Methodenartikel

Time-Lapse Epifluorescentiemicroscopie Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Heterogene fenotypes

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67617

⸱

14 februari 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology & Biophysics, UConn Health, 2School of Dental Medicine, UConn Health, 3Richard D. Berlin Center for Cell Analysis and Modeling, UConn Health

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

In dit manuscript bieden we een uitgebreid protocol voor het beoordelen van de antibioticaoverleving voor Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus, waarbij plasmiden worden getransformeerd in P. aeruginosa en S. aureus om reporterstammen te creëren en fenotypische varianten, zoals persisters, te visualiseren door time-lapse epifluorescentiemicroscopie.

Samenvatting

Antibioticapersistentie is een fenomeen waarbij een klein aantal bacteriële cellen in een genetisch gevoelige populatie een antibioticabehandeling overleven die de andere genetisch identieke cellen doodt. Bacteriële persisters kunnen de replicatie hervatten zodra de antibioticabehandeling is beëindigd en worden algemeen aangenomen dat ze ten grondslag liggen aan het falen van de klinische behandeling. Recent werk dat gebruik maakt van de kracht van time-lapse fluorescentiemicroscopie, waarbij bacteriën worden gelabeld met fluorescerende transcriptionele reporters, translationele reporters en/of kleurstoffen voor een verscheidenheid aan cellulaire kenmerken, heeft ons begrip van Escherichia coli-persisters verder ontwikkeld dan wat kan worden geleerd van antibiotica-overlevingstesten op populatieniveau. Dergelijke eencellige benaderingen, in plaats van bulkpopulatietests, zijn essentieel voor het afbakenen van de mechanismen van persistervorming, schaderespons en overleving. De methoden voor het bestuderen van persisters in andere belangrijke pathogene soorten op dit detailniveau blijven echter beperkt.

Deze studie biedt een aanpasbare benadering voor time-lapse-beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa (een gramnegatieve staaf) en Staphylococcus aureus (een grampositieve coccus) tijdens antibioticabehandeling en herstel. We bespreken moleculair genetische benaderingen om fluorescerende reporters in deze bacteriën te introduceren. Met behulp van deze reporters, evenals kleurstoffen, kunnen we de fenotypische veranderingen, morfologische kenmerken en het lot van individuele cellen volgen als reactie op een antibioticabehandeling. Bovendien zijn we in staat om de fenotypes van individuele persisters te observeren terwijl ze reanimeren na de behandeling. Al met al dient dit werk als een hulpmiddel voor diegenen die geïnteresseerd zijn in het volgen van de overleving en genexpressie van individuele met antibiotica behandelde cellen, inclusief persisters, zowel tijdens als na de behandeling, bij klinisch belangrijke pathogenen.

Inleiding

Bacteriële pathogenen kunnen de effecten van antibiotica omzeilen via twee primaire mechanismen: antibioticaresistentie, waarbij genetische veranderingen betrokken zijn, en fenotypische tolerantie, waarbij niet-genetische veranderingen betrokken zijn. Antibioticaresistentie is een genetisch gecodeerd fenomeen dat een bepaalde bacteriecel het vermogen geeft om niet alleen te overleven, maar ook te repliceren in de aanwezigheid van een antibioticum1. Fenotypische tolerantie, die antibioticatolerante of antibioticapersistente bacteriën kan omvatten, treedt op wanneer cellen bestand zijn tegen bacteriedodende antibioticabehandeling zonder het vermogen te krijgen om te repliceren in aanwezigheid van een remmende concentratie van het antibioticum 1,2. Wat tolerantie onderscheidt van persistentie, is dat tolerantie verwijst naar het vermogen van de hele populatie om de behandeling te overleven, terwijl persistentie verwijst naar een subset van een isogene maar fenotypisch heterogene populatie die een antibioticabehandeling overleeft. Wanneer een klonale cultuur wordt behandeld met bacteriedodende antibiotica en overlevenden die in de cultuur blijven, worden uitgezet tegen de tijd op een log-lineaire schaal, wordt meestal een bifasische curve gedetecteerd wanneer persisters aanwezig zijn. Op deze curven laat de eerste fase zien dat de meerderheid van de bevolking relatief snel wordt gedood, en de tweede fase geeft aan dat een persistente antibioticafractie langzamer of helemaal niet wordt gedood 1,2.

Persistentie van antibiotica vormt een grote belasting voor de wereldwijde gezondheidszorgsystemen. Zo wordt gedacht dat Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa persisters, die de focus van dit artikel zijn, antibiotica-recalcitrante infecties veroorzaken, waaronder terugkerende luchtweginfecties bij patiënten met cystische fibrose en chronische wondinfecties 3,4. Daarom is het van cruciaal belang om de persistercelbiologie en fenotypische programma's verder op te helderen. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het begrijpen hoe persisters ontstaan en reanimeren, blijven er kritieke kennislacunes met betrekking tot de coördinatie van metabole herprogrammering en moleculaire gebeurtenissen in individuele cellen die ten grondslag liggen aan persistentie 5,6,7,8.

Het effectief bestuderen van persistentie is een technische uitdaging gebleken. Aangezien persistentie alleen waarneembaar is in een kleine subset van een bacteriepopulatie, slagen technieken die bulkbacteriepopulaties bemonsteren er vaak niet in om relevante biologische informatie vast te leggen 1,2,8,9,10. Bovendien, aangezien fenotypische veranderingen die ten grondslag liggen aan persistentie van voorbijgaande aard en niet erfelijk zijn, kan het volgen van het lot van persisterende cellen complex zijn 1,8,9,10,11. Zodra bacteriële persisters weer groeien, kunnen ze zich delen en aanleiding geven tot zowel persisters als niet-persisters, wat het onmogelijk maakt om te verrijken voor pure persister-populaties door te kweken. Deze uitdagingen benadrukken de behoefte aan technieken die aan de volgende criteria kunnen voldoen: 1) het vermogen om biologische informatie van levende, afzonderlijke cellen vast te leggen en 2) het vermogen om te worden gebruikt in combinatie met fluorescerende kleurstoffen, sondes, sensoren en reporters waarmee fenotypes van individuele cellen in heterogene populaties in de loop van de tijd kunnen worden ondervraagd.

Recente ontwikkelingen in single-cell-technologieën hebben een manier geboden om bacteriële heterogeniteit effectief te onderzoeken en deze hindernissen bij het bestuderen van persistentie te overwinnen12,13. Sommige van deze technieken omvatten fluorescentiemicroscopie, flowcytometrie/fluorescentie-geactiveerde celsortering, microfluïdica en eencellige RNA-sequencing12,13. Hier beschrijven we protocollen voor het ophelderen van single-cell persister fysiologie met behulp van epifluorescentie time-lapse microscopie van transcriptionele of translationele reporter stammen. Fluorescentiemicroscopie is een krachtige techniek die voldoet aan de criteria voor het bestuderen van persister-fenotypes, namelijk het vermogen om te identificeren welke individuele cellen in een grote populatie zich voortplanten na verwijdering van antibiotica en dus kunnen worden gedefinieerd als persisters. Met de introductie van geautomatiseerde cameratechnologieën en geïncubeerde kamers is het vastleggen van levende bacteriële cellen algemeen toegankelijk op het gebied van microbiologie. Cruciaal is dat time-lapse-microscopie de mogelijkheid biedt om afzonderlijke cellen in realtime te visualiseren, in de loop van uren en zelfs dagen, waardoor het mogelijk wordt om bacteriën voor, tijdens en na de antibioticabehandeling te volgen 14,15,16. Inzichten uit deze onderzoeken met behulp van time-lapse-microscopie hebben een enorm potentieel om inzicht te genereren in de complexe mechanismen van persisterbiologie.

Protocol

1. Genereren van fluorescerende reporterstammen van  S. aureus door transformatie en transductie

OPMERKING: Reporter-stammen herbergen een fluorescerend eiwit om de expressie van een gen of eiwit van belang aan te geven. Transcriptionele reporters bevatten een duplicaat van de native promotorsequentie voor een gen van belang stroomopwaarts van een fluorescerend eiwit, zodat de fluorescentie toeneemt naarmate de expressie van een interessant gen toeneemt. Translationele verslaggevers koppelen de open leeskaders van een fluorescerend eiwit en een interessant eiwit aan een flexibele peptideconnector. Het visualiseren van reporterstammen met live-celmicroscopie kan onthullen of een bepaald gen/eiwit van belang geassocieerd is met specifieke celmorfologieën of celloten (Figuur 1, Aanvullende Video 1 en Aanvullende Video 2). Kies een fluorescerend eiwit dat codon-geoptimaliseerd is voor S. aureus. Hoewel deze studie gebruik maakt van sGFP van pCM29, geschonken door Dr. Alexander Horswill, bevat de Nebraska Transposon Mutant Library Genetic Toolkit plasmiden met codon-geoptimaliseerde sGFP, eYFP, eCFP, DsRed.T3 en eqFP65017,18.

