Beeldvorming en analyse voor het kwantificeren van maïs (Zea mays) abiotische stressfenotypes

Samenvatting

Er wordt een methode gepresenteerd voor goedkope beeldvorming van planten om fenotypes te meten, samen met best practices voor het vastleggen van afbeeldingen en een pijplijn voor beeldanalyse voor het kwantificeren van planteigenschappen. Deze methoden werden toegepast om de fenotypes van maïs (Zea mays) te meten onder hitte, droogte en gecombineerde abiotische stressomstandigheden.

Samenvatting

Het meten van kwantitatieve plantenfenotypes, of eigenschappen, is essentieel voor het begrijpen van de reacties van planten op omgevingsfactoren, waaronder biotische en abiotische stress. Traditionele methoden voor het meten van planten kunnen echter tijdrovend, onnauwkeurig en destructief zijn, vooral bij het beoordelen van eigenschappen zoals biomassa en hoogte op individuele basis. Analyse op basis van beelden biedt de mogelijkheid om arbeid te verminderen, de nauwkeurigheid en precisie te verbeteren en herhaalde metingen van dezelfde installatie op meerdere tijdstippen mogelijk te maken. Hoewel high-throughput fenotyperingsfaciliteiten een oplossing bieden, zijn ze vaak onbetaalbaar en wereldwijd beperkt beschikbaar. Er wordt een methode beschreven voor het vastleggen van plantbeelden met behulp van goedkope single-board computers en digitale camera's binnen een fotostudio-opstelling, vergezeld van een beeldanalysepijplijn op basis van het gratis en open-source pakket PlantCV. Deze methode biedt een snel en nauwkeurig protocol voor het vastleggen, labelen en overbrengen van afbeeldingen, samen met best practices voor het garanderen van beeldacquisitie van hoge kwaliteit. Door middel van beeldanalyse werden meer dan 10 fenotypes gekwantificeerd voor alle afbeeldingen in het experiment tegelijk, inclusief eigenschappen zoals plantgrootte, hoogte en kleur. Deze methoden werden gebruikt om de respons van de Zea mays (maïs) inteeltvariëteit B73 op hitte, droogte en gecombineerde hitte- en droogte-abiotische stressomstandigheden te karakteriseren.

Inleiding

Het meten van planteigenschappen, of fenotypes, is van cruciaal belang voor het beantwoorden van fundamentele en toegepaste vragen in de plantenwetenschap. Een onderzoeker die bijvoorbeeld de impact van een genetische mutatie op de plantgrootte wil begrijpen, moet de planthoogte en het bladoppervlak¹ kwantitatief meten. Een onderzoeker die een biotische stress (zoals bacteriële, virale of schimmelinfectie) of een abiotische stress (zoals droogte, hitte, kou of uitputting van voedingsstoffen) toepast, zal het effect van de stress op de kleur van de plant, of "groenheid", moeten onderzoeken om chlorose ^2,3 te meten.

Hoewel het meten van deze eigenschappen essentieel is voor de basisbiologie van planten en voor toegepaste plantenveredeling, kunnen metingen van deze eigenschappen met de hand tijdrovend, onnauwkeurig en onnauwkeurig zijn 4,5,6,7. Het meten van planten op hoogte omvat bijvoorbeeld het handmatig gebruiken van een liniaal voor elke plant, vaak in warme of vochtige omgevingsomstandigheden, en is onderhevig aan fouten vanuit het oogpunt van de persoon die meet, evenals welk punt wordt beschouwd als de "top" van de plant. Bovendien zijn metingen zoals biomassa en pigmentgehalte destructief, en dezelfde plant kan niet worden gemeten op verandering in de loop van de tijd of worden gebruikt voor meerdere bemonsteringen, omdat deze moet worden vernietigd tijdens het uitvoeren van deze metingen 4,5,6,7. De tijdrovende, foutgevoelige aard van deze metingen belemmert de vooruitgang bij het evalueren van planten op hun fenotypische en fysiologische stressreacties.

Het vastleggen van afbeeldingen van planten en het meten van kwantitatieve eigenschappen uit het beeld biedt oplossingen voor deze problemen 4,5,6,7. Beeldanalyse verbetert de nauwkeurigheid en precisie, terwijl de tijd die een onderzoeker heeft om de metingen uit te voeren, wordt verkort, en dezelfde plant kan meerdere keren worden afgebeeld of worden gebruikt voor andere bemonsteringen dankzij de niet-destructieve kwantificering^{van eigenschappen 4,5,6,7}. Bovendien kunnen afbeeldingen worden opgeslagen en opnieuw worden geanalyseerd lang nadat een experiment is voltooid en planten zijn weggegooid 4,5,6,7. Beeldanalyse kan individueel worden voltooid met beeldbewerkingstools met een lage doorvoer, zoals ImageJ (Fiji)⁸, of in een hogere doorvoer met behulp van computervisie en machine learning met platforms zoals PlantCV⁹. PlantCV is een gratis, open-source beeldanalyseplatform waarmee onderzoekers eerst een plant of ander object kunnen maskeren (of scheiden) van de achtergrond van een afbeelding en metingen kunnen doen van grootte, morfologie, kleur en meer van die plant of dat object⁹. Met behulp van een modulaire workflow bouwt een onderzoeker eerst een flexibele workflow (of pijplijn) van verschillende modules met een voorbeeldafbeelding en onderwerpt vervolgens de resterende afbeeldingen aan de high-throughput-workflow zonder interactie met elke afzonderlijke afbeelding⁹. Kwantitatieve kenmerken worden uitgevoerd en geanalyseerd op statistisch significante verschillen tussen groepen. Deep Learning-pijplijnen kunnen worden ontwikkeld voor efficiënte, geautomatiseerde beeldanalyse nadat er voldoende afbeeldingen zijn vastgelegd en gelabeld met de juiste eigenschapsmetingen of metagegevens¹⁰.

