Zuivering, expansie en op flowcytometrie gebaseerde fenotypering van van muizen afgeleide beenmergmesenchymale stamcellen

Summary

Het huidige protocol beschrijft een kosteneffectieve methode om zeer homogene beenmergmesenchymale stamcellen (BMSC's) van muizen te zuiveren, uit te breiden en te karakteriseren. Deze aanpak vergemakkelijkt de verwerving van grote hoeveelheden BMSC's met een hoog proliferatie- en differentiatiepotentieel, het ondersteunen van muismodellen en het bevorderen van preklinisch onderzoek.

Abstract

Mesenchymale stamcellen (MSC's) zijn een populatie van stamcellen die zichzelf kunnen vernieuwen en differentiëren tot meerdere cellijnen. Onder hen spelen MSC's die in het beenmerg worden aangetroffen, bekend als beenmergmesenchymale stamcellen (BMSC's), een cruciale rol bij osteogenese, hematopoëtische ondersteuning, homing/migratie en immunosuppressie. BMSC's worden veel gebruikt in celbiologie en weefselmanipulatieonderzoek vanwege hun potentieel voor cellulaire therapeutische strategieën, evenals hun gemakkelijke beschikbaarheid, genetische stabiliteit en lage immunogeniciteit. Hematopoëtische stamcellen (HSC's) en BMSC's bestaan naast elkaar in het beenmerg, maar hebben verschillende voorlopercellen. Bij het extraheren van cellen uit het beenmerg worden doorgaans meerdere celtypen verkregen, wat kan leiden tot heterogeniteit in de celpopulatie, wat mogelijk vertekening kan veroorzaken en niet voldoet aan hoge experimentele normen. Daarom is het van cruciaal belang om effectieve technieken te ontwikkelen om de homogeniteit en opbrengst van BMSC's in vitro te verbeteren. Deze studie presenteert een gedetailleerd protocol voor de zuivering, expansie en op flowcytometrie gebaseerde fenotypering van BMSC's verkregen uit BALB/c-muizen. De homogeniteit en het stamcelfenotype van BMSC's met derde passage werden gekarakteriseerd met behulp van flowcytometrie, waarbij positiviteit werd aangetoond voor CD29, CD44 en Sca-1, negativiteit voor CD45 en CD31, en hun osteogene en adipogene differentiatievermogen werden bevestigd. Dit kosteneffectieve protocol biedt een gemakkelijke en efficiënte methode om een voldoende aantal homogene BMSC's te verkrijgen met een hoog proliferatie- en differentiatiepotentieel, wat essentieel is voor het bevorderen van onderzoek in muismodellen en uitgebreide preklinische studies.

Introduction

Mesenchymale stamcellen van het beenmerg (BMSC's) staan bekend om hun multipotente eigenschappen en worden veel gebruikt bij de behandeling van verschillende ziekten vanwege hun zelfhernieuwbare, differentiatie- en immunomodulerende eigenschappen ^1,2. BMSC's zijn gemakkelijk verkrijgbaar, in staat tot uitgebreide expansie, vertonen immunosuppressieve eigenschappen en veroorzaken geen onmiddellijke immuunreacties³, waardoor ze aantrekkelijk zijn voor weefselmanipulatietoepassingen en effectieve dragers voor celtherapie.

In het beenmerg zijn twee belangrijke stamcelpopulaties en hun nakomelingen, de hematopoëtische stamcellen en de BMSC's, de primaire bewoners⁴. Traditioneel worden BMSC's verkregen door gerichte beenmergaspiratie en in vitro geïdentificeerd als plastisch-hechtende cellen. Deze methode is echter onvoldoende om BMSC's te onderscheiden van andere beenmergsubpopulaties, waaronder endotheelcellen, pericyten, leukocyten en hematopoëtische stamcellen⁵. Daarom is een eenvoudig en effectief protocol voor het isoleren van BMSC's nodig.