  1. Transformeer reporterplasmiden in S. aureus RN4220.
    OPMERKING: Het volgende protocolgedeelte is een bewerking van de Essentials of Staphylococcul Genetics and Metabolism Workshop aan het University of Nebraska Medical Center19,20.
    1. Bereid eerst de elektrocompetente S. aureus RN4220 voor. Bereid 200 ml B2-bouillon voor door 2 g casaminozuren, 5 g gistextract, 2 ml 10% K2HPO4, pH 7,5, 2 ml 50% glucoseoplossing en 5 g NaCl te combineren. Breng het volume op 100 ml met steriel ultrapuur water. Meng kort bij 37 °C om componenten op te lossen en steriliseer met een flessenfilter (poriegrootte van 0,22 μm).
    2. Inoculeer S. aureus RN4220 uit een diepvriesbouillon bewaard bij -80 °C in 25% glycerol in 30 ml B2-bouillon in een kolf van 250 ml en incubeer gedurende 18 uur bij 30 °C, schuddend bij 125 tpm.
    3. Incubeer twee kolven van 250 ml met elk 50 ml B2-bouillon bij 37 °C een nacht om de media voor te verwarmen voor de volgende dag.
    4. Meet de volgende dag de OD600 van de nachtcultuur. Voeg voldoende nachtcultuur toe aan elke kolf met 50 ml B2-bouillon om een uiteindelijke OD600 van 0,25 te krijgen.
    5. Incubeer bij 37 °C, schudden bij 250 tpm, totdat de OD600 0,35-0,4 bereikt.
      OPMERKING: Controleer de OD600 ongeveer 30 minuten na het subkweken om er zeker van te zijn dat de cultuur niet verder groeit dan 0,35-0,4. Als de OD600 niet binnen 1 uur na het subkweken 0,35-0,4 bereikt, stop dan met de procedure en probeer het de volgende dag opnieuw. De bacteriën groeiden hoogstwaarschijnlijk van de ene op de andere dag te veel en zaten te diep in de stationaire fase.
    6. Zodra de cultuur de mid-log-fase bereikt, giet u de cultuur uit elke kolf in een steriele conische buis van 50 ml en pelletcellen door centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 10 minuten.
    7. Decanteer het bovenstaande en resuspendeer de pellet in 1 ml steriel water op kamertemperatuur (RT). Breng de cellen over naar een microcentrifugebuis.
    8. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 21.000 x g gedurende 30 s, verwijder de supernatant en suspendeer opnieuw in 1 ml steriel RT-water. Herhaal de centrifugatie, verwijdering van het supernatant en resuspensie in stappen van 1 ml water nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
    9. Centrifugeer de cellen, verwijder het water, suspendeer de cellen vervolgens opnieuw in 1 ml steriele RT 10% glycerol (in water, steriel gefilterd) en laat 15 minuten op RT staan.
    10. Pellet de cellen door centrifugatie op 21.000 x g gedurende 30 s, verwijder het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in nog eens 1 ml steriele, RT 10% glycerol. Deze cellen zijn nu elektrocompetent.
    11. Breng 70 μL elektrocompetente cellen aan in microcentrifugebuisjes met klikdop en bewaar deze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
    12. Om de elektrocompetente S. aureus RN4220 te transformeren, ontdooit u een aliquot cellen op ijs. Voeg 1 μg plasmide-DNA toe aan de cellen, veeg het monster om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten op ijs. Elektroporeer vervolgens de cellen en laat ze herstellen in 390 μL B2-media gedurende 1-2 uur bij 37 °C, schudden bij 225 rpm, en plaattransformatoren op selectieve tryptische soja-agar.
      OPMERKING: De meeste shuttle-vectoren die in deze studie zijn gebruikt, zijn voorzien van een ampicilline-resistentiecassette voor selectie in E. coli (100 μg/ml) en een chlooramfenicol- (10 μg/ml) of erytromycine- (Erm, 10 μg/ml) resistentiecassette voor selectie in S. aureus. Veel S. aureus-stammen die routinematig in het laboratorium worden gebruikt, zijn Erm-resistent. Zorg ervoor dat een interessante stam compatibel is met het selectieve antibioticum voordat u een bepaalde shuttlevector gebruikt. Het is belangrijk dat het DNA-volume dat aan de cellen wordt toegevoegd, wordt geminimaliseerd (d.w.z. <5 μL) om vonkvorming te voorkomen, die optreedt wanneer het monster te geleidend is tijdens elektroporatie. Het zuiveren van hoge concentraties (≥300 ng/μL) van het plasmide-DNA van E. coli zal helpen de volumes laag te houden.
  2. Bacteriofaag vermeerderen op getransformeerde S. aureus RN4220.
    OPMERKING: Het volgende protocolgedeelte is aangepast van methoden van Krausz en Bose21en Olson22. Twee van de meest gebruikte bacteriofagen voor S. aureus Transductie zijn φ11 en 80α. De procedure voor het oogsten van beide is hetzelfde, behalve dat we φ11 verkrijgen van S. aureus RN451 en 80α van S. aureus RN10359. φ11 is met succes gebruikt met onder andere de gangbare stammen JE2 en HG003 en wordt in dit protocol gebruikt23,24. Het is echter mogelijk dat deze fagen klinische isolaten met verschillende faagresistenties niet efficiënt transduceren. Zie de publicaties van Krausz en Bose21 en Olson22 Voor een methode voor het bereiden van φ11 en het bepalen van de faagtiter.
    1. Om het reporterplasmide te transduceren, bereidt u zes tryptische soja-agar (TSA)-platen voor met 5 mM CaCl2 en de juiste concentratie van het selectieve antibioticum. Streak S. aureus RN4220 getransformeerd met het reporterplasmide op een TSA-plaat met het selectieve antibioticum en geen CaCl2 en incubeert 's nachts.
    2. Zet de volgende dag een broedmachine of waterbad aan op 56 °C. Label zes buisjes met klikdop van 5 ml 1 x 104 tot en met 1 x 109 en aliquoot 40 μl 500 mM CaCl2 in elk buisje met klikdop.
    3. Smelt zachte TSA (0,5% agar) in een magnetron met de dop los om drukopbouw te voorkomen en tegelijkertijd de steriliteit te behouden. Doseer vervolgens 4 ml in elk van de buisjes met klikdop. Keer de buisjes om om te mengen en plaats ze vervolgens in de broedmachine van 56 °C om te voorkomen dat de zachte agar stolt.
    4. Verdun de faagbouillon tot 1 x 1010 PFU/ml in tryptische sojabouillon (TSB) + 5 mM CaCl2. Voeg 100 μL 1 x 1010 PFU/ml faag toe aan een microcentrifugebuisje met 900 μL TSB + 5 mM CaCl2 voor een uiteindelijke concentratie van 1 x109 PFU/ml. Verdun vervolgens serieel in extra microcentrifugebuisjes die 900 μL TSB + 5 mM CaCl2 bevatten tot een concentratie van 1 x 104 PFU/ml. Label elk van de zes TSA + 5 mM CaCl2 + selectieve antibiotische agarplaten met een seriële verdunning: 1 x104 tot en met 1 x 109 PFU/ml.
    5. Resuspendeer de nachtelijke S. aureus RN4220 met het plasmide in 1 ml TSB + 5 mM CaCl2. Verwijder de 109 snap-cap buis uit de incubator en voeg snel 10 μL geresuspendeerde RN4220 met het plasmide en 100 μL 1 x 109 PFU/ml faagverdunning toe, keer om om te mengen en giet de inhoud op de overeenkomstige TSA + 5 mM CaCl2 + selectieve antibiotische agarplaat.
    6. Voer deze procedure uit voor de resterende faagverdunningen en hun respectievelijke platen. Laat de zachte agar op de platen stollen en incubeer vervolgens met de zachte agar naar boven een nacht bij 37 °C.
    7. Zorg er de volgende dag voor dat er plaques (vrije plekken op het bacteriële gazon) zichtbaar zijn op de platen (Figuur 2A). Plaques vertegenwoordigen lysisgebieden waar fagen RN4220 met succes hebben geïnfecteerd, en sommige fagen zullen het plasmide van interesse hebben opgenomen. Selecteer de plaat met de minst verdunde faagvoorraad die bijna confluente lysis heeft (bijvoorbeeld: 1 x 109 PFU/ml faag) en de platen die de twee verdunningen daaronder hebben ontvangen (in dit geval 1 x 108 PFU/ml en 1 x 107 PFU/ml, die beide bijna confluente lysis moeten hebben).
    8. Voeg 3 ml TSB + 5 mM CaCl2 toe aan de minst verdunde van deze platen (1 x 109 PFU/ml, voor dit voorbeeld). Gebruik een steriele L-vormige celspreider om de laag zachte agar voorzichtig van de gewone agar te schrapen (Figuur 2B). Gebruik de celspreider om de agar zoveel mogelijk te verstoren om de afgifte van faag uit de zachte agar te vergemakkelijken.
    9. Zodra de zachte agar op de eerste plaat grondig is verstoord, giet u de zachte agar en bouillonsuspensie voorzichtig op de volgende plaat (in dit geval 1 x 108 PFU/ml). Schraap en verstoor de zachte agar op deze plaat, giet de resulterende suspensie op de uiteindelijke plaat en herhaal.
    10. Na het bereiden van de zachte agarsuspensie van alle drie de platen, giet u de slurry voorzichtig in een conische buis van 50 ml. Pipetteer voorzichtig om de zachte agar verder te verstoren, maar vermijd het vormen van bubbels. Draaikolken niet, omdat dit de faag kan beschadigen en de titer kan verlagen.
    11. Centrifugeer de zachte agarsuspensie bij 4.000 x g gedurende 10 minuten bij RT. Giet het bovenstaande voorzichtig in een spuit die is aangesloten op een filter van 0,45 μm.
      OPMERKING: Het is essentieel om voorzichtig te gieten en te voorkomen dat er stukjes agar in het filter komen. Deze stukjes zullen het filter verstoppen en voorkomen dat de resterende bovenliggende, afnemende titer wordt gefilterd.
    12. Bepaal de titer van het resulterende faaglysaat met behulp van wildtype RN422021.
  3. Introduceer reporterplasmiden in S. aureus-stammen van belang door transductie.
    1. Bereid acht TSA-platen voor die 500 μg/ml natriumcitraat en de juiste concentratie selectief antibioticum bevatten. Streep de gewenste ontvangende S. aureus-zeef dicht op gewone TSA en broed een nacht bij 37 °C.
    2. Veeg de volgende dag de plaat schoon en suspendeer de recipiente stam opnieuw in 1 ml TSB + 5 mM CaCl2.
    3. Verdun de faagvoorraad met het gewenste reporterplasmide tot 1 x1010 PFU/ml.
    4. Meng 1,5 ml TSB + 5 ml CaCl2, 0,5 ml geresuspendeerde ontvangende stam en 0,5 ml verdunde faagbouillon in een conische buis van 50 ml. Incubeer bij 37 °C, schudden bij 225 tpm, gedurende 20 min.
      OPMERKING: Langere incubatietijden worden niet aanbevolen, omdat ze waarschijnlijk de transductie-efficiëntie zullen verminderen naarmate de faag de ontvangende cellen begint te lyseren.
    5. Voeg direct daarna 1 ml steriel gefilterd ijskoud 0,02 M natriumcitraat (in water) toe aan de conische buis en centrifugeer bij 4.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de pellet vervolgens in 1 ml ijskoude 0,02 M natriumcitraat.
    6. Verdeel 100 μl aliquots op elk van de zes TSA-platen die 500 μg/ml natriumcitraat bevatten en de juiste concentratie selectief antibioticum om te selecteren voor transductanten. Incubeer een nacht bij 37 °C.
    7. Veeg de volgende dag individuele kolonies van de transductieplaten op de resterende twee TSA-platen die 500 μg/ml natriumcitraat en de juiste concentratie selectief antibioticum bevatten. Incubeer een nacht bij 37 °C.
      OPMERKING: Deze passaging-stap op extra natriumcitraatplaten helpt de titer van faag rond de getransduceerde cellen te verminderen, waardoor lysis22 wordt voorkomen.
    8. Pluk individuele kolonies van de streepplaat, laat de cellen groeien tot de exponentiële fase in TSB met het selectieve antibioticum en bewaar ze in 25% glycerol bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

