Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.
Methodenartikel
Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In de afgelopen decennia is er aanzienlijke vooruitgang geboekt in het begrijpen van de mechanismen van het bepalen van het lot van cellen. Het proces waarmee door het lot bepaalde cellen driedimensionale organismale vormen vormen, blijft echter onduidelijk. Recente ontwikkelingen in confocale microscopie hebben het mogelijk gemaakt om de celdynamiek tijdens de ontwikkeling te observeren door middel van live beeldvorming. De Drosophila melanogaster pop is ideaal voor live beeldvorming vanwege zijn onbeweeglijkheid, transparante popnagelriem en de beschikbaarheid van fluorescerende reporterlijnen. Een primaire uitdaging voor beeldvorming is het puparium, de cuticula rond de pop, die optische beeldvorming belemmert. Terwijl eerdere methoden gedeeltelijke of volledige verwijdering van het puparium inhielden, bleef het een uitdaging om de levensvatbaarheid van de pop gedurende langere perioden na deze procedure te behouden. Hier wordt een eenvoudige methode gepresenteerd voor dagenlange live beeldvorming van het Drosophila-been tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. De methode omvat het verwijderen van het puparium van een pop die aan dubbelzijdig plakband is vastgemaakt, gevolgd door het monteren van een kleine kamer op een schaal met glazen bodem om de pop en een druppel water te omsluiten. Deze opstelling is eenvoudig, betrouwbaar en ondersteunt een langere overleving van de pop door uitdroging te voorkomen. Langdurige live beeldvorming van de Drosophila-pop heeft aanzienlijk bijgedragen aan het vastleggen van hoe het volwassen been gedurende 2-3 dagen dramatische driedimensionale structurele veranderingen ondergaat. Deze veranderingen omvatten de voorbijgaande vorming van een intrigerende structuur (de Parthenon-achtige structuur) door epitheelcellen, snelle weefselvernauwing, gewrichtsvorming en rek van de borstelharen. Deze methode is toepasbaar op de observatie van verschillende weefsels en kan mogelijk worden gecombineerd met andere technieken, zoals optische geninductie, om het begrip van celdynamica tijdens de uiteindelijke vormvorming van weefsels in het popstadium te vergroten.
Inleiding
Ondanks de aanzienlijke vooruitgang die de afgelopen decennia is geboekt bij het ophelderen van het mechanisme van het lot van cellen, is de manier waarop door het lot bepaalde cellen driedimensionale organismale vormen opbouwen nog steeds ongrijpbaar. Dankzij de technologische verbeteringen in confocale microscopie zijn de pogingen om de celdynamiek tijdens de ontwikkeling te onthullen door middel van live beeldvorming de afgelopen jaren toegenomen 1,2. De Drosophila melanogaster-pop heeft de voorkeur gekregen voor live-beeldvorming vanwege de geschikte eigenschappen: immobiliteit, transparantie van de cuticula van de pop en beschikbaarheid van fluorescerende reporterlijnen 3,4,5. Het grootste obstakel bij het uitvoeren van live beeldvorming van de Drosophila-pop is het puparium (popgeval), de misvormde en gebruinde laatste nagelriem van de instar-larvale nagelriem rond de pop. Om optische obstructie te voorkomen, werd het puparium gedeeltelijk of volledig verwijderd volgens de eerder gerapporteerde methoden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Volledige verwijdering van het puparium maximaliseert het observatiegebied en de toepasbaarheid op verschillende weefsels. De pop zonder zijn puparium sterft echter meestal binnen ongeveer een halve dag, vermoedelijk als gevolg van uitdroging. Daarom is het handhaven van het vocht van de pop cruciaal voor langdurige live beeldvorming. Hoewel de exacte duur van de overleving van de pop na volledige verwijdering van puparium in eerdere methoden onduidelijk is, duurden de gerapporteerde voorbeelden meestal tot ongeveer 20 uur. Aangezien het popstadium ongeveer vier dagen duurt, werd verwacht dat een methode voor nog langere live beeldvorming zou bijdragen aan het vastleggen van het hele proces van weefselvormvorming.
