Methodenartikel

Evaluatie van celdoodsignalering door immunofluorescentie in een rattenmodel van ischemische beroerte

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67606

⸱

3 januari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Physiology, West China School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine, Sichuan University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In vivo modellen van ratten zijn onmisbare hulpmiddelen om de pathologische mechanismen en therapeutische doelen voor ischemische beroerte te onderzoeken. Dit werk beschrijft het uitvoeren van immunofluorescentiekleuring in hersenplakjes met een infarct na occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) bij ratten.

Samenvatting

Beroerte is wereldwijd een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit. De meeste gevallen van een beroerte zijn ischemisch en zijn het gevolg van de occlusie van de middelste hersenslagader (MCA). De huidige farmacologische benaderingen voor de behandeling van ischemische beroerte zijn beperkt; Daarom zijn er dringend nieuwe therapieën nodig die effectieve neuroprotectie bieden tegen ischemisch letsel na een beroerte. In het hersenweefsel na een ischemische beroerte is het gebied van de ischemische penumbra te redden, maar loopt het risico zich te ontwikkelen tot onomkeerbare schade. Het penumbrale gebied rond de infarctkern is een conceptueel doelwit voor neuroprotectie. Aangezien de bloedstroom in het penumbrale gebied gedeeltelijk in stand wordt gehouden, overleven neuronale en niet-neuronale cellen in dit gebied tijdelijk na een beroerte, en deze cellen die nog steeds levensvatbaar zijn, kunnen worden gered door passende medische ingrepen. Het begrijpen van de pathofysiologie van de penumbra is belangrijk bij de ontwikkeling van neuroprotectieve therapieën, omdat de celdoodroutes die in de ischemische penumbra worden geactiveerd, kunnen wijzen op therapeutische doelen, zoals RUNX1 en cathepsines. Deze eiwitdoelwitten die fungeren als bemiddelaars van geprogrammeerde celdood kunnen verder worden benut in translationeel onderzoek. Met een matige grootte en gelijkenis met het menselijk brein, bootst het in vivo rattenmodel van MCA-occlusie (MCAO) de menselijke ischemische beroerte na en biedt het een toepasbaar hulpmiddel om de penumbrale pathologie te onderzoeken, de celdoodsignalering te onderzoeken en de effecten van potentiële doelen in de context van MCAO te evalueren. Hier beschrijven we hoe MCAO bij ratten kan worden geïnduceerd en hoe immunofluorescentiekleuring kan worden uitgevoerd voor de detectie van celdoodsignalering in de hersenen van ratten na MCAO.

Inleiding

Cerebrale beroerte is wereldwijd een belangrijke doodsoorzaak en invaliditeit1. De hoge mortaliteit en morbiditeit van een beroerte leiden tot een enorme last van de openbare gezondheidszorg en ernstige sociaaleconomische gevolgen. Hoewel de incidentie en mortaliteit van een beroerte stabiel blijven, neemt het aantal patiënten met een beroerte en sterfgevallen als gevolg van een beroerte in de loop van decenniatoe 2,3. Beroertes kunnen worden gecategoriseerd als ischemisch of hemorragisch. De meeste gevallen van een beroerte zijn ischemische beroertes veroorzaakt door de occlusie van een hoofdhersenslagader4. Tot op heden is weefselplasminogeenactivator (tPA) het enige door de FDA goedgekeurde medicijn voor ischemische beroerte, maar de toepassing ervan wordt sterk beperkt door het smalle therapeutische venster, complicaties en contra-indicaties 5,6,7. Het is dus dringend nodig om nieuwe behandelingsopties te ontwikkelen met een breder therapeutisch venster om de effecten van een beroerte te verzachten.

