Kwantificering van driedimensionale celmigratie binnen en in granulaire hydrogel biomaterialen

Summary

Een protocol voor de kwantitatieve evaluatie van 3D-celmigratie binnen en in het grensvlak van granulaire hydrogels wordt hier gepresenteerd.

Abstract

Granulaire hydrogelsteigers hebben een aanzienlijk potentieel in de regeneratieve geneeskunde, omdat ze functioneren als dragers voor celafgifte of als interfaces voor weefselintegratie. Dit artikel introduceert twee nieuwe benaderingen voor het kwantificeren van celmigratie in en naar granulaire hydrogels, waarbij de verschillende toepassingen van deze steigers worden belicht. Eerst wordt een celmonolaagse interfacetest gepresenteerd die weefselgroei in granulaire hydrogels simuleert voor integratiedoeleinden. Ten tweede wordt een op sferoïden gebaseerde test beschreven, ontworpen om de celbeweging binnen de hydrogelmatrix te volgen, specifiek geschikt voor toepassingen met celafgifte. Beide methoden maken nauwkeurige en gecontroleerde metingen van celmigratie mogelijk en bieden een uitgebreide toolkit voor onderzoekers die gebruik maken van granulaire hydrogelsteigers. De motivatie voor deze methoden komt voort uit de behoefte aan op maat gemaakte controle over celmigratie binnen de steiger om af te stemmen op specifieke toepassingen. Door deze kwantificeringstechnieken te optimaliseren en te standaardiseren, kunnen onderzoekers de eigenschappen van granulaire hydrogel iteratief verfijnen, waardoor hun effectiviteit in diverse contexten van regeneratieve geneeskunde wordt gegarandeerd. Deze robuuste set kwantitatieve instrumenten biedt nieuwe mogelijkheden om granulaire hydrogelsteigers te verbeteren en het gebruik ervan in zowel celafgifte- als weefselintegratietoepassingen te bevorderen.

Introduction

Biomaterialen voor therapeutische toepassingen evolueren steeds meer naar complexere en relevantere modellen van celomgevingen om weefselintegratie te bestuderen. Steigers van biomaterialen bieden een driedimensionale (3D) structuur voor celgroei en zijn bedoeld om een gewenst weefsel na te bootsen ^1,2. Driedimensionale celcultuurmodellen omvatten natuurlijke matrices en synthetische steigers die cellen meer complexiteit geven via haptotactische of chemotactische signalen ^3,4. Traditionele hydrogelsteigers zijn in bulk verknoopt, wat een nanoporeus gaas oplevert dat diffusie van kleine moleculen mogelijk maakt ^5,6, maar afbraak vereist voor migratie op celschaal naar een weefselgebied dat gerepareerd moet worden⁷. Granulaire hydrogels zijn een subset van biomaterialen die een hoog potentieel hebben voor klinische vertaling vanwege hun biocompatibiliteit, het vermogen om zich aan te passen aan onregelmatige vormen en, in veel gevallen, hun injecteerbaarheid ^8,9. Hun bouwsteenkarakter biedt het voordeel van porositeit op celschaal om weefselinfiltratie en angiogenese te verbeteren, evenals modulariteit, waardoor heterogene signalen voor celgedrag kunnen worden toegevoegd 10,11,12. Het begrijpen van de respons en beweging van cellen binnen een 3D-steiger is van vitaal belang voor fysiologische relevantie in alle toepassingen waarbij biomaterialen worden gebruikt voor weefselintegratie.

Het bestuderen van weefselingroei in drie dimensies is echter moeilijk te bereiken met kwantitatieve nauwkeurigheid. De uitgebreide complexiteit van een 3D-omgeving vereist in vitro modellen van celmigratie die niet alleen inzicht kunnen geven in het gedrag van cellen, maar ook de materiaalconditie kunnen optimaliseren. Eerder gepubliceerde rapporten van 3D granulaire steigercelmigratie hebben topische seeding gebruikt om celgedrag te onderzoeken, infiltratie in de poreuze structuur en celmorfologie^{te rapporteren 13} en andere sferoïde kiemen^14,15, waarbij de uitgroeilengte en het aantal spruiten worden gemeten. De migratielengtes van topische zaailingen kunnen ongelijk worden beïnvloed door zwaartekrachten en vanwege microscopiebeperkingen kunnen de resultaten niet longitudinaal zijn. De sferoïde kiemmethode is beperkt tot 2D-kwantificering via maximale projectie, die niet in staat is om het mechanisme van gecontroleerde invasie vast te leggen. Beide methoden worden gemeten in een xy-vlak, dat de nuance mist die nodig is om 3D-cellulaire beweging en scaffold-infiltratie volledig samen te vatten.

