Beeldvorming en kwantificering van mitochondriale morfologie in C. elegans tijdens veroudering

Summary

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde benadering voor het in beeld brengen van de mitochondriale morfologie in meerdere weefsels van C. elegans tijdens veroudering.

Abstract

Mitochondriën, belangrijke cellulaire organellen die in de meeste eukaryote cellen worden aangetroffen, zijn belangrijke plaatsen van energieproductie door middel van aërobe ademhaling. Naast deze bekende rol als de 'cellulaire krachtpatser', zijn mitochondriën ook betrokken bij vele andere essentiële cellulaire processen, waaronder de regulatie van het cellulaire metabolisme, proliferatie, immuunsignalering en hormonale signalering. Verslechtering van de mitochondriale functie tijdens veroudering of onder mitochondriale stress wordt vaak gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de mitochondriale morfologie en het volume. De nematode C. elegans is een ideaal model voor het bestuderen van deze veranderingen vanwege zijn transparante lichaam en korte levensduur, die live microscopie gedurende zijn hele leven mogelijk maken. Maar zelfs binnen het C. elegans-veld zijn er tal van transgene constructies en methoden voor mitochondriale beeldvorming beschikbaar, elk met zijn eigen beperkingen. Hier worden single-copy, matrix-gelokaliseerde GFP-constructen gepresenteerd als een robuuste en betrouwbare methode voor het in beeld brengen van mitochondriale morfologie in C. elegans. Deze studie richt zich specifiek op experimenteel controleerbare factoren om fouten te minimaliseren en de variabiliteit tussen replicaten en tussen onderzoeken te verminderen bij het uitvoeren van mitochondriale beeldvorming tijdens het verouderingsproces. Bovendien wordt mitoMAPR aanbevolen als een robuuste methode om veranderingen in de mitochondriale morfologie van weefseltypen tijdens veroudering te kwantificeren.

Introduction

Mitochondriën zijn cellulaire organellen omsloten door een dubbel fosfolipidemembraan en spelen een belangrijke rol bij het behoud van cellulaire bio-energetica als de belangrijkste plaats voor metabolisme en energieproductie¹. Een groot aantal mitochondriën genereert continu energie in de vorm van ATP om aan de cellulaire vraag te voldoen². Naast deze belangrijke rollen nemen mitochondriën ook deel aan complexe cellulaire processen zoals signaaltransductie, autofagie, aangeboren immuniteit, celcyclus en celdoodroutes ^2,3. Mitochondriën vertonen diverse morfologieën, variërend van kleine individuele organellen tot uitgebreide onderling verbonden buisvormige netwerken, afhankelijk van verschillende energetische vereisten en mitochondriale gezondheid⁴.

Een belangrijk kenmerk van mitochondriën is hun dynamische aard, waarbij ze kunnen afwisselen tussen deze verschillende vormen door middel van een strak gecoördineerde en continue opeenvolging van splijtings- en fusiegebeurtenissen⁴. De precieze balans tussen deze tegengestelde processen reguleert de mitochondriale morfologie, het aantal, de grootte en de positionering binnen het cytoplasma⁵. Bovendien zijn deze fusie- en splijtingsprocessen belangrijk voor het behoud van de kwaliteitscontrole van mitochondriën⁵. Mitochondriale splijting is bijvoorbeeld een essentieel onderdeel van het verwijderen van beschadigde mitochondriën door mitofagie en selectieve verwijdering van mitochondriën door autofagie². Mitochondriale dynamiek speelt ook een belangrijke rol bij celdeling, ontwikkeling, weerstand tegen verschillende stressoren en behoud van cellulair metabolisme⁶.

Verstoring van de mitochondriale dynamiek is betrokken bij tal van ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen, stofwisselingsziekten, hart- en vaatziekten en kankers⁴. Bovendien wordt veroudering geassocieerd met dramatische hermodellering van de mitochondriën, grotendeels als gevolg van veranderingen in deze fusie-splijtingsdynamiek⁷. Daarom biedt het visualiseren en monitoren van de veranderingen in de mitochondriale morfologie onder verschillende stress- of ziekteomstandigheden en tijdens het verouderingsproces waardevolle inzichten in het begrijpen van de cellulaire functie, het ziektemechanisme en mogelijke therapeutische strategieën.

Zoals veel moleculaire routes zijn de mitochondriale dynamiek en functie ook sterk geconserveerd in eukaryoten, inclusief modelorganismen zoals de nematode Caenorhabditis elegans. Net als bij menselijke cellen wordt mitochondriale fusie in C. elegans bereikt door de functie van dynamin-gerelateerde guaninetrifosfatase (GTPase)-eiwitten, waaronder FZO-1 (ortholoog van zoogdier Mfn1/2) en EAT-3 (ortholoog van zoogdier Opa1) die de fusie van respectievelijk het buitenste mitochondriale membraan (OMM) en het binnenste mitochondriale membraan (IMM) regelen⁸. Mitochondriale splijting wordt gereguleerd door het dynamin-gerelateerde eiwit (DRP-1, ortholoog van humaan Drp1), dat mitochondriale splijting bevordert door ringachtige complexen te vormen rond het mitochondriale buitenmembraan die de mitochondriale membranen vernauwen en uiteindelijk scheiden⁹. Mitochondriale fusie speelt een cruciale rol bij de mitochondriale kwaliteitscontrole door het mengen van mitochondriale inhoud, waaronder mitochondriaal DNA, eiwitten en lipiden, mogelijk te maken, waardoor aanvulling van gedeeltelijk beschadigde mitochondriën mogelijk is met inhoud van gezonde mitochondriën⁹. Aan de andere kant zorgt mitochondriale splijting ervoor dat mitochondriën zich kunnen delen, waardoor nieuwe mitochondriën worden gecreëerd en hun distributie niet alleen in het cytoplasma wordt vergemakkelijkt, maar ook naar dochtercellen tijdens de celdeling, waardoor een goede mitochondriale overerving en functie wordt gegarandeerd⁹. Deze gebeurtenis is ook essentieel om beschadigde of disfunctionele mitochondriale segmenten te scheiden, die vervolgens kunnen worden gericht op afbraak door mitofagie⁹.

C. elegans wordt al lang beschouwd als een van de krachtigste genetische modelsystemen vanwege het volledige genoom en de beschikbaarheid van een verscheidenheid aan genetische hulpmiddelen, waaronder CRISPR/Cas9 dat genetische modificaties mogelijk maakt¹⁰, talrijke methoden voor overexpressie van genen en een op bacterieel voedsel gebaseerde methode voor RNA-interferentie (RNAi)¹¹. Bovendien maakt hun transparante anatomie microscopische beeldvorming in levende organismen mogelijk¹². Ten slotte maken hun relatief korte levensduur, lage onderhoudskosten en het gemak waarmee een groot aantal dieren van dezelfde leeftijd kan worden geproduceerd, ze tot een uitstekend modelsysteem voor verouderingsbiologie¹³. Deze voordelen, gecombineerd met het bekende behoud van belangrijke mitochondriale regulerende routes, maken C. elegans tot een zeer aantrekkelijk modelsysteem voor het bestuderen van mitochondriale dynamiek tijdens veroudering.