"High-throughput" fenotypering kan de snelheid verhogen en menselijke arbeid verminderen tijdens het verzamelen van gegevens en/of tijdens gegevensanalyse 4,5,6,7. High-throughput fenotyperingsfaciliteiten hebben de automatisering van het verzamelen van beelden mogelijk gemaakt in gecontroleerde omgevingen, waar fabrieken op transportbanden of via robots naar een beeldvormingsstation worden verplaatst en automatisch worden gelabeld met de naam (d.w.z. label met metadata) die bij de fabriek hoort 6,11,12,13,14 . Hoewel deze transportbanden of robotfaciliteiten het mogelijk maken om grote hoeveelheden afbeeldingen vast te leggen en te labelen zonder menselijke tussenkomst, zijn er maar weinig in de wereld en kunnen ze miljoenen dollars kosten om te bouwen, waardoor ze voor veel onderzoekers ontoegankelijk worden. Om deze concepten van geautomatiseerde beeldvorming tegen lagere kosten toe te passen, zijn Raspberry Pi (hier single-board computers, SBC genoemd) goedkope computers (minder dan $ 35 per stuk) die zijn gebruikt om afbeeldingen vast te leggen, te benoemen, op te slaan en over te dragen van planten die in gecontroleerde omgevingen zijn gekweekt. Deze opstellingen leggen beelden vast in geautomatiseerde, getimede intervallen met behulp van een array van maximaal 72 Raspberry Pi 12,15,16. Hoewel ze kosteneffectiever zijn dan transportbandsystemen die miljoenen dollars kunnen kosten, zijn eerder beschreven SBC-groeikamers het meest toepasbaar op een top-down weergave van het kweken van kleine planten en vereisen ze nog steeds tal van SBC¹⁵. In veldomgevingen leggen portalen, UAS (uncrewed aerial systems) zoals drones en satellieten allemaal beelden vast voor analyse van planteigenschappen^17,18. Zowel veldsystemen als faciliteiten met een gecontroleerde omgeving met hoge doorvoer kunnen onbetaalbaar zijn wat betreft hun initiële kosten, onderhoud en deskundige kennis die nodig zijn om de systemen te bouwen en te onderhouden, en om afbeeldingen te analyseren^17,18. Mobiele telefoons en digitale camera's die alleen worden gebruikt voor plantenfotografie brengen tijdrovende uitdagingen met zich mee op het gebied van beeldoverdracht en naamgeving met metadata, wat essentieel is voor downstream-beeldanalyse.

De hier beschreven methoden bieden een goedkope oplossing voor beeldvorming van planten voor de uitdagingen die door andere systemen niet worden aangepakt. Een fotografie-opstelling, waarbij planten individueel naar de studio worden getransporteerd, maakt het mogelijk om planten van alle groottes in potten efficiënt te meten. Met behulp van een SBC die is aangesloten op een digitale camera, zorgt deze methode eerst voor gestandaardiseerde vastlegging, labeling en overdracht van afbeeldingen. Het gebruik van een toetsenbord of een QR-/barcodescanner om afbeeldingen een naam te geven terwijl ze worden vastgelegd, omzeilt de tijdrovende en foutgevoelige activiteit van het hernoemen van afbeeldingen met metadata nadat ze zijn vastgelegd en opgeslagen. De samenstelling van het beeld en de aanbevolen camera-instellingen zijn belangrijk om downstream beeldanalyse mogelijk te maken, en richtlijnen worden hier beschreven. Ten slotte wordt een pijplijn voor beeldanalyse in PlantCV geleverd om kwantitatieve eigenschappen uit de vastgelegde afbeeldingen te extraheren, zoals bladoppervlak, planthoogte, breedte en kleur.

In vergelijking met transportbandsystemen is deze methode goedkoop en vereist een enkele SBC. De hier beschreven fenotyperingsopstelling is geconstrueerd om de beperkingen en kosten van een transportband of robotsystemen weg te nemen - elke plant van grootte kan worden gemeten omdat de opstelling kan worden gescheiden van de groeiruimte, er is slechts een enkele SBC nodig en het werkt met tal van cameratypes voor maximale flexibiliteit en betaalbaarheid. Vergelijkbare benaderingen als die hier worden gepresenteerd, zijn de PhenoBox of PhenoRig^12,19. In vergelijking met handmatige metingen bespaart deze methode tijd, vermindert het fouten en vernietigt het de planten niet 4,12,15,19.

Protocol

De details over de reagentia en de apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de fotostudio

1. Hang zwarte stof van fotografiekwaliteit aan een muur of plafond voor zijaanzicht. Drapeer de stof minimaal 0,5 m op de vloer zodat de plant op de stof komt te staan (Figuur 1).
   OPMERKING: De stof moet minimaal 100 cm hoger en breder zijn dan de plant die moet worden afgebeeld.
2. Plaats een kleurenkaart op de achtergrond, gestut tegen een object zoals een doos, zodat het zichtbaar is in het kader (Figuur 1). Gebruik voor planten groter dan 30 cm hoog of breed een kleurenkaart van minimaal 20 cm breed. Gebruik voor planten kleiner dan 30 cm hoog of breed een kleurenkaart die tussen de 4-8 cm breed is.
3. Sluit een SD-kaart aan op een laptop of desktopcomputer. Download Raspberry Pi Imager uit het softwaregedeelte op de website (https://www.raspberrypi.com/software/) en download het meegeleverde raspberrypi-image-capture.img.gz-bestand (https://github.com/danforthcenter/photo-maize-paper) naar de laptop of desktopcomputer.
4. Start de Imager door het gedownloade imager-bestand (.exe) te openen. Klik op de knop Besturingssysteem kiezen en selecteer onderaan de knop Aangepast gebruiken . Selecteer het image-capture.img.gz bestand.
   1. Klik vervolgens op de knop Opslag kiezen en selecteer de SD-kaart die op de computer is aangesloten. Klik op de knop Schrijven .
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de juiste SD-kaart is geselecteerd, aangezien bij dit proces alle gegevens die op de kaart zijn opgeslagen, worden verwijderd.
5. Sluit de nieuwste versie van SBC aan op een toetsenbord met behulp van een USB-kabel, op een externe monitor met behulp van een HDMI-kabel en op een stekkerdoos met behulp van een netsnoer met een schakelaar. Sluit de monitor aan op de stekkerdoos met behulp van het netsnoer dat bij de monitor is geleverd. Plaats de SD-kaart in de SBC. Zie afbeelding 1 voor een gelabeld schema van de opstelling.
6. Zet de stekkerdoos aan door op de schakelaar op de strip te drukken, zet de monitor aan met de knop op de monitor en zet vervolgens de SBC aan door de schakelaar op het netsnoer op "aan" te zetten.
7. Verbind de SBC met het lokale internet via WIFI of een ethernetkabel.
8. Als foto's rechtstreeks naar een server of cloudopslag moeten worden overgebracht:
   1. Bewerk het bestand "CAPTURE-PHOTO.py" op de SBC om het bestandspad te bevatten om de overdracht te voltooien.
   2. Bewerk het win-credentials-bestand met het pad en het wachtwoord voor de server of cloudopslag met behulp van de volgende opdracht in de terminal: sudo nano /etc/win-credentials.
      OPMERKING: Neem contact op met de internetsysteembeheerder om er zeker van te zijn dat de map toestemming heeft om bestanden over te dragen.
9. Sluit een draadloze barcodescanner aan op de SBC met behulp van de instructies van de fabrikant die bij de barcodescanner zijn geleverd, via een USB of Bluetooth.
10. Schakel de SBC uit door op de Raspberry Pi-knop linksboven in het scherm te klikken, op Uitloggen te klikken en vervolgens op Afsluiten te klikken om de SBC veilig uit te schakelen. Zet na het uitschakelen de SBC-aan/uit-schakelaar "aan", het netsnoer op "uit" en de stekkerdoos op "uit".

