Dit protocol schetst een methode voor het enten van een magnetische kraal in het zich ontwikkelende zebravishart door middel van microchirurgie, waardoor mechanische krachten in vivo kunnen worden gemanipuleerd en mechanische stimulusafhankelijke calciuminstroom in endocardiale cellen kan worden geactiveerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Mechanische krachten manipuleren in het zich ontwikkelende zebravishart met behulp van magnetische kralen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Mechanische krachten geven continu feedback aan morfogenetische programma's van hartkleppen. Bij zebravissen is de ontwikkeling van de hartklep afhankelijk van hartcontractie en fysieke prikkels die worden gegenereerd door het kloppende hart. Intracardiale hemodynamica, aangedreven door de bloedstroom, komt naar voren als fundamentele informatie die de ontwikkeling van het embryonale hart vormgeeft. Hier beschrijven we een effectieve methode om mechanische krachten in vivo te manipuleren door een magnetische kraal met een diameter van 30 μm tot 60 μm in het hartlumen te transplanteren. Het inbrengen van de kraal wordt uitgevoerd door middel van microchirurgie in verdoofde larven zonder de hartfunctie te verstoren en maakt kunstmatige wijziging van de randvoorwaarden mogelijk, waardoor de stromingskrachten in het systeem worden gewijzigd. Als gevolg hiervan versterkt de aanwezigheid van de kraal de mechanische krachten die door endocardiale cellen worden ervaren en kan het direct mechanische stimulusafhankelijke calciuminstroom veroorzaken. Deze benadering vergemakkelijkt het onderzoek naar mechanotransductieroutes die de ontwikkeling van het hart regelen en kan inzicht geven in de rol van mechanische krachten in de morfogenese van de hartklep.
Inleiding
Sinds de introductie in delate jaren 1970 1 heeft de zebravis (Danio rerio) zich ontpopt als een krachtig modelsysteem voor het bestuderen van de fijne kneepjes van de hartontwikkeling en aangeboren hartaandoeningen. In tegenstelling tot de meeste gewervelde dieren, waaronder muizen- en kuikenembryo's, die afhankelijk zijn van een functioneel cardiovasculair systeem en vroege hartafwijkingen niet kunnen overleven, bieden zebravissen een uniek voordeel door het onderzoek naar ernstige hartfenotypes mogelijk te maken. Dit komt door hun kleine formaat, dat voldoende zuurstoftoevoer mogelijk maakt door passieve diffusie, waardoor overleving mogelijk is, zelfs bij afwezigheid van hartcontractie en actieve bloedcirculatie 2,3,4. Bovendien is een van de vele belangrijke kenmerken van zebravissen de optische transparantie van hun embryo's, waardoor niet-invasieve monitoring van het zich ontwikkelende hart mogelijk is 5,6,7,8.
Mechanische krachten geven continu feedback aan de morfogenetische programma's van de hartklep: 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 , en afwijkende bloedstroom wordt algemeen erkend als een gedeelde factor bij verschillende cardiovasculaire aandoeningen23,24. Bij zebravissen is de ontwikkeling van de hartklep afhankelijk van de samentrekking van het hart en de mechanische krachten die door het kloppende hart worden opgewekt. Meerdere zebravismutanten hebben het belang aangetoond van door het hart gegenereerde mechanische stimuli bij valvulogenese. Opmerkelijk is dat de volledige afwezigheid van hartcontractie en, bijgevolg, bloedstroom als gevolg van mutaties van cardiaal troponine T (tnnt2) in stille hart (sih) mutanten resulteert in de afwezigheid van weefselconvergentie en clustering van endocardiale cellen (EdC) tijdens vroege morfogenetische stadia25.