Experimentele diermodellen zijn nuttige hulpmiddelen om de pathofysiologie van ischemische beroerte te bestuderen. Bij de meeste menselijke patiënten wordt een ischemische beroerte veroorzaakt door de blokkering van de middelste hersenslagader (MCA)8. Daarom zijn knaagdiermodellen van occlusie van de middelste hersenslagader (MCAO) ontwikkeld om op een herseninfarct bij de mens te lijken. Hoewel er verschillende MCAO-benaderingen zijn die worden gebruikt in studies met kleine dieren, is de meest gebruikte methode het intraluminale hechtmodel, waarbij een nylonfilament in de middelste hersenslagader wordt ingebracht vanuit de externe of interne halsslagaders, wat resulteert in voorbijgaande of permanente afsluiting van de bloedstroom 4,9. Dit model leidt tot een groot volume herseninfarct en maakt onderzoek van celdoodsignalering in het herseninfarct mogelijk

Het gebied rond de infarctkern, penumbra genoemd, is het doelwit voor mogelijke therapieën na een beroerte10,11. Aangezien de bloedstroom in de penumbra gedeeltelijk in stand wordt gehouden, kunnen beschadigde neuronen en niet-neuronale cellen in dit gebied worden gered door de activering van celdoodsignalering te remmen. Het richten op celdoodroutes kan een veelbelovende strategie zijn voor neuroprotectie na een beroerte12. Daarom is het evalueren van celdoodsignalering cruciaal voor experimenteel onderzoek naar beroertes. Onlangs is aangetoond dat cathepsine-B, een lysosomaal protease, een rol speelt bij het mediëren van geprogrammeerde celdood na een beroerte, en het heeft veel aandacht gekregen op neurologisch gebied13. Cathepsine-B vertegenwoordigt een potentieel doelwit voor neuroprotectie dat verder onderzoek verdient.

Dit artikel laat zien hoe MCAO kan worden geïnduceerd met behulp van de intraluminale hechtdraadbenadering bij ratten. We laten ook zien hoe 2,3,5-trifenyltetrazaliumchloride (TTC)-kleuring kan worden uitgevoerd om de grootte van het infarct te bepalen en apoptotische cellen te detecteren met behulp van terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) kleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol en de hier gerapporteerde experimenten werden goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van de Universiteit van Sichuan. De verzorging en het gebruik van dieren waren in overeenstemming met lokale en internationale ethische criteria.

OPMERKING: Volwassen mannelijke Sprague-Dawley-ratten met een gewicht van 250-280 g werden in dit onderzoek gebruikt. De ratten werden gehuisvest in een standaard omgevingsconditie (temperatuur van 20-22 °C, 12 uur licht/donker-cyclus), gevoed met een standaard rattenvoeding en zeer zuiver water. De chirurgische ingreep werd uitgevoerd onder steriele omstandigheden.

1. Het model van de rat van MCAO

  1. Induceer initiële anesthesie met behulp van 4% isofluraan met zuurstof van 1 l/min. Bewaak de diepte van de anesthesie door met de voet te knijpen. Terwijl anesthesie wordt bereikt, dient u een oogzalf toe om uitdroging te voorkomen. Injecteer ratten subcutaan met 1 ml zoutoplossing als volumeaanvulling en met 5 mg/kg carprofen en 0,1 mg/kg buprenorfine voor preoperatieve analgesie. Verminder isofluraan in eerste instantie tot 3,5% en vervolgens geleidelijk tot 2% tijdens de operatie.
  2. Plaats de rat in rugligging en houd de lichaamstemperatuur op 36,5 ± 0,1 °C op een gereguleerde warmtemat met een rectale temperatuurbewakingssonde. Scheer en desinfecteer de huid in de nek met een jodofor-desinfecterende oplossing.
  3. Maak een incisie in de middellijn van 2 cm in de nek en trek de zachte weefsels terug om de halsslagaders bloot te leggen. Gebruik een tang om de rechter gemeenschappelijke halsslagader (CCA), de externe halsslagader (ECA) en de interne halsslagader (ICA) te isoleren.
  4. Gebruik hechtingen om de proximale rechter CCA te ligate en klem de rechter ICA en ECA vast met een microclip aan de oorsprong.
  5. Steek een nylon monofilament bedekt met een ronde siliconen tip in het lumen van de CCA via een kleine incisie en leg een knoop in de CCA om bloeden en losraken van het nylon monofilament te voorkomen.
  6. Open de rechter ICA-microclip en steek het nylon monofilament in de rechter middelste hersenslagader (MCA) via de ICA-stomp totdat de siliconen punt de oorsprong van MCA afsluit (~18-20 mm).
  7. Snijd het blootgestelde deel van het nylon monofilament af en sluit de incisie in de middellijn van de nek.
  8. Na 2 uur occlusie van MCA, opent u de incisie in de nek en maakt u de knoop in de CCA los. Trek vervolgens het nylon monofilament terug om de MCA te vervangen. Ligate de distale rechter CCA en sluit de incisie in de nek met continue of onderbroken hechtingen.
  9. Postoperatief buprenorfine toedienen via subcutane injectie om de 8 uur, in een dosis van 0,03 mg/kg. Observeer ratten tijdens het herstel van de anesthesie in een verwarmde kooi met een temperatuurgeregelde verwarmingsmat. Om het eten te stimuleren, zet je een petrischaal met gepureerde chow in de kooi. Huisvesting één rat per kooi na de operatie.
  10. Onderwerp de schijnratten aan dezelfde procedure zonder het inbrengen van het monofilament.
    OPMERKING: In elke groep worden in totaal 9 dieren gebruikt voor het meten van de grootte van het infarct (n = 3), immunofluorescentieanalyse (n = 3) en apoptosedetectie (n = 3).
  11. Evalueer de neurologische functie 2 uur na MCAO en 22 uur na reperfusie met behulp van de Zea-Longa-gedragsbeoordelingsschaal met een 0-5-puntsschaal14. Sluit tarieven met een score van 0 of 4 uit.