Fluorescerende markers worden veel gebruikt in biologisch onderzoek om cellulaire componenten, waaronder mitochondriën, te visualiseren en te bestuderen. Er zijn specifieke celdoorlatende kleurstoffen zoals MitoTracker en tetramethylrhodamine ethylester (TMRE) die vaak worden gebruikt¹⁴. De eerste wordt gebruikt om de algehele negatief geladen mitochondriale matrix¹⁵ te verven, terwijl de laatste wordt gebruikt om de relatieve mitochondriale membraanpotentiaal te evalueren door middel van het positief geladen trifenylfosfoniumion¹⁶. Hoewel ze er baat bij hebben dat er geen transgenen nodig zijn, maken de dikke cuticula van de wormen die tijdens het ouder worden van structuur en permeabiliteit verandert en de variabiliteit van kleurstofinfiltratie over verschillende weefsels op kleurstof gebaseerde benaderingen uitdagend in C. elegans¹⁷. Bovendien wordt de evaluatie van de mitochondriale morfologie verward door mogelijke off-target effecten van de kleurstoffen, zoals kleurstofaggregatie¹⁷. In plaats daarvan worden genetische methoden om mitochondriën-gelokaliseerde fluoroforen tot expressie te brengen vaak gebruikt in het wormmodel.

Hier richt deze studie zich op het benadrukken van stammen die een mitochondriale matrix tot expressie brengen, gelokaliseerd GFP (hierna MLS::GFP genoemd) onder celtypespecifieke promotors. Belangrijk is dat deze transgene lijnen zijn gemaakt met behulp van de MosSCI-methode om te zorgen voor expressie van de reporter in een bekende genomische locus, waardoor problemen met andere beschikbare stammen worden voorkomen. Bijvoorbeeld, hoge kopie-expressie van sommige mitochondriën-gerichte eiwitten leidt tot variabiliteit in expressieniveaus als gevolg van de integratie van extrachromosomale plasmide-arrays in een willekeurige locus met een onbekend kopienummer¹⁸. Bovendien is eerder aangetoond dat ze schade aan mitochondriën veroorzaken, omdat het een grote last is voor cellen om de tot overexpressie gebrachte mitochondriale eiwitten goed te lokaliseren¹⁹. Daarom maken de precieze, stabiele en lage genexpressie en het gemak van kruising naar bekende loci deze MosSCI-transgenen tot de voorkeursmethode. Met behulp van deze stammen standaardiseert deze studie methoden om mitochondriën in de spier, darm en hypodermis van C. elegans in beeld te brengen. Bovendien belicht het de belangrijke technische toepassingen en methoden voor probleemoplossing die belangrijk zijn om te overwegen en te zorgen voor een reproduceerbare experimentele analyse van mitochondriën tijdens veroudering in C. elegans.

Protocol

Details over de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Groei en onderhoud van C. elegans

1. Voorbereiden van platen voor nematodengroeimedia (NGM)
   1. Gebruik voor de kweek van C. elegans standaard 2% agarplaten met NGM die 1 mM CaCl₂, 12,93 μM (5 μg/ml) cholesterol, 25 mM KPO₄ (pH 6,0), 1 mM MgSO₄, 2,5 mM (0,25% w/v) Pepton en 51,3 mM NaCl bevatten. Zie de gedetailleerde methode voor het gieten van NGM-platen beschreven in Castro Torres et ^al.20.
      OPMERKING: Voeg voor experimenten met RNA-interferentie (RNAi) 1 ml 1 M IPTG en 1 ml 100 mg/ml carbenicilline toe voor 1 L NGM-agarplaten.
   2. Nadat de NGM-platen zijn gestold, kweekt u een cultuur van OP50 in lysogeniebouillon (LB) gedurende 24-48 uur bij kamertemperatuur of kweekt u een cultuur van HT115 met een pL4440 leeg vectorplasmide in LB met antibiotica (ampicilline/carbenicilline 100 μg/ml + tetracycline 5 μg/ml) met schudden bij 37 °C gedurende 12-16 uur.
      OPMERKING: Dit plasmide is verkrijgbaar bij commerciële bronnen (zie materiaaltabel).
   3. Zaai 200 μL OP50 of HT115 cultuur op platen van 60 mm, of 1 ml op platen van 100 mm.
   4. Droog de platen tot ze niet meer nat zijn en bewaar de platen in afgesloten containers bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
   5. Optioneel: Voeg 100 μL 10 mg/ml 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUDR) rechtstreeks toe op NGM-agarplaten die zijn bezaaid met bacteriën om L4/volwassen wormen chemisch te steriliseren en de ontwikkeling van jongere wormen te voorkomen.
      OPMERKING: De stammen die in dit onderzoek zijn ontwikkeld en gebruikt zijn:
      (1) RHS191 - uthSi17[myo3p::MLS::GFP::unc-54 3'UTR::cb-unc-119(+)] I
      (2) RHS192 - uthSi83[col19p:: MLS::GFP::unc-54 3'UTR::cb-unc-119(+)] I
      (3) RHS193 - uthSi80[vha-6p:: MLS::GFP::unc-54 3'UTR::cb-unc-119(+)] IV
2. Synchroniseren C. elegans door bleken
   1. Voor een grootschalige test waarvoor een groot aantal nematoden nodig is, snijdt u een 60 mm NGM-agarplaat vol dieren in kleine stukjes en snijdt u ze in stukjes op platen van 100 mm die zijn bezaaid met bacteriën voor expansie. Wacht 2-3 dagen voordat de platen van 100 mm vol wormen zitten wanneer ze na het afbrokkelen bij 20 °C worden gekweekt. Voor meer gedetailleerde aanbevelingen voor het uitbreiden van dieren, zie Castro Torres et ^al.20.
   2. Om de wormen te verzamelen voor synchronisatie, giet u 5-10 ml M9-oplossing (22 mM KH₂PO₄ monobasisch, 42,3 mM Na₂HPO₄, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO₄) op 100 mm NGM-agarplaten met wormen, en zwenkt u de M9-oplossing voorzichtig om de wormen los te maken van de bacteriële gazons.
   3. Zuig de wormen op met een serologische pipet en breng ze over in conische buisjes van 15 ml.
      OPMERKING: Serologische pipetten van glas worden aanbevolen, omdat plastic serologische pipetten de neiging hebben om de wormen aan de binnenwand van de plastic pipetten te laten plakken.
   4. Centrifugeer gedurende 30 s bij 1.100 x g bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren en het bovenstaande op te zuigen met behulp van een vacuümpomp.
   5. Bereid 5 ml bleekoplossing met 1,5 ml 6% natriumhypochloriet, 0,75 ml 5 M NaOH of KOH en 2,75 ml dH₂O. Giet de 5 ml bleekoplossing in de wormpellet.
      LET OP: Het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas wordt in deze stap aanbevolen, aangezien natriumhypochloriet- en hydroxideoplossingen bijtend zijn.
   6. Incubeer de worm + bleekoplossing mix gedurende ~4-6 minuten totdat alle lichamen van de dieren volledig zijn opgelost en alleen de eieren overblijven. Schud het mengsel krachtig om het oplosproces te bevorderen.
      OPMERKING: Controleer de wormen elke minuut onder een ontleedmicroscoop. Verkort of verleng de bleektijd op basis van de mate waarin de lichamen van volwassen wormen zijn opgelost. Als u de eieren gedurende langere tijd in een bleekoplossing laat liggen, zal dit leiden tot schade aan de eieren en zal de levensvatbaarheid van de nematoden worden aangetast.
   7. Centrifugeer het mengsel van eieren/bleekoplossing gedurende 30 s bij 1.100 x g bij kamertemperatuur om de eieren te pelleteren en zuig vervolgens het bovenstaande voorzichtig op met behulp van een vacuümpomp, waarbij u ervoor zorgt dat de eierpellet niet wordt opgezogen.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om wasbeurten snel uit te voeren om langdurige blootstelling van de eieren aan de bleekoplossing te voorkomen.
   8. Was de eieren 4 keer met 5-10 ml M9-oplossing.
   9. Resuspendeer de eieren in een kleine hoeveelheid M9-oplossing en leg ze op NGM-platen die zijn bezaaid met bacteriën door te pipetteren tot 50 μl. Bereken een ruwe schatting van het aantal eieren door 3-5 μl van het eimengsel op een bord te pipetteren en het aantal eieren in dit volume te tellen. Voeg M9 toe om het eimengsel te verdunnen tot een telbaar aantal eieren in dit volume.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om minder dan 100 wormen per bord te plateren, omdat de wormen kunnen verhongeren vóór dag 1 van de volwassenheid wanneer er te veel dieren zijn geplateerd. Voor meer gedetailleerde aanbevelingen voor het uitplaten van het aantal dieren, zie Castro Torres et ^al.20.
   10. Als alternatief kunnen de nematoden worden uitgeschakeld voor een strakkere leeftijdssynchronisatie. Voeg voor L1-arrestatie het juiste volume M9-oplossing toe aan de eierpellet in een conische buis van 15 ml tot een volume van 10-12 ml. Laat de wormen 16-24 uur in een rotator draaien bij 20 °C. Centrifugeer (zoals in stap 1.2.7) en zuig het supernatant op. Bereken de concentratie van L1-dieren en plaats ze op NGM-platen zoals beschreven voor eieren in stap 1.2.9.
   11. Rijp de C . elegans-populatie tot de gewenste leeftijd: Breng de L4/volwassen dieren over op platen die 5-fluor-2'-deoxyuridine (FUDR) bevatten, zoals beschreven in stap 1.1.6, om nageslacht te voorkomen en eventuele reeds geproduceerde nakomelingen te elimineren. Voor alternatieve methoden om wormen te verouderen zonder FUDR, zie Castro Torres et ^al.20.
       OPMERKING: Er moet rekening worden gehouden met enkele belangrijke factoren voordat u kiest voor bleken als methode om wormen in hun eerste larvale stadium te synchroniseren. Zoals eerder benadrukt, kan overmatige blootstelling aan bleekmiddel embryo's beschadigen, het aantal uitkomsten verminderen en selectiedruk creëren voor bleekresistente stammen, waardoor de genetica van de populatie mogelijk kan veranderen. Als embryo's gedurende langere tijd niet worden gevoed, kan uitputting van voedingsstoffen bovendien de stofwisseling en ontwikkeling aantasten. Daarom kunnen leg- of NemaSync-methoden worden gebruikt als alternatief voor bleekmethoden. De methode voor het leggen van eieren wordt stapsgewijs beschreven in de genoemde studie van Castro Torres et ^al.20. NemaSync is een nieuwere en duurdere commerciële methode, waarbij een handmatige wormsynchronisatie wordt gebruikt om wormen te synchroniseren zonder het gebruik van chemicaliën²¹.