Het huidige werk beschrijft de scheiding en zuivering van BMSC's door hun fysieke hechting aan plastic celkweekplaten. Flowcytometrie-experimenten werden uitgevoerd op BMSC's met derde passage met behulp van de oppervlaktemarkers CD29, CD44 en Sca-1, zoals uiteengezet door de International Society for Cell & Gene Therapy (ISCT) Mesenchymale stromale cel (MSC) commissie⁶. Volgens ISCT-criteria worden MSC's van muizen gekenmerkt door positiviteit voor CD29, CD44 en stamcelantigeen 1 (Sca-1), en negativiteit voor hematopoëtische celmarker CD45 en endotheelcelmarker CD31. Bovendien moeten BMSC's multipotent zijn en trilineaire differentiatie vertonen in osteoblasten, chondrocyten en adipocyten. In dit experiment werd osteogenese geïnduceerd in de geëxtraheerde BMSC's, waarbij ALP-kleuring werd uitgevoerd op dag 7 en een alizarine rode S-test op dag 21 om differentiatie te beoordelen. Adipogene differentiatie van geïsoleerde en gezuiverde BMSC's werd ook geïnduceerd, waarbij Oil Red O-kleuring op dag 21 werd uitgevoerd om adipogenese te beoordelen.

Protocol

De omgang met dieren is goedgekeurd in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor proefdieren (ethische goedkeuring nr.: PZSHUTCM2211070009) van de Shanghai University of Traditional Chinese Medicine. In deze studie werden acht weken oude vrouwelijke BALB/c-muizen (SPF-graad, 20 ± 1 g lichaamsgewicht) gebruikt. Dit protocol schetst de zuivering, passaging, fenotypering op basis van flowcytometrie en osteogene en adipogene differentiatie van van muizen afgeleide BMSC's. De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Omgaan met dieren

1. Huisvest muizen onder specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden in individueel geventileerde kooien, met vijf muizen per kooi. Zorg voor SPF-kwaliteit voer en steriel water. Houd een licht-/donkercyclus van 12 uur aan.
   OPMERKING: Deze methode is getest en haalbaar bevonden in zowel de BALB/c- als de C57BL/6-muizenstammen. In dit artikel wordt voornamelijk BALB/c als voorbeeld gebruikt.

2. Oogsten van dijbenen en scheenbenen van de achterpoten van muizen

1. Euthanasie van de dieren via CO₂ -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie⁷ volgens ethische richtlijnen.
2. Week de muizen 5 minuten in 75% ethanol (Figuur 1A).
   OPMERKING: Stamcellen werden binnen 30 minuten² na euthanasie geoogst en het hele proces, inclusief mergspoeling, filtratie en zaaien in kweekplaten, werd binnen 2 uur voltooid om een optimale levensvatbaarheid van de cellen te garanderen.
   OPMERKING: Gebruik volwassen muizen (≥8 weken oud) voor een optimale BMSC-opbrengst; Muizen van 8-12 weken oud zijn ideale⁸.
3. Maak een incisie van ongeveer 1 cm in de achterpoot van de achillespees met een steriele dissectieschaar (Figuur 1B).
4. Maak met een steriele schaar een cirkelvormige incisie rond de achterpoot van de achillespees om het distale scheenbeen bloot te leggen (Figuur 1C).
5. Trek de huid van de incisie naar de heup om deze van beide achterpoten te verwijderen (Figuur 1D).
6. Snijd langs het darmbeen om de heupkop van het heupbeen te scheiden (Figuur 2A).
   OPMERKING: Vermijd beschadiging van de bilaterale gewrichten van het dijbeen tijdens dissectie om het verlies van beenmerg te voorkomen.
7. Plaats de verzamelde dijbenen en scheenbenen in een schaal van 60 mm met steriele pre-koude PBS met 2% penicilline/streptomycine (Figuur 2B).
8. Snijd met een steriel scalpel zoveel mogelijk pees en spieren van het scheenbeen en kuitbeen af om het later spoelen te vergemakkelijken (Figuur 2C).
9. Breng de bewerkte botten terug naar PBS met 2% penicilline/streptomycine en breng ze over naar de steriele kap voor volgende isolatiestappen.