2. Meting van de grootte van het infarct (Figuur 1)

  1. Offer ratten onder diepe verdoving (4% isofluraan) met een guillotine en isoleer zorgvuldig de hele hersenen van de schedel.
  2. Vries de hersenen 20 minuten in bij -20 °C en snijd de bevroren hersenen in zes kroonschijfjes met een afstand van 2 mm tussen de plakjes. Kleur de hersenschijfjes met 2% TTC gedurende 15 minuten bij 37 °C in het donker.
  3. Fixeer hersenschijfjes met 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur bij kamertemperatuur (RT). Fotografeer de bevlekte plakjes met een digitale camera, met de automatische modusinstelling voor close-upobjecten.
  4. Breng de foto's over naar een computer en meet de grootte van het infarct met behulp van ImageJ. Presenteer de infarctgrootte als de verhouding van de som van het infarctgebied in 6 plakjes tot de som van het hele hersengebied in dezelfde plakjes. Gegevens uitdrukken als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).

3. Immunofluorescentieanalyse op cryosectie van de hersenen (Figuur 2)

  1. Induceer anesthesie met 4% isofluraan en 1 l/min zuurstof. Snijd in de huid en het onderhuidse weefsel om het hart bloot te leggen.
  2. Verwijder het hartzakje en maak een kleine snee in het rechter atrium. Prik 200 ml zoutoplossing door de linker hartkamer, gevolgd door 200 ml 4% paraformaldehyde.
  3. Open de schedel en verwijder de intacte hersenen.
  4. Fixeer de hersenen in 4% paraformaldehyde bij RT gedurende meer dan 24 uur. Dehydrateer het vervolgens in een reeks sucroseoplossingsgradiënten van 10%, 15% en 30% concentraties totdat het weefsel zinkt, ongeveer 6-8 uur voor elke concentratie.
  5. Veranker de hersenen in een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding en verwijder luchtbellen als die er zijn. Vries de hersenen vervolgens in vloeibare stikstof in en bewaar ze in de vriezer van -80 °C.
  6. Snijd de hersenen door met behulp van een cryostaat met een dikte van 5 μm. Zorg er tijdens het snijden voor dat de temperatuur van de kast tussen -18 °C en -20 °C blijft. Label de doorsnedelocatie op basis van de modellocatie en experimentele omstandigheden. Bewaar de secties in een vriezer.
  7. Laat de bevroren secties ~30 minuten in evenwicht komen bij RT om immunofluorescentiekleuring uit te voeren. Week de secties vervolgens 3x gedurende 5 minuten met steriel PBS.
  8. Omlijn het weefsel met een immunohistochemiepen. Incubeer met 20 μg/ml proteïnase K (RNase-vrij) en 0,3% Triton X-100 bij RT gedurende 10 min.
  9. Week de secties 3x 5x gedurende 5 minuten met steriel PBS. Breng 3% BSA aan op het omlijnde weefsel en incubeer gedurende 1 uur bij RT om te blokkeren.
  10. Verwijder na het blokkeren de oplossing, voeg het juiste primaire antilichaam toe (Rabbit recombinant monoklonaal cathepsine-B-antilichaam, 1:200) en incubeer de coupes een nacht in het donker bij 4 °C.
  11. Verwijder het primaire antilichaam en was de secties 3x gedurende 5 minuten met steriel PBS met 0,1% Tween-20.
  12. Voeg het juiste secundaire antilichaam (Geit Anti-Rat IgG [H+L] [FITC geconjugeerd], 1:200) toe aan de vereiste fluorofoor en incubeer de coupes gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer bij RT om ze tegen licht te beschermen.
  13. Was na incubatie van secundaire antilichamen de secties 3x gedurende 5 minuten met steriel PBS met 0,1% Tween-20. Beits de secties met een montagemedium dat DAPI bevat en bedek ze met een dekglaasje.
  14. Maak beelden met een fluorescentiemicroscoop met de volgende instellingen: excitatiegolflengte van 488 nm, emissiegolflengte van 520 nm en belichtingstijd van 500 ms. Bewaar de secties in het donker bij 4 °C voor langdurige bewaring.