2. Genereren van fluorescerende reporterstammen van  P. aeruginosa door conjugatie

OPMERKING: Het verplaatsen van een reporterplasmide naar P. aeruginosa van een E. coli-kloneringsstam kan worden gedaan door drieouderlijke paring25. Een donorstam van E. coli die het plasmide van belang draagt (dat een oriT moet bevatten voor echtelijke overdracht), E. coli HB101 + pRK2013 - een hulpstam om de conjugatie te vergemakkelijken (gebruik 50 μg/ml kanamycine voor het onderhoud van pRK2013-plasmide), en de P. aeruginosa-ontvangende stam die het plasmide zal ontvangen, zijn vereist. Voor dit voorbeeld heeft het plasmide van belang een tetracycline (Tet) resistentiemarker, dus elke E. coli-cultuur met het plasmide heeft 10 μg/ml Tet nodig, en P. aeruginosa met het plasmide heeft 75 μg/ml Tet nodig voor selectie26.

  1. Inoculeer bacteriën uit bevroren voorraden die bij -80 °C in 25% glycerol zijn bewaard in lysogene bouillon (LB) met het juiste antibioticum voor nachtelijke groei, schudden bij 225 rpm bij 37 °C.
  2. Verdeel de volgende dag 200 μL van elke vloeibare nachtcultuur op de LB-agarplaat met het juiste selectieve antibioticum. Afhankelijk van het aantal transformatieparingen dat moet worden gedaan, spreidt u meer platen uit voor de helper- en donorstammen. Eén plaat helper/donor per transformatie wordt aanbevolen. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C om dichte gazons van elke soort te krijgen.
  3. Verzamel de volgende dag de groeigazons door elk plaatoppervlak af te vegen met een steriel wattenstaafje en het langs de binnenkant van een microcentrifugebuis af te vegen. Centrifugeer elke buis kort (pulseer gedurende 5 s) om de cellen naar de bodem van de buis te verzamelen. Resuspendeer elke celpellet in 200 μL LB.
    OPMERKING: De resuspensies moeten er erg dik en ondoorzichtig uitzien en klontjes verwijderen.
  4. Meng in nieuwe microcentrifugebuisjes voor elke dekking 5 μL van de ontvangende P. aeruginosa-stam , 160 μL van de donor-E. coli-stam met het plasmide van belang en 160 μL helper E. coli HB101 + pRK2013. Meng voorzichtig, pipetter op en neer en spot vervolgens 50 μL van het mengsel op een voorgedroogde LB-agarplaat. Spot ook 20 μL van elke individuele stam naar de LB-agar voor controle. Laat de vlekken volledig in de plaat drogen en incubeer vervolgens gedurende 3-6 uur bij 37 °C.
    OPMERKING: Het voordrogen van de LB-agar voorkomt dat de plek van 50 μL zich over het oppervlak verspreidt en dwingt de cellen zo om binnen een kleiner gebied te interageren.
  5. Veeg na de incubatie voorzichtig met een pipetpunt over de paringsplek om enkele cellen over te brengen naar een nieuwe microcentrifugebuis. Centrifugeer kort om de cellen op de bodem van de buis te verzamelen. Resuspendeer in 200 μl LB en plaat de gehele resuspensie tot een LB + Irgasan (Igr; 25 μg/ml) + Tet (75 μg/ml) agarplaat.
    OPMERKING: P. aeruginosa is intrinsiek resistent tegen Igrasan, en het plasmide van belang bevat de Tet-resistentiemarker, dus alleen succesvol getransformeerde P. aeruginosa zou moeten kunnen groeien op de LB + Irgasan + Tet-platen. Afhankelijk van de transformatie-efficiëntie kan het opnieuw suspenderen en plateren van de hele paringsplek de volgende dag resulteren in een gazon met transformatoren. Om individuele kolonies te bereiken, resust u ofwel (i) de hele paringsplek in een groter volume LB en plaatst u er vervolgens 200 μL van, of (ii) brengt u een klein deel van de paringsplek over in een microcentrifugebuis en resuspendeert u vervolgens in 200 μL en plaat.
  6. Veeg met de controlepunten van elke afzonderlijke stam voorzichtig een deel van de dichte celvlek op een pipetpunt, breng over naar een nieuwe microcentrifugebuis, suspendeer opnieuw in 200 μL LB en spot vervolgens 50 μL op een LB + Irgasan + Tet-agarplaat (meerdere controlespots kunnen op dezelfde agarplaat worden geplaatst). Laat de vlekken volledig indrogen. Incubeer alle platen gedurende 16-20 uur een nacht bij 37 °C.
    OPMERKING: Voor de controleplekken is het doel om te controleren of de antibioticaplaat selectief is voor P. aeruginosa-transformatoren . Als de controleplekken te geconcentreerd zijn wanneer ze worden gespot op de LB + Irgasan + Tet-agarplaten, dan zal het moeilijk zijn om te bepalen of de selectie de volgende dag werkte, omdat er een halo van dode cellen zal zijn die kunnen worden aangezien voor groei.
  7. Bevestig de volgende dag de antibioticaselectiviteit van de LB + Irgasan + Tet-platen door het gebrek aan celgroei voor de individuele stamcontroleplekken op te merken.
    OPMERKING: Kolonies die verschijnen op de drieouderlijke paringsplaat LB + Igrasan + Tet zijn P. aeruginosa transformatoren die het plasmide van belang dragen.
  8. Optioneel om kolonies te plukken en te strepen op LB + Irgasan + Tet-agar en 's nachts te laten groeien om overtollige dode E. coli uit het paringsmengsel te verwijderen.
  9. Kies individuele kolonies, kweek gedurende 3-6 uur in vloeibare LB + Tet (75 μg/ml) tot ze zichtbaar troebel zijn en bewaar vervolgens ingevroren voorraden in 25% glycerol (500 μL celcultuur + 500 μL 50% glycerol in water). Controleer of de klonen met succes zijn getransformeerd door kolonie-PCR gevolgd door Sanger- of hele plasmide-sequencing.