2. Plantengroei en stressbehandeling

LET OP: Elke plant is geschikt voor deze methode van fenotypering; Deze plantengroeimethoden zijn van toepassing op de hier gepresenteerde representatieve resultaten.

1. Verkrijg zaden van B73 of een andere maïsvariëteit bij een voorraadcentrum.
2. Bereid bodemmedia en groeiomstandigheden voor:
   1. Vul 3,5-inch potten (0,7 L) met een 1:1 volumemix van Turface MVP en Berger BM7-35 met 3 lb/kubieke meter meststof met langzame afgifte 14-14-14 (NPK). Plaats de potten in een bak met gaten en geef grondig water met water met omgekeerde osmose (RO).
   2. Stel een groeikamer in op de volgende omgevingsomstandigheden: 30 °C dag/20 °C nacht, 16 uur daglengte, 60% luchtvochtigheid en 500 ^{mmol.m-2 s-1} licht op het niveau van de pot gedurende de dag. Stel een aparte groeikamer in met dezelfde omstandigheden, behalve 38 °C dag/28 °C nacht voor hittestress.
3. Plant 20 maïszaden, elk in een pot van 3.5 inch, door ~ 2 cm diep in de grond te plaatsen en deze te bedekken met de verplaatste grond. Geef grondig water met RO-water en plaats het in de controlegroeikamer. Geef dagelijks water met vloeibare meststof (gemengd volgens de instructies van de fabrikant; zie materiaaltabel).
   OPMERKING: Het planten van extra planten die nodig zijn voor het experiment zal verantwoordelijk zijn voor een slechte kieming en gebrek aan uniformiteit voorafgaand aan de start van een stresstoepassing. De kiemkracht verschilt per soort.
4. Verplant na 21 dagen groei 16 van de meest uniforme planten (n = 4 planten per behandeling) naar potten van 3,79 L gevuld met dezelfde potgrondmix, voorbevochtigd met RO-water. Zet de planten terug in de controlegroeikamer.
5. Verplaats op dag 25 (4 dagen na het verplanten) de helft van de planten (n = 8) naar de hittestresskamer op het moment dat de lichten in de kamer aangaan. Stop met het water geven van de planten met droogte in beide kamers (n = 4 per kamer).
   OPMERKING: Droogtestressplanten moeten mogelijk worden bewaterd, zodat de planten overleven tot het einde van het experiment; Hier werden droogteplanten op dag 31 en dag 37 bewaterd met kunstmestwater.
6. Op dag 38 (13 dagen na het begin van de stress) verwijder je de planten uit de groeikamers voor beeldvorming.

3. Beeldvorming van planten

1. Start de SBC op (zie figuur 2):
   1. Zet de stekkerdoos aan met de schakelaar op de stekkerdoos.
   2. Zet de monitor aan met de knop op de monitor.
      OPMERKING: Als de SBC is ingeschakeld voordat de monitor is ingeschakeld, zal deze niet correct starten.
   3. Zet de schakelaar op het SBC-netsnoer op "aan".
      OPMERKING: Hiermee wordt de SBC ingeschakeld en wordt deze opgestart op de monitor; er is geen "aan"-schakelaar op de SBC zelf, alleen op het netsnoer.
2. Plaats de camera op een statief of stabiele tafel.
   OPMERKING: De hele plant en kleurenkaart moeten in beeld zijn op het camerascherm. De camera moet loodrecht op de grond staan en direct zicht (geen hoek) hebben op het midden van de plant. De camera moet compatibel zijn met het gphoto2-pakket en een lijst is hier te vinden: http://www.gphoto.org/proj/libgphoto2/support.php.
3. Voorzie de camera van stroom via een netsnoer met de camera of batterijen. Zet de camera aan met de knop op de camera.
4. Sluit de camera aan op de USB-poort van de SBC met behulp van de gegevensoverdrachtkabel die bij de camera is geleverd.
5. Schik de plant in fotografie-opstelling:
   1. Plaats een stuk donkergekleurde tape op de stof van fotografiekwaliteit waar de pot zal worden geplaatst om ervoor te zorgen dat de plaatsing voor elke plant hetzelfde is. Zorg ervoor dat de kleurenkaart in lijn is met het stuk tape.
      LET OP: Plaats de kleurenkaart minimaal 10 cm van de rand van de plant. Tijdens de kwaliteitscontrole in de PlantCV-workflow (hieronder) moet de afbeelding kunnen worden bijgesneden om alleen de plant en de pot te bevatten, maar niet de kleurenkaart om ervoor te zorgen dat de kleurchips niet worden opgenomen in de uiteindelijke eigenschapsextractie. Zie Figuur 2 voor voorbeelden van afbeeldingen van hoge en lage kwaliteit.
   2. Plaats de pot op het stuk tape. Voor planten die in een vlak groeien, zoals maïs (Zea mays) en sorghum (Sorghum bicolor), richt je de breedste hoek van de plant naar de camera. Voor planten die niet in een vlak groeien, legt u de hoeken van 0 en 90 graden van de plant vast en neemt u het gemiddelde van de resulterende kwantitatieve metingen nadat de beeldanalyse is voltooid.
6. Open op het SBC-bureaubladscherm dat op de monitor wordt weergegeven de terminal door op de terminalknop in de menubalk linksboven te klikken.
7. Als u de opslag rechtstreeks op een server of cloudopslag opslaat, koppelt u de opslag aan met behulp van de volgende opdracht door te bewerken naar het benodigde cloudopslagpad (cloudopslagpad in het onderstaande voorbeeld) en wachtwoord, de coderegel in het geopende terminalvenster te typen en op enter op het toetsenbord te drukken. Indien ongewijzigd ten opzichte van de fabrieksinstellingen, is de gebruikers-ID (UID) "pi".
   NOTITIE:
   sudo mount -t cifs -o credentials=/etc/win-credentials,uid=pi //cloud-storage-path /mnt/cloud-storage
8. Typ de volgende code in de terminal en druk op enter op het toetsenbord. Er verschijnt een nieuw venster.
   ./RUN-PHOTOSTUDIO-SHELL.sh
   OPMERKING: Het RUN-PHOTOSTUDIO-SHELL.sh-bestand roept het CAPTURE-PHOTO.py-bestand aan, dat vooraf op de pi is geladen als het met de bovenstaande methode is geladen. Als alternatief zijn deze scripts op GitHub geleverd om op een bestaande Raspberry Pi SD-kaart te plaatsen.
9. Er wordt een grafisch venster met de gebruikersinterface geopend. Typ de naam van de afbeelding in of scan de barcode of QR-code van de plant met een barcodescanner.
10. Selecteer een optie om de afbeelding lokaal of op een gekoppelde server/cloudopslag op te slaan.
11. Klik hier om een foto te maken! knoop.
12. Als er voor lokale opslag is gekozen, opent u de map FOTO'S op het bureaublad om de afbeelding te bekijken. Als er een server of cloudopslag is gekozen, opent u de afbeelding op die locatie.
13. Pas indien nodig de instellingen op de camera aan door deze los te koppelen van de SBC, aan te passen volgens de instructies van de fabrikant en weer aan te sluiten op de SBC.
    OPMERKING: Instellingen zoals belichting, helderheid, contrast, enz. moeten mogelijk worden aangepast, afhankelijk van de verlichting in de kamer en het object dat wordt afgebeeld. Een veelgemaakte fout is om de afbeeldingen te overbelichten. Om de belichting van een testbeeld te controleren, gaat u verder met het testbeeld via de PlantCV-beeldanalyseworkflow, die een kwaliteitscontrole voor belichting omvat. Pas de camera-instellingen zo nodig aan om de belichting te verminderen of te vergroten totdat de histogrammen op de juiste manier zijn verdeeld.
14. Nadat alle afbeeldingen zijn vastgelegd, brengt u de afbeeldingen over van de SBC naar een lokale computer of cloudopslag met behulp van de voorkeursmethode, zoals USB-opslag, internetbrowser of SSH-overdracht.