3. Zuivering en kweek van BMSC's van muizen

1. Bereid het volledige MEM Alpha Modification (αMEM)-medium voor BMSC-cultuur door αMEM aan te vullen met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine.
   OPMERKING: Kies αMEM-medium omdat het 1000 mg/L glucose bevat, wat een relatief lage concentratie is. Dit helpt de remming van celproliferatie te voorkomen die kan optreden in omgevingen met een hoge glucosespiegel⁹
2. Neem een spuit van 50 ml en bevestig de naald die bij de spuit wordt geleverd.
3. Zuig 20 ml αMEM-medium op in de spuit van 50 ml en vervang vervolgens de naald door de naald die bij de spuit van 1 ml wordt geleverd.
   OPMERKING: Gebruik een injectienaald van 1 ml om de botgrootte aan te passen en de celbeschadiging te minimaliseren. Een spuit van 50 ml zorgt voor een efficiënte spoeling van het beenmerg met minder risico op celbesmetting door herhaaldelijk inbrengen.
4. Gebruik een schaar om beide uiteinden van het gescheiden dijbeen of scheenbeen in een steriele kap af te snijden.
5. Steek de naald langs de snijrand in het bot en spoel het beenmerg in een kweekschaaltje van 100 mm met volledig αMEM-medium (Figuur 2D).
6. Spoel de botholten herhaaldelijk door totdat de botstukken bleek lijken om er zeker van te zijn dat het meeste beenmerg is geëxtraheerd (Figuur 2E).
7. Pipetteer 40 keer voorzichtig op en neer met een pipetpunt om de geaggregeerde cellen zoveel mogelijk te verspreiden.
8. Filtreer de celsuspensie door een celzeef van 40 μm in een centrifugebuis van 50 ml om vuil, weefselfragmenten en niet-verspreide klonten te verwijderen.
9. Breng de gefilterde celsuspensie over in een celkweekschaaltje van 100 mm en voeg het volledige αMEM-medium toe tot een eindvolume van 15 ml per schaaltje.
   OPMERKING: Kweek alle beenmergcellen die zijn verzameld uit de dijbenen en scheenbenen van elke muis in een kweekschaaltje van 100 mm om de celgroei te bevorderen. Op basis van eerdere experimenten kan ongeveer 1 × 10⁷ BMC worden geïsoleerd uit een muis van 8 weken oud (uit twee dijbenen en twee scheenbenen). Deze cellen worden gezaaid in een kweekschaal van 100 mm met een dichtheid van 1,8 × 10⁵ cellen/^cm2 voor primaire cultuur.
10. Houd de schaal met beide handen vast en draai hem voorzichtig 15 keer in een achtvormige beweging om een gelijkmatige verdeling van de cellen over de schaal te garanderen.
11. Plaats de kweekschaal op 37 °C in een 5% CO₂ -incubator en kweek gedurende 5 dagen (Figuur 3A).
    OPMERKING: Vermijd het verplaatsen van de kweekschaal tijdens deze periode om een uniforme celgroei te garanderen.

4. Vervanging van αMEM-medium voor BMSC-cultuur

1. Bekijk de cellen onder een microscoop om te bepalen of ze een samenvloeiing van 80% hebben bereikt. Als dit niet het geval is, gaat u verder met het vervangen van het medium op de 5e^dag.
2. Zuig 3 ml PBS op met een steriele pasteurpipet en doseer deze vanaf een hoogte van 1 cm boven de kweekschaal op verschillende posities.
   NOTITIE: Vermijd het afgieten van vloeistof aan één kant van de schaal, omdat dit aanhangende cellen kan verwijderen als gevolg van overmatige slagkracht en een effectieve verwijdering van ongewenste cellen kan voorkomen.
3. Na het toevoegen van 3 ml PBS, schudt u de kweekschaal voorzichtig om de cellen grondig te wassen en verwijdert u PBS uit de schaal met een pipet. Herhaal het wasproces nog een keer om ervoor te zorgen dat de cellen grondig worden gewassen.
4. Zuig 15 ml volledig αMEM-medium op met een steriele pasteurpipet en doseer het vanaf 1 cm boven de kweekschaal op verschillende posities.
5. Breng de kweekschaal terug naar de broedmachine en controleer totdat de cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt voordat u gaat subkweken (Figuur 3B).

5. Passage van BMSC's

1. Was 80% van de confluente cellen twee keer met PBS (Figuur 3C).
   OPMERKING: Het wassen van de cellen met PBS vóór de spijsvertering helpt bij het verwijderen van restmedium en celafscheidingen en vermindert de MSC-hechting aan de kweekschaal.
2. Verteer de cellen met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA door 2-3 minuten te incuberen bij 37 °C in een 5% CO₂ -incubator.
3. Neutraliseer de trypsine door 4 ml volledig αMEM-medium aan de celsuspensie toe te voegen.
4. Zuig de celsuspensie uit de kweekschaal met behulp van een pipetpunt van 1 ml en spoel de bodem van de schaal voorzichtig door om alle aanhangende cellen los te maken.
5. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Gebruik een pipet om het bovenstaande weg te gooien en suspendeer de celpellet in 2 ml volledig αMEM-medium.
   OPMERKING: Voor subcultuur bleek een zaaidichtheid van ongeveer 4 × 10⁴ cellen/^cm2 optimaal te zijn voor verdere groei en proliferatie.
7. Splits de cellen in een verhouding van 1:1-1:2 in nieuwe celkweekschaaltjes van 100 mm (dit vormt de 1e^passage, P1) (Figuur 3D).
8. Splits de cellen ongeveer elke drie dagen in een verhouding van 1:1,5 wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken om de tweede passage (P2) (Figuur 3E) en de derde passage (P3) (Figuur 3F) van BMSC's te genereren.