2. Beeldvorming van mitochondriën in C. elegans

1. Voorbereiding van objectglaasjes voor beeldvorming van C. elegans
   1. Voeg 10-20 μL M9-oplossing toe aan glasplaatjes en breng een gewenst aantal volwassen wormen op de specifieke leeftijden over naar de oplossing op het objectglaasje. Ongeveer 25 wormen worden aanbevolen.
      OPMERKING: Het gebruik van traditionele methoden om wormen te verlammen (bijv. tetramisol of natriumazide) kan onder bepaalde omstandigheden mitochondriale fragmentatie veroorzaken (zie hieronder). In plaats daarvan wordt hier het gebruik van HistoBond-dia's aanbevolen, die een oppervlak hebben met een permanente positieve oppervlaktelading, de beweging van wormen verminderen zonder medicijnen te gebruiken die artefacten kunnen introduceren. Het is belangrijk om een geschikte verhouding tussen wormen en M9-oplossing aan te brengen, omdat lage volumes ertoe kunnen leiden dat dieren verpletterd raken tussen het glaasje en het dekglaasje, terwijl hoge volumes ertoe leiden dat dieren bewegen tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. Aanbevelingen zijn te vinden in tabel 1.
   2. Als alternatief, voor het gebruik van geneesmiddelen die wormen verlammen, verwijzen wij naar representatieve resultaten van dit manuscript voor een reeks concentratie- en tijdstippen die kunnen worden gebruikt met beperkte fragmentatie van mitochondriën.
      OPMERKING: Hoewel er geen grote fragmentatie was bij gezonde, wilde dieren, is het belangrijk om te onthouden dat bepaalde mutanten of aandoeningen mitochondriale fragmentatie kunnen ervaren met dezelfde concentratie van deze geneesmiddelen, dus sommige tests zijn vereist bij het gebruik van deze geneesmiddelen.
   3. Bedek de wormen met M9-oplossing op het glaasje met een dekglas en gebruik nagellak om de zijkanten af te dichten en verdamping van M9-oplossing te voorkomen.
   4. Optioneel: Rol voor spierbeeldvorming wormen door zachtjes tegen het dekglaasje te duwen. Hierdoor kunnen de spieren van de lichaamswand aan de zijkanten van de wormen beter worden uitgelijnd met het brandvlak voor beelden van hogere kwaliteit.
2. Beeldvorming van mitochondriën met behulp van een samengestelde microscoop
   1. Gebruik een standaard groothoekmicroscoop voor spier- en hypodermale mitochondriën (myo-3p::MLS::GFP en col-19p::MLS::GFP).
      OPMERKING: Er werd een in de handel verkrijgbare imager gebruikt die was uitgerust met een 63x/1.4 Plan Aprochromat-objectief, GFP-filter (11525314), DFC9000 GT-camera en LED5-lichtbron en er werd compatibele microscoopsoftware gebruikt.
   2. Optimaliseer de beeldvormingsinstellingen voor elke microscoop en experimentele opstelling.
      OPMERKING: Als uitgangspunt zijn de parameters voor beeldvorming met de imager die in dit manuscript wordt gebruikt echter als volgt: Afmetingen zijn 2048 (x) * 2048 (y) pixels bij een stapgrootte van 0,50 μm voor hypodermale mitochondriën en "System Optimized" automatisch berekend door de software voor spiermitochondriën. De blootstellingstijd is 50 ms voor spiermitochondriën en 50 ms voor hypodermale mitochondriën. De 475 nm LED werd ingesteld op 50% vermogen en het filter met neutrale dichtheid werd ingesteld op 30% voor spieren en 17% voor hypodermale mitochondriën. Z-range begint vanaf het punt waar het GFP-signaal zichtbaar is tot waar het eindigt. Om de ruis in een max-projectie te minimaliseren, kan men het aantal z-vlakken dat voor de max-projectie wordt gebruikt, verminderen.
   3. Gebruik voor beeldvorming van intestinale mitochondriën (vha-6p::MLS::GFP) een confocale microscoop.
      OPMERKING: Beeldvorming werd uitgevoerd op een in de handel verkrijgbare confocale microscoop die was uitgerust met een 63x/1.4 Plan ApoChromat-objectief, witlichtlaser (WLL), Acousto-Optical Beam Splitter, HyD S-detectoren en uitgevoerd op microscoopsoftware. Zoals eerder vermeld, moet men elke individuele experimentele opstelling optimaliseren, maar als uitgangspunt zijn de parameters voor beeldvorming met de Stellaris die in dit onderzoek zijn gebruikt, als volgt: De WLL was ingesteld op 85,00 % maximaal vermogen en met een laserlijn van 485 nm met een intensiteit van 3,00 %. De HyD S-detector was ingesteld op 490-590 nm met een versterking van 25 in de analoge instelling. We hebben in één richting een gebied van 1024 (x) * 1024 (y) of 82,01 μm (x) * 82,01 μm (y) gescand met 5 (z) pixels met een stapgrootte van 0,495 μm (dimensie z is variabel afhankelijk van de grootte van de wormen of weefsels) met een scansnelheid van 1.000 Hz, 2,25 zoom, lijngemiddelde van 2 en gaatje van 1 AU (95,5 μm). Het Z-bereik begint vanaf het punt waar het GFP-signaal zichtbaar is tot waar het eindigt. Om de ruis in een max-projectie te minimaliseren, kan men het aantal z-vlakken dat voor de max-projectie wordt gebruikt, verminderen.
3. Kwantificering van mitochondriale morfologie
   OPMERKING: Raadpleeg voor meer informatie Schindelin et ^al.22 en zie aanvullende figuur 1A-D.
   1. Download en installeer FIJI-software (Fiji is gewoon ImageJ, https://fiji.sc/). Open dan FIJI.
   2. Als u de MitoMAPR-macro wilt downloaden en installeren, downloadt u broncode 1 van https://doi.org/10.7554/eLife.49158.033. Kopieer vervolgens alle code die onder "A" wordt genoemd. IJM-code voor MitoMAPR-1.0." Open vervolgens Fiji, ga naar Plug-ins > New > Macro en plak de eerder gekopieerde code in het macrovenster. Ga naar Bestand > Opslaan als optie en sla de macro op voor toekomstig gebruik.
   3. Open een 3D-microscopisch kleine afbeelding met Z-stacks in FIJI door bestanden naar de Fiji-werkbalk te slepen en neer te zetten of door naar Bestand > Openen te gaan.
   4. Maak een maximale projectie van de afbeelding door naar Afbeelding > stapels > Z-project te gaan, vervolgens het bereik van segmenten met scherpgestelde afbeeldingen te selecteren die maximaal moeten worden geprojecteerd en Max. intensiteit als projectietype te selecteren.