Het volwassen been van Drosophila is een uitstekend model voor het bestuderen van het proces van driedimensionale weefselvormvorming. Het is afgeleid van de schijfvormige primordia (beenschijf) die tijdens de larvale stadia worden gevormd. Regio's die overeenkomen met elk segment in de volwassen poot worden bepaald door het prepopstadium11. Vervolgens steekt de beenschijf uit het centrale deel om ongeveer 11 uur na pupariumvorming (APF) een opgeblazen buisvormige structuur te vormen. Hoe dit weefsel, met zijn eenvoudige vorm, in latere stadia zijn uiteindelijke vorm van het volwassen been bereikt, is lange tijd onduidelijk gebleven. Er zijn verschillende studies gepubliceerd die dit probleem benaderen 12,13,14. Omdat ze gefixeerde of gekweekte weefsels observeerden, konden continue veranderingen in individuele cellen niet worden getraceerd en was de verkregen informatie enigszins gefragmenteerd. Om het vormingsproces volledig te begrijpen, is het essentieel om de veranderingen in individuele cellen continu te observeren door middel van langdurige live beeldvorming.
Een recente studie onthulde de dynamische vervorming van driedimensionale structuren in weefsel- en cellulaire niveaus door middel van langdurige live beeldvorming (Figuur 1). De meest intrigerende bevinding in deze studie is de voorbijgaande vorming van een onverwacht complexe structuur door epitheelcellen. Deze structuur, de "Parthenon-achtige structuur" genoemd, heeft apicobasale projecties en basale mesh-achtige verbindingen van epitheelcellen. Belangrijk is dat de vorming en verdwijning van deze structuur samenvalt met een snelle weefselvernauwing15. De daaropvolgende vormvorming, inclusief gewrichtsvorming en rek van de borstelharen, duurde 2-3 dagen. Langdurige live-beeldvorming legde effectief het hele verhaal van deze dagenlange opeenvolgende gebeurtenissen vast.
Dit artikel biedt een stap-voor-stap methode voor het uitvoeren van dagenlange live beeldvorming van het Drosophila-been tijdens het popstadium met volledige verwijdering van het puparium. De methode is gemakkelijk te volgen en kan op verschillende andere weefsels worden toegepast.
Protocol
Dit protocol maakt gebruik van Drosophila melanogaster-stammen die fluorescerende reporters tot expressie brengen15. De details van de reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van de pop
- Verzamel met een penseel witte poppen van de gewenste stam Drosophila melanogaster uit flesjes en doe ze in schaaltjes of lege flesjes (Figuur 2A).
OPMERKING: In deze studie verwijst "witte poppen" naar het stadium tussen het moment waarop de larve volledig onbeweeglijk wordt en voordat het puparium bruin wordt. Deze fase duurt ongeveer 30 minuten bij 25 °C. - Incubeer witte poppen gedurende ten minste 14 uur bij 25 °C totdat zij zich ontwikkelen tot het te observeren stadium (figuur 2B).
OPMERKING: Het puparium kan pas worden verwijderd nadat de cuticula van de pop volledig is gevormd om 12-13,5 uur APF en gemakkelijk pas na 14 uur APF worden verwijderd. - Veeg de lijm en vlieg het voedsel weg van het puparium met een penseel gedrenkt in gedestilleerd water.
OPMERKING: De ventrale zijde van het puparium moet bijzonder schoon zijn om in latere stappen voldoende hechting aan de dubbelzijdige tape te bereiken. - Leg de poppen enkele minuten op reinigingsdoekjes om te drogen.
LET OP: Achterblijvend vocht op het puparium zou een goede hechting op een dubbelzijdige tape in de weg staan. - Bevestig een stuk dubbelzijdig plakband op een glasplaatje.
- Leg de gedroogde poppen op een dubbelzijdige tape met de buikkant naar beneden (Figuur 2C).
- Duw voorzichtig met een gedroogde kwast op de dorsale kant van de poppen om een betere hechting aan de dubbelzijdige tape te krijgen.
- Open onder een stereomicroscoop het operculum voorzichtig met een tang (Figuur 2 D,E).
OPMERKING: Het operculum is het anterodorsale gebied van het puparium waar de volwassen vlieg uit komt en dus gemakkelijk opengaat. - Steek vanaf de rand van het geopende operculum een van de uiteinden van de tang in de ruimte tussen de pop en het puparium (Figuur 2F).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de cuticula van de pop niet beschadigt met de punt van de tang. - Pak het puparium met een tang vast en trek het naar buiten totdat het openbreekt.
- Til de gescheurde fragmenten van het puparium met een tang op en plak ze op dubbelzijdig plakband (Figuur 2G).
- Herhaal stap 1.10-1.11 totdat de opening van het puparium het achterste uiteinde bereikt, waardoor een klein deel van het puparium overblijft (Figuur 2 H,I).