6. Voorbereiding van P3 BMSC's voor fenotypische identificatie en osteogene differentiatie

1. Gooi het celkweekmedium weg.
2. Was de P3 BMSC's twee keer met 3 ml PBS.
3. Vereer de P3 BMSC's met 1 ml 0,25% trypsine-EDTA door 2-3 minuten bij 37 °C in een 5% CO₂ -incubator te incuberen wanneer ze 80% samenvloeiing bereiken.
4. Neutraliseer de trypsine door 4 ml volledig αMEM-medium aan de celsuspensie toe te voegen.
5. Breng de celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 300 × g en gooi het bovenstaande weg.
   OPMERKING: De P3 BMSC-pellets die hier worden bereid, zullen worden gebruikt voor fenotypische identificatie via flowcytometrie en voor het beoordelen van osteogene of adipogene differentiatie.

7. Fenotypische identificatie van BMSC's door middel van flowcytometer

1. Resuspendeer de celpellets van P3 BMSC's met 1,5 ml PBS-oplossing met 2% FBS en stel de concentratie in op 5 × 10,6 cellen/ml.
2. Aliquot 100 μL van de celsuspensie in elk van de 11 buisjes om 5 × 10⁵ cellen per buis te verkrijgen. Bereid de volgende groepen voor: blanco label, CD29 isotypecontrole, CD29, CD44 isotypecontrole, CD44, Sca-1 isotypecontrole, Sca-1, CD31 isotypecontrole, CD31, CD45 isotypebesturing en CD45.
   OPMERKING: In de huidige studie werden de volgende fluorochromen gebruikt: CD29-FITC, CD29 isotype-FITC, CD44-APC, CD44 isotype-APC, Sca-1-PECy7, Sca-1 isotype-PECy7, CD45-PerCPcy5.5, CD45 isotype-PerCPcy5.5, CD31-PE en CD31 isotype-PE (zoals weergegeven in de materiaaltabel). Deze fluorochromen kunnen worden gemodificeerd op basis van de configuraties van verschillende flowcytometers.
3. Voeg voor elke groep de volgende reagentia toe: 2 μl PBS aan de blanco groep met het etiket, 2 μl CD29-isotype aan de CD29-isotypecontrolegroep (1:50-verdunning), 2 μl CD29 aan de CD29-groep (1:50-verdunning), 0,5 μl CD44-isotype aan de CD44-isotypecontrolegroep (1:200-verdunning), 0,5 μl CD44 aan de CD44-groep (1:200-verdunning); 0,5 μl isotype Sca-1 voor de Sca-1 isotype controlegroep (1:200 verdunning), 0,5 μl Sca-1 voor de Sca-1 groep (1:200 verdunning), 2 μl CD31 isotype voor de CD31 isotype controlegroep (1:50 verdunning), 2 μl CD31 voor de CD31 groep (1:50 verdunning), 2 μl CD45 isotype voor de CD45 isotype controlegroep (1:50 verdunning), en 2 μl CD45 tot de CD45-groep (verdunning 1:50).
   OPMERKING: Antilichamen werden gebruikt volgens de geoptimaliseerde aanbevelingen van de fabrikant voor flowcytometrie. Voorlopige experimenten bevestigden optimale kleuring en specificiteit voor doelcellen. Raadpleeg de doseringsrichtlijnen van de fabrikant en voer indien nodig titervoortests uit.
4. Meng voorzichtig, centrifugeer met behulp van een handcentrifuge en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker.
5. Voeg 900 μL PBS toe aan elke buis, meng door inverteren en centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg om overtollige antilichamen te verwijderen.
6. Resuspendeer de celpellet in elk buisje met 300 μL PBS en analyseer met behulp van een flowcytometer.
   OPMERKING: Cellen hoeven niet te worden gefixeerd met 2,5% neutraal formaldehyde als de flowcytometertest binnen 1-2 uur kan worden voltooid. Als de analyse niet binnen 1-2 uur kan worden uitgevoerd, fixeer de cellen dan met 2,5% neutraal gebufferde formaline (bereid door 10% neutraal gebufferde formaline te mengen met PBS in een verhouding van 1:3) en bewaar ze 's nachts bij 4 °C in het donker voor een latere flowcytometertest.
7. Pas de spanning van de flowcytometer aan met behulp van de blanco groep van het label om ervoor te zorgen dat de autofluorescentie van de cel zich binnen ongeveer 1/4-1/3 van de coördinaatas bevindt. Laad achtereenvolgens de cellen van de groepen CD29 isotype, CD29, CD44 isotype, CD44, Sca-1 isotype, Sca-1, CD31 isotype, CD31, CD45 isotype en CD45. Stel de P1-poort in (zoals gedefinieerd in de FSC/SSC-plot) om 10.000 cellen op te vangen, die op gemiddelde snelheid worden uitgevoerd.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat de flowcytometer is uitgerust met de juiste kanalen, zoals die gewoonlijk in de experimenten worden gebruikt: FITC, PE, PerCp-Cy5.5, PE-Cy7 en APC, of andere kanalen die overeenkomen met antilichaamgekoppelde fluoresceïnen.