3. Bepaling van antibioticadoses voor persister-assays

OPMERKING: Om een dosis van een bepaald antibioticum te selecteren waarmee de bacteriepopulatie kan worden behandeld voor persister-experimenten, meet u eerst de minimale remmende concentratie (MIC) van het antibioticum ten opzichte van de bacteriestam van belang. Dit kan worden bereikt met behulp van de microdilutiemethode voor bouillon - een benadering die door het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) wordt onderschreven - of de epsilometertest (E-test), die wordt uitgevoerd met behulp van teststrips met een reeks antibioticadoses27. Zodra de MIC is bepaald, kiest u ten minste vijf concentraties van het antibioticum die variëren van 1- tot 100-voudige MIC voor celbehandeling.

  1. Inoculeer bacteriën uit bevroren voorraden die bij -80 °C in 25% glycerol zijn bewaard in 2 ml voor kationen gecorrigeerde MHB (CA-MHB) of een ander voedingsrijk medium. Laat de cellen gedurende ongeveer 4 uur bij 37 °C groeien door te schudden bij 250 tpm alvorens 125 μl van de cultuur over te brengen op 25 ml verse, chemisch welbepaalde media in een erlenmeyer met verveling van 250 ml. Kweek de bacteriën gedurende 16 uur (tot stationaire fase) bij 37 °C, schudden bij 250 tpm.
    OPMERKING: Basale zoutmedia (BSM) met succinaat als enige koolstofbron worden meestal gebruikt voor P. aeruginosa-experimenten en rijke, chemisch gedefinieerde media worden meestal gebruikt voor S. aureus-experimenten 28,29,30,31.
  2. Bereid de volgende ochtend 100x antibioticavoorraden (in de respectievelijke oplosmiddelen) voor het gewenste bereik van supra-MIC-concentraties. Voeg 10 μl van elke verdunning toe aan de afzonderlijke reageerbuisjes.
  3. Meet de OD600 van de nachtcultuur om de troebelheid in de stationaire fase te bevestigen. Verdun 10 μl cultuur achter serie en plaats de verdunningen op voedzame agarplaten, zoals LB-agar, CA-MHB-agar of TSA, om de kolonievormende eenheden (CFU's) te bepalen voorafgaand aan de antibioticabehandeling.
  4. Doseer voor antibioticabehandeling 1 ml aliquots van de cultuur in de reageerbuisjes met 10 μl 100x antibioticaconcentraties. Incubeer de monsters bij 37 °C, schuddend bij 250 tpm, voor een duur die voldoende is om niet-persisters in de populatie te doden, waardoor persisters de enige kolonievormende cellen zijn.
    OPMERKING: De duur van de behandeling kan variëren, afhankelijk van het experiment en de bacteriestam die wordt getest. Meestal wordt S. aureus gedurende 5 uur of 7 uur behandeld en P. aeruginosa gedurende 7 uur of 24 uur. Over het algemeen kan elk tijdstip in de tweede fase van de tijdsafhankelijke overlevingstest worden gebruikt, omdat van de cellen die in de tweede fase achterblijven, wordt verwacht dat ze persisters zijn.
  5. Breng na een antibioticabehandeling 100 μL cellen over van de reageerbuizen naar microcentrifugebuisjes die 900 μL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bevatten. Pellet de cellen door centrifugatie bij RT op 21.000 x g gedurende 3 minuten. Verwijder 900 μl supernatans en suspendeer de pellet opnieuw in 900 μl steriel PBS. Herhaal de wasstap minstens één keer om de resterende antibiotica te verminderen tot sub-MIC-niveaus.
  6. Verdun de cultuur 10-voudig (zes keer) en plaat 10 μL van elke verdunning op voedzame agarplaten. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
    OPMERKING: Gebruik onbehandelde platen met 96 putjes met ronde bodem voor seriële verdunning en plaatcellen op vierkante agarplaten met behulp van een meerkanaalspipet.
  7. Tel de volgende dag de kolonies bij elke antibioticaconcentratie. Zet de overlevingsfractie (CFU aan het einde van de behandeling/CFU voorafgaand aan de behandeling) af tegen de concentratie op een log-lineaire schaal. Om een geneesmiddelconcentratie te kiezen voor toekomstige persistertesten, selecteert u een concentratie in de tweede fase van de bifasische curve (Figuur 3).