OPMERKING: Als er vloeistof uit een pop zou komen, zou deze beschadigd zijn (Figuur 2K). Om de normale ontwikkeling te observeren, vermijd het afbeelden van beschadigde poppen.
2. Beeldvorming instellen
- Doe 1 μL gedestilleerd water of siliconenolie (bij gebruik van een silicium onderdompelingslens) op de bodem van een schaal met glazen bodem.
- Week een penseel in het gedestilleerde water en schep de pop voorzichtig op (Figuur 2J).
- Leg de pop met de buikkant naar beneden op het gedestilleerde water of de siliconenolie (Figuur 2L).
- Breng met een micropipet 10 μL van het gedestilleerde water aan de rand van het glazen gedeelte van de glazen bodemschaal (Figuur 2L).
- Plaats een cirkel van siliconenvet met een spuit rond de rand van het glazen gedeelte van de glazen bodemschaal (Figuur 2M).
- Doe een dekglaasje op het siliconenvet om het af te dichten (Figuur 2M). De montage wordt geïllustreerd in figuur 2N.
NOTITIE: Zorg ervoor dat er geen openingen zijn tussen het dekglaasje en het siliconenvet.
3. Confocale beeldvorming
- Schakel een omgekeerde confocale lasermicroscoop en beeldvormingssoftware in.
- Plaats de schaal op de podiumaccepter van een omgekeerde confocale microscoop.
- Zoek de poppen met een objectief met een lage vergroting in de helderveldobservatie. Zorg ervoor dat de poppen geen lekkage van de lichaamsvloeistof vertonen.
- Centreer het gewenste gebied van de pop om te observeren in het interessegebied (ROI).
OPMERKING: De anterolaterale zijden van de tarsus in de eerste en tweede poot, en de ventrale zijde van de tarsus in de derde poot, zijn gericht op de ventrale zijde van de pop. Daarom kan de longitudinale doorsnede van de tarsus langs de dorsoventrale as worden waargenomen in de eerste en tweede poot, terwijl die langs de anteroposterieure as kunnen worden waargenomen in de derde poot. - Verander de objectieflens in die voor live beeldvorming.
OPMERKING: Als een lens voor het onderdompelen in water wordt gebruikt, zal het water tussen de lens en de schaal met glazen bodem uitdrogen tijdens de langdurige observatie. Een onderdompelingslens zonder onderdompeling of onderdompeling in siliconenolie wordt aanbevolen. - Pas de voorwaarden voor de gewenste waarneming aan en start met het verzamelen van gegevens.
OPMERKING: Om schade aan de pop te voorkomen, moeten de laservermogens minimaal zijn voor zover er duidelijke beelden kunnen worden verkregen. Het minimaliseren van de ROI en het vergroten van de stapgrootte zijn nuttig om tijd te besparen bij het verwerven van Z-stacks. Bij het bepalen van de diepte van de Z-stapel moet rekening worden gehouden met de toekomstige transformatie van het weefsel. In het geval van beenobservatie om 15-25 uur APF, aangezien het been erg smaller wordt, beweegt het dichtstbijzijnde deel bij het dekglaasje (lateraal epitheel) snel dieper. Gezien deze beweging moeten extra diepe Z-stapels vanaf het begin worden ingesteld. Een voorbeeld van de confocale microscoopinstelling voor live beeldvorming van het beentarsale gebied van 15-30 uur APF wordt gegeven in aanvullend bestand 1. Fluorescentievervaging is onvermijdelijk tijdens langdurige live beeldvorming. Om dit probleem te verhelpen, is het raadzaam om minimaal laservermogen te gebruiken. De ImageJ-plug-in "AutoEnhance"16 wordt aanbevolen voor het verwerken van live beeldgegevens om vervagingseffecten te compenseren.