   5. Sla de afbeelding op als een TIFF door naar Bestand > Opslaan als > Tiff te gaan.
   6. Snijd interessegebieden (ROI's) bij uit volledige afbeeldingen met behulp van de tool 'Rechthoek', teken een ROI en ga vervolgens naar Afbeelding > bijsnijden.
   7. Sla de afbeelding op als een TIFF door naar Bestand > Opslaan als > Tiff te gaan.
   8. Voer de MitoMAPR-macro uit die eerder is opgeslagen door het macrobestand naar de Fiji-werkbalk te slepen en neer te zetten en vervolgens op Uitvoeren te klikken. Een nieuw venster zal vragen om de map te selecteren waarin het Tiff-bestand is opgeslagen in 2.3.6.
   9. Een nieuw venster zal vragen om een gebied te selecteren; maak een rechthoek in de afbeelding met behulp van het rechthoekgereedschap zoals eerder vermeld in stap 2.3.4 en druk op Ok.
      OPMERKING: De hele afbeelding kan worden geselecteerd als deze eerder is bijgesneden zoals beschreven in stap 2.3.6. Sla het venster "Gegevens" met alle waarden met betrekking tot mitochondriale morfologie op als een Excel-bestand door naar Bestand > Opslaan als > Opslaan te gaan.
4. Batchverwerking van monsters met behulp van FIJI-macro's
   1. Maak een macro voor het specificeren van het gebied van de afbeeldingen die moeten worden geanalyseerd. Open Fiji en ga naar Plugins > New > Macro. Plak de volgende code in het tekstvak en sla de macro op zoals beschreven in 2.3.2 (aanvullende afbeelding 1E-H).
      OPMERKING: Maak een rechthoek (100, 100, 200, 200); run (Opgeven..., breedte = 100, hoogte = 100, x = 100, y = 100 geschaald).
   2. Maak een macro om alle geopende afbeeldingen op te slaan als TIFF-bestanden. Ga in het macrovenster naar Bestand > nieuw en plak de volgende code in het tekstvak. Sla de macro op zoals beschreven in 2.3.2.
      OPMERKING: dir = getDirectory("Selecteer een map"); ids=nieuwArray(nImages); voor (i=0; i
   3. Maak een macro voor de batch MitoMAPR. Ga naar https://doi.org/10.7554/eLife.49158.033 broncode 1 en kopieer alle codes vermeld onder B.). IJM-code voor MitoMAPR-1.0_Batch". Ga in het macrovenster naar Bestand > nieuw, plak de code van de broncode 1 in het tekstvak en sla de macro op zoals beschreven in stap 2.3.2.
   4. Maak een macro voor iteratief bijsnijden. Ga naar https://doi.org/10.7554/eLife.49158.033 broncode 1 en kopieer alle codes genoemd onder C.) IJM code voor CropR". Ga in het macrovenster naar Bestand > nieuw, plak de code van de broncode 1 in het tekstvak en sla de macro op zoals beschreven in stap 2.3.2.
   5. Om te beginnen met batchverwerking, slaat u eerst alle afbeeldingen op die moeten worden verwerkt als TIFF door alle afbeeldingen te openen en de macro uit te voeren die is opgeslagen in stap 2.4.2. Alle afbeeldingen worden als TIFF opgeslagen in de opgegeven map. Sluit alle afbeeldingen nadat ze zijn opgeslagen.
   6. Als de afbeeldingen die in stap 2.4.5 zijn opgeslagen, 3D-afbeeldingen zijn (afbeeldingen die z-stacks bevatten), converteert u ze naar 2D-afbeeldingen door er Z-projecties van te maken. Om de afbeeldingen in batch Z te projecteren, opent u het batchverwerkingsvenster door naar Batch > Batch > Macro verwerken in het hoofdvenster van FIJI te gaan.
      1. Selecteer bij "Invoer" de locatie van de map met alle 3D-afbeeldingen die vanaf 2.4.5 moeten worden verwerkt. Selecteer bij "Uitvoer" de gewenste locatie voor de opgeslagen beelden na verwerking. Selecteer het uitvoerformaat als TIFF. Plak de volgende code in het grote tekstvak in het venster en druk op de procesknop : run ("Z Project...", "projection=[Max Intensity]").
   7. Snijd ROI's met identieke afmetingen bij uit alle 2D-afbeeldingen die moeten worden verwerkt met behulp van de iteratieve bijsnijdmacro uit stap 2.4.4 in combinatie met de macro voor het opgeven van een regio uit stap 2.4.3. Voer de iteratieve bijsnijdmacro uit vanaf stap 2.4.4. Er verschijnt een venster waarin om een map wordt gevraagd.
      1. Selecteer de map met alleen 2D-beelden uit stap 2.4.5 of de 2D Z-geprojecteerde beelden uit stap 2.4.6 en druk op de knop Selecteren . De macro opent een van de afbeeldingen in de geselecteerde map en er verschijnt een venster met het label "maak een selectie" met twee knoppen.
   8. Voer de opgegeven selectiemacro uit vanaf stap 2.4.3. Wijzig de breedte- en hoogtewaarden in dat macrotekstvak indien nodig om de selectiedimensie te wijzigen en druk op Uitvoeren om de nieuwe selectie te bekijken. Als u de X- en Y-waarden in de macro wijzigt, wordt de positie in de linkerbovenhoek van de selectie gewijzigd.
      1. Zodra de selectieafmetingen bevredigend zijn, sleept u de rechthoek naar het gewenste gebied en drukt u vervolgens op de OK-knop in het venster "een selectie maken". Het bijgesneden gebied wordt opgeslagen in de map die in stap 2.4.7 is geselecteerd.
   9. De macro doorzoekt alle resterende afbeeldingen in de map. Voer voor elke afbeelding de macro uit stap 2.4.8 uit zonder de dimensiewaarden te wijzigen om ervoor te zorgen dat dezelfde afmetingen voor alle afbeeldingen worden bijgesneden. Sleep voor elke afbeelding de selectierechthoek naar de gewenste locatie en druk op de OK-knop in het venster "een selectie maken".
   10. Open de map met de bijgesneden afbeeldingen uit de stappen 2.4.8-2.4.9 en verplaats alle bijgesneden afbeeldingen naar een nieuwe map.
   11. Analyseer alle bijgesneden afbeeldingen door de batch MitoMAPR-macro uit stap 2.4.3 uit te voeren. In een nieuw venster wordt u gevraagd een map te selecteren. Selecteer de map met alle bijgesneden afbeeldingen uit stap 2.4.10. Eenmaal voltooid, verschijnt er een venster met de naam "Gegevens" met alle waarden die verband houden met mitochondriale morfologie. Sla alle gegevens op als een Excel-bestand zoals beschreven in stap 2.3.9.