4. Beeldvorming van cellen tijdens antibioticabehandeling of herstel

  1. Bereid agarosepads en celmonsters voor op time-lapse-beeldvorming
    OPMERKING: Het volgende protocol voor het bereiden van monsters is ontwikkeld als een gebruiksvriendelijk, kosteneffectief alternatief voor traditionele agarose "sandwich"-methoden14,16. Het gebruik van een verwisselbaar dekglaasje voorkomt dat er rommelig vet of nagellak nodig is om het monster af te dichten, wat de beluchting van het monster verder zou kunnen beperken. De agarose wordt in de verwisselbare dekglaasschaal geplaatst terwijl de dekglaasje al op zijn plaats zit, waardoor betrouwbare vlakke agarose-oppervlakken ontstaan in vergelijking met agarosepadpreparaten uit de vrije hand. Over het algemeen heeft deze methode het mogelijk gemaakt om monsters te beeldvormen met een verbeterde focus over het hele gezichtsveld en voor langere duur als gevolg van stabiele bevochtiging. De hier beschreven methode wordt gebruikt om bacteriën tijdens een antibioticabehandeling in beeld te brengen (Figuur 4, Aanvullende video 3en Aanvullende video 4). Om persisters te visualiseren terwijl ze reanimeren en weer ontwaken na een antibioticabehandeling (Figuur 5, Aanvullende video 5en Aanvullende video 6), bereid de agarosepads voor met verse kweekmedia in plaats van gebruikte media en voeg geen antibiotica toe aan de pads (behalve die welke zijn toegevoegd voor plasmideonderhoud/antibioticaselectie).
    1. Plaats een steriel dekglaasje van 30 mm (#1.5 dikte) in de bodem van de roestvrijstalen bodem van een verwisselbaar dekglaasje ("kamer"). Draai het inzetstuk van polycarbonaat voorzichtig in de basis zodat het dekglaasje van 30 mm de basis van de kamer vormt en sluit het op zijn plaats af door de bijgevoegde siliconen O-ring samen te drukken. Herhaal deze stap om een dubbele kamer voor te bereiden.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om voor elk experiment duplicaten klaar te maken voor het geval de voorbereiding van een van de kamers niet optimaal is. Een op maat gemaakte 3D-geprinte scheidingswand wordt tegen het 30 mm dekstrookje geplaatst om te voorkomen dat beweeglijke cellen zoals P. aeruginosa kruisbesmetting veroorzaken en om oriëntatiepunten te bieden voor monsterlocaties. Het STL-bestand voor 3D-printen is beschikbaar in aanvullend bestand 1.
    2. Bereid 1,5% agarose in een conische tube van 50 ml met het medium van uw keuze. Draai voorzichtig om te mengen.
      OPMERKING: Voor het beeldvorming van cellen in de stationaire fase tijdens de behandeling worden celvrije gebruikte media van een nachtcultuur in de stationaire fase gebruikt als basismedia. Doorgaans wordt agarose-media bereid als 0.105 g agarose in 7 ml media voor het bereiden van twee kamers; elke kamer vereist 2 ml agarosemedia en het teveel is nuttig om luchtbellen tijdens het pipetteren te voorkomen.
    3. Plaats de conische 50 ml in een glazen bekerglas of magnetronbestendige houder (zorg ervoor dat de dop los zit). Magnetron op hoog vuur en stop elke 3-4 s om te wervelen en te mengen. Pauzeer en meng vaak om te voorkomen dat het agarosemengsel overborrelt.
      1. Controleer na ~1 min totale opwarmtijd of er nog zichtbare agarose is die niet is gesmolten in het mengsel. Als het mengsel gelijkmatig helder is, laat het agarosemedium dan kort afkoelen tot ~60 °C voordat u extra medicijnen of kleurstoffen toevoegt. Draai voorzichtig om te mengen en de vorming van luchtbellen te voorkomen.
        OPMERKING: Propidiumjodide (16 μM voor P. aeruginosa of 1,6 μM voor S. aureus) kan worden toegevoegd om te visualiseren wanneer cellen hun levensvatbaarheid verliezen.
    4. Om te voorkomen dat het agarosemedium stolt, pipetteer u 2 ml van het agarosemedium in de kamer met het dekglaasje van 30 mm. Leg voorzichtig een steriel dekglaasje van 25 mm (#1.5 dikte) over het agarosemedium in de opening van de bovenste kamer; Dit helpt uitdroging van het agarosekussen te voorkomen en zorgt voor een plat bovenoppervlak van de agarose voor een optimale fasecontrastbeeldvorming. Laat de pad 1-2 uur stollen.
    5. Nadat het kussentje is gestold, bereidt u de cellen voor die moeten worden afgebeeld door ze te verdunnen tot een voldoende schaarse dichtheid in PBS voor het visualiseren van afzonderlijke cellen. Hier worden de cellen verdund tot OD600 0,01-0,05.
    6. Gebruik op het dekglaasje van 25 mm een permanente marker met fijne punt om de locaties/identiteiten van elk monster dat op het kussen is gezaaid, te markeren. Keer de kamer om zodat de roestvrijstalen basisring naar boven wijst en houd het inzetstuk van polycarbonaat eronder voorzichtig vast terwijl u de basis losmaakt. Plaats de roestvrijstalen basis opzij. Schuif het 30 mm dekglaasje voorzichtig van de pad en gooi het weg.
      OPMERKING: Verwijder het dekglaasje van 30 mm door horizontaal te schuiven en zorg ervoor dat het agaroseoppervlak niet inspringt. Vermijd ook het werken over het blootgestelde agarose-oppervlak: stof dat erop valt, heeft invloed op de beeldkwaliteit en kan mogelijk de pad verontreinigen.
    7. Gebruik de markeringen op het dekglaasje van 25 mm als leidraad en spot 5 μl van de verdunde cellen op de respectievelijke locaties op het agarosepad. Voeg drie spots van 5 μL toe (pas dit naar behoefte aan, bijv. 4 x 4 μL spots, enz.). Zodra de vlekken volledig zijn opgedroogd, plaatst u lichtjes een nieuw, steriel dekglaasje van 30 mm in het midden over het kussentje.
    8. Houd het inzetstuk van polycarbonaat met één hand vast en rijg met de andere hand de roestvrijstalen basis langzaam weer over het nieuwe dekglaasje. Draadsnijden tot net handvast is voldoende om de siliconen O-ring samen te drukken en de kamer af te dichten.
      OPMERKING: Pas op dat u niet te vast aandraait - als het dekglaasje van 30 mm tegen het monsteroppervlak wordt samengedrukt door de roestvrijstalen basis en herhaaldelijk wordt gedraaid, kunnen de cellen zich in een radiaal patroon verspreiden, waardoor kruisbesmetting van het monster kan ontstaan.
    9. Zodra de kamer is afgesloten, controleert u of de agarose in contact komt met het oppervlak van het dekglaasje van 30 mm; Op dit punt is er meestal enig, maar niet volledig, oppervlaktecontact. Gebruik het stompe uiteinde van een pincet of een soortgelijk instrument om voorzichtig tegen het 25 mm dekglaasje te drukken totdat de agarose het 30 mm dekglaasje gelijkmatig over het hele oppervlak raakt.
      LET OP: Deze stap kan ertoe leiden dat het dekglaasje van 25 mm breekt als er te veel kracht wordt gebruikt.
    10. Zodra de agarose goed tegen het 30 mm dekglaasje is gedrukt zodat er geen grote luchtbellen meer zijn, is het kussen klaar om in beeld te worden gebracht.
  2. Stel de microscoop en het beeld in.
    1. Bereid de omgevingscontroles van de microscoop en de beeldkamer voor. Stel de temperatuur van de stage-incubator en de incubator met grote kamer in op 37 °C en schakel de kamerbevochtiger in. Plaats een van de preparaten van de agarosepads in de broedmachine en sluit de incubatiekamer zodat het monster in evenwicht is. Het bevochtigingsdeksel van de stage-top couveuse wordt op dit punt open gelaten om condensatie op het 25 mm dekglaasje van de kamer te voorkomen.
      OPMERKING: Krimp/uitzetting van de pad als gevolg van temperatuurveranderingen kan een afwijking tussen tijdstippen veroorzaken die het scanbereik van het autofocusalgoritme overschrijden. Het is van cruciaal belang om het agarosekussen in evenwicht te brengen tot een stabiele temperatuur vóór de beeldvorming, wat doorgaans ten minste 15 minuten duurt. Voldoende opwarming voorkomt ook condensatie op de bovenste dekslip wanneer het bevochtigingsdeksel wordt geplaatst. De hardwarecomponenten van het beeldvormingssysteem waren (Materiaaltabel): incubatiekamer voor levende cellen, omgekeerde microscoop met een Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27-objectief, Spectra 7 LED-lichtmotor en sCMOS-camera (pixelgrootte van 6.5 μm). Controle van de gemotoriseerde componenten van de microscoop en beeldacquisitie wordt gedaan met behulp van een softwaretoepassing voor microscopieanalyse.
    2. Bereid de software voor op beeldacquisitie. Stel het ingebouwde autofocusalgoritme van MetaMorph (software voor microscopie-analyse) in om het fasekanaal te gebruiken tijdens multidimensionale acquisitie.
      1. Stel op het tabblad Fase meerdere faseposities in voor elk monster, gericht op gezichtsvelden waar de celdichtheid gelijkmatig is verdeeld. Stel op het tabblad Timelapse de gewenste duur en frequentie (tijdsinterval) in van de foto's die moeten worden gemaakt. Stel op de tabbladen Golflengten de gewenste kanalen voor acquisitie in en pas de belichtingstijden aan voor de signaalintensiteiten van de samples.
        OPMERKING: Afbeeldingen van elke positie worden elke 10 minuten gedurende maximaal 24 uur gemaakt. Voor fluorescentiebeeldvorming van de in dit artikel genoemde kleurstoffen/fluoroforen werden de volgende excitatie-instellingen van de lichtmotor gebruikt: propidiumjodide (Cy3; 555/15 nm) en GFP (GFP/FITC; 470/24 nm). De typische belichtingstijd voor fluorescentie-excitatie die wordt gebruikt, is 100 ms. Filterset 15 (Beamsplitter FT580, Emissie LP590) voor propidiumjodide en filterset 44 (Beamsplitter FT500, Emissie BP 530/50) voor GFP worden gebruikt.
    3. Nadat het agarosekussen in de kamer is opgewarmd, voegt u het bevochtigingsdeksel toe aan de podiumbroedmachine. Dit helpt voorkomen dat de pad uitdroogt en verschuift tijdens de beeldvorming.
    4. Verander met het bevochtigingsdeksel erop van fase naar differentieel interferentiecontrast (DIC) en pas de condensor en het diafragma van de microscoop aan voor de juiste Köhler-verlichting.
    5. Schakel na het afstellen terug naar fase. Navigeer naar elke fasepositie, pas de focus aan en reset de stagepositie naar het nieuwe brandpuntsvlak. De instellingen zijn nu ingesteld om te beginnen met beeldvorming.
      OPMERKING: Het is belangrijk om elke fasepositie opnieuw te bezoeken voordat u begint met verwerven om er zeker van te zijn dat de pad niet is verschoven. Als de cellen onscherp zijn wanneer ze op een bepaalde fasepositie opnieuw worden bezocht, stelt u er opnieuw op scherp en overschrijft u de vorige fasepositie. De instelling van het autofocusalgoritme gebruikt de focale z-positie vanaf het laatste tijdstip ± 3 μm als zoekbereik, dus als de pad meer dan 3 μm verschuift, zal het algoritme niet goed scherpstellen.
    6. Start de multidimensionale acquisitie door op de knop Acquisitie te klikken.
    7. Nadat het experiment is voltooid, compileert u de afzonderlijke afbeeldingen van elk kanaal in een stapel die u als video of voor andere analyse kunt bekijken. Doe dit met behulp van MetaMorph of ImageJ.
      1. Om afbeeldingen samen te stellen in MetaMorph (bij voorkeur), selecteert u in de app Multidimensionale gegevens bekijken de kanalen/golflengten die van belang zijn en selecteert u alle tijdstippen voor een bepaalde podiumpositie. Klik op Afbeeldingen laden. Er verschijnen vensters voor elk kanaal/golflengte. Sla elke compilatie met de bijbehorende kanaalnaam op als een .tiff bestand.
      2. Om in ImageJ te compileren, opent u de bestanden voor alle tijdstippen voor één etappepositie en één kanaal. Compileer met behulp van afbeeldingen om te stapelen.

5. Time-lapse-video's maken met Fiji/ImageJ

OPMERKING: Fiji (Fiji is gewoon ImageJ) is een vrij beschikbare software voor beeldverwerking en -analyse die hier kan worden gedownload: "https://imagej.net/software/fiji/downloads32"32. Fiji/ImageJ2 1.54f is gebruikt voor de hieronder beschreven beeldverwerkingsmethoden.