8. Osteogene differentiatie van BMSC's

1. Resuspendeer P3 BMSC-pellets in een volledig αMEM-medium en stel de concentratie in op 1 × 10⁵ cellen/ml.
2. Zaai P3 BMSC's in een celkweekplaat met 24 putjes door 1 ml compleet αMEM-medium met 1 × 10⁵ cellen aan elk putje toe te voegen.
3. Kweek de P3 BMSC's 3-5 dagen bij 37 °C in een 5% CO₂ -incubator totdat ze meer dan 90% samenvloeiing bereiken. Vervang het volledige αMEM-medium elke 2 dagen door vers medium.
4. Verdeel de verschillende putjes gelijkmatig in twee groepen: de negatieve controlegroep (zonder osteogene differentiatie-inductie) en de osteogene differentiatiegroep
5. Bereid het osteogene differentiatie-inductiemedium voor door het volledige αMEM-medium aan te vullen met 10 mmol/L β-glycerofosfaat, 50 mg/L L-ascorbinezuur en ^10-8 mol/L dexamethason.
6. Gooi het celkweekmedium weg en was de P3 BMSC's met 1 ml PBS.
7. Voeg het osteogene differentiatie-inductiemedium toe aan de putjes van de osteogene differentiatiegroep voor de osteogene differentiatie-inductie (1 ml/putje).
8. Voeg het volledige αMEM-medium toe aan de putjes van de controlegroep (1 ml/putje).
9. Kweek de P3 BMSC's gedurende 7 of 21 dagen bij 37 °C in een 5% CO₂ incubator, waarbij het osteogene differentiatie-inductiemedium of het volledige αMEM-medium om de 3 dagen wordt vervangen door hetzelfde verse medium.
   OPMERKING: Cellen met een 7-daagse inductie worden gebruikt voor de alkalische fosfatase (ALP) kleuring. Cellen met een inductie van 21 dagen worden gebruikt voor de alizarine-rode S-test.

9. Identificatie van gedifferentieerde osteogene cellen met ALP-kleuring

1. Was de cellen in elk putje van de plaat met 24 putjes eenmaal met 1 ml PBS.
2. Fixeer de cellen door 0,5 ml 10% gebufferde formalineoplossing toe te voegen en gedurende 20 minuten te incuberen.
3. Was de cellen in elk putje opnieuw met 1 ml PBS eenmalig.
4. Voeg 0,5 ml alkalische fosfatasekleuringsreagens 1-Step NBT/BCIP toe aan elk putje en incubeer 30 minuten bij 37 °C met aluminiumfolie ter bescherming tegen licht.
5. Gooi de oplossing weg, was de cellen in elk putje eenmaal met 1 ml gedestilleerd water en laat de plaat drogen.
6. Observeer en verkrijg beelden van gekleurde kolonies met behulp van een camera om ALP-positieve cellen met zwart-paars neerslag te identificeren.
   OPMERKING: Het alkalische fosfatase (ALP) kleuringsreagens 1-Step NBT/BCIP produceert een sterk, onoplosbaar zwart-paars neerslag bij reactie met ALP, dat gemakkelijk kan worden gevisualiseerd.