Resultaten
Hier wordt een voorbeeld beschreven van 44-uurs live beeldvorming van de zich ontwikkelende volwassen poot van Drosophila in het popstadium. Vliegen die His2Av-mRFP17 (labelende kernen) en sGMCA18 (GFP-gelabeld actinebindend eiwit Moesin, labelende actine) tot expressie brengen, werden verzameld in het witte popstadium en gedurende 15 uur bij 25 °C geïncubeerd. Het puparium werd verwijderd en gemonteerd volgens het protocol (Figuur 2). Z-stapelbeelden van de tarsus en pretarsus, nabij de punt van het been, werden met succes elke 15 minuten van 16 uur tot 60 uur APF bij kamertemperatuur (niet strikt, maar in de buurt van 25 °C) verkregen. De eerste helft van de reeks afbeeldingen wordt getoond in Figuur 3, de tweede helft in Figuur 4 en de film van het geheel in Movie 1. Toen het beenweefsel snel smaller werd, vormden de epitheelcellen tijdelijk een intrigerende structuur, de Parthenon-achtige structuur, gekenmerkt door zijn apicobasale uitsteeksels en basale verbindingen (Figuur 3). De vermindering van de epitheeldikte werd waargenomen, zelfs nadat de omtrek bijna voltooid was (Figuur 4). Het hele proces wordt overzien in figuur 1.
Figuur 1: Het overzicht van de uiteindelijke vormvorming van de Drosophila volwassen tarsus tijdens het popstadium. Het hele proces werd opgedeeld in vijf fasen op basis van de morfologische veranderingen op zowel weefsel- als cellulair niveau die werden waargenomen in live-beeldvormingsexperimenten op lange termijn. Representatieve foto's of oppervlakkige afbeeldingen (sGMCA-signaal) die overeenkomen met verschillende tijdstippen worden aan de linkerkant weergegeven. Aan de rechterkant staan korte beschrijvingen van de gebeurtenissen in elke fase. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Hiraiwa et al.15. Zie ook Film 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Puparium verwijderen en monteren voor live beeldvorming. (A) Een witte pop verzameld in een schaal. (B) De pop vertoonde zich in (A) na 15 uur bij 25 °C te hebben geïncubeerd. Het gebied dat cyaan gekleurd is, geeft het operculum aan. (C) Een foto van een pop die op een stuk dubbelzijdig plakband is geplakt. (D-J) Reeks afbeeldingen van de procedure voor het verwijderen van puparium. (D) Het operculum wordt met een tang opgetild. (E) Het operculum wordt verwijderd. (F) Een tangpunt wordt tussen de cuticula van de pop en het puparium ingebracht. (G) Het puparium is gedeeltelijk geopend. (H) Er wordt opnieuw een pincetpunt ingebracht. (I) Het puparium ging open, waardoor slechts een klein deel van het achterste uiteinde overbleef. (J) De pop wordt opgetild door een penseel. (K) Een voorbeeld van lekkage van lichaamsvloeistof van de pop. De vloeistof die uit de wond komt die door een tangpunt wordt geprikt, wordt aangegeven door een pijlpunt. (L-N) Afbeeldingen en illustraties van de montage. (L) Een afbeelding van bovenaf met geplaatste poppen en gedestilleerd water op de bodem van een schaal met glazen bodem. (M) De schotel na voltooiing van de montage. Langs de rand rond het glasgedeelte werd siliconenvet aangebracht en er werd een dekglaasje op het vet geplaatst om het af te dichten. (N) Schematische tekening van de montageconstructie van de Drosophila-pop voor live-beeldvorming op lange termijn. (O) Een opgezette pop ontwikkelde zich bijna volwassen. (P) Een opgezette pop die zich sluit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dynamische vormveranderingen in de tarsale epitheelcellen in 16-27,5 uur APF. (A) Een illustratie van de pop gezien vanaf de ventrale zijde. De gestippelde rechthoek komt overeen met het gebied dat wordt waargenomen in (B-E). L1: eerste been, L2: tweede been, L3: derde been. (B,C,D,E) Stills van de live beeldvorming van het distale deel van de tarsus in de sGMCA (groen) en His2Av-mRFP (magenta) die vlieg tot expressie brengt. Het weefsel vernauwt zich snel en de inkeping van gewrichtsgebieden vordert. (B',C',D',E') Vergroting van gebieden omgeven door de stippellijnen in respectievelijk (B,C,D,E). De pijl en de pijlpunt in (C') tonen een voorbeeld van respectievelijk apicobasale projecties en de positie van basale verbindingen. De Parthenon-achtige structuur begint zich te vormen in (B'), wordt volledig gevormd in (C'), begint te verdwijnen in (D') en wordt moeilijk te zien in (E'). Distaal is in alle figuren naar rechts en dorsaal naar