  1. Corrigeer de beeldstapel van het fasekanaal in de schaduw met behulp van BaSiC33. Open de gewenste fase-installatiestapel in Fiji en selecteer vervolgens BaSiC op het tabblad Plug-ins . De stapel met kleurcorrectie verschijnt in een apart venster met de naam Corrected:ImageName.
    OPMERKING: BaSiC.jar kunt u hier downloaden: "https://github.com/marrlab/BaSiC33"33. Volg de instructies van de ontwikkelaar voor het correct installeren van BaSiC in Fiji.
  2. Voeg de schaduwgecorrigeerde fasekanaalstapel samen met andere kanalen/golflengten met behulp van Afbeelding > Kleur > Kanalen samenvoegen. Pas de achtergrond en signaalintensiteit aan met Afbeelding > Pas > helderheid/contrast aan voor elk kanaal. Sla het samengevoegde bestand op als een .tiff.
  3. Stabiliseer vervolgens de afbeeldingen met behulp van Correct 3D Drift. Selecteer de stapel met kleurcorrectie en ga naar Plug-ins > Registraties > 3D-drift corrigeren. Stel in het dialoogvenster dat wordt geopend het kanaal voor registratie in op het kanaalnummer dat overeenkomt met de fasestapel. De resulterende stapel na correctie krijgt de naam geregistreerde tijdstippen. Snijd bij tot het gewenste gezichtsveld en sla het gecorrigeerde bestand vervolgens op als een .tiff.
    OPMERKING: Als MetaMorph is gebruikt om de gecompileerde afbeeldingsstapel te maken, is er een extra verwerkingsstap: ga naar Eigenschappen > afbeelding en verwissel de nummers in de velden Segmenten (z) en Frames (t). De driftcorrectie kan nu elk frame correct interpreteren als een tijdpunt en niet als een segment van een z-stack. Het bestand met schaduwcorrectie en driftcorrectie .tiff kan worden gebruikt voor latere beeldanalyses. Er zijn veel softwarepakketten beschikbaar om fluorescerende signaalintensiteiten te meten, morfologische kenmerken te kwantificeren, het lot van individuele cellen te volgen en meer. Twee veelgebruikte programma's zijn de MicrobeJ plug-in voor Fiji en Oufti34,35.
  4. Voeg tijdstempels en tekstlabels toe aan de stapel met behulp van Afbeelding > Stapels > Label.
  5. Als u een schaalbalk wilt toevoegen, moet u eerst de pixelgrootte van de camera en de vergroting van het microscoopobjectief kennen. Bereken de pixel:micron-verhouding als pixelgrootte gedeeld door vergroting. Voer in het dialoogvenster Schaal analyseren > instellen de pixel:micron-verhouding in het veld voor bekende afstand in. Voeg vervolgens een schaalbalk toe aan de stapel met Hulpmiddelen voor het analyseren van > > Schaalbalk.
    OPMERKING: De precieze schaal van een microscoop moet worden gekalibreerd met behulp van een fasemicrometer. De gebruikte microscoop, objectieflens en camera kunnen echter een ruwe schatting van de schaal geven. De PCO sCMOS-camera die hier wordt gebruikt, heeft bijvoorbeeld een pixelgrootte van 6.5 x 6.5 μm2 en het 63x-objectief werd gebruikt voor beeldvorming, dus de pixelgrootte gedeeld door vergroting is 6.5/63 = 0.1032 μm per pixel. Voer 0,1032 in het veld voor de bekende afstand in voor het dialoogvenster Schaal instellen .
  6. Als u de voltooide afbeeldingsstapel wilt exporteren als een video die kan worden afgespeeld in QuickTime Player, Microsoft PowerPoint, enz., slaat u deze op als een .avi bestand.

Resultaten

Succesvolle introductie van reporterplasmiden in P. aeruginosa en S. aureus wordt aangegeven door groei op de juiste selectieve antibiotica en kan worden bevestigd door kolonie-PCR en/of sequencing. De gemodificeerde stammen moeten worden geverifieerd als fenotypische reporters door ze te onderwerpen aan omstandigheden waarvan bekend is dat het gen van belang wordt geïnduceerd, en de resulterende fluorescentie kan worden gemeten door middel van flowcytometrie, spectrofotometrie of epifluorescentiemicroscopie (Figuur 1).

Om de selectie van een of meer antibioticadoses te vergemakkelijken die voor volgende experimenten zullen worden gebruikt, moeten concentratieafhankelijke antibiotica-persistertesten worden uitgevoerd voor de P. aeruginosa of S. aureus stammen van belang. Concentratieafhankelijke testen resulteren doorgaans in een bifasische curve met een steile beginhelling bij lagere antibioticaconcentraties en een plateau of minder steile helling bij hogere concentraties. Voor sommige paren van antibioticasoorten kan het echter niet mogelijk zijn dat er een duidelijke bifasische curve ontstaat. De curve voor S. aureus delafloxacine-curve is bijvoorbeeld duidelijk bifasisch (Figuur 3A), maar de P . aeruginosa levofloxacine-curve is dat niet (Figuur 3B)15. In dit scenario zouden we een concentratie kiezen die ten minste 10x de MIC is (bijv. 5 μg/ml, wat ongeveer 15x de MIC is voor P. aeruginosa)15. Omdat 15x levofloxacine MIC echter slechts ~0,001% P. aeruginosa overlevenden oplevert, gebruiken we een behandeling met levofloxacine van 1 μg/ml als we persisters willen zien bij het afbeelden van cellen terwijl ze herstellen op antibioticavrije agarosepads (aanvullende video 6); Anders wordt het aantal gezichtsvelden dat nodig is om meerdere persisters in beeld te brengen onbetaalbaar.

Aan het begin van de beeldvorming moet het ideale preparaat van het monster en de agarosepad er vlak uitzien in het hele gezichtsveld, vrij van groot vuil, rimpels of luchtbellen, en met gelijkmatig verdeelde afzonderlijke cellen. Het verkrijgen van goed verdeelde afzonderlijke cellen kan optimalisatie van de monsterverdunning of resuspensie vereisen. Voor S. aureus hebben cellen de neiging om kleine clusters te vormen en moeten ze grondig worden gevortexeerd voordat ze naar het agarosekussen worden gezaaid (Figuur 4 en Figuur 5). Voor P. aeruginosa kunnen cellen aggregaten vormen die zijn ingekapseld in een kleverige extracellulaire matrix in suspensie; Het is noodzakelijk om deze monsters grondig te pipetteren en de aggregaten te verstoren voor het afbeelden van afzonderlijke cellen.

Na de conclusie van een beeldvormingsexperiment verschijnt een succesvolle time-lapse van beelden in focus, stabiel verlicht en met minimale drift in het x-y-vlak gedurende het experiment. Aanvullende video 7 vertegenwoordigt een optimale beeldacquisitie: dit is het fasekanaal van aanvullende video 4 vóór schaduw- of driftcorrectie. Verlies van scherpstelling kan optreden als condensatie (door overmatige bevochtiging of onvoldoende opwarming van het monster) ervoor zorgt dat zich waterdruppels vormen op het bovenste dekglaasje van 25 mm, waardoor het licht wordt vervormd en het brandpuntsvlak buiten het maximale zoekbereik van het autofocusalgoritme wordt geduwd (aanvullende video 8). Variatie in verlichting duidt meestal op onvoldoende onderdompelingsolie op het moment van beeldvorming. Als het podium te snel beweegt, kan de olie op het doel achterblijven en nog steeds een inhaalslag maken wanneer de beelden worden verkregen. Dit kan worden verzacht door de acquisitieknoppen aan te passen om de bewegingssnelheid te vertragen of door een pauze toe te voegen tussen de beweging naar de volgende positie en de beeldacquisitie. Grote monsterdrift ziet eruit als veel cellen die over het gezichtsveld schieten, terwijl sommige op hun plaats blijven (aanvullende video 9). Dit gebeurt meestal later in experimenten omdat het agarosekussen is uitgedroogd door onvoldoende vochtigheidsregeling. De voorbereiding van het agarosepad die in dit artikel wordt gepresenteerd, is ontworpen om de stabiliteit van het monster te vergemakkelijken, maar het correct opwarmen/bevochtigen van het monster en de omgeving is noodzakelijk voor een optimale beeldacquisitie.