10. Identificatie van gedifferentieerde osteogene cellen door middel van alizarine rood S-test

1. Was de cellen in elk putje van de plaat met 24 putjes eenmaal met 1 ml PBS.
2. Fixeer de cellen door 0,5 ml 10% gebufferde formalineoplossing toe te voegen en gedurende 20 minuten te incuberen.
3. Was de cellen in elk putje van de plaat met 24 putjes eenmaal met 1 ml PBS.
4. Voeg 0,5 ml 0,1% alizarine rood S in 0,1 mol/L Tris-HCl (pH 8,3) toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C gedurende 30-60 min.
5. Gooi de oplossing weg, was de cellen in elk putje eenmaal met 1 ml gedestilleerd water en laat de plaat drogen.
6. Observeer en verkrijg beelden van gekleurde kolonies met behulp van een camera om alizarine rode S-positieve cellen te identificeren.
   OPMERKING: De alizarinerode S-test voor MSC-differentiatie in rijpe gemineraliseerde botcellen resulteert in de vorming van een alizarinerood S-calciumcomplex, dat een helderrode vlek produceert die visueel kan worden waargenomen.

11. Bereiding van adipogene inductiedifferentiatiemedia A voor BMSC's

OPMERKING: Voor adipocytendifferentiatie van BMSC's wordt vaak een adipogene differentiatiekit voor beenmergmesenchymale stamcellen van muizen gebruikt volgens de richtlijnen.

1. Plaats het foetaal runderserum (een bestanddeel van de kit, serum genoemd) gedurende ten minste 6 uur in de koelkast van 4 °C voordat u het volledig ontdooit.
2. Plaats Supplement A-I (onderdeel van de Kit) ten minste 30 minuten voor bereiding in de koelkast van 4° C; plaats Supplement A-II (onderdeel van de kit) op kamertemperatuur tot het volledig ontdooid is.
3. Keer de reagensbuis om of tik er zachtjes op om de inhoud te mengen.
4. Centrifugeer de Supplement A-II reagensbuis bij 300 × g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om ervoor te zorgen dat het reagens zich op de bodem verzamelt zodat het gemakkelijk kan worden opgehaald.
5. Reinig de buitenverpakking van alle onderdelen grondig met 75% medische alcohol en open ze in een bioveiligheidskast.
6. Voeg serum, Supplement A-I en Supplement A-II toe aan het medium.
   OPMERKING: Om een goede oplossing te garanderen, verwarmt u het basale medium (een onderdeel van de kit) voor op 37 °C, anders kan supplement A-II neerslaan als gevolg van blootstelling aan kou.
7. Gebruik een kleine hoeveelheid Basal Medium om elke fles en tube te spoelen en zorg ervoor dat alle componenten in het Basale Medium worden overgebracht.
8. Zet de dop vast op de Basal Medium-fles en schud voorzichtig om goed te mengen.
9. Sluit de fles af met paraffinefolie, wikkel hem in aluminiumfolie en label hem met de naam, bereidingsdatum en andere details.

12. Bereiding van adipogene inductiedifferentiatiemedia B voor BMSC's

1. Plaats het foetaal runderserum ten minste 6 uur in de koelkast van 4 °C voordat u het volledig ontdooit.
2. Plaats Supplement B (een onderdeel van de Kit) in een koelkast van 4 °C totdat het volledig is ontdooid gedurende ten minste 30 minuten voordat u het bereidt.
3. Keer de reagensbuis om of tik er zachtjes op om de inhoud te mengen.
4. Centrifugeer de buis van Supplement B om het reagens op de bodem te concentreren om het gemakkelijker te verzamelen.
5. Reinig de buitenverpakking van alle onderdelen grondig met 75% medische alcohol en open ze in een bioveiligheidskast.
6. Voeg serum en supplement B toe aan het basale medium.
7. Gebruik een kleine hoeveelheid van het basale medium om elke fles en tube te wassen en zorg ervoor dat alle componenten volledig op het medium worden overgebracht.
8. Zet de dop vast op de Basal Medium-fles en schud voorzichtig om goed te mengen.
9. Sluit de fles af met parafilm, wikkel hem in aluminiumfolie en label hem met de naam, bereidingsdatum en andere details.