boven. Stadia worden weergegeven in de rechterbenedenhoek in (B,C,D,E). Schaal staven: B, C, D, E: 50 μm; B',C',D',E': 10 μm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Hiraiwa et al.15. Zie ook Film 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vormveranderingen in de tarsale epitheelcellaag in 41-60 uur APF. (A,B,C,D) Stilstaande beelden van dezelfde sequentiële dataset van live beeldvorming als Figuur 3. Onderbroken rechthoeken in (A,B,C,D) worden respectievelijk vergroot in (A',B',C',D'). Tegen ongeveer 48 uur APF (A-B') is de uitwendige vormvorming, zoals verlenging van borstelharen, klauwen en pulvilli, bijna voltooid. De onderkant van het geïnvaginateerde gewricht bewoog proximaal en vervolgens vorderde de vorming van de kogel-en-komstructuur na ongeveer 54 uur APF. Het morfologische verschil tussen het dorsale en ventrale epitheel werd duidelijk (dubbele pijlen en open dubbele pijlen in B',C',D'). Na 54 uur APF (C-D') nam de dikte van de epitheellaag af zonder de omtrek van de segmenten nauwelijks te veranderen. Dorsaal is naar boven en distaal naar rechts in alle figuren. Schaal staven: A, B, C, D: 50 μm; A',B',C',D': 20 μm.Dit cijfer is geciteerd uit Hiraiwa et al.15. Zie ook Film 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 5: Een voorbeeld van de beenwaarneming met behulp van de Bright Z-functie. (een, b) Afbeeldingen van het corresponderende gebied, de diepte en het stadium van de derde poot van de sGMCA (groen) en His2Av-mRFP (magenta) die vlieg tot expressie brengen, met (B) of zonder (A) met behulp van de Bright Z-functie. (A) Een XY-vlak op 59,1 μm diep, geëxtraheerd uit de waarneming van het tarsale gebied in de derde etappe om 16 uur APF, verkregen zonder gebruik te maken van de Bright Z-functie. (EEN') De dwarsdoorsnede komt overeen met de gele verticale lijn in (A). De verticale lijn in (A') geeft het brandvlak van (A) aan. (B) Een XY-vlak op 61,6 μm diep, geëxtraheerd uit de waarneming van het tarsale gebied in de derde etappe om 16 uur APF, verkregen met behulp van de Bright Z-functie. Zowel de PMT-spanning als het laservermogen werden aangepast. De zichtbaarheid van het beeld is verbeterd ten opzichte van (A). (B') De doorsnede komt overeen met de gele verticale lijn in (B). De gele verticale lijn in (B') geeft het brandpuntsvlak van (B) aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend bestand 1: Een voorbeeld van de confocale microscoopinstelling voor live beeldvorming van het beentarsale gebied van 15-30 uur APF. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Filmpje 1: Langdurige live beeldvorming van het distale deel van de tarsus gedurende 44 uur. De sGMCA (groen) en His2Av-mRFP (magenta) die vlieg tot expressie brengen, werden gebruikt. Het meest representatieve XY-vlak werd geëxtraheerd uit dezelfde dataset als Figuur 3 en Figuur 4. Pijlpunten geven voorbeelden aan van toekomstige gezamenlijke regio's. Snel bewegende cellen in het weefsel zijn macrofaagachtige cellen. Het snaarachtige signaal dat zich langs de tarsale segmenten uitstrekt, maakt deel uit van het septum. De tijdstempel toont hh: mm. Distaal is naar rechts en dorsaal naar de top. Deze film is een bewerking van Hiraiwa et al.15Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
In dit artikel wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor langdurige live beeldvorming van het Drosophila-been in het popstadium. De imaginaire schijf van het been steekt uit het centrale deel om een buisvormige structuur te vormen, en vervolgens vindt de uiteindelijke vormvorming van het volwassen been plaats in het popstadium op een manier die ongrijpbaar was. Eerdere pogingen om dit proces waar te nemen waren voornamelijk door middel van gefixeerde kleuring, weefselkweek en scanning-elektronenmicroscoop 12,13,14. Deze methoden konden geen continue veranderingen in individuele cellen volgen en er werd slechts fragmentarische informatie verkregen. Met de methode die in deze studie wordt beschreven, kan het uiteindelijke vormvormingsproces van het tarsale gebied met succes worden waargenomen als de dagenlange sequentiële live-beeldvorming door een confocale microscoop, en kunnen veranderingen in individuele cellen continu worden gevolgd. Intrigerende celdynamieken die door deze live beeldvorming aan het licht zijn gekomen, zijn in detail beschreven in het recente rapport15.