4. Extractie van eigenschappen uit afbeeldingen

1. Download de volgende bestanden naar een lokale computer of server: "photo-studio-SV-notebook.ipynb", "workflow.py" en "photo-studio-SV-config.json". Alle bestanden zijn beschikbaar op GitHub (https://github.com/danforthcenter/photo-maize-paper).
2. Installeer PlantCV op de lokale computer of server met behulp van de beschreven stappen (https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/installation/).
3. Open het bestand photo-studio-SV-notebook.ipynb met behulp van de voorkeurscode-editor, zoals JupyterLab of Visual Studio Code.
4. Voer elk codeblok uit en bewerk indien nodig gezien de parameters die in het codeblok worden beschreven om een schoon masker te krijgen van alleen de plant in de afbeelding.
5. Als u tevreden bent met de analyse van de voorbeeldafbeelding, opent u het bestand workflow.py in de gewenste code-editor. Bewerk dit bestand met eventuele parameters die zijn gewijzigd in "photo-studio-SV-notebook.ipynb" en sla het op.
6. Open het bestand photo-studio-SV-config.json en bewerk de bestandspaden om naar een map met invoerafbeeldingen, een gewenste uitvoermap, enz. te leiden, zoals aangegeven in het bestand.
7. Open een terminal en voer de volgende code uit om PlantCV te activeren. Typ hiervoor de code conda activeer plantcv in de terminal en druk op enter op het toetsenbord.
8. Wijzig de volgende regel code in het bestandspad van het bestand "photo-studio-SV-config.json" (dit is de enige wijziging die u in de onderstaande code moet aanbrengen).
   1. Typ in de terminal de bewerkte code en druk op enter op het toetsenbord. Hiermee wordt de werkstroom uitgevoerd op alle afbeeldingen die in het experiment zijn vastgelegd.
      NOTITIE:
      plantcv-run-workflow --config /Users/USERNAME/photo-studio-SV-config.json
9. Inspecteer de uitvoerafbeeldingen om te bepalen of de code geschikt was voor alle afbeeldingen.
   OPMERKING: De blauwe en roze omtrek van de plant moeten rond de randen van de plant liggen en er mogen geen andere objecten in de afbeelding staan. Ga indien nodig terug naar de "photo-studio-SV-analysis.ipynb" en test problematische afbeeldingen en bewerk de code, met name de maskeringsstappen en ruisonderdrukking, om de gewenste resultaten te verkrijgen. Zie Afbeelding 3 voor voorbeelden van afbeeldingssegmentatie met een hoge, acceptabele en lage kwaliteit.
10. Het uitvoerbestand heeft de vorm van een .json bestand. Ga terug naar de terminal (zorg ervoor dat conda activate plantcv al is uitgevoerd), typ de volgende code en druk op enter op het toetsenbord om het bestand naar .csv te converteren voor downstream statistische analyse, waarbij het bestandspad wordt gewijzigd in dat van het "results-photo-studio.json"-bestand.
    plantcv-utils json2csv -j /Gebruikers/GEBRUIKERSNAAM/results-photo-studio.json -c /Gebruikers/GEBRUIKERSNAAM/results-photo-studio.csv
    OPMERKING: Om de metingen te converteren van pixels naar een standaardmaateenheid, zoals cm, gebruikt u de conversie die wordt geleverd door de functie find_color_card in de PlantCV-workflow.
11. Voer statistische analyse uit van de kwantitatieve eigenschappen van de output om verschillen in plantfenotypes te bepalen als gevolg van verschillende plantensoorten, variëteiten, behandelingen en tijdstippen.
    OPMERKING: Het pcvr-pakket in R Studio is geformuleerd om de output van PlantCV te analyseren op statistische significantie en het uitzetten van resultaten²⁰. Bekijk een samenvatting en visuele weergave van eigenschappen verzameld in Figuur 4.