figure-results-1
Figuur 1: Fluorescerende reporterstammen verlichten de expressie van een interessant gen. (A) S. aureus werd getransduceerd met een GFP-transcriptionele reporter voor een gen van belang volgens Protocol 1. De reporterstam werd gedurende 24 uur behandeld met antibiotica, gewassen met PBS en vervolgens gezaaid op een agarosepad gemaakt van CA-MHB plus propidiumjodide (1,6 μM) en chlooramfenicol (10 μg/ml voor het onderhoud van het reporterplasmide) voor beeldvorming tijdens herstel (aanvullende video 1). (B) P. aeruginosa werd getransformeerd met een plasmide met een mScarlet-gekoppelde translationele reporter voor een interessant eiwit26. De reporterstam werd gedurende 5 uur behandeld met antibiotica, gewassen met PBS en vervolgens gezaaid op een agarosepad gemaakt van BSM plus Tet (75 μg/ml; voor het onderhoud van het reporterplasmide) voor beeldvorming tijdens herstel (aanvullende video 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Vermeerderen en oogsten van bacteriofaag. (A) De zes platen tonen zes verschillende hoeveelheden verdunde faagvoorraad op de gazons van S. aureus RN4220. De rode contouren geven de drie platen aan die zouden worden geoogst, van de plaat met de meeste klaring (vetgedrukte rode omtrek; 1 x109 PFU/ml) tot de volgende twee verdunningen (1 x108 en 1 x 107 PFU/ml). De zwarte pijlen wijzen naar individuele plaquettes. (B) Om faag van de platen te oogsten, schraapt u de zachte agarlaag (links), brengt u de slurry over naar de volgende verdunningsplaat (midden) en, na het samenvoegen van de zachte agar van alle drie de platen, combineert u deze tot een conische buis voor centrifugatie (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve concentratieafhankelijke persistertesten. Concentratieafhankelijke persistentie van fluorchinolon werd beoordeeld in stationaire fase (A) S. aureus (tegen delafloxacine) en (B) P. aeruginosa (tegen levofloxacine). Latere experimenten gebruiken 5 μg/ml delafloxacine (rode cirkel) omdat het doden van S. aureus bij deze concentratie was gestagneerd. Een dosering van ten minste 1 μg/ml levofloxacine (rode cirkel) zou worden gebruikt voor latere experimenten met P. aeruginosa. Merk op dat de bacteriële doding niet plateaut voor P. aeruginosa, maar er is nog steeds een minder steile "tweede fase" van de bifasische curve die wijst op een aanhoudende subpopulatie. Paneel 3B is aangepast met toestemming van Hare et al.15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Beeldvorming van bacteriële fenotypes tijdens antibioticabehandeling. Stationaire fase (A) S. aureus en (B) P. aeruginosa cellen werden gezaaid op agarosepads met fluorchinolon-antibiotica en tijdens de behandeling gecontroleerd: 5 μg/ml delafloxacine voor S. aureus (aanvullende video 3) en 5 μg/ml levofloxacine voor P. aeruginosa (aanvullende video 4)15. Propidiumjodide (PI; 16 μM voor P. aeruginosa, 1,6 μM voor S. aureus) werd aan de pads toegevoegd om dode of stervende cellen te markeren. S. aureus-cellen blijven grotendeels intact en in leven in aanwezigheid van de FQ, terwijl de meeste P. aeruginosa-cellen drastische morfologische veranderingen ondergaan, waaronder de vorming van ronde sferoplasten, voordat ze lyseren en afsterven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Persisters volgen tijdens herstel. (A) S. aureus en (B) P. aeruginosa populaties werden gezaaid op agarosepads met verse media nadat ze waren behandeld met fluoroquinolonen (5 μg/ml delafloxacine voor S. aureus en 1 μg/ml levofloxacine voor P. aeruginosa) en gecontroleerd tijdens hun herstel na de behandeling (aanvullende video 5 en aanvullende video 6). De waargenomen perisisters zijn aangegeven met groene pijlen in de eerste twee frames in elk paneel, en ze bleven intact en levensvatbaar tijdens de antibioticabehandeling. Na een aanvankelijke vertragingsperiode begonnen de persisters zich te delen en gaven ze aanleiding tot nieuwe nakomelingen (aangegeven met groene cirkels). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Voorbereiding van microscoopmonsters. (A) Schema van de workflow voor de monstervoorbereiding met behulp van een verwisselbare dekglaasschaal ("kamer"). (B) Foto van de gedemonteerde kamer en de afzonderlijke componenten. (C) Foto van de volledig gemonteerde kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende video 1: S. aureus persister. Videobestand met de afbeeldingen in figuur 1A. Kortom, S. aureus met een GFP-transcriptiereporter voor een interessant gen werd gedurende 24 uur behandeld met een antibioticum, gewassen met PBS en vervolgens gezaaid op een agarosepad gemaakt met CA-MHB plus propidiumjodide (1,6 μM) en chlooramfenicol (10 μg/ml) voor beeldvorming tijdens herstel. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 2: P. aeruginosa persister. Videobestand met afbeeldingen in Figuur 1B. In het kort, P. aeruginosa met een mScarlet-gekoppelde translationele reporter voor een interessant eiwit werd gedurende 5 uur behandeld met een antibioticum, gewassen met PBS en vervolgens gezaaid op een agarosepad gemaakt met BSM plus Tet (75 μg/ml) voor beeldvorming tijdens herstel26. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 3: S. aureus tijdens een antibioticakuur. Een stationaire fasecultuur van S. aureus , gekweekt in rijke, chemisch gedefinieerde media, werd gezaaid tot agarosepads gemaakt van de celvrije geconditioneerde media van de cultuur met propidiumjodide (1,6 μM) en delafloxacine (5 μg/ml). Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 4: P. aeruginosa tijdens een antibioticakuur. Een stationaire fasecultuur van P. aeruginosa gekweekt in BSM werd gezaaid tot agarosepads gemaakt van celvrije geconditioneerde media van een cultuur van P. aeruginosa die parallel in BSM werd gekweekt; het agarosepad bevatte ook propidiumjodide (16 μM) en levofloxacine (5 μg/ml). Deze video is aangepast met toestemming van Hare et al.15. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 5: S. aureus tijdens het herstel na antibiotica. S. aureus werd gekweekt tot stationaire fase in rijke, chemisch gedefinieerde media. De culturen in de stationaire fase werden gedurende 24 uur behandeld met 5 μg/ml delafloxacine in reageerbuisjes, gewassen met PBS en vervolgens gezaaid op antibioticavrije CA-MHB-agarosepads met propidiumjodide (1,6 μM) voor beeldvorming. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 6: P. aeruginosa tijdens herstel na antibiotica. Een stationaire fasecultuur van P. aeruginosa , gekweekt in BSM, werd gedurende 7 uur behandeld met 1 μg/ml levofloxacine in reageerbuisjes, gewassen met PBS en vervolgens gezaaid op antibioticavrije BSM-agarosepads met propidiumjodide (16 μM) voor beeldvorming. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 7: Voorbeeld van optimale beeldacquisitie. Deze video is het fasekanaal van Supplementary Video 4 vóór de beeldverwerking als voorbeeld van een optimale time-lapse-acquisitie. Let op de minimale drift, stabiele verlichting en behoud van focus tijdens het experiment. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 8: Voorbeeld van suboptimale beeldacquisitie als gevolg van condensatie. Deze video toont een deel van een experiment waarbij de beeldacquisitie werd beïnvloed door slechte focus, waarschijnlijk als gevolg van condensatie op de kamer als gevolg van onjuiste verwarming van het monster en/of overmatige bevochtiging van de beeldvormingsomgeving. Het monster dat werd afgebeeld was met levofloxacine behandelde P. aeruginosa tijdens herstel na antibiotica op een BSM-agarosepad. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende video 9: Voorbeeld van suboptimale beeldacquisitie als gevolg van drift. Deze video toont een deel van een experiment waarbij de beeldacquisitie werd beïnvloed door monsterdrift, waarschijnlijk als gevolg van uitdroging en het krimpen/optillen van het agarosekussen van het dekglaasje. Het monster dat werd afgebeeld was P. aeruginosa op een agarosekussen met levofloxacine en propidiumjodide. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullend bestand 1: 25mm-3D-divider-for-35mmBioptechs.stl Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

We hebben ontdekt dat het succes van een time-lapse-microscopie-experiment afhangt van de kwaliteit van de agarosepads en hun stabiliteit tijdens de beeldvorming. De met kamers omsloten agarosepads van roestvrij staal zijn relatief eenvoudig te bereiden, wat resulteert in consistent vlakke monsters die gedurende tientallen uren stabiel kunnen worden afgebeeld. Dit maakt de beeldvorming van tienduizenden cellen in een enkel experiment mogelijk en vergroot de kans op het detecteren van zeldzame fenotypische varianten, zoals persistercellen, in een populatie.

Deze bereidingsmethode voor agarosepads biedt een eenvoudig implementeerbaar alternatief voor eerder gepubliceerde methoden. Ons protocol vereist niet de technische precisie van de fabricage van microfluïdische apparaten of de behendige manipulaties van agarose "sandwich" -methoden, waardoor het gemakkelijker wordt om consistente voorbereidingen te bereiken van run tot run 14,16,36. Bovendien is het systeem kosteneffectief. De roestvrijstalen kamer is steriliseerbaar en herbruikbaar (in tegenstelling tot plastic kamers voor eenmalig gebruik) en voor de opstelling is geen gespecialiseerde apparatuur nodig16,37. De kamer is eenvoudig aan te passen aan verschillende microscopiesystemen met behulp van in de handel verkrijgbare stage-inserts. Omdat bacteriën geïmmobiliseerd zijn op het raakvlak tussen agarose en afdekking, hebben we bovendien succes gehad met het volgen van zeer beweeglijke bacteriën zoals P. aeruginosa, terwijl we nog steeds rekening houden met morfologische veranderingen (Figuur 4, Aanvullende Video 4). Andere beeldvormingstechnieken met één cel, zoals de "moedermachine", beperken cellen tot kanalen die de waarneming van andere morfologische veranderingen dan filamentatie onmogelijk maken36.

Voor succes met dit protocol zijn er enkele cruciale stappen en parameters waarmee u rekening moet houden. Voor de voorbereiding van het verband is het belangrijk om de agarose grondig te verwarmen en te smelten, omdat eventuele resterende agarosekristallen lichtdiffractie veroorzaken en de beeldkwaliteit beïnvloeden. Evenzo moet men ervoor zorgen dat de agarose in de kamer wordt gepipeteerd zonder luchtbellen te introduceren. Om ervoor te zorgen dat de dikte van de agarosepads consistent blijft en om monsterdrift te beperken, is het belangrijk om de pad in evenwicht te laten zijn - meestal gedurende 15 minuten - in de bevochtigde, temperatuurgecontroleerde behuizing voordat de beeldvorming begint. Een andere factor die een slechte beeldkwaliteit kan veroorzaken, is de vochtigheidsregeling: een lage luchtvochtigheid leidt ertoe dat het agarosekussen uitdroogt en krimpt, terwijl een hoge luchtvochtigheid (of onjuiste opwarming van het monster in de kamer) ervoor kan zorgen dat de warme lucht op het monster condenseert en de beeldvorming vervormt. Een voorbeeld van suboptimale time-lapse-beeldvorming als gevolg van condensatie is te vinden in Aanvullende video 8.