Voor succesvolle live beeldvorming op lange termijn is het van cruciaal belang om de levensvatbaarheid van de pop te behouden en ervoor te zorgen dat de ontwikkeling ervan onaangetast blijft. In de hier beschreven methode ontwikkelde de puparium-verwijderde pop zich in veel gevallen tot de faraatvolwassene en de volwassen pop (Figuur 2O,P). De timings van morfologische veranderingen van de zich ontwikkelende tarsus die met deze methode werden waargenomen, kwamen overeen met eerdere rapporten 12,13,14. Bovendien vertoonden de epitheelcellen veranderingen zoals de diktevermindering, zelfs in 48-60 uur APF (32-44 uur na montage) (Figuur 4B'-D'). Deze feiten suggereren dat de pop intact blijft en bijna geen verstoring of vertraging ondervindt in zijn normale ontwikkeling tijdens langdurige live beeldvorming met behulp van de hier beschreven methode. Houd er rekening mee dat de levensvatbaarheid van de pupariumverwijderde pop die aan live beeldvorming wordt onderworpen, kan variëren, afhankelijk van de timing van de pupariumverwijdering, de behandeling tijdens de procedure, de mate van fototoxiciteit in de beeldvorming en de gebruikte vliegenstammen.
Een van de cruciale stappen om de intactheid van de pop en de ontwikkeling ervan te garanderen, is het verwijderen van de puparium zonder de pop te beschadigen. Een stabiele hechting van de pop aan de dubbelzijdige tape en een zorgvuldige omgang met de tang zijn de sleutels tot succes. Het voorkomen van uitdroging van de pop is ook cruciaal. In dit opzicht is het van cruciaal belang om openingen tussen het dekglaasje en het siliconenvet te vermijden.
Om uitdroging van de pop te voorkomen, omvatten veel eerdere methoden de gedeeltelijke verwijdering van het puparium 1,2,3,4,5,6,7. Voor het observeren van de hele pop wordt echter de voorkeur gegeven aan volledige verwijdering van het puparium. Hoewel de maximale overlevingstijd van de pop niet bekend is, zijn er verschillende methoden gerapporteerd waarbij het puparium volledig wordt verwijderd 8,9,10. De meest gebruikelijke manier om de pop bij deze methoden van vocht te voorzien, is het gebruik van bevochtigd filterpapier. In vergelijking met de vorige methoden zorgt de hier beschreven methode voor vocht door op een eenvoudigere en gemakkelijkere manier een druppel water te doen. Bovendien is het bij veel eerdere methoden mogelijk om de pop op een glasplaatje te monteren. Bij het monteren van de puparium-verwijderde pop op een glasplaatje, kan er een probleem zijn waarbij het drukken van het dekglaasje tegen de pop spanning op de pop veroorzaakt, of een gekanteld dekglaasje ruis, vervormingen en gebrek aan helderheid in de afbeeldingen introduceert. De hier beschreven methode maakt gebruik van een schaal met glazen bodem, waardoor het niet nodig is om het dekglaasje tegen de pop te drukken, waardoor de weefsels zo dicht mogelijk bij hun natuurlijke staat kunnen worden waargenomen. Omdat het niet nodig is om de hoek van het dekglas aan te passen, is de opstelling stabiel, gemakkelijk te hanteren en betrouwbaarder. Daarom vereist deze methode bijna geen gespecialiseerde vaardigheden, waardoor zelfs beginners met succes live imaging kunnen uitvoeren.
De belangrijkste beperkingen van deze methode zijn de diepte van de waarnemingen en de tijdresoluties. Onder de omstandigheden voor het observeren van de tarsus kunnen alleen heldere beelden worden verkregen tot ongeveer 40 μm diep. Het gebruik van de Bright Z-functie helpt dit probleem op te lossen. Zoals bijvoorbeeld te zien is in afbeelding 5, verbeterde het verhogen van het laservermogen en de PMT-spanning naarmate de diepte toeneemt door gebruik te maken van de Bright Z-functie de kwaliteit van beelden op diepere posities. Het verhogen van het laservermogen gaat echter gepaard met een afweging tussen fototoxiciteit en signaalvervaging. Daarom is het noodzakelijk om de optimale omstandigheden te vinden die aansluiten bij het doel van de observatie. De tijdsresolutie is ook van belang bij het observeren van snel bewegende cellen en weefsels. Vermindering van plakjes en verkleining van de ROI zijn de belangrijkste oplossingen voor dit probleem. Het gebruik van up-to-date apparatuur met een verbeterde detectorgevoeligheid of een confocale microscoop met draaiende schijf kan de tijdresolutie verbeteren. Een andere beperking heeft betrekking op het stadium van de pop. Het puparium kan pas worden verwijderd nadat de cuticula van de pop volledig is gevormd om 12-13,5 uur APF19en kan pas gemakkelijk worden verwijderd na 14 uur APF. De vroege stadia dan 12 uur APF kunnen gedeeltelijk worden waargenomen door de pop te monteren zonder het puparium15 te verwijderen, ook al is het verkrijgen van heldere beelden moeilijk vanwege snelle weefselbewegingen en optische obstakels door het puparium in deze toestand.
