Mechanische krachten manipuleren in het zich ontwikkelende zebravishart met behulp van magnetische kralen

Summary

Dit protocol schetst een methode voor het enten van een magnetische kraal in het zich ontwikkelende zebravishart door middel van microchirurgie, waardoor mechanische krachten in vivo kunnen worden gemanipuleerd en mechanische stimulusafhankelijke calciuminstroom in endocardiale cellen kan worden geactiveerd.

Abstract

Mechanische krachten geven continu feedback aan morfogenetische programma's van hartkleppen. Bij zebravissen is de ontwikkeling van de hartklep afhankelijk van hartcontractie en fysieke prikkels die worden gegenereerd door het kloppende hart. Intracardiale hemodynamica, aangedreven door de bloedstroom, komt naar voren als fundamentele informatie die de ontwikkeling van het embryonale hart vormgeeft. Hier beschrijven we een effectieve methode om mechanische krachten in vivo te manipuleren door een magnetische kraal met een diameter van 30 μm tot 60 μm in het hartlumen te transplanteren. Het inbrengen van de kraal wordt uitgevoerd door middel van microchirurgie in verdoofde larven zonder de hartfunctie te verstoren en maakt kunstmatige wijziging van de randvoorwaarden mogelijk, waardoor de stromingskrachten in het systeem worden gewijzigd. Als gevolg hiervan versterkt de aanwezigheid van de kraal de mechanische krachten die door endocardiale cellen worden ervaren en kan het direct mechanische stimulusafhankelijke calciuminstroom veroorzaken. Deze benadering vergemakkelijkt het onderzoek naar mechanotransductieroutes die de ontwikkeling van het hart regelen en kan inzicht geven in de rol van mechanische krachten in de morfogenese van de hartklep.

Introduction

Sinds de introductie in de^{late jaren} 1970 1 heeft de zebravis (Danio rerio) zich ontpopt als een krachtig modelsysteem voor het bestuderen van de fijne kneepjes van de hartontwikkeling en aangeboren hartaandoeningen. In tegenstelling tot de meeste gewervelde dieren, waaronder muizen- en kuikenembryo's, die afhankelijk zijn van een functioneel cardiovasculair systeem en vroege hartafwijkingen niet kunnen overleven, bieden zebravissen een uniek voordeel door het onderzoek naar ernstige hartfenotypes mogelijk te maken. Dit komt door hun kleine formaat, dat voldoende zuurstoftoevoer mogelijk maakt door pas....

Protocol

De procedures voor het werken met zebravisembryo's die in dit protocol worden beschreven, voldoen aan de Europese richtlijn 2010/63/EU en de richtlijnen van het ministerie van Binnenlandse Zaken in het kader van de projectvergunning PP6020928.

1. Het verkrijgen van zebravisembryo's voor het enten van kralen

1. Kruis de betreffende zebravislijn en laat de embryo's groeien in Danieau's medium bij 28,5 °C. Voor meer gedetailleerde instructies over het kruisen van zebravislijnen, zie de JoVE Science Education Database²⁷.
2. Behandel de embryo's met 1-fenyl....

Results

Voorbeelden van succesvolle pareltransplantatie worden weergegeven in Figuur 3, Video 3 en Video 4. De magnetische kraal was correct gepositioneerd in het atrium van het hart van de zebravis, waardoor een onbelemmerde bloedstroom mogelijk was en er geen waargenomen bloeding was. Bovendien behielden de hartwanden hun structurele integriteit zonder in te storten (Figuur 3 en Video 3

Discussion

Kritieke stappen in het protocol en probleemoplossing

Montage van zebravisembryo's

De hoeveelheid agarose die wordt gebruikt om de embryo's op te bouwen is belangrijk. De gevormde koepel mag niet te groot zijn, omdat dit de manipulatie van de kraal van het oppervlak naar de embryo's kan belemmeren. Omgekeerd mag het niet te klein zijn; Het hebben van meerdere kralen bovenop de agarose, dich.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Essential equipment for zebrafish raising, breeding, and embryo collection
Glass-bottom dish (35 mm x 15 mm)	VWR International	734-2905
Heat block	Eppendorf	EP5382000031	Eppendorf ThermoMixer C
Jewelers forceps	Sigma-Aldrich	F6521-1EA	Dumont No. 5, L 4 1/4 in., Inox alloy
Microcentrifuge tubes 2 mL	Eppendorf	30120094
Pasteur pipette
Petri dish
Stereomicroscope
Reagents
4 mg/mL tricaine stock solution
Danieau's medium (60x stock solution)
PureCube Glutathione MagBeads	Cube Biotech	32201
PTU (1-phenyl-2-thiourea)	Sigma-Aldrich	P7629
UltraPure low melting point agarose	Invitrogen	16520-050
Danieau's medium (60x stock solution)
34.8 g NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
1.6 g KCl	Sigma-Aldrich	P9541
5.8 g CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
9.78 g MgCl2·6H2O	Sigma-Aldrich	442611-M
Dissolve the ingredients in H2O to a final volume of 2 L. Adjust the pH to 7.2 using NaOH, then autoclave.
4 mg/mL tricaine stock solution
400 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma-Aldrich	A5040
97.9 mL double-distilled H2O
2.1 mL 1 M Tris (pH 9)
Adjust the pH to 7, then aliquot and store at -20 °C.