Resultaten

Om deze methode te ontwikkelen, werden B73-maïsplanten geëvalueerd op kwantitatieve fenotypes onder gecontroleerde temperaturen, hittetemperaturen, goed bewaterde en droogte, evenals hun combinaties, voor in totaal vier behandelingen. B73 is een bekend ingeteeld maïsras met een schat aan genetische gegevens²¹.

Beeldanalyse in PlantCV heeft de afbeeldingen met succes in kleur gecorrigeerd, de kwantitatieve resultaten gelabeld met de metagegevens van de plant en de plant gesegmenteerd (met andere woorden, gescheiden) van de achtergrond, zoals wordt gedemonstreerd in Figuur 3. Een mislukte analyse zou uitvoerbeelden opleveren die niet de blauwe omtrek of roze vorm rond de buitenkant van de plant laten zien, maar eerder extra ruis of ontbrekende stukjes van de plant bevatten (Figuur 3, voorbeeld van lage kwaliteit). Een tweekanaalsdrempel was nodig om zoveel mogelijk van de plant in het masker op te nemen (zie alternatieve enkelkanaalsstrategieën in de "photo-studio-SV-notebook.ipynb"). Sommige planten, vooral die met paars gekleurde stengels, hadden echter geen perfecte segmentatie, maar waren voldoende voor stroomafwaartse analyse (Figuur 3).

De PlantCV-analyse leverde 16 kwantitatieve eigenschappen met één waarde op, samengevat in figuur 4. Een eigenschap met één waarde levert één waarde per plant op, bijvoorbeeld het bladoppervlak, de hoogte, de breedte en het gemiddelde van de tintcirkel. Het bladoppervlak werd overwogen met behulp van de functie "analyze.shape" (Figuur 4) en rekening gehouden met de hele plant. Hoogte en breedte werden echter overwogen met behulp van de "analyze.bound_horizontal-functie", met een binding getekend op de grondlijn van de plant. Dit komt omdat planten die over de zijkant van de pot hangen, een grotere hoogte zullen hebben, gezien de plant als een geheel object, en in plaats daarvan alleen mogen meten vanaf de basis van de plant waar deze de grond raakt. Naast de eigenschappen met één waarde, voert PlantCV eigenschappen met meerdere waarden uit, dit zijn histogrammen, met name van de kleurwaarden, die elke pixel van de plant vertegenwoordigen. Het gemiddelde van de kleurtooncirkel is een eigenschap met één waarde die de gemiddelde tintwaarde voor de hele plant is.

Om te bepalen welke eigenschappen het meest interessant zijn, werd de variantie berekend die werd verklaard door de behandeling voor elke eigenschap, evenals de correlatie tussen de verschillende eigenschappen met behulp van de "frem"-functie in het pcvr R Studio-pakket²⁰ (Figuur 5A). Bladoppervlak, hoogte, breedte en kleurcirkelvormig gemiddelde werden geselecteerd voor stroomafwaartse analyse omdat ze meer dan 50% van de variantie als gevolg van behandeling verklaarden en relevante metingen zijn voor plantengroei (oppervlakte, hoogte en breedte) en gezondheid (tint). Representatieve afbeeldingen van de plant met het grootste en kleinste bladoppervlak tonen de variatie in fenotypes die in dit experiment zijn verzameld (respectievelijk Figuur 5B,C). De plant met het grootste bladoppervlak had ook de hoogste gemiddelde tint en was een B73, goed bewaterde, door hitte gestreste plant (Figuur 5B). Het kleinste bladoppervlak had de kleinste gemiddelde tint (Figuur 5C) en was een B73, door droogte gestreste, door hitte gestreste plant.

Waterbehandeling had een significant effect bij het bepalen van het bladoppervlak (F(1,13) = 226,5, p = 1,32 x ^10-9), hoogte (F(1,13) = 21,1, p = 0,0005), breedte (F(1,13) = 75,5, p = 8,92 x ^10-7) en het cirkelvormige gemiddelde van de tint (F(1,13) = 27,8, p = 0,0002), bepaald met behulp van een lineair regressiemodel voor het behandelingseffect en een tweerichtings-ANOVA in R Studio (volledige resultaten in tabel 1). Temperatuurbehandeling had een significant effect op de hoogte (F(1,13) = 5,94, p = 0,03), maar niet op het bladoppervlak, de breedte of het cirkelvormige gemiddelde van de tint (p > 0,05, tabel 1). De interactie tussen temperatuur en watertoestand was geen significante factor in een van de gemeten eigenschappen (p > 0,05, tabel 1).

Vervolgens werden individuele behandelingen vergeleken met de controle en met elkaar door middel van lineaire regressie en post-hoc test (geschatte marginale gemiddelden) met een Sidak-correctie voor meerdere vergelijkingen (Figuur 6). Het bladoppervlak, de planthoogte, de plantbreedte en het gemiddelde tintcirkel waren significant verminderd bij planten met droogtestress in vergelijking met goed bewaterd onder beide temperatuuromstandigheden (p < 0,05, figuur 6). Hittestress terwijl goed bewaterd, verminderde alleen de planthoogte (p < 0,05, Figuur 6), maar verminderde het bladoppervlak, de plantbreedte of het gemiddelde van de tintcirkel niet significant. Dit verschil in tint kan verder worden onderzocht door de kleureigenschap met meerdere waarden te beoordelen, uitgezet als een histogram in figuur 7, in plaats van alleen een gemiddelde. De vermindering van de gemiddelde tint als gevolg van droogte was het gevolg van een verschuiving van groene naar gele pixels, bekend als chlorose (Figuur 7). Hoewel warmte geen significant verschil in gemiddelde tint vertoonde, vertoonde het wel een vermindering en toename als gevolg van zowel vergeling (chlorose) als verdonkering van de groene kleur (Figuur 7).

Na beeldvorming werden de planten gesneden bij de wortel-scheutovergang en werd het gewicht van het bovengrondse weefsel geregistreerd. De wortels werden voorzichtig gewassen en gedroogd met een handdoek en vervolgens gewogen om de totale plantaardige biomassa (ook bekend als gewicht) te berekenen ter vergelijking met de beschreven fenotyperingsmethode op basis van afbeeldingen. Bladoppervlak gemeten via beeldanalyse sterk gecorreleerd met plantaardige biomassa (R² = 0,84, Figuur 8).