4. Detectie van apoptose door TUNEL-kleuring (Figuur 3)

OPMERKING: Voor TUNEL-kleuring wordt een in de handel verkrijgbare TUNEL-testkit gebruikt. Deze TUNEL-kit bevat een DNase I Buffer-werkoplossing, deoxynucleotidyltransferase (TdT) equilibratiebuffer, etiketteringswerkoplossing en DAPI-werkoplossing.

  1. Verfuseer en isoleer de hersenen met behulp van dezelfde procedure als hierboven (stappen 3.2-3.3). Dompel de hersenen 3-4 uur onder in 4% paraformaldehyde voor fixatie.
  2. Snijd de hersenen in coronale plakjes van ongeveer 2 mm dik, beginnend van het rostrale uiteinde tot het caudale uiteinde, en dompel onder in 4% paraformaldehyde gedurende nog eens 12 uur. Was na fixatie de hersenschijfjes 1 uur onder stromend water.
  3. Dompel de hersenplakjes onder in ethanoloplossingen van 50%, 70%, 80%, 90%, 95% en 100% concentraties achtereenvolgens gedurende 35-50 minuten elk voor uitdroging.
  4. Behandel de hersenschijfjes met TO-type transparant biologisch middel I gedurende 35-50 minuten, gevolgd door klaringsmiddel II gedurende 35-50 minuten, totdat het weefsel volledig transparant is.
  5. Dompel de hersenplakjes achtereenvolgens onder in inbeddingsmedium I gedurende 60 min, inbeddingsmedium II gedurende 60 min, inbeddingsmedium III gedurende 60 minuten en inbeddingsmedium IV gedurende 60 min.
  6. Plaats de hersenplakjes in een inbeddingscassette. Sluit de cassette af, label hem duidelijk en plaats hem in een koude opslagruimte om te stollen.
  7. Stel de microtoom in op een begindikte van 10 μm om het weefselblok bij te snijden. Pas vervolgens de dikte aan op 5 μm om te snijden.
  8. Verwarm het waterbad tot 45 °C, laat de weefselsecties op het wateroppervlak drijven en pak ze op op glijbanen. Verwijder na ongeveer 30 s de objectglaasjes, droog ze bij RT en bewaar ze in een droogdoos.
  9. Deparaffiniseer de opgeslagen hersensecties door ze gedurende 2 cycli van elk 10 minuten onder te dompelen in een klaringsmiddel.
  10. Om de secties te rehydrateren, laat u ze 5 minuten weken in watervrije ethanol en herhaalt u dit 3 keer. Breng de secties gedurende 3 minuten over op 90% ethanol. Week de secties verder 3 minuten in 80% ethanol. Dompel de secties ten slotte 3 minuten onder in 70% ethanol.
  11. Spoel de monsters in PBS 3x gedurende 5 minuten elk. Verwijder voorzichtig overtollig vocht met behulp van filtreerpapier.
  12. Dien 100 μl 1x proteïnase K-werkoplossing toe aan elk monster en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C. Spoel de monsters na permeabilisatie 3x gedurende 5 minuten in PBS.
  13. Bereid de monsters voor op positieve controle.
    1. Voeg 100 μL 1x DNase I Buffer werkoplossing (TUNEL assay kit) toe aan het gepermeabiliseerde monster en laat het gedurende 5 minuten in evenwicht komen bij RT. Verwijder voorzichtig overtollige vloeistof uit het monster met absorberend papier.