13. Differentiatie van adipocyten van BMSC's

1. Voeg 1 ml 0,1% gelatine toe aan een bord met zes putjes en schud het om de bodem van elk putje gelijkmatig te bedekken.
2. Plaats de met 0,1% gelatine beklede zesputjesplaat minstens 30 minuten in een steriele kap of CO₂ -incubator.
3. Zuig de gelatine op en de plaat is klaar om te zaaien, of wacht tot de putjes droog zijn voordat u na 30 minuten zaait.
4. Zaai de P3 BMSC's met een dichtheid van 4 × 10⁴ cellen/^cm2 in elk putje van de plaat met zes putjes, en voeg 2 ml volledig medium toe aan elk putje.
5. Incubeer de cellen bij 37 °C in een CO₂ -incubator met 5% CO₂ en verzadigde vochtigheid.
6. Zuig het medium voorzichtig op en voeg 2 ml adipogeen differentiatie-inductiemedium A toe aan elk putje wanneer de cellen 100% samenvloeiing bereiken.
7. Zuig medium A na 3 dagen inductie uit de putjes en voeg 2 ml adipogeen differentiatiemedium B toe.
8. Zuig medium B na 1 dag op en schakel terug naar medium A voor verdere inductie.
9. Wissel af tussen medium A en B en observeer de cellen dagelijks. Als celcontractie of -dood optreedt tijdens inductie met medium A, schakel dan onmiddellijk over naar medium B.
10. Herhaal het inductie- en onderhoudsproces totdat er een voldoende aantal lipidedruppels van de juiste grootte verschijnen en bereid u vervolgens voor op de kleuring.

14. Olierood O (ORO) kleuring

OPMERKING: Voer alle procedures zo voorzichtig mogelijk uit om te voorkomen dat de lipidedruppels losraken.

1. Zuig het adipogene inductiedifferentiatiemedium op van de plaat met 6 putjes nadat de adipogene inductiedifferentiatie is voltooid en was voorzichtig met 1×PBS 2-3 keer.
2. Voeg 2 ml 10% neutraal gebufferde formaline toe per putje en fixeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
3. Bereid Oil Red O werkoplossing door Oil Red O bouillon te mengen met gedestilleerd water in een verhouding van 3:2. Centrifugeer na het mengen 4 minuten bij 250 × g en gebruik de supernatant.
4. Zuig het fixeermiddel op en was voorzichtig 2-3 keer met PBS, zorg ervoor dat het fixatief grondig wordt verwijderd.
5. Voeg 0,8 ml rode O-kleurstofoplossing toe aan elk putje en laat 30 minuten op kamertemperatuur staan.
6. Zuig de vlekoplossing op, was tweemaal met 1 ml 75% ethanol.
7. Voeg gedurende 2 minuten 1 ml hematoxyline-tegenvlek toe aan elk putje en aspireer dan.
8. Voeg 2 ml PBS toe aan elk putje en bekijk de adipogene kleuringsresultaten onder een microscoop.
9. Sluit de bevlekte plaat met zes putjes af met parafilm en bewaar bij 4 °C.
   OPMERKING: Niet langer dan 1 week bewaren. De lipidedruppels kunnen samensmelten, waardoor de kleuringstoestand verloren gaat.

Results

Van muizen afgeleide BMSC's werden gedurende ongeveer 2 weken geïsoleerd en gekweekt om de derde passage (P3) BMSC's te genereren (Figuur 3). Zoals te zien is in figuur 3A, bleven cellen die vers uit het beenmerg waren geëxtraheerd mononucleair met zichtbare vetdruppels. Spoelvormige cellen verschenen in de kweekschaal en bereikten een samenvloeiing van 60%-80% op de 5e^kweekdag (