Probleemoplossing
Moeilijkheid bij het verwijderen van puparium
Bij het verwijderen van het puparium is hechting van de ventrale zijde van het puparium aan de dubbelzijdige tape belangrijk. Lijm en voedsel moeten van het pupariumoppervlak worden verwijderd en vervolgens drogen is belangrijk omdat natte oppervlakken een goede hechting voorkomen. Met name de dubbelzijdige tape in de materiaaltafel heeft een sterkere hechting aan de binnenkant. De binnenste (sterkere) kant moet worden gebruikt om de pop te hechten. Het puparium knippen met een dissectieschaar in plaats van het met een tang te scheuren, is handig wanneer het verwijderen van het puparium moeilijk is.
Vloeistoflekkage uit de pop
Het is van cruciaal belang om het puparium te verwijderen zonder de pop te beschadigen. Lekkage van de lichaamsvloeistof van de pop duidt op schade aan de pop (Figuur 2K). Dergelijke poppen moeten worden vermeden van live beeldvorming. Om popbeschadiging te voorkomen tijdens het verwijderen van het puparium, is naast een voorzichtige behandeling aan te raden om een tang met relatief brede punten te gebruiken.
Slechte beeldkwaliteit
Wanneer het fluorescerende signaal te zwak is, zijn er veel manieren om de helderheid aan te passen, zoals het verhogen van de PMT-spanning, het openen van het gaatje (CA), het vertragen van de scansnelheid en het verhogen van het laservermogen. Houd er rekening mee dat elke methode bijwerkingen heeft: het verhogen van de PMT-spanning kan de ruis verhogen, het openen van het gaatje verlaagt de resolutie van de Z-as, het vertragen van de scansnelheid verlengt de scantijd en het verhogen van het laservermogen verhoogt het risico op fototoxiciteit en bleken. Afhankelijk van het interessegebied, het soort en de expressieniveaus van fluorescerende reporters en de gewenste lengte van de live-beeldvorming moeten de juiste instellingen worden gevonden. Over het algemeen wordt aanbevolen om het laservermogen te minimaliseren voor live beeldvorming op lange termijn.
Vervaging van fluorescentie
Het vervagen van fluorescentie is onvermijdelijk bij live beeldvorming op lange termijn. Om dit probleem te voorkomen, wordt minimaal gebruik van laservermogen geadviseerd. Om vervaging te compenseren, wordt de ImageJ-plug-in "AutoEnhance"16 aanbevolen bij het verwerken van de verkregen live-beeldgegevens.