    2. Voeg 100 μl verdunde DNase I-werkoplossing (200 E/ml) toe aan het monster en incubeer gedurende 10-30 minuten bij 37 °C. Spoel de monsters in PBS 3x gedurende 5 minuten elk.
  14. Bereid de monsters voor op negatieve controle.
    1. Breng 100 μL 1x DNase I Buffer werkoplossing aan op het gepermeabiliseerde monster en breng gedurende 5 minuten in evenwicht bij RT. Incubeer het negatieve controlemonster met DNase I-buffer bij 37 °C gedurende 10-30 minuten en zorg ervoor dat er geen DNase I-enzym wordt toegevoegd. Spoel de monsters in PBS 3x gedurende 5 minuten elk.
  15. Breng 100 μl terminale deoxynucleotidyltransferase (TdT)-evenwichtsbuffer (TUNEL-testkit) aan op elk monster en incubeer in een bevochtigde kamer bij 37 °C gedurende 10-30 min. Verwijder vervolgens de TdT-evenwichtsbuffer met absorberend papier.
  16. Voeg 50 μL etiketteringsoplossing (TUNEL-testkit) toe aan elk monster en incubeer ze vervolgens gedurende 60 minuten bij 37 °C in een bevochtigde, donkere kamer. Als de signaalintensiteit laag is, overweeg dan om de reactietijd van de DNA-labeling te verlengen. Spoel de monsters vervolgens 3x in PBS gedurende 5 minuten elk.
  17. Breng na het deppen van overtollig vocht de DAPI-werkoplossing (TUNEL-testkit) aan en incubeer 5 minuten in het donker bij RT om de kernen tegen te gaan. Spoel de monsters vervolgens 4x in PBS gedurende 5 minuten elk. Verwijder overtollige vloeistof met absorberend papier en sluit de dia's af met een anti-fade montagemedium.
  18. Scan de gekleurde objectglaasjes met behulp van het Vectra Polaris multispectrale beeldvormingssysteem en analyseer de gegevens met de systeemsoftware.

5. Statistische analyse

  1. Presenteer de experimentele resultaten als middel ± SEM en analyseer gegevens met een t-toets voor studenten voor twee groepsvergelijkingen met behulp van GraphPad Prism 10-software (GraphPad Software, San Diego, CA).
  2. Stel een p-waarde van minder dan 0,05 in als statistisch verschil.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Ratten worden tijdens MCAO onderworpen aan ischemie van 120 minuten, gevolgd door reperfusie van 22 uur. Het sterftecijfer was minimaal tijdens MCAO chirurgie en lag rond de 25% binnen de periode van reperfusie. Significante hersenbeschadiging werd waargenomen in de MCAO-groep, terwijl er geen infarct werd waargenomen in de grote hersenen van de Sham-groep (24,87 ± 1,21% vs. 0% som van het infarctgebied tot het hele hersengebied; MCAO [n = 3] vs. Sham [n = 3], P < 0.001;

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Occlusie van een hersenslagader leidt tot gebrek aan zuurstof en voeding, gevolgd door de activering van reactieve zuurstofsoorten, intracellulaire calciumoverbelasting, afgifte van glutamaat en inductie van ontstekingsreacties15. Deze reeks gebeurtenissen resulteert in celdood en onomkeerbare weefselbeschadiging in de hersenen van het infarct. De penumbra is mogelijk te redden door medisch ingrijpen binnen een geschikt therapeutisch venster16