Results

C. elegans is een geweldig model voor mitochondriale beeldvorming vanwege het transparante lichaam, dat het mogelijk maakt om gemakkelijk hele wormen en levende dieren in beeld te brengen zonder overmatige monstervoorbereiding. Bovendien kan mitochondriale morfologie in verschillende weefsels gemakkelijk worden gevisualiseerd door weefselspecifieke promotors te gebruiken om mitochondriën-gerichte fluorescerende eiwitten tot expressie te brengen. Hier werden myo-3p (voor spiermitochondriën), vha-6p (voor intestinale mitochondriën) en col-19p (voor hypodermale mitochondriën) gebruikt om de expressie van een op mitochondriën gerichte GFP (mitochondriale lokalisatiesequentie van het ATP-1-eiwit) te stimuleren. De mitochondriën van de lichaamswandspieren van C. elegans vertonen een buisvormige morfologie, uitgelijnd langs spiervezels (myofibrillen) (Figuur 1A); intestinale mitochondriën vertoonden sterk onderling verbonden, webachtige structuren, met minder uniforme uitlijning (Figuur 1B); en de hypodermis heeft buisvormige mitochondriën die meer afgerond of ovaal van vorm lijken in vergelijking met de darm of spier (Figuur 1C). De mitochondriale morfologie is over het algemeen consistent over de lengte van de worm in de spier en darm, maar de hypodermis vertoont enkele kleine verschillen in de onderlinge verbondenheid van mitochondriën tussen de proximale en distale uiteinden van de worm. Om reproduceerbare experimentele resultaten te bereiken, wordt dus aanbevolen om zich te concentreren op een specifiek deel van hun lichaam. Hier wordt het gebied tussen de keelholte en de vulva ~100-200 μm onder de keelholte consequent in beeld gebracht.

Voor spier- en hypodermale mitochondriën biedt beeldvorming onder een samengestelde microscoop voldoende resolutie vanwege de vlakheid van de cellen en de lage niveaus van onscherp licht. Intestinale mitochondriën zijn echter moeilijk waar te nemen met een samengestelde microscoop, omdat het grote volume van de darm de resolutie beperkt vanwege een grote hoeveelheid onscherp licht uit andere delen van de darm (Figuur 2). Daarom wordt aanbevolen om de mitochondriën van de darm onder een confocale microscoop in beeld te brengen om onscherp licht te verminderen en de juiste mitochondriale morfologie te visualiseren.

De vorm van mitochondriën is zeer dynamisch en verandert op basis van de metabolische omgeving van de dieren²³ of zelfs als gevolg van blootstelling aan variabele substraatstijfheid²⁴. Daarom kan het langdurig achterlaten van dieren op microscoopglaasjes bij afwezigheid van een voedselbron en op het stijve substraat van glas mogelijk invloed hebben op de mitochondriale morfologie. Hier bleek uit deze studie dat de mitochondriën van wormen na ongeveer 30 minuten fragmenteren op een glaasje in M9-oplossing, waarbij hypodermale mitochondriën de meeste fragmentatie vertonen (Figuur 3). Daarom moet beeldvorming van mitochondriën snel na de voorbereiding van het monster worden uitgevoerd.

Chemicaliën die de mobiliteit van wormen beperken, waaronder natriumazide en tetramisol, worden vaak gebruikt voor live beeldvorming van C. elegans, omdat stationaire wormen nodig zijn om meerdere z-secties van dieren vast te leggen voor 3D-beeldvorming. Eerdere studies hebben aangetoond dat blootstelling aan natriumazide of tetramisol kan leiden tot mitochondriale fragmentatie²⁵. Verrassend genoeg bleek dat natriumazide - zelfs bij hoge concentraties - een beperkte invloed had op de mitochondriale morfologie in de spier of darm. De hypodermis vertoonde echter een eerdere mitochondriale fragmentatie dan M9-controles (Figuur 3). Belangrijk is dat hoge concentraties tetramisol (100 mM) resulteerden in significante mitochondriale fragmentatie onmiddellijk na blootstelling in alle celtypen. Ter vergelijking: gemiddelde concentraties (10 mM) resulteerden in snellere fragmentatie in vergelijking met een M9-controle. Lage concentraties (1 mM) hadden een beperkte impact op de mitochondriale morfologie. Deze gegevens suggereren dat het gebruik van natriumazide een haalbare optie kan zijn voor snelle beeldvorming van mitochondriën, terwijl tetramisol over het algemeen moet worden vermeden.