Een beperking van de huidige opstelling is dat de kweekmedia niet kunnen worden uitgewisseld, waardoor individuele bacteriën voor, tijdens en na de antibioticabehandeling niet continu kunnen worden gevolgd. We verwachten dat het koppelen van het agarosekussen aan flowcellen of microfluïdische apparaten die uitwisseling van kweekmedia mogelijk maken, het mogelijk zou kunnen maken om populaties te volgen tijdens voedings- of omgevingsveranderingen. Een andere parameter van het huidige ontwerp die voor verbetering vatbaar is, is de beluchting van monsters. De O-ringafdichting en het schroefdopontwerp van de verwisselbare dekglaasschaal zorgen voor een betere beluchting van het monster in vergelijking met opstellingen waarbij het gebruik van kit op was- of vetbasis nodig is om de pads16 af te dichten. De beluchting in de afgesloten kamer kan echter nog steeds beperkt zijn en kan de groei van obligate aeroben niet ondersteunen, hoewel dit nog moet worden getest.

Het time-lapse beeldvormingsprotocol voor de voorbereiding van monsters dat we in dit artikel presenteren, maakt het mogelijk om duizenden bacteriën te volgen terwijl ze reageren op of herstellen van een antibioticabehandeling. Deze methode is ook zeer generaliseerbaar en heeft een verscheidenheid aan potentiële toepassingen die verder gaan dan de biologie van persisters. De opstelling van het agarosekussen en de deler maakt het bijvoorbeeld mogelijk om ruimtelijk gescheiden celmonsters te zaaien, maar maakt cel-celcommunicatie mogelijk via diffusie via het agarosekussen. We onderzoeken momenteel het potentieel van deze opstelling om te testen hoe de uitwisseling van uitgescheiden producten de celgroei in multispecies-gemeenschappen beïnvloedt. We verwachten dat dit protocol een lage toegangsdrempel tot time-lapse-microscopie zal bieden voor de nieuwe onderzoeker en onbeperkte variaties voor de doorgewinterde microbioloog om te verkennen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

We danken mevrouw Susan Staurovsky van het UConn Health Center for Cell Analysis and Modeling Microscopy Facility voor haar hulp bij microscopie-experimenten. We danken Dr. Mona Wu Orr en de Essentials of Staphylococcul Genetics and Metabolism Workshop voor hun protocollen en advies over klonen in respectievelijk P. aeruginosa en S. aureus. Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (NIH; DP2GM146456-01 en 1R01AI167886-01A1 naar W.W.K.M., 1F30DE032598-01A1 naar P.J.H., en 1F31DK136259-01A1 naar T.J.L.). De financiers hadden geen rol in het ontwerp van onze experimenten of de voorbereiding van dit manuscript.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BaSiCGitHubhttps://github.com/marrlab/BaSiC
Certified Molecular Biology AgaroseBiorad1613101
Fiji-ImageJNIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Interchangeable Coverglass DishBioptechs190310-3535 mm ICD voor het bereiden van agarose pads; wordt geleverd met 30 mm (#1.5) dekvlakken
Lumencor Spectra 7 LED light engineLumencorhttps://lumencor.com/products/spectra-light-engineSpectra 7 LED light engine
MetaMorphMolecular DevicesPremier versie 7.10.5
pco.edge 4.2 bi sCMOS cameraExcelitashttps://www.excelitas.com/product/pcoedge-42-bi-usb-scmos-camerasCMOS camera
PeCon live cell incubatiekamerpeConhttps://www.pecon.biz/
Thomas Scientific Ronde dekglas, #1.5 dikte, 25 mm, 100 packFisher ScientificNC127277025 mm (#1.5) dekvlakken
Zeiss Axiovert 200M microscoopZeisshttps://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/widefield-microscopes/axiovert-for-materials.htmlOmgekeerd microscoop met Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil Ph3 M27 objectief, Lumencor Spectra 7 LED light engine, en pco.edge 4.2 bi sCMOS camera (6.5 mm pixelgrootte)

Referenties

  1. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nat Rev Microbiol. 14, 320-330 (2016).
  2. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nat Rev Microbiol. 17 (7), 441-448 (2019).
  3. Conlon, B. P. Staphylococcus aureus chronic and relapsing infections: evidence of a role for persister cells. Bioessays. 36 (10), 991-996 (2014).
  4. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  5. Verstraete, L., Van den Bergh, B., Verstraeten, N., Michiels, J. Ecology and evolution of antibiotic persistence. Trends Microbiol. 30 (5), 466-479 (2021).
  6. Sett, A., Dubey, V., Bhowmik, S., Pathania, R. Decoding bacterial persistence: Mechanisms and strategies for effective eradication. ACS Infect Dis. 10 (8), 2525-2539 (2024).
  7. Mempin, R., et al. Release of extracellular ATP by bacteria during growth. BMC Microbiol. 13, 301(2013).
  8. Lewis, K. Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol. 5 (1), 48-56 (2006).
  9. Fauvart, M., De Groote, V. N., Michiels, J. Role of persister cells in chronic infections: clinical relevance and perspectives on anti-persister therapies. J Med Microbiol. 60 (pt 6), 699-709 (2011).
  10. Van den Bergh, B., Fauvart, M., Michiels, J. Formation, physiology, ecology, evolution and clinical importance of bacterial persisters. FEMS Microbiol Rev. 41, 219-251 (2017).
  11. Levin, B. R., Rozen, D. E. Non-inherited antibiotic resistance. Nat Rev Microbiol. 4 (7), 556-562 (2006).
  12. Davis, K. M., Isberg, R. R. Defining heterogeneity within bacterial populations via single cell approaches. Bioessays. 38 (8), 782-790 (2016).
  13. Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters. Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).
  14. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live cell imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using automated time-lapse microscopy. J Vis Exp. 53, e3145(2011).
  15. Hare, P. J., Gonzalez, J. R., Quelle, R. M., Wu, Y. I., Mok, W. W. K. Metabolic and transcriptional activities underlie stationary-phase Pseudomonas aeruginosa sensitivity to levofloxacin. Microbiol Spectr. 12 (1), e0356723(2024).
  16. Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
  17. Pang, Y. Y., et al. agr-Dependent interactions of Staphylococcus aureus USA300 with human polymorphonuclear neutrophils. J Innate Immun. 2 (6), 546-559 (2010).
  18. Bose, J. L., Fey, P. D., Bayles, K. W. Genetic tools to enhance the study of gene function and regulation in Staphylococcus aureus. Appl Environ Microbiol. 79 (7), 2218(2013).
  19. Schenk, S., Laddaga, R. A. Improved method for electroporation of Staphylococcus aureus. FEMS Microbiol Lett. 73, 133-138 (1992).
  20. Grosser, M. R., Richardson, A. R. Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  21. Krausz, K. L., Bose, J. L. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus: Broth-Based Method. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  22. Olson, M. E. Bacteriophage Transduction in Staphylococcus aureus. The Genetic Manipulation of Staphylococci. Methods Molecular Biology. , Humana Press. New York, NY. (2016).
  23. Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), e00537-e00612 (2013).
  24. Coe, K. A., et al. Multi-strain Tn-Seq reveals common daptomycin resistance determinants in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 15 (11), e1007862(2019).
  25. Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (4), 1648(1979).
  26. Shee, C., et al. Engineered proteins detect spontaneous DNA breakage in human and bacterial cells. eLife. 2, e01222(2013).
  27. Kowalska-Krochmal, B., Dudek-Wicher, R. The minimum inhibitory concentration of antibiotics: methods, interpretation, clinical relevance. Pathogens. 10 (2), 165(2021).
  28. Robinson, J. L., Jaslove, J. M., Murawski, A. M., Fazen, C. H., Brynildsen, M. P. An integrated network analysis reveals that nitric oxide reductase prevents metabolic cycling of nitric oxide by Pseudomonas aeruginosa. Metab Eng. 41, 67-81 (2017).
  29. Wolff, J. A., MacGregor, C. H., Eisenberg, R. C., Phibbs, P. V. Isolation and characterization of catabolite repression control mutants of Pseudomonas aeruginosa PAO. J Bacteriol. 173 (15), 4700-4706 (1991).
  30. Batchelder, J. I., Taylor, A. J., Mok, W. W. K. Metabolites augment oxidative stress to sensitize antibiotic-tolerant Staphylococcus aureus to fluoroquinolones. mBio. , e0271424(2024).
  31. Power, A. D., Mok, W. W. K. Agar and agarose used for Staphylococcus aureus biofilm cultivation impact fluoroquinolone tolerance. J Appl Microbiol. 135 (8), lxae191(2024).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Peng, T., et al. A BaSiC tool for background and shading correction of optical microscopy images. Nat Commun. 8, 14836(2017).
  34. Ducret, A., Quardokus, E., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nat Microbiol. 1 (7), 16077(2016).
  35. Paintdakhi, A., et al. Oufti: an integrated software package for high-accuracy, high-throughput quantitative microscopy analysis. Mol Microbiol. 99 (4), 767-777 (2016).
  36. Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
  37. Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Time lapsemicroscopieepifluorescentie imagingantibioticapersistentiesingle cell imagingbereiding van agarosepadsfluorescente reporterspropidiumjodide kleuringpersistercellen
Time-Lapse Epifluorescentiemicroscopie Beeldvorming van Pseudomonas aeruginosa en Staphylococcus aureus Heterogene fenotypes
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.