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Simiao Wu werd ondersteund door de afdeling Wetenschap en Technologie van de provincie Sichuan (2024YFHZ0330) en het West China Hospital van de Universiteit van Sichuan. Weihong He werd ondersteund door de afdeling Wetenschap en Technologie van de provincie Sichuan (2023YFS0297) en de Universiteit van Sichuan. We danken Yi Zhang en Yue Li van de Research Core Facility, West China Hospital van de Universiteit van Sichuan, voor hun technische ondersteuning bij TUNEL-beeldvorming en -analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Akoya Vectra PolarisAkoya BiosciencesN/AVectra Polaris multispectral imaging system 
Anhydrous ethanolChengdu Jinshan Chemical Reagent Co.N/A
BuprenorfineWest China HospitalN/A
CarprofenWest China HospitalN/A
Cathepsin-B antilichaamAbcamAb214428
CryostatLEICA LEICA CM 1950
Digitale cameraOLYMPUSTG-7
Geit Anti-rat IgG (H+L) (FITC geconjugeerd)Elabscience E-AB-1021
Geit serumSolarbioSL038
GraphPad Prism 10 softwareN/Ahttps://www.graphpad-prism.cn/?c=i&a=prismdownload_cn
ImageJN/Ahttps://imagej.net/ij/
Immunohistochemie penBiosharphttp://www.biosharp.cn/index/product/details/language/en/product_id/2828.html
InForm softwareAkoya BiosciencesVersie 2.6.0systeemsoftware voor het multispectrale beeldvormingssysteem 
Iodofoor desinfectieoplossingHuatian Technology Industry Co.N/A
IsofluraanRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/
Montagemedium met DAPISolarbioS2110
Nylon monofilRWD Life Science Co.https://www.rwdstco.com/
Optimale snijtemperatuur (OCT) compoundEprediaN/A
ParaformaldehydeBiosharpN/A
Fosfaatbufferoplossing (PBS)SolarbioN/A
PrismGraphPad Versie 10
Proteinase KTiangenRT403-02
ZoutmoplossingKelun Co.N/A
Sprague-Dawley rattenHuafukang Co.N/A
SucroseBioFroxx1245GR500
Chirurgische instrumentenRWD Life Science Co.N/A
TO-type transparant biologisch middel  Beijing Solarbio Science & Tecnology Co., Ltd.http://www.solarbio.net/
Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) oplossingSolarbioG3005
Triton X-100BioFroxx1139ML100
TUNEL kitElabscience E-CK-A321