Figuur 1: Afbeelding van de fotostudio-opstelling met gelabelde componenten voor het verzamelen van plantafbeeldingen. (A) stof van fotografiekwaliteit, (B) kleurenkaart, (C) lijn tape voor het gelijkmatig plaatsen van potten, (D) digitale camera, (E) single-board computer, (F) monitor die het beeldopnameproces weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van de beeldvormingsworkflow. Er wordt een representatieve afbeelding van "hoge kwaliteit" en "lage kwaliteit" verstrekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Overzicht van de workflow voor beeldanalyse in PlantCV. Representatieve afbeeldingen van segmentatie van "hoge", "acceptabele" en "lage" kwaliteit worden gepresenteerd; PlantCV-eigenschappen worden weergegeven met behulp van een roze omtrek van de vorm van de hele plant en een blauwe omtrek van het plantgebied. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Samenvattende en visuele weergave van de vormkenmerken die uit de analyse zijn vastgelegd. Vormfunctie in PlantCV. Paarse vakken vertegenwoordigen eigenschappen die geen gebruik maken van een andere eigenschap in hun berekening. Oranje vakken vertegenwoordigen eigenschappen die andere eigenschappen gebruiken in hun berekening; Pijlen geven aan welke eigenschappen in deze berekeningen worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Fenotypering op basis van afbeeldingen legt fenotypische variantie en gecorreleerde eigenschappen vast. (A) Variantie van eigenschappen verklaard door behandeling (rechts) en correlatie van eigenschappen met elkaar (links). Elke eigenschap is gelabeld, gevolgd door de meeteenheid; "NA" betekent dat het een eenheidsloze meting is. (B) Afbeelding van de plant met het hoogste bladoppervlak en het hoogste kleurcirkelgemiddelde (graden). (C) Afbeelding van de plant met het kleinste bladoppervlak en het laagste tintcirkelvormige gemiddelde (graden). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Boxplot vergelijking van behandelingseffecten op plantenfenotypes. Bladoppervlak (A), hoogte (B), breedte (C) en tintcirkelvormig gemiddelde (D) worden vergeleken voor het effect van droogte, hitte en de gecombineerde spanningen. n = 4. Letters vertegenwoordigen statistisch significante verschillen tussen behandelingen (p < 0,05); behandelingen werden vergeleken met behulp van lineaire regressie en post-hoctest (geschat marginaal gemiddelde) met een Sidak-correctie voor meerdere vergelijkingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Histogrammen van kleur (tint) opgeteld van alle pixels van elke behandelingscombinatie, genormaliseerd door het totale aantal pixels in de behandelingscombinatie. Histogrammen worden gekleurd op basis van de kleurwaarde voor de kleurtoongraad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Correlatie van het bladoppervlak gemeten aan de hand van afbeeldingen met de biomassa van de hele plant. Elke zwarte punt vertegenwoordigt één plant. De roze lijn geeft de lineaire correlatie weer tussen bladoppervlak (X) en biomassa (Y). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Trek	Factor	vrijheidsgraden	F-waarde	p-waarde
Bladoppervlak (cm^2)	Temperatuur	1	0.5372	0.4766
Bladoppervlak (cm^2)	Water	1	226.5318	1.32E-09
Bladoppervlak (cm^2)	Temperatuur: Water	1	2.1526	0.1661
Bladoppervlak (cm^2)	Reststoffen	13
Hoogte (cm)	Temperatuur	1	5.9426	0.0298935
Hoogte (cm)	Water	1	21.107	0.0005029
Hoogte (cm)	Temperatuur: Water	1	2.1752	0.1640545
Hoogte (cm)	Reststoffen	13
breedte (cm)	Temperatuur	1	2.2495	0.1575
breedte (cm)	Water	1	75.5474	8.92E-07
breedte (cm)	Temperatuur: Water	1	0.0839	0.7766
breedte (cm)	Reststoffen	13
Tint cirkelvormig gemiddelde (graden)	Temperatuur	1	0.9154	0.3561432
Tint cirkelvormig gemiddelde (graden)	Water	1	27.7988	0.0001509
Tint cirkelvormig gemiddelde (graden)	Temperatuur: Water	1	3.4792	0.0848724
Tint cirkelvormig gemiddelde (graden)	Reststoffen	13

Tabel 1: Resultaten van het lineaire regressiemodel en de tweerichtingsanalyses van ANOVA, waarbij de effecten van waterbehandeling, temperatuurbehandeling en hun interactie op planteigenschappen worden onderzocht.

Discussie

Beeldgebaseerde fenotypering biedt nauwkeurige, snelle, kwantitatieve metingen van plantenfenotypes 4,5,6,7. Deze methode is aanzienlijk sneller, preciezer, nauwkeuriger en biedt een groter aantal metingen dan handmatig gebruik van een liniaal om de planthoogte vast te leggen, of kwalitatieve metingen van plantkleurkenmerken die betrekking kunnen hebben op gezondheid 4,5,6,7. Het bladoppervlak correleert hier, en in eerder onderzoek¹⁰, sterk met de biomassa van planten (Figuur 8), wat suggereert dat deze maat het tijdrovende, destructieve en foutgevoelige proces van het handmatig wegen van de biomassa van de hele plant op betrouwbare wijze zou kunnen vervangen. Hoewel alleen een camera kon worden gebruikt voor het vastleggen van de beelden, verhoogde de toevoeging van de goedkope SBC de doorvoer door automatisering van het verzamelen van afbeeldingen en het labelen van afbeeldingen met de nodige metadata¹⁵. Deze methode is geschikt voor één tot ~300 planten die eenmaal daags (of minder vaak) in beeld worden gebracht. Voor grotere aantallen planten in een experiment is een op transportbanden gebaseerd, bovengronds portaal of robot-enabled beeldvormingssysteem geschikter, aangezien de tijd om de planten afzonderlijk te verplaatsen voor beeldvorming langer kan zijn dan een werkdag^11,13. Voor frequentere tijdstippen (bijvoorbeeld elk uur een beeld in plaats van één keer per dag of minder vaak), zijn camera-opstellingen in een groeikamer geschikter omdat ze automatisch beelden vastleggen, maar worden beperkt door de grootte van de planten en extra SBC¹⁵ nodig hebben.