Dankzij de volledige verwijdering van het puparium is deze methode zeer toepasbaar op andere weefsels, alleen al door de ROI en oriëntatie van de pop aan te passen. Inderdaad, hoewel dit geen levende beeldvorming is, werden het proximale deel van het been, de proboscis, het hoofdepitheel bij de antenne en het epitheel van de dorsale thorax met deze methode waargenomen in Hiraiwa et al.15. Een dergelijke toepasbaarheid op een breed scala aan weefsels kan verdere integratie met andere technieken, zoals optische inductie van genen, vergemakkelijken. Deze methode kan ook van toepassing zijn op andere cyclorrhapaansoorten (pupariumvormende) soorten dan Drosophila. Bovendien kan het mogelijk worden gebruikt voor andere insectensoorten als ze een transparante popnagelriem hebben. Dit artikel bevat gedetailleerde instructies voor Drosophila-onderzoekers om live beeldvorming van de pop uit te voeren om de celdynamiek in levende weefsels vast te leggen.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
We zijn Dr. Masayuki Miura (De Universiteit van Tokio) en Dr. Yuya Fujisawa (De Universiteit van Tokio) dankbaar voor technisch advies, en we danken het Bloomington Stock Center voor vliegbronnen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35 mm/glasbodem schaal | IWAKI | 3911-035 | |
| Reinigingsdoekjes | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | |
| Dumont #3c Forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Eppendorf Research plus 2-20 µL | Eppendorf | 3123000098 | |
| Vliegstam: His2Av-mRFP, sGMCA | Bloomington Drosophila Stock Center | 59023 | |
| FV3000 | EVIDENT | invers confocale microscoop | |
| FV31S-SW | EVIDENT | software voor FV3000 | |
| G40L | Shin-Etsu Silicone | silicone vet | |
| Micro Dekglas 18 x 18 mm 0.13-0.17 mm | MATSUNAMI | C018181 | |
| Micro Diapositiva 76 x 26 mm 0.9-1.2 mm | MATSUNAMI | S7213 | |
| NEO-SABLE Maat 0 rond, fijn | Pentel | XZBNR-0 | schilderskwast |
| SIL300CS-30CC | EVIDENT | silicone olie | |
| Stereomicroscoopsysteem SZX7 | EVIDENT | ||
| Terumo-sering 50 mL | Terumo | SS-50ESZ | |
| Transparant dubbelzijdig plakband | Scotch | 665-1-12 | Aangezien de binnenste laag sterker hecht dan de buitenste laag, moet de binnenste laag worden gebruikt om poppen te fixeren. |
| UPLSAPO10x | EVIDENT | ||
| UPLSAPO40XS | EVIDENT | silicone onderdompeling lens | |
| Vannas Veerschaar - 2,5 mm snijrand | Fine Science Tools | 15000-08 | optioneel |
Referenties
- Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. Temporal regulation of Drosophila IAP1 determines caspase functions in sensory organ development. J Cell Biol. 187 (2), 219-231 (2009).
- Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nat Protoc. 2 (12), 3074-3080 (2007).
- Chiba, M., et al. Activatable photosensitizer for targeted ablation of lacZ-positive cells with single-cell resolution. ACS Cent Sci. 5 (11), 1676-1681 (2019).
- Umetsu, D., et al. Local increases in mechanical tension shape compartment boundaries by biasing cell intercalations. Curr Biol. 24 (16), 1798-1805 (2014).
- Tran, N. V., et al. Programmed disassembly of a microtubule-based membrane protrusion network coordinates 3D epithelial morphogenesis in Drosophila. EMBO J. 43 (6), 568-594 (2024).
- Hellerman, M. B., Choe, R. H., Johnson, R. I. Live-imaging of the Drosophila pupal eye. J Vis Exp. (95), e52120(2015).
- O'Connor, J. T., Shannon, E. K., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Mounting Drosophila pupae for laser ablation and live imaging of the dorsal thorax. STAR Protoc. 3 (2), 101396(2022).
- Ziserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J Vis Exp. (51), e2706(2011).
- Tögel, M., Pass, G., Paululat, A. In vivo imaging of Drosophila wing heart development during pupal stages. Int J Dev Biol. 57 (1-2), 13-24 (2013).
- Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term in vivo tracking of inflammatory cell dynamics within Drosophila pupae. J Vis Exp. (136), e57871(2018).
- Kojima, T. Developmental mechanism of the tarsus in insect legs. Curr Opin Insect Sci. 19, 36-42 (2017).
- Mirth, C., Akam, M. Joint development in the Drosophila leg: Cell movements and cell populations. Dev Biol. 246 (2), 391-406 (2002).
- Mirth, C. Ecdysteroid control of metamorphosis in the differentiating adult leg structures of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 278 (1), 163-174 (2005).
- Tajiri, R., Misaki, K., Yonemura, S., Hayashi, S. Dynamic shape changes of ECM-producing cells drive morphogenesis of ball-and-socket joints in the fly leg. Development. 137 (12), 2055-2063 (2010).
- Hiraiwa, S., et al. Unveiling the cell dynamics during the final shape formation of the tarsus in Drosophila adult leg by live imaging. Dev Genes Evol. , (2024).
- ImageJ plugin page. , Signaling RIKEN. Available at: https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/ (2024).
- Pandey, R., Heidmann, S., Lehner, C. F. Epithelial re-organization and dynamics of progression through mitosis in Drosophila separase complex mutants. J Cell Sci. 118 (4), 733-742 (2005).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149 (2), 471-490 (2000).
- Ashburner, M. Drosophila: A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
Herprints en machtigingen