Referenties

  1. Tsao, C. W., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2023 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 147 (8), e93-e621 (2023).
  2. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  3. Hankey, G. J. Stroke. Lancet. 389 (10069), 641-654 (2017).
  4. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  5. Barthels, D., Das, H. Current advances in ischemic stroke research and therapies. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (4), 165260(2020).
  6. Frank, D., Zlotnik, A., Boyko, M., Gruenbaum, B. F. The development of novel drug treatments for stroke patients: A review. Int J Mol Sci. 23 (10), 5796(2022).
  7. Wang, S. -N., et al. Humanized cerebral organoids-based ischemic stroke model for discovering of potential anti-stroke agents. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (3), 513-523 (2023).
  8. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol Biochem Behav. 87 (1), 179-197 (2007).
  9. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  10. Donnan, G. A., Baron, J. C., Ma, H., Davis, S. M. Penumbral selection of patients for trials of acute stroke therapy. Lancet Neurol. 8 (3), 261-269 (2009).
  11. Lo, E. H. A new penumbra: transitioning from injury into repair after stroke. Nat Med. 14 (5), 497-500 (2008).
  12. Datta, A., et al. Cell death pathways in ischemic stroke and targeted pharmacotherapy. Transl Stroke Res. 11 (6), 1185-1202 (2020).
  13. Gaire, B. P., Subedi, L., Teramoto, H., Hu, B. Cerebral Ischemia. , Exon Publications. Brisbane, Australia. (2021).
  14. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  15. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  16. Fisher, M. The ischemic penumbra: identification, evolution and treatment concepts. Cerebrovasc Dis. 17 Suppl 1, 1-6 (2004).
  17. Adams, H. P. Jr, et al. Guidelines for the early management of adults with ischemic stroke: A guideline from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, Clinical Cardiology Council, Cardiovascular Radiology and Intervention Council, and the Atherosclerotic Peripheral Vascular Disease and Quality of Care Outcomes in Research Interdisciplinary Working Groups: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists. Circulation. 115 (20), e478-e534 (2007).
  18. Fonarow, G. C., et al. Timeliness of tissue-type plasminogen activator therapy in acute ischemic stroke: patient characteristics, hospital factors, and outcomes associated with door-to-needle times within 60 minutes. Circulation. 123 (7), 750-758 (2011).
  19. Yamori, Y., Horie, R., Handa, H., Sato, M., Fukase, M. Pathogenetic similarity of strokes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats and humans. Stroke. 7 (1), 46-53 (1976).
  20. Bogousslavsky, J., Van Melle, G., Regli, F. The Lausanne stroke registry: analysis of 1,000 consecutive patients with first stroke. Stroke. 19 (9), 1083-1092 (1988).
  21. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1 (1), 53-60 (1981).
  22. Garcia, J. H., Liu, K. F., Ho, K. L. Neuronal necrosis after middle cerebral artery occlusion in Wistar rats progresses at different time intervals in the caudoputamen and the cortex. Stroke. 26 (4), discussion 643 636-642 (1995).
  23. Türeyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), discussion 196-200 196-200 (2005).
  24. Spratt, N. J., et al. Modification of the method of thread manufacture improves stroke induction rate and reduces mortality after thread-occlusion of the middle cerebral artery in young or aged rats. J Neurosci Methods. 155 (2), 285-290 (2006).
  25. Naqvi, S. A. R., et al. Biochemistry of Drug Metabolizing Enzymes. , Elsevier, Academic Press. (2022).
  26. Yadati, T., Houben, T., Bitorina, A., Shiri-Sverdlov, R. The ins and outs of cathepsins: Physiological function and role in disease management. Cells. 9 (7), 1679(2020).
  27. Liu, C. L., et al. Cysteine protease cathepsins in cardiovascular disease: from basic research to clinical trials. Nat Rev Cardiol. 15 (6), 351-370 (2018).
  28. O'Toole, D., et al. Signalling pathways linking cysteine cathepsins to adverse cardiac remodelling. Cell Signal. 76, 109770(2020).
  29. Luke, C. J., et al. Lysoptosis is an evolutionarily conserved cell death pathway moderated by intracellular serpins. Commun Biol. 5 (1), 47(2022).
  30. Xie, Z., et al. Cathepsin B in programmed cell death machinery: mechanisms of execution and regulatory pathways. Cell Death Dis. 14 (4), 255(2023).
  31. Nagakannan, P., Islam, M. I., Conrad, M., Eftekharpour, E. Cathepsin B is an executioner of ferroptosis. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (3), 118928(2021).
  32. Conus, S., Simon, H. U. Cathepsins: key modulators of cell death and inflammatory responses. Biochem Pharmacol. 76 (11), 1374-1382 (2008).