Hoewel PlantCV hier wordt gepresenteerd als de optie voor beeldanalyse, bestaat er andere software. ImageJ (Fiji) is een gratis softwarepakket voor beeldanalyse dat ook kan worden gebruikt voor afbeeldingen van planten via een grafische gebruikersinterface (GUI)⁸; het is echter niet speciaal ontwikkeld voor beeldanalyse van de hele fabriek, is minder aanpasbaar aan high-throughput computing en is minder gemakkelijk te herhalen dan reeds werkende pijplijnen zoals die in PlantCV die gemakkelijk kunnen worden toegepast op nieuwe afbeeldingen⁹. Deep Learning (zoals BioDock, zie Tabel met materialen) en Segment Anything²²) methoden zijn aantrekkelijk vanwege hun vermogen om gemakkelijk planten van de achtergrond te segmenteren, en kunnen worden gebruikt voor de segmentatietaken die hier worden beschreven. Deze Deep Learning-modellen bieden echter niet de hier beschreven fenotypemetingen van planten¹⁰, en om deze complexere metingen van kwantitatieve fenotypes te maken, kan een grote hoeveelheid trainingsbeelden nodig zijn (vaak meer dan 10.000) en rekenkracht die verder gaat dan een eenvoudige laptop of desktopcomputer¹⁰. Deze modellen vereisen ook een aanzienlijk computergeheugen en verwerkingskracht, die voor veel onderzoekers niet beschikbaar zijn¹⁰.

De meest kritische stap van het protocol is het regelen van de beeldvormingsopstelling van de plant en ervoor zorgen dat er geen objecten (zoals andere planten, een kleurenkaart of plantenresten) in de buurt van de plant van interesse zijn¹⁴. Als afbeeldingen niet op de juiste manier zijn ingesteld of als er geen kleurenkaart wordt gebruikt, kunnen ze later niet worden geanalyseerd omdat er geen mechanisme voor standaardisatie is. Hoewel er in dit protocol geen kalibratiestappen nodig zijn, zijn kleurcorrectie en standaardisatie van de grootte tijdens de verwerking essentieel. Zorg er altijd voor dat de hele kleurenkaart in beeld is, maar niet overlapt met de plant (Figuur 2). Een andere veel voorkomende valkuil is ongelijkmatige belichting, wat schaduwen of heldere opnamen kan veroorzaken; we raden aan om helder, diffuus plafondlicht te gebruiken en ramen in de kamer af te dekken om ongelijkmatige verlichting te voorkomen (Figuur 2). Extra lampen kunnen in een hoek naar voren ten opzichte van de plant worden toegevoegd als bovenlichten schaduwen veroorzaken. Het type gloeilamp is geen probleem, aangezien de kleur in de afbeelding wordt gecorrigeerd met behulp van een kleurenkaart. Wazige beelden zijn niet acceptabel voor analyse - gebruik autofocus op de camera of de instructies van de fabrikant voor handmatige scherpstelling om ervoor te zorgen dat de beelden helder zijn.

Evenzo maakt het mogelijk om ervoor te zorgen dat afbeeldingen niet overbelicht zijn (een veelgemaakte fout) en om de juiste analyse mogelijk te maken (Figuur 2); Overbelichte beelden kunnen niet worden vastgelegd in een kleurcorrectie tijdens de beeldanalyse, omdat de pixelwaarden buiten het detectiebereik van de camera liggen met de huidige instellingen¹⁴. Om overbelichting te voorkomen, evalueert u de kleurenhistogrammen of RGB-waarden voor een testbeeld met behulp van de PlantCV-workflow die hier wordt beschreven (Afbeelding 3) en verlaagt u de helderheidsinstelling op de camera als uit de belichtingstest blijkt dat het beeld overbelicht is. De RGB-waarden (en dus de histogrammen) mogen geen waarden hebben op 0 of op 255, wat het waardebereik is, omdat het mogelijk is dat die waarden boven of onder het detectiebereik liggen en alleen het minimum of maximum kunnen registreren in plaats van de werkelijke waarde. Een testbeeld moet altijd worden beoordeeld met behulp van deze methoden voor overbelichting (Figuur 2 en Figuur 3); we raden aan om de PlantCV-belichtingskwaliteitscontrole in deze publicatie te gebruiken als controle, die bepaalt dat een kwaliteitsafbeelding minder dan 5 procent pixels heeft bij 0 of 255 voor elke kleur. Als vuistregel geldt dat camera's en analysesoftware histogrammen leveren, die gelijke en volledige histogramstaarten moeten hebben; Waarden die onder 0 (onderbelicht) of boven 255 (overbelicht) zijn afgesneden, moeten opnieuw worden genomen met aangepaste camera-instellingen. We raden aan om een locatie te kiezen met helder, gelijkmatig kunstlicht zonder ramen voor verlichting, omdat ramen te helder en ongelijk kunnen zijn en de blootstelling aan licht van de ruimte vaak veranderen. Afbeeldingen moeten gelijkmatig belicht zijn en de grijze vierkanten van een kleurenkaart mogen niet wit lijken, wat wijst op overbelichting.

Afhankelijk van het IP-adres en de beveiligingsinstellingen van de instelling van de gebruiker kan het nodig zijn om problemen op te lossen met de code voor het vastleggen van afbeeldingen. Neem voor het oplossen van problemen contact op met de IT-afdeling voor problemen met de internetverbinding en bestandsoverdracht. Een veelgemaakte fout is het gebruik van de verkeerde maat SD-kaart voor de SBC, of het inschakelen van de SBC voordat de aangesloten monitor wordt ingeschakeld. Om het probleem op te lossen, volgt u het bovenstaande protocol nauwkeurig en laadt u de SBC-software opnieuw. Online forums zijn een uitstekende bron voor het oplossen van problemen en het vinden van oplossingen voor de specifieke camera naar keuze bij het gebruik van gphoto2. Als u problemen met de analyse van PlantCV-afbeeldingen wilt oplossen en het meest up-to-date versiebeheer wilt gebruiken, gebruikt u de documentatiepagina (https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/) of plaatst u een probleem op GitHub (https://github.com/danforthcenter/plantcv/issues). In het bijzonder, als de drempelmethode in dit protocol de installatie niet voldoende van de achtergrond scheidt, gebruik dan alternatieve drempelmethoden die worden aangeboden in "photo-studio-SV-notebook.ipynb" of op de documentatiepagina.