Intracardiale hemodynamica en mechanische krachten die door de bloedstroom worden gegenereerd, komen naar voren als fundamentele epigenetische componenten die de ontwikkeling van het embryonale hart van de zebravis vormgeven. Talrijke studies suggereren dat een goede cardiale morfogenese bij zebravissen duidelijke stroomstimuli vereist, en afwijkingen van deze fysiologische patronen leiden tot hartklepdefecten 10,13,14,22,26. Hier beschrijven we een effectieve methode, aangepast van Fukui et al.13, om mechanische krachten in vivo te manipuleren door een magnetische kraal met een diameter van 30 μm tot 60 μm te enten in het zich ontwikkelende kloppende hart van de zebravis. De techniek omvat microchirurgische inbreng van een kraal in het hartlumen van verdoofde larven zonder de hartfunctie te verstoren. De aanwezigheid van de kraal leidt tot de versterking van de mechanische krachten die door EdC's worden ervaren, waardoor mechanische stimulusafhankelijke calciuminstroom direct wordt geactiveerd13. Deze benadering maakt het mogelijk om mechanotransductieroutes te onderzoeken die de morfogenese van het hart reguleren en biedt een middel om ons begrip van de rol van mechanische krachten bij klepvorming te verdiepen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De procedures voor het werken met zebravisembryo's die in dit protocol worden beschreven, voldoen aan de Europese richtlijn 2010/63/EU en de richtlijnen van het ministerie van Binnenlandse Zaken in het kader van de projectvergunning PP6020928.
1. Het verkrijgen van zebravisembryo's voor het enten van kralen
- Kruis de betreffende zebravislijn en laat de embryo's groeien in Danieau's medium bij 28,5 °C. Voor meer gedetailleerde instructies over het kruisen van zebravislijnen, zie de JoVE Science Education Database27.
- Behandel de embryo's met 1-fenyl-2-thioureum (PTU) vanaf 24 uur na de bevruchting (hpf) om de pigmentvorming te remmen, met behulp van een concentratie van 0,003% PTU in het medium van Danieau.
- Als u een fluorescerend gelabelde lijn gebruikt, onderzoek dan de embryo's onder een fluorescentiestereoscoop voordat u begint met het enten van kralen en selecteer 10-20 gezonde embryo's die een heldere fluorescentie vertonen. Ontchorioneer de vooraf geselecteerde embryo's voorzichtig onder de stereomicroscoop met een pincet en zorg ervoor dat de embryo's niet worden beschadigd.
2. Montage van zebravisembryo's
- Bereid 20 ml Danieau's medium met 0,02% tricaïne.
- Bereid 2 ml aliquots van 1% agarose met een laag smeltpunt (LMP) met 0,02% tricaïne in microcentrifugebuisjes van 2 ml. Plaats de buizen in een warmteblok van 38 °C om de LMP-agarose in vloeibare toestand te houden.
LET OP: De 1% LMP agarose kan van tevoren worden klaargemaakt voor gebruik op de dag van montage en parelen. - Breng 3-6 gedechorioneerde embryo's over naar een petrischaal met Danieau's medium aangevuld met 0,02% tricaïne.
- Wanneer de embryo's zijn verdoofd, plaatst u ze over in een schaal van 35 mm x 15 mm met glazen bodem met minimaal medium. Voeg snel 300-400 μL 1% LMP-agarose met tricaïne toe om een koepel te creëren. Plaats de embryo's met een pincet zo dat ze rechtop liggen, in contact met het glas, met de buikzijde naar boven, zoals weergegeven in figuur 1. Wacht ~4 minuten totdat de agarose is gestold.
OPMERKING: De hoeveelheid agarose die wordt gebruikt voor het monteren van embryo's is erg belangrijk. Streef naar een koepel van ongeveer 350 μL, die voldoende dekking moet bieden en tegelijkertijd een paar millimeter ruimte boven de embryo's laat. Voor beginners kan het monteren van een kleiner aantal embryo's tegelijk een veiligere aanpak zijn.
3. Kralen enten
- Zodra de agarose is gestold, legt u er ongeveer 0,5 μl magnetische kralen op.
OPMERKING: Gebruik een pipetpunt van 10 μl om de magnetische kralen over te brengen. Een nauwkeurige meting van 0,5 μl is niet nodig, omdat de korrels sterk geconcentreerd zijn in de suspensie. Gewoon de punt in de injectieflacon steken na het centrifugeren is voldoende om voldoende kralen te verzamelen. - Voeg een druppel Danieau's medium met 0,02% tricaïne toe aan de agarose en de kralen.
- Selecteer de juiste kraal.
OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang. De grootte van de kralen kan enigszins variëren, variërend van 30 μm tot 60 μm in diameter, dus het is essentieel om de juiste kraal met het oog te selecteren, op basis van het monster en de grootte van het hart. - Zodra de geschikte kraal is geselecteerd, gebruikt u een pincet om deze op de dooier te plaatsen (Figuur 2A en Video 1).
