.

Een beperking is dat, hoewel veel van de meest gebruikte doelen in de immuunoncologie gevalideerd en klaar voor gebruik zijn, sommige doelen mogelijk testontwikkeling vereisen voordat ze in een multiplexpaneel worden opgenomen. Hoewel dit proces relatief snel gaat, kan dit nog een paar weken duren voordat een op maat gemaakt multiplexpaneel kan worden gebruikt.

Er zijn verschillende verschillen tussen deze test en andere multiplex immunofluorescentietechnologieën. Vergeleken met directe en indirecte op immunofluorescentie gebaseerde technologieën, heeft de hier gedemonstreerde test een significant hoger niveau van versterking, waardoor een aanzienlijk verbeterde signaal-ruisverhouding mogelijk is, met name in kanalen die de neiging hebben om weefselautofluorescentie te vertonen, zoals het FITC-kanaal. Dit resulteert in een ~30x sterker signaal dan directe immunofluorescentie en ~10x sterker signaal dan indirecte immunofluorescentie, zoals gekwantificeerd door gebruik te maken van intensiteitsanalyse van de hele dia en handmatige ROI-gebaseerde analyse (Figuur 8). Deze methode maakt een veel gevoeligere detectie van doeleiwitten mogelijk bij aanzienlijk kortere belichtingstijden en elimineert de noodzaak van beeldmanipulatie, inclusief achtergrondaftrekking die het risico met zich meebrengt dat signalen met een lage intensiteit worden verwijderd.

Vergeleken met mIF-assays op basis van enzymgekatalyseerde amplificatie, heeft de hier gedemonstreerde test een aanzienlijk verbeterd vermogen om multiplexing uit te voeren, naast een eenvoudigere workflow en over het algemeen een kortere doorlooptijd van de test (Figuur 1). In deze test worden antilichamen in één stap samengebracht en tegelijkertijd versterkt, waardoor het testprotocol aanzienlijk wordt vereenvoudigd. Bovendien kunnen sommige op enzymen gebaseerde technologieën, zoals tyramidesignaalversterking (TSA), interferentie tussen verschillende antilichamen aantonen, in wat het paraplu-effect wordt genoemd 12,17,18. De amplificatietechnologie die hier wordt gebruikt, vermijdt dit probleem, waardoor de detectie van meerdere gelokaliseerde en co-tot expressie gebrachte markers op dezelfde cel mogelijk is, zoals te zien is in figuur 4.

Ongeveer 90% van de kankers bij de mens komt voort uit epitheelcellen19. Dit komt omdat ze vaak de eerste verdedigingslinie vormen tegen de externe omgeving en zich sneller vermenigvuldigen, wat leidt tot een snellere accumulatie van mogelijk oncogene mutaties. Hier speelt ontsteking een cruciale rol bij het ontstaan, de progressie en de verspreiding van tumoren. In het afgelopen decennium zijn veel therapieën gericht op immuuncheckpointremmers en immuuncellen naar voren gekomen als een krachtig arsenaal tegen veel tumortypen 5,20,21. Een aanzienlijk deel van de patiënten reageert echter nog steeds niet. Het is waarschijnlijk dat de micro-omgeving van de tumor (TME) en het lokale immuunlandschap een cruciale rol spelen. Door TME-moleculaire handtekeningen geassocieerd met differentiële geneesmiddelrespons bij veel patiënten te profileren, is het misschien mogelijk om therapeutische biomarkers beter te definiëren. Dit rapport toont aan dat mIF-technologie kan worden gebruikt om meerdere eiwitbiomarkers parallel te profileren, inclusief markers met lage expressie, over honderden hele monsterglaasjes of tumormicroarrays.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs K. H., A. Veith, L. D., D. W., G. C., Y. C., J. H. L. en A. Vasaturo zijn werknemers van Ultivue, dat de multiplex immunofluorescentiekits produceert die in dit werk worden gebruikt.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door Ultivue.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-CD3UltivueClone BC33 (BioCare). Onderdeel van ULT50801
Anti-CD4UltivueClone SP35 (Abcam). Onderdeel van ULT50801
Anti-CD68UltivueClone KP1 (BioCare). Onderdeel van ULT50801
Anti-CD8UltivueClone C8/144B (BioCare). Onderdeel van ULT50801
Anti-Cytokeratin + Anti-SOX10UltivueClones AE1/AE3 (Bethyl Labs) en BC34 (BioCare). Onderdeel van ULT50801, geleverd als mengsel
Anti-FOXP3UltivueClone 236A/E7 (Thermo). Onderdeel van ULT50801
Anti-PD1UltivueClone CAL20 (Abcam). Onderdeel van ULT50801
Anti-PDL1UltivueClone 73-10 (Abcam). Onderdeel van ULT50801
Axioscan.Z1 MicroscoopZeissgenoemd als fluorescentiemicroscoop in tekst
Bond Dewax SolutionLeicaAR9222
Bond Epitope Retrieval Solution 2LeicaAR9640
Bond Open Containers, 30 mLLeicaOP309700
Bond Research Detection KitLeicaDS9455
Bond Titration InsertsLeicaOPT9049
Bond Titration KitLeicaOPT9719
Bond Universal CovertilesLeicaS21.4611
Bond Wash Solution 10x ConcentrateLeicaAR9590
BondRX AutostainerLeicagenoemd als "autostainer" in tekst
BondRX SoftwareLeicaVersie 6.0 of hoger
Coverslips, #1.5 dikteCorning2980-244
Ethanol, 200 proofVWR89370-084
FFPE weefselblokkenBioIVTweefseltypen variëren
OmniVUE 8-plex assay (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Cytokeratin/SOX10)UltivueULT50801bevat alle andere Ultivue componenten
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Boston BioProductsC-9911F(pH 7.4 met 2.7 mM KCl en 137 mM NaCl)
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144genoemd als "montagemedium" in tekst
UltiAnalyzer.AIUltivue
UltiStacker.AIUltivue
Ultivue Amplification BufferUltivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Antibody DiluentUltivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Exchange BufferUltivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Exchange InitiatorUltivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Exchange NeutralizerUltivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 1Ultivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Fluorescent Probes 2Ultivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Pre-Amplification MixUltivueonderdeel van ULT50801
Ultivue Probe BufferUltivueonderdeel van ULT50801
Ultrapure waterSigma-AldrichW4502

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).
  2. Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).
  3. Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies. Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).
  4. Singhal, S. K., et al. Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival. Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).
  5. Patil, N. S., et al. Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).
  6. Hong, D. S., et al. Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial. Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).
  7. Robbins, C. J., et al. Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry. Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).
  8. Ko, H., et al. Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate. Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).
  9. Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy. Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).
  10. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
  11. Sheng, W., et al. Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy. Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  12. Taube, J. M., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).
  13. Myers, J. A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization. Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).
  14. Schwarze, J. K., et al. Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial. J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).
  15. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  16. Koppel, C., et al. Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms. Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).
  17. Parra, E. R., et al. Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies. Cancers. 12 (2), 255(2020).
  18. Surace, M., et al. Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens. J Vis Exp. (143), e58390(2019).
  19. Hinck, L., Näthke, I. Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon. Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).
  20. Alturki, N. A. Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment. J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).
  21. Sun, Q., et al. Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends. Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Geautomatiseerde immunofluorescentieDNA gebarcodeerde antilichamensignaalversterkingwhole slide imagingspatiale proteomicaweefselmicroarrayanalyse op single celniveauimmuunfenotyperingformalinegefixeerd weefsel

Gerelateerde artikelen