Zoals verwacht vertonen mitochondriën van alle weefsels van C. elegans fragmentatie tijdens het natuurlijke verouderingsproces (Figuur 4A). De fragmentatie kan worden gevisualiseerd als mitochondriën die zich presenteren als meer afgeknotte en bolvormige structuren, die dramatisch verschillen van de lineaire, buisvormige mitochondriën die bij jonge dieren worden weergegeven. Het is belangrijk op te merken dat de darm op latere leeftijd toeneemt in bolvormige autofluorescerende structuren, dus er moet voor worden gezorgd dat autofluorescentie niet wordt verward met werkelijke mitochondriale structuren. Omdat er variabiliteit kan zijn van veranderingen in de mitochondriale structuur tussen wormen, is het belangrijk om kwantificering van de mitochondriale morfologie uit te voeren op een significante steekproefomvang in plaats van alleen een paar wormen in beeld te brengen. Hier werd mitoMAPR gebruikt, waarmee geautomatiseerde kwantificering van de mitochondriale morfologie mogelijk is met behulp van een diverse reeks statistieken, waaronder objecten, netwerken, knooppunten per netwerk, knooppunten, objectlengte, mitochondriale voetafdruk, mitochondriale dekking en objectgebied (aanvullende tabel 1 en aanvullende tabel 2). De automatisering verwijdert subjectieve vooroordelen van de gebruiker. Hier rapporteren we dat de objectlengtemetriek optimaal is om de veranderingen in spier- en darmmitochondriale morfologie tijdens veroudering kwantitatief te meten, en junctiepunten om de veranderingen in hypodermale mitochondriale morfologie tijdens veroudering te meten (Figuur 4B).

Figuur 1: Afbeeldingen van mitochondriën door het hele lichaam van C. elegans. Mitochondriale beeldvorming werd uitgevoerd over de gehele lengte van dag 5 volwassen dieren gekweekt op EV vanaf het L1-stadium bij transgene dieren met MLS::GFP-expressie in de spier (A), darm (B) en hypodermis (C). Schaal balk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Vergelijking van mitochondriale beeldvorming tussen samengestelde microscoop en confocale microscoop. Mitochondriale beeldvorming werd uitgevoerd bij volwassen dieren op dag 1 gekweekt op EV vanaf het L1-stadium bij transgene dieren met MLS::GFP-expressie in de spier (A), darm (B) en hypodermis (C). Schaal balk: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Beoordeling van mitochondriale fragmentatie van verschillende weefsels na behandeling met M9, natriumazide en tetramisol. Mitochondriale beeldvorming werd uitgevoerd bij volwassen dieren op dag 1 met expressie van MLS::GFP in de spier, darm en hypodermis. Dieren werden gekweekt op EV vanaf het L1-stadium. Dieren werden op objectglaasjes geplaatst die M9, natriumazide (1 mM, 10 mM en 100 mM) of tetramisol (1 mM, 10 mM en 100 mM) bevatten en beeldvorming werd uitgevoerd onmiddellijk na de voorbereiding van de objectglaasjes (0 min) of 15 minuten of 30 minuten na de voorbereiding van de objectglaasjes. Representatieve beelden worden getoond voor n > 5 dieren per stam voor 2 biologische replicaten. Schaal staven: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Mitochondriale beeldvorming van C. elegans tijdens veroudering in verschillende weefsels en kwantificering van mitochondriale morfologie met behulp van MitoMAPR. (A) Mitochondriale beeldvorming werd uitgevoerd bij volwassen dieren op dag 1, 5, 9, 13 en 15 van de volwassenheid met expressie van MLS::GFP in de spier, darm en hypodermis. Dieren werden gekweekt op EV vanaf het L1-stadium en vanaf dag 1 volwassen werden ze overgebracht op EV-platen met FUDR. Afbeeldingen zijn representatief voor n ≥ 5 dieren per stam voor ≥ 3 biologische replicaten. Schaal balk: 5 μm. (B) De kwantificering voor de objectlengte van spiermitochondriën en darmmitochondriën van wormen op dag 1, 5, 9, 13 en 15, en de kwantificering voor knooppunten van hypodermale mitochondriën van wormen op dag 1, 5, 9, 13 en 15. Alle individuele datapunten gecombineerd met gemiddelde ± SD. Grafieken werden uitgezet en statistisch geanalyseerd met behulp van een t-toets van een student. ns = niet significant, *p < 0,03; **p < 0,002; p < 0,0002; p < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dagen van wormen	Aantal wormen	Volume buffer (ml)
1	25	13
5	25	14
9	20	15
13	20	15

Tabel 1: Aanbevolen aantallen wormen en buffervolumes bij het voorbereiden van dia's.

Aanvullende figuur 1: Workflows van de toepassing van een enkele beeldkwantificering met behulp van MitoMAPR en batchverwerking voor meerdere afbeeldingen. (A) Workflow voor het kwantificeren van de mitochondriale morfologie van een enkel beeld met behulp van MitoMAPR-macro. (B) Z-projectie van onbewerkt 3D-beeldbestand met behulp van Fiji (Max-projectie). (C) Het interessegebied bijsnijden van het Z geprojecteerde beeld. (D) Skeletbeelden verkregen van MitoMAPR-macro. Schaal staven: 5 μm. (E) Workflow voor het kwantificeren van de mitochondriale morfologie van meerdere afbeeldingen met behulp van een batchproces met behulp van MitoMAPR-macro. (F) Screenshot van macro bijsnijden. (G) Screenshot van een batchproces voor Z-projectie. (H) Schermafbeelding van het selectiebevestigingsvenster van de macro voor het bijsnijden van batches. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1: Kwantitatieve analyse van mitochondriale morfologiemetrieken in C. elegans-spierweefsel . De geregistreerde statistieken omvatten objecten, netwerken, knooppunten per netwerk, knooppunten, objectlengte, mitochondriale voetafdruk, objectgebied en mitochondriale dekking, gemeten over verschillende dagen. Gegevens bieden een basis voor het beoordelen van veranderingen in de mitochondriale morfologie bij veroudering. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Effecten van immobiliserende chemicaliën op de mitochondriale morfologie bij C. elegans. Gegevens omvatten metingen zoals objecten, netwerken, knooppunten per netwerk, knooppunten, objectlengte, mitochondriale voetafdruk, objectgebied en mitochondriale dekking over verschillende concentraties en tijdstippen na monstervoorbereiding met M9-buffer of verschillende concentraties tetramisol en natriumazide. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Fluorescerende beeldvorming van mitochondriale morfologie is de meest gebruikelijke manier om veranderingen in mitochondriën te bepalen. Hoewel geavanceerde microscopietechnieken zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), atoomkrachtmicroscopie en cryo-elektronenmicroscopie een hogere resolutie bieden, blijft fluorescentiemicroscopie betaalbaarder en toegankelijker voor de meeste onderzoekers. Bovendien kan fluorescerende microscopie worden uitgevoerd in levende cellen, en in heldere modelorganismen zoals C. elegans, beeldvorming kan worden uitgevoerd in hele dieren^26,27. Beeldvorming van transgene C. elegans is vrij eenvoudig, en genetisch gecodeerde fluorescerende markers zorgen voor een betrouwbaardere en robuustere beeldvorming van mitochondriën, omdat er geen complexe monsterverwerking nodig is of last heeft van variabele kleuring in verschillende celtypen of omstandigheden van conventionele mitochondriale kleurstoffen zoals MitoTracker of TMRE 28,29,30. Genetisch gecodeerde fluorescerende markers omvatten meestal directe labeling van mitochondriale eiwitten met fluoroforen of conjugatie van fluoroforen met een minimale mitochondriale lokalisatiesequentie. Deze constructies worden vaak aangestuurd door weefselspecifieke promotors, waardoor visualisatie van mitochondriën in verschillende weefsels zoals spier-, darm- of hypodermisweefsels mogelijk is³¹. Over het algemeen worden deze fluorescerend gelabelde eiwitten tot overexpressie gebracht, wat mogelijk ongewenste fysiologische effecten kan hebben als mitochondriale eiwitten van volledige lengte tot overexpressie worden gebracht; daarom zijn minimale MLS-sequenties een betere optie³². Maar zelfs met de overexpressie van minimale MLS-fluorescerende eiwitfusies moet hoge overexpressie worden vermeden, aangezien het importeren van een grote hoeveelheid eiwit in de mitochondriën het potentieel van het mitochondriale membraan kan doen instorten en de diergezondheid kan beïnvloeden³³. Hoewel een uitputtende karakterisering van alle momenteel beschikbare C. elegans-stammen buiten het bestek van dit manuscript valt, is een gedetailleerde vergelijkende analyse van talrijke mitochondriale reporters en de voor- en nadelen van elk hier^{te vinden 31}.