Discussion

Stamceltherapie heeft veel belangstelling gewekt vanwege het potentieel om een revolutie teweeg te brengen in de regeneratieve geneeskunde. Preklinische studies hebben substantieel bewijs opgeleverd ter ondersteuning van de klinische toepassing van stamcellen, met name BMSC's¹³. Uitdagingen zoals lage celopbrengst, contaminatie en langzame groei hebben de klinische toepassing ervan echter belemmerd. Daarom is er dringend behoefte aan onderzoek dat zich richt op de...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL spuit(22G spuitnaald)	KINDLY GROUP(KDL)	60017031
1-Step NBT/BCIP	Pierce Biotechnology, Inc.	34042	Alkaline fosfataseverkleuring
10% neutraal gebufferd formaline	Wexis	5200250	celfixatie
6-well plaat	Labselect	11110	Celcultuur
24-well plaat	Labselect	11310	Celcultuur
40 μm Cell Strainer	Cornig	352340	Filtratie om agglomeraten te verwijderen
50 mL spuit	KINDLY GROUP(KDL)	60017040
75% ethanol	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	31009001	Desinfecteer de huid van muizen
Alizarine Rood S	Sigma-Aldrich	A5533	Calciumafzettingen en verkalkte knobbeltjes detectie
APC CD44 monoklonaal antilichaam (klon:IM7)	eBioscience	17-0441-82	Flow cytometry
APC Rat IgG2b kappa Isotype Control (Klon:eB149/10H5)	eBioscience	17-4031-82	Flow cytometry
Autoclaaf	Japan Hiryama Company	HVE-50	Sterilisatie chirurgische instrumenten
CO2 incubator	Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.	300583057	Celcultuur
Cytoflex flowmetrie	Beckman Coulter	A00-1-1102	Flow cytometry
dexamethason	Sigma-Aldrich	D4902	BMSCs osteogene differentiatie
Schaal (100mm)	Corning	430167	Celcultuur
Schaal (60mm)	Corning	430166	Plaats monsters tijdens transplantatie
Desinfecterende wattenbolletjes	Shanghai Honglong Industrial Co., Ltd.	20230627	Desinfecteer de huid van muizen
Sterile wegwerphandschoenen	Shanghai Honglong Industrial Co.,Ltd	YT21131	Steriele operatie
Dubbele leeuw bestraalde knaagdier dieet	Suzhou Shuangshi Experimental Animal Feed Technology Co., Ltd.	GB 14924.3	Diervoeding
Fetaal runderserum	Shanghai Biosun Sci&Tech Co.,Ltd.	BS-0002-500	Celcultuur
FITC Hamster Anti-Rat CD29 (klon:Ha2/5)	BD Biosciences	555003	Flow cytometry
FITC Hamster IgM, λ1 Isotype Control (klon:G235-1)	BD Biosciences	553960	Flow cytometry
gelatine (0,1%)	OriCell	GLT-11301	Verbeter de hechtingscapaciteit van cellen
IVC's muizenkooi	Suzhou Monkey King Animal Experimental Equipment Technology Co., Ltd.	HH-MMB-2	Dierlijke barrière
L-ascorbinezuur	Sigma-Aldrich	A8960	BMSCs osteogene differentiatie
Markeerpen	Zebra Trading (Shenzhen) Co.,Ltd.	YYST5	Markeer de cellulaire informatie op de petrischaal
MEM Alpha Modificatie (1X)	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	SH30265	Celcultuur
Muis Botuinmerg Mesenchymale Stamcellen Adipogene Differentiatie Kit	Cyagen	MUXMX-90031	BMSCs adipogene differentiatie
Nikon Eclipse Ti2 Inverted Microscope Systeem	Japan Nikon Corporatin	Ti2-U	Observeer de cellen en foto's nemen
Oogheelkundige schaar	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	Y00030 JZ	Snij de huid
Oogheelkundige pincet	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-ZER-S-100 Biosharp	Verkrijg muizenbotweefsel.
PASTEUR PIPETTE	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	BS-XG-03M	Zuig het kweekmedium
PE Rat Anti-Mouse CD31 (klon:Ha2/5)	BD Biosciences	553373	Flow cytometry
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control (klon:R35-95)	BD Biosciences	553930	Flow cytometry
PE-Cyanine7 Ly-6A/E (Sca-1) Monoclonal Antilichaam (klon:D7)	eBioscience	25-5981-82	Flow cytometry
PE-Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control (klon:eBR2a)	eBioscience	25-4321-82	Flow cytometry
Penicilline-Streptomycine	Shanghai NianYue Biotechnology Co., Ltd	2585636	Celcultuur
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 (klon:Ha2/5)	BD Biosciences	561869	Flow cytometry
PerCP-Cy5.5 Rat IgG2b, κ Isotype Control (klon:A95-1)	BD Biosciences	550764	Flow cytometry
Schilfers	Surgical Instrument Factory oShanghai Medical Devices?Group?Co., Ltd.	J11010-10# JZ	Isoleer de achterpoten en romp van de muis, en verwijder overtollig weefsel van het bot
Steriele kap	Thermo Fisher Technology (China)Co., Ltd.	ECO0.9	Chirurgische operatietafel
steriele chirurgische schermen	Henan Huayu Medical Equipment Co., Ltd.	20160900	Zorg voor een steriele operatiegebied
Buis (50 mL)	Shanghai Baisai, Biotechnology Co., Ltd.	BLD-BL2002500	Bewaar de gefilterde celoplossing
trypsine-EDTA (0,25%)	Gibco	25200056	verteer adhesieve cellen
β-glycerofosfaat	Sigma-Aldrich	G5422	BMSCs osteogene differentiatie