- Maak een dooierlaesie of 'gat' in het midden van de dooier met behulp van één arm van het pincet (Figuur 2B en Video 2).
OPMERKING: De diepte van de laesie mag niet te diep in de dooier doordringen; Het moet ongeveer ter hoogte zijn van de kardinale ader. De diameter van het gemaakte gat komt overeen met de punt van de pincetarm. Zorg ervoor dat de laesie in de dooier wordt gemaakt en vermijd contact met de kardinale aderen door eronder te richten. Er komt meestal een kleine hoeveelheid dooier uit wanneer het gat wordt gemaakt. - Plaats de kraal in de laesie die in stap 3.5 is ontstaan en duw deze voorzichtig naar voren totdat deze de veneuze pool bereikt. Daar zullen de samentrekkingen van het hart zuigkracht creëren, waardoor de kraal in het hartlumen wordt getrokken (Figuur 2 en Video 2).
OPMERKING: De veneuze wand wordt doorbroken tijdens het inbrengen van de parel en de hoge dichtheid van de dooier helpt uitgebreide bloedingen te minimaliseren. De dooierlaesie geneest meestal binnen een paar minuten na het inbrengen van de parel. Sommige embryo's kunnen 20-24 uur na het enten van de hiel pericardiaal oedeem vertonen.
4. Ontmontage van zebravisembryo's
- Na het enten van magnetische kralen in alle gemonteerde embryo's, voegt u 1-2 ml Danieau's medium met PTU toe aan de schaal met glazen bodem.
- Breek met een pincet de LMP-agarose voorzichtig en verwijder de vissen voorzichtig, zorg ervoor dat er geen agarose op achterblijft.
- Plaats de embryo's met behulp van een pasteurpipet over in een nieuwe petrischaal met Danieau's medium met PTU en laat ze herstellen en ontwikkelen bij 28,5 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voorbeelden van succesvolle pareltransplantatie worden weergegeven in Figuur 3, Video 3 en Video 4. De magnetische kraal was correct gepositioneerd in het atrium van het hart van de zebravis, waardoor een onbelemmerde bloedstroom mogelijk was en er geen waargenomen bloeding was. Bovendien behielden de hartwanden hun structurele integriteit zonder in te storten (Figuur 3 en Video 3
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen in het protocol en probleemoplossing
Montage van zebravisembryo's
De hoeveelheid agarose die wordt gebruikt om de embryo's op te bouwen is belangrijk. De gevormde koepel mag niet te groot zijn, omdat dit de manipulatie van de kraal van het oppervlak naar de embryo's kan belemmeren. Omgekeerd mag het niet te klein zijn; Het hebben van meerdere kralen bovenop de agarose, dich...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We danken de leden van het Vermot lab voor de discussies en opmerkingen over het protocol. We zijn alle medewerkers van de visfaciliteit van het Imperial College London dankbaar. Dit project heeft financiering ontvangen van de Europese Onderzoeksraad (ERC) in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie: GA N°682939, Additional Ventures (toekenningsnummer 1019496), de MRC (MR/X019837/1) en de BBSRC (BB/Y00566X/1). CV-P werd ondersteund door een Bioengineering Departmental Scholarship (Imperial College London). HF werd ondersteund door de JSPS KAKENHI (23H04726 en 24K02207), het JST FOREST-programma (23719210), de Uehara Memorial Foundation, de Cell Science Research Foundation, de Takeda Medical Research Foundation en de Novartis Research Foundation.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| Essentiale apparatuur voor het kweken, fokken en verzamelen van zebravis-embryo's | |||
| Schaal met glazen bodem (35 mm x 15 mm) | VWR International | 734-2905 | |
| Verwarmingsblok | Eppendorf | EP5382000031 | Eppendorf ThermoMixer C |
| Juwelierstang | Sigma-Aldrich | F6521-1EA | Dumont Nr. 5, L 4 1/4 in., Inox legering |
| Microcentrifugebuizen 2 mL | Eppendorf | 30120094 | |
| Pasteurpipet | |||
| Petrischaal | |||
| Stereomicroscoop | |||
| Reagentia | |||
| 4 mg/mL tricaine stockoplossing | |||
| Danieau's medium (60x stockoplossing) | |||
| PureCube Glutathione MagBeads | Cube Biotech | 32201 | |
| PTU (1-fenyl-2-thioureum) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| UltraPure lage smeltpunt agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Danieau's medium (60x stockoplossing) | |||
| 34,8 g NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| 1,6 g KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| 5,8 g CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| 9,78 g MgCl2·6H2O | Sigma-Aldrich | 442611-M | |
| Los de ingrediënten op in H2O tot een eindvolume van 2 L. Pas de pH aan tot 7,2 met NaOH, en steriliseer vervolgens. | |||
| 4 mg/mL tricaine stockoplossing | |||
| 400 mg tricainepoeder (Ethyl 3-aminobenzoaat methaansulfonaat zout) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| 97,9 mL twee keer gedistilleerd H2O | |||
| 2,1 mL 1 M Tris (pH 9) | |||
| Pas de pH aan tot 7, en verdeel in porties en bewaar bij -20 °C. |
Referenties
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84 (1), 4-16 (2012).