Voor live-cell beeldvorming van mitochondriën in C. elegans kan standaard samengestelde of breedveldmicroscopie een voorkeursoptie zijn vanwege de hoge snelheid en het gemak van deze methoden ten opzichte van confocale microscopie. In deze studie wordt aangetoond dat platte cellen zoals de spier en de hypodermis minimaal profiteren van confocale microscopie, en samengestelde microscopie maakt acquisitie mogelijk met voldoende resolutie om de juiste mitochondriale morfologie te visualiseren. Grotere cellen zoals de darm maken samengestelde microscopie uitdagend vanwege onscherp licht. Daarom is confocale microscopie vereist voor betrouwbare beeldvorming van de mitochondriale morfologie van de darm.

Een belangrijke overweging bij 3D-beeldvorming over de gehele dikte van weefsel bij levende dieren is het voorkomen van de beweging van de wormen tijdens het verkrijgen van beelden. Onderzoekers gebruiken vaak methoden om wormen te verlammen, zoals tetramisol of natriumazide³⁴. Natriumazide remt cytochroom c-oxidase (complex IV), een cruciaal enzym in de elektronentransportketen van mitochondriën, wat leidt tot algemene verlamming vanwege het gebrek aan ATP dat nodig is voor spiercontracties en andere cellulaire functies^34,35. Tetramisol werkt door acetylcholine na te bootsen bij de neuromusculaire overgangen, waardoor aanhoudende depolarisatie en spiercontractie worden veroorzaakt³⁶. Blootstelling aan deze geneesmiddelen kan echter mitochondriale fragmentatie veroorzaken door oxidatieve stress te veroorzaken²³. In deze studie werd gevonden dat tetramisol zeer snel mitochondriale fragmentatie induceerde, maar natriumazide had een veel beperkter effect.

C. elegans biedt een zeer eenvoudige en gemakkelijke manier om de impact van veroudering op de mitochondriale morfologie te bestuderen vanwege de korte levensduur en het gemak waarmee dieren kunnen verouderen. Hier hebben we gekozen voor het gebruik van blootstelling aan FUDR, een robuuste methode om dieren chemisch te steriliseren door DNA-replicatie te voorkomen 20,37,38. FUDR kan echter ongewenste effecten hebben op specifieke verouderingsparameters, en voor degenen die zich zorgen maken over off-target effecten van FUDR, kunnen andere strategieën om nakomelingen te verwijderen worden gebruikt³⁹. Er zijn bijvoorbeeld steriele mutanten, waaronder de temperatuurgevoelige kiembaanmutant glp-4, of spermadeficiënte mutanten, zoals CF512 40,41,42. Als alternatief kunnen dieren ook op natuurlijke wijze ouder worden door dagelijks handmatig volwassenen uit hun nageslacht te plukken.

Kwantificering van de veranderingen in de mitochondriale morfologie is ook een zeer belangrijke overweging, aangezien er aanzienlijke variabiliteit kan zijn in de mitochondriale morfologie tussen dieren. Daarom is het uitvoeren van kwantitatieve analyses en statistieken over een voldoende steekproefomvang essentieel om significante conclusies te trekken over veranderingen in de mitochondriale morfologie. Beeldanalyse en kwantificering kunnen echter sterk lijden onder subjectieve vooringenomenheid en uitdagingen bij het afbeelden van zeer complexe structuren zoals onderling verbonden mitochondriën. Daartoe volgt hier een samenvatting van een geautomatiseerde methode om de mitochondriale morfologie te kwantificeren met behulp van talrijke metrieken die zijn ontwikkeld door het Mair-lab. MitoMAPR maakt objectieve, geautomatiseerde kwantificering van de mitochondriale morfologie mogelijk, waarbij verschillende aspecten van de mitochondriën worden gemeten, waaronder het mitochondriale netwerk, de objectlengte, de verspreiding, de netwerkdekking en de mitochondriale voetafdruk. MitoMAPR is een gratis macro voor ImageJ en is dus beschikbaar voor alle labs met een functionele computer. Een belangrijk aspect van het gebruik van MitoMAPR is het uitvoeren van kwantificering over een grote steekproefomvang om te bepalen welke metriek van mitochondriale morfologie het meest robuust is om veranderingen in de experimentele omstandigheden die worden getest te bepalen^43,44. Hier wordt vastgesteld dat objectlengte en verbindingspunten de beste maatstaven zijn om veranderingen tijdens veroudering in de spier, darm en hypodermis te bepalen. Een alternatieve benadering voor het analyseren van veranderingen in de mitochondriale morfologie is het genereren van 3D-representaties van mitochondriën uit z-stack-afbeeldingen, gevolgd door 3D-analyse^16,45. Dit kan worden bereikt met behulp van in de handel verkrijgbare software, zoals Image-Pro Plus met de modules SharpStack Total Deconvolution en 3D Constructor. Het is aangetoond dat kwantificering van 3D mitochondriale representaties nauwkeurigere inzichten biedt in mitochondriale vorm en netwerkeigenschappen⁴⁶. Deze methode is echter technisch complexer en duurder in vergelijking met de semi-3D-benadering, waarbij meerdere beeldsecties van een wide-field of confocale z-stack worden samengevouwen tot een enkele 2D-projectie en deze worden geanalyseerd met tools zoals mitoMAPR. Deze studie vat het gebruik van single-copy expressie van mitochondriale matrix-gerichte GFP samen en beschrijft enkele valkuilen die tijdens beeldvorming moeten worden vermeden.

Beperkingen en tijdsoverwegingen
Hoewel confocale microscopie wordt aanbevolen voor grote en dikke weefsels, zoals darmweefsel, kunnen standaard lijnscanning-confocale microscopietechnieken te traag zijn om snelle beeldvorming van mitochondriën uit te voeren. Dit geldt met name gezien onze gegevens die aantonen dat het langdurig houden van wormen op dia's kan leiden tot fragmentatie van mitochondriën. Hoewel de confocale microscopietechnologie aanzienlijk is gevorderd, kunnen microscopen die snelle beeldvorming kunnen uitvoeren, zoals een draaiende schijf, Airyscan of degene die in dit onderzoek wordt gebruikt, voor sommige laboratoria onbetaalbaar zijn. In deze gevallen kan samengestelde microscopie worden gecombineerd met computationele klaringsmethoden om onscherp licht te verwijderen, zoals deconvolutie⁴⁷.