Deze methode kan worden toegepast op elke plantensoort en behandeling die kan worden getransporteerd naar de beschreven geassembleerde fototografie-opstelling. Het is bijvoorbeeld niet van toepassing op planten die in een veld groeien, omdat ze niet naar de fotografie-opstelling kunnen worden getransporteerd zonder de plant op te graven. In deze situatie zouden planten kunnen worden gekapt en vervolgens in beeld worden gebracht met behulp van het protocol, hoewel de meting destructief zou zijn. Meerdere planten kunnen in één afbeelding worden vastgelegd en geanalyseerd, maar een gebruiker moet oppassen dat planten elkaar niet aanraken (Figuur 2), en planten worden elke keer op dezelfde locatie op de achtergrond geplaatst om ervoor te zorgen dat de workflow automatisch over de hele set afbeeldingen kan worden uitgevoerd. Als een bovenaanzicht nodig is voor planten zoals Arabidopsis thaliana, gebruik dan een statief om de camera naar de bovenkant van de planten te verplaatsen die op de stof van fotografiekwaliteit zijn geplaatst; De overige methoden voor het vastleggen en analyseren van afbeeldingen blijven hetzelfde.

Zoals hier met maïs is aangetoond, is deze methode belangrijk voor zowel plantenveredeling als fundamentele inzichten in hoe planten abiotische stress, zoals hitte en droogte, verdragen. Hitte- en droogtestress dragen samen bij aan een jaarlijks opbrengstverlies van 15%-20% in maïs wereldwijd²³. Verwacht wordt dat de opbrengstverliezen alleen maar zullen toenemen als gevolg van de wereldwijde klimaatverandering, aangezien de temperatuur naar verwachting met 1,4-4,4 °C zal stijgen tegen het jaar^{2100 24}. Het evalueren van maïsdiversiteit op stresstolerantie, evenals het bepalen van de fenotypische, fysiologische en moleculaire mechanismen van abiotische stresstolerantie, zijn cruciale onderzoeksdoelen voor wereldwijde voedselzekerheid²⁵. Om deze vragen te beantwoorden, moeten onderzoekers in alle aangrenzende gebieden - fysiologen, genetici, veredelaars, moleculair biologen, enz. - in staat zijn om snel, effectief en vaak niet-destructief de fenotypes van maïsplanten onder abiotische stress te evalueren²⁵. De hier getoonde methode- en voorbeeldresultaten komen in deze behoefte terecht en zijn een belangrijk hulpmiddel voor onderzoekers om echte landbouwuitdagingen aan te pakken.

De hier waargenomen fenotypes werden verondersteld, gezien een schat aan eerder onderzoek - droogtestress vermindert de grootte en groenheid van de plant (gemeten aan de hand van het cirkelvormige gemiddelde van de tint)²⁶ (Figuur 6, Figuur 7 en Tabel 1). Het fenotype van hittestress bij onverwacht goed water geven verminderde het bladoppervlak niet significant, hoewel met meer replicaten deze relatie statistisch beter kon worden geëvalueerd en de hoogte werd verminderd zoals verwacht (Figuur 6). Hoewel het cirkelvormige gemiddelde van de tint niet werd gewijzigd als gevolg van hitte, werd het kleurprofiel inderdaad gewijzigd om zowel meer gele als donkerdere groene pixels op te nemen, wat aantoont dat de evaluatie van alleen de gemiddelde tint onvoldoende is, en dat het histogram van kleur met meerdere waarden moet worden overwogen (Figuur 7). Deze fenotypische veranderingen beschrijven de reactie van een plant op de omgeving, en aanvullende technieken zoals metingen van gasuitwisseling, microscopische beeldvorming en meer kunnen worden gebruikt om de fysiologische veranderingen te beoordelen die optreden als reactie op stress. Dit resultaat toont de kracht aan van nauwkeurige, kwantitatieve metingen die anders zouden worden gemist met behulp van handmatige of kwalitatieve metingen van de gezondheid van planten. Deze inzichten zijn van cruciaal belang voor het veredelen en manipuleren van gewassen die bestand zijn tegen klimaatverandering, die de wereldwijde gewasopbrengsten aanzienlijk vermindert en naar verwachting in de komende jaren zal verslechteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15W USB-C voeding	CanaKit	DCAR-RSP-3A5-C
25604 UC-E6 USB-kabel	Nikon	18208256044
3.5 inch potten	Hummert International	13006000
Berger BM7 35% Bark HP	Hummert International	10121500
Biodock 2024		AI-softwareplatform	www.biodock.ai.
Code-bewerkingssoftware	Jupyter		https://jupyter.org/install
Code-bewerkingssoftware	Visual Studio Code		https://code.visualstudio.com/download
Color Card ColorChecker Classic	Calibrite	CCC
Color Card ColorChecker Passport	Calibrite	CCPP2
Conviron Growth Chamber	Conviron	BDW80 model
Dell 22 Monitor	Dell	SE2222H
EH-67 AC-adapter	Nikon	AZ185
Beeldanalysesoftware	PlantCV		https://plantcv.readthedocs.io/en/latest/installation/
Jack's Wateroplosbare meststof 15-5-15	Hummert International	7590200	vloeibare meststof
Toetsenbord en muis	Logitech	1440638	MK270 draadloze toetsenbord en muis
Maïszaad	USDA-ARS Germplasm Resources Information Network (GRIN)	B73	https://www.ars-grin.gov/
Micro HDMI naar HDMI-kabel	Amazon	B07KSDB25X
Nikon Coolpix B500-camera	Nikon
Nikon D7200-camera	Nikon
Osmocote 14-14-14	Hummert International	7630000
Fotografiekwaliteitsstof	Yayoya		Polyester stof zwarte foto-achtergrond voor fotovideo studio televisie
Raspberry Pi 4-behuizing met koellichaam	iUniker	‎B07ZVKN262
Raspberry Pi 4 Model B Rev 1.1	Raspberry Pi Foundation	RP4B4GB_BP
Raspberry Pi 4 PiSwitch (USB-C)	CanaKit	RSP-PISWITCH-USBC
Raspberry Pi-software	Raspberry Pi Imager		https://www.raspberrypi.com/software/
Statistische analysesoftware	Rstudio		https://posit.co/downloads/
Statieven	K&F Concept	T255A3+BH-28L
Turface MVP	Hummert International	10240000
Draadloze streepjescodescanner	Netumscan	B08X4NMX2M	1D en 2D streepjescodescanner