- Stainier, D. Y. Zebrafish genetics and vertebrate heart formation. Nat Rev Genet. 2 (1), 39-48 (2001).
- Brown, D. R., Samsa, L. A., Qian, L., Liu, J. Advances in the study of heart development and disease using zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 13(2016).
- Hoo, J. Y., Kumari, Y., Shaikh, M. F., Hue, S. M., Goh, B. H. Zebrafish: A versatile animal model for fertility research. Biomed Res Int. 2016 (2016), 9732780(2016).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 282 (1), R3-R9 (2002).
- Veldman, M. B., Lin, S. Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research. Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J. Mechanically activated piezo channels modulate outflow tract valve development through the Yap1 and Klf2-Notch signaling axis. Elife. 8, e44706(2019).
- Vignes, H., et al. Extracellular mechanical forces drive endocardial cell volume decrease during zebrafish cardiac valve morphogenesis. Dev Cell. 57 (5), 598-609.e595 (2022).
- Steed, E., et al. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646(2016).
- Chow, R. W., et al. Cardiac forces regulate zebrafish heart valve delamination by modulating Nfat signaling. PLoS Biol. 20 (1), e3001505(2022).
- Fukui, H., et al. Bioelectric signaling and the control of cardiac cell identity in response to mechanical forces. Science. 374 (6565), 351-354 (2021).
- Vignes, H., Vagena-Pantoula, C., Vermot, J. Mechanical control of tissue shape: Cell-extrinsic and -intrinsic mechanisms join forces to regulate morphogenesis. Semin Cell Dev Biol. 130, 45-55 (2022).
- Juan, T., et al. Multiple pkd and piezo gene family members are required for atrioventricular valve formation. Nat Commun. 14 (1), 214(2023).
- Juan, T., et al. Control of cardiac contractions using Cre-lox and degron strategies in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (3), e2309842121(2024).
- Duchemin, A. L., Vignes, H., Vermot, J., Chow, R. Mechanotransduction in cardiovascular morphogenesis and tissue engineering. Curr Opin Genet Dev. 57, 106-116 (2019).
- Kalogirou, S., et al. Intracardiac flow dynamics regulate atrioventricular valve morphogenesis. Cardiovasc Res. 104 (1), 49-60 (2014).
- da Silva, A. R., et al. egr3 is a mechanosensitive transcription factor gene required for cardiac valve morphogenesis. Sci Adv. 10 (20), eadl0633(2024).
- Bartman, T., et al. Early myocardial function affects endocardial cushion development in zebrafish. PLoS Biol. 2 (5), E129(2004).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. 1863 (7 Pt B), 1760-1766 (2016).
- Vermot, J., et al. Reversing blood flows act through klf2a to ensure normal valvulogenesis in the developing heart. PLoS Biol. 7 (11), e1000246(2009).
- Bäck, M., Gasser, T. C., Michel, J. B., Caligiuri, G. Biomechanical factors in the biology of aortic wall and aortic valve diseases. Cardiovasc Res. 99 (2), 232-241 (2013).
- Hahn, C., Schwartz, M. A. Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (1), 53-62 (2009).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J. B., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. 144 (23), 4322-4327 (2017).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421 (6919), 172-177 (2003).
- JoVE Science Education database. Biology II: Mouse, zebrafish, and chick. Zebrafish breeding and embryo handling. JoVE. , (2023).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