Zoals beschreven is MitoMAPR ook een krachtige geautomatiseerde macro om de lengte van mitochondriën en de onderlinge verbinding van het mitochondriale netwerk kwantitatief te meten. Het moet echter zorgvuldig worden gebruikt, rekening houdend met de hier genoemde beperkingen. Ten eerste observeert het gebruik van een matrixgerichte GFP alleen mitochondriale fragmentatie van het binnenmembraan, wat de mitochondriale morfologie van het buitenmembraan mogelijk niet volledig recapituleert, aangezien splijting van het binnenmembraan kan optreden bij afwezigheid van splijting van het buitenmembraan. Voor een meer verfijnde beeldvorming van beide membranen moeten dus zowel een matrixgerichte als een mitochondriaal buitenmembraangericht fluorofoor worden gebruikt. Aangezien markers van het buitenste mitochondriale membraan dezelfde gevolgen kunnen ondervinden als matrix-gelokaliseerde eiwitten als ze sterk tot overexpressie worden gebracht, wordt het gebruik van markers met één kopie aanbevolen, vooral die waarbij minimale mitochondriale lokalisatiesequenties worden gebruikt in plaats van volledige eiwitten zoals die hier worden gebruikt³¹.

Zoals beschreven in figuur 3, kunnen mitochondriën snel fragmenteren onder de microscoop, en verschillende methoden om monsterglaasjes voor te bereiden kunnen de morfologie grotendeels beïnvloeden, afhankelijk van de buffer die wordt gebruikt. De representatieve gegevens die in dit manuscript worden beschreven, tonen aan dat de mitochondriën van de wormen minimale fragmentatie ondergaan onder M9 en lage concentraties natriumazide. Tetramisole, een andere veelgebruikte chemische stof om wormen te verlammen, fragmenteert snel de mitochondriale, wat aangeeft dat het gebruik ervan over het algemeen moet worden vermeden. Hoewel M9 en natriumazide geen significante fragmentatie van mitochondriën vertoonden, is het belangrijk op te merken dat verschillende stammen anders kunnen reageren dan de hier getoonde resultaten. Hoewel andere studies hebben aangetoond dat natriumazide mitochondriën kan fragmenteren, is het mogelijk dat onze stammen geen significante mitochondriale fragmentatie vertonen bij blootstelling aan natriumazide vanwege het lage expressieniveau van onze constructen. Hoge expressie van mitochondriën-gelokaliseerde eiwitten kan het membraanpotentieel doen instorten, en daarom kunnen verschillende stammen die in andere onderzoeken worden gebruikt, mitochondriën vatbaarder maken voor fragmentatie van dezelfde concentraties natriumazide die in deze studie zijn gebruikt. Hoe dan ook, er moet voor worden gezorgd dat chemicaliën die wormen verlammen geen mitochondriale fragmentatie veroorzaken in specifieke omstandigheden die moeten worden getest voordat ze in alle onderzoeken worden gebruikt, aangezien specifieke mutanten of aandoeningen vatbaarder kunnen zijn voor door geneesmiddelen geïnduceerde mitochondriale fragmentatie. Bovendien kan zelfs het houden van de wormen in M9 resulteren in veranderingen in hun natuurlijke mitochondriale morfologie en activiteit, aangezien eerder is aangetoond dat hun zwemactiviteit in de M9-buffer de mitochondriale splijting en fusiedynamiek beïnvloedt. Bovendien kan het langdurig achterlaten van wormen in M9 hypoxiereacties activeren die de mitochondriën aanzienlijk beïnvloeden door mitochondriale proteostaseverstoringen te veroorzaken^48,49.

Ten slotte is een andere belangrijke overweging dat, hoewel veranderingen in de mitochondriale morfologie vaak gecorreleerd zijn met veranderingen in de mitochondriale functie, er niet altijd een directe correlatie is tussen de twee. Daarom wordt een grondigere analyse van de mitochondriale functie aanbevolen. Het zuurstofverbruik kan bijvoorbeeld worden gemeten met behulp van een Seahorse-instrument⁵⁰, het mitochondriale membraanpotentiaal kan worden gemeten met behulp van membraanpotentiaalkleurstoffen zoals JC9 of TMRE⁵¹, de mitochondriale oxidatieve toestand kan worden gemeten met behulp van redoxgevoelige kleurstoffen zoals roGFP⁵², en mitochondriale stressbestendigheid kan worden gemeten met behulp van gevoeligheid voor stressoren zoals rotenon⁵³. Omdat beeldvorming van mitochondriën vrij snel kan zijn, bieden we de methoden hier aan als een gemakkelijke eerste stap om te bepalen of experimentele omstandigheden de mitochondriale morfologie beïnvloeden. Deze methoden zijn zelfs geschikt voor grootschalige screening van geneesmiddelen of genen, waarbij de follow-up van een grondigere mitochondriale analyse met behulp van aanvullende statistieken wordt aanbevolen. Al met al bespreken we hier wat wordt beschouwd als de eenvoudigste methoden om de mitochondriale morfologie in C. elegans in beeld te brengen met minimale experimentele fouten.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUDR)	Spectrum Chemical	F2026-10GMBL	for proliferation inhibition
APEX IPTG	Genesee	18-242	for RNAi
Bacto Agar	VWR	90000-764	for NGM plates
Bacto Peptone	VWR	97064-330	for NGM plates
Calcium chloride dihydrate	VWR	97061-904	for NGM plates
Carbenicillin	VWR	76345-522	for RNAi
Cholesterol	VWR	80057-932	for NGM plates
Confocal microscope	Stellaris 5
DMSO	VWR	BDH1115-1LP	solvent for drugs
HistoBond microscope slides	VWR	16005-110	for slides preparation
LB Broth	VWR	95020-778	for LB
LEICA S7E Dissecting Scope	Leica	10450840	Standard dissecting microscope
LEICA STELLARIS 5	Leica	158101100	Confocal Microscope
LEICA THUNDER	Leica	11525679	Compound Microscope
Magnesium sulfate heptahydrate	VWR	97062-132	for NGM plates, M9
pL4440 empty vector plasmid	addgene	plasmid #1654	for empty vector plasmid
Potassium Chloride	VWR	97061-566	for bleach soluton
Potassium phosphate dibasic	VWR	EM-PX1570-2	for NGM plates
Potassium phosphate monobasic	VWR	EM-PX1565-5	for M9
Sodium azide	VWR	97064-646	for paralyzing worms
Sodium Chloride	VWR	EM-SX0420-5	for NGM plates, M9
Sodium hypochlorite	VWR	RC7495.7-32	for bleach solution
Sodium phosphate dibasic	VWR	71003-472	for M9
Tetracycline hydrochloride	VWR	97061-638	for RNAi
WOB-L® Dry Vacuum Pumps, Standard-Duty, Welch®	VWR	80077-612	for aspiration