  33. Bhoopathi, P., et al. Cathepsin B facilitates autophagy-mediated apoptosis in SPARC overexpressed primitive neuroectodermal tumor cells. Cell Death Differ. 17 (10), 1529-1539 (2010).
  34. Ding, X., Zhang, C., Chen, H., Ren, M., Liu, X. Cathepsins trigger cell death and regulate radioresistance in glioblastoma. Cells. 11 (24), 4108(2022).
  35. He, W., et al. Inhibition of myocardial cathepsin-L release during reperfusion following myocardial infarction improves cardiac function and reduces infarct size. Cardiovasc Res. 118 (6), 1535-1547 (2022).
  36. McCarroll, C. S., et al. Runx1 deficiency protects against adverse cardiac remodeling after myocardial infarction. Circulation. 137 (1), 57-70 (2018).
  37. Song, J., et al. Age-related promoter-switch regulates Runx1 expression in adult rat hearts. BMC Cardiovasc Disord. 23 (1), 541(2023).
  38. Riddell, A., et al. RUNX1: an emerging therapeutic target for cardiovascular disease. Cardiovasc Res. 116 (8), 1410-1423 (2020).
  39. Chen, H., et al. Pharmacological inhibition of RUNX1 reduces infarct size after acute myocardial infarction in rats and underlying mechanism revealed by proteomics implicates repressed cathepsin levels. Funct Integr Genomics. 24 (3), 113(2024).
  40. Petanceska, S., Burke, S., Watson, S. J., Devi, L. Differential distribution of messenger RNAs for cathepsins B, L and S in adult rat brain: an in situ hybridization study. Neuroscience. 59 (3), 729-738 (1994).
  41. Chaitanya, G. V., Babu, P. P. Activation of calpain, cathepsin-b and caspase-3 during transient focal cerebral ischemia in rat model. Neurochem Res. 33 (11), 2178-2186 (2008).
  42. Yuan, D., Liu, C., Wu, J., Hu, B. Inactivation of NSF ATPase leads to cathepsin b release after transient cerebral ischemia. Transl Stroke Res. 9 (3), 201-213 (2018).
  43. Hill, I. E., Preston, E., Monette, R., MacManus, J. P. A comparison of cathepsin B processing and distribution during neuronal death in rats following global ischemia or decapitation necrosis. Brain Res. 751 (2), 206-216 (1997).
  44. Kilinc, M., et al. Lysosomal rupture, necroapoptotic interactions and potential crosstalk between cysteine proteases in neurons shortly after focal ischemia. Neurobiol Dis. 40 (1), 293-302 (2010).
  45. Seyfried, D., et al. Cathepsin B and middle cerebral artery occlusion in the rat. J Neurosurg. 87 (5), 716-723 (1997).
  46. Saido, T. C., Yokota, M. Neurodegenerative diseases as proteolytic disorders: brain ischemia and Alzheimer's disease. Tanpakushitsu Kakusan Koso. 42 (14 Suppl), 2408-2417 (1997).
  47. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsins b induces neuroprotection against secondary degeneration in ipsilateral substantia nigra after focal cortical infarction in adult male rats. Front Aging Neurosci. 10, 125(2018).
  48. Zuo, X., et al. Inhibition of cathepsin b alleviates secondary degeneration in ipsilateral thalamus after focal cerebral infarction in adult rats. J Neuropathol Exp Neurol. 75 (9), 816-826 (2016).
  49. Pluta, R., Salínska, E., Puka, M., Stafiej, A., Lazarewicz, J. W. Early changes in extracellular amino acids and calcium concentrations in rabbit hippocampus following complete 15-min cerebral ischemia. Resuscitation. 16 (3), 193-210 (1988).
  50. Hatsuta, H., et al. Tau and TDP-43 accumulation of the basal nucleus of Meynert in individuals with cerebral lobar infarcts or hemorrhage. Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 49(2019).
  51. van Groen, T., Puurunen, K., Mäki, H. M., Sivenius, J., Jolkkonen, J. Transformation of diffuse beta-amyloid precursor protein and beta-amyloid deposits to plaques in the thalamus after transient occlusion of the middle cerebral artery in rats. Stroke. 36 (7), 1551-1556 (2005).
  52. Gómez-Sintes, R., Ledesma, M. D., Boya, P. Lysosomal cell death mechanisms in aging. Ageing Res Rev. 32, 150-168 (2016).
  53. Heimer, S., Knoll, G., Schulze-Osthoff, K., Ehrenschwender, M. Raptinal bypasses BAX, BAK, and BOK for mitochondrial outer membrane permeabilization and intrinsic apoptosis. Cell Death Dis. 10 (8), 556(2019).
  54. Elena-Real, C. A., et al. Cytochrome c speeds up caspase cascade activation by blocking 14-3-3ε-dependent Apaf-1 inhibition. Cell Death Dis. 9 (3), 365(2018).
  55. Linfante, I., et al. Clinical and vascular outcome in internal carotid artery versus middle cerebral artery occlusions after intravenous tissue plasminogen activator. Stroke. 33 (8), 2066-2071 (2002).
  56. Farges, M. C., et al. Increased muscle proteolysis after local trauma mainly reflects macrophage-associated lysosomal proteolysis. Am J Physiol Endocrinol Metab. 282 (2), E326-E335 (2002).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ImmunofluorescentiekleuringRattenmodel voor beroerteOcclusie van de arteria cerebri mediaNeuroprotectie van de penumbraCathepsine B expressieTUNEL kleuringDetectie van apoptoseAnalyse van hersenweefsel

Gerelateerde artikelen