Dit protocol beschrijft twee benaderingen voor het kwantificeren van celmigratie, zoals in vitro infiltratie in de poreuze 3D granulaire hydrogelsteigers, met name met behulp van Microporeus gegloeid deeltje (MAP) steigers 16,17,18,19. Het doel van de volgende methoden is om het celgedrag in korrelige gels te bestuderen door de richting van hun migratie te controleren voor driedimensionale analyse. De eerste, op monolaag gebaseerde ascending migration assay (MAMA)-benadering, is een vereenvoudigd model van endogene celintegratie dat uniforme cel-materiaalinteracties illustreert en dient als een platform om de initiële omgeving weer te geven waarin cellen interlateren met granulaire hydrogels en om individueel gedrag te isoleren voorafgaand aan infiltratie van de steiger. De tweede, de parallel gelaagde uitgaande sferoïde migratietest (PLOSMA) -methode genoemd, is een 3D-cel sferoïde migratietest, die celbeweging onderzoekt wanneer deze volledig is omgeven door een complexe steigeromgeving en celbeweging na de bevalling modelleert, evenals beweging nadat cellen volledig een korrelige gel zijn binnengegaan.

Beide methoden zijn kwantificeerbaar door middel van 3D-beeldanalyse en kunnen worden toegepast op het bestuderen en optimaliseren van materiaal-celinteracties met behulp van longitudinale tijdstippen voor regeneratieve geneeskunde en weefselmanipulatietoepassingen, waarbij het bevorderen of beperken van celbeweging binnen de ontwerpcriteria valt. Bovendien maken deze methoden gebruik van plaatcentrifugatie voor een uniforme voorbereiding van de multiwell-test.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Granulaire hydrogel voorbereiding

OPMERKING: MAP-deeltjes die in dit protocol worden gebruikt, zijn 3,2 wt% w/v gel met 45,88 mg/ml peg-mal (10 kDa), 0,82 mg/ml RGD, 8,06 mg/ml MethMal¹⁹ en 5,62 mg/ml MMP-2 afbreekbare crosslinker. De mechanische stijfheid van de gel is 15-20 kPa om overeen te komen met huidstijfheid¹⁷.

1. Genereer korrelige hydrogeldeeltjes en bereid je voor op celkweek zoals normaal.
   OPMERKING: Dit protocol beschrijft de steriele bereiding van microporeuze gel met gegloeide deeltjes, waarvan de productie wordt beschreven door Roosa et ^al.18.
2. Bereid de korrelige hydrogeldeeltjes voor op in vitro gebruik door ze te steriliseren met drie wasbeurten van 70% isopropylalcohol, gevolgd door drie wasbeurten van steriel 1x PBS.
3. Bereid een steriele oplossing van 0,2 mM lithiumfenyl-2,4,6-trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) in mediaoplossing door LAP-poeder op te lossen in ultrapuur water en de oplossing door een steriel filter van 0,22 μm te leiden. Voeg deze oplossing 1:1 v/v toe met de hoeveelheid gel die nodig is om het experiment uit te voeren.
4. Incubeer de 0,2 mM LAP-, gel- en media-oplossing bij 37 °C op een buisrotator bij 20 tpm gedurende ten minste 30 minuten alvorens verder te gaan om diffusie van LAP door de microdeeltjes mogelijk te maken.
5. Centrifugeer na 30 minuten de deeltjessuspensie bij 18.000 x g gedurende 5 minuten bij 25 °C. Aspiratie van het bovenlevende.
   OPMERKING: De algehele droogte van MAP-deeltjes kan variëren als gevolg van verschillen in chemie, hydrofiliciteit en deeltjesgrootte. Voor consistentie is het het beste om de deeltjessuspensie te centrifugeren zoals beschreven, de deeltjes in de buis te mengen met behulp van een positieve verplaatsingspipet en vervolgens de centrifugatiestap te herhalen.

2. Monolayer-based Ascending Migration Assay (MAMA) methode: celcultuur en beeldvorming

OPMERKING: Cellen werden afgebeeld met behulp van het FITC-kanaal (488 nm). De kleurstof die voor de cellen werd gebruikt, had een excitatie bij 492 nm en een emissie bij 517 nm. 10x vergroting zorgt voor meer detail dan 4x vergroting, maar beide kunnen worden gebruikt.

1. Ontdooi menselijke dermale fibroblasten (HDF's) volgens het protocol van de fabrikant. Doorgang indien nodig totdat de gewenste doorgang is bereikt; over het algemeen behouden primaire cellen genetische en fenotypische samenstelling tot en met P5.
2. Plaat 120.000 cellen/cm² voor ten minste n = 6 in een plaat met 96 putjes of de gewenste plaatgrootte met behulp van het aanbevolen mediavolume per putje voor suspensie, voorzichtig aanzuigend voor elke toevoeging. Laat cellen 's nachts hechten, zoals weergegeven in figuur 1A, wat de volgende dag resulteert in ongeveer 80% samenvloeiing.
   OPMERKING: Over het algemeen zijn de middelste kolom- en rijputten het beste voor een optimale verspreiding van de gel. De auteurs gebruiken maximaal 24 putjes voor een plaat met 96 putjes (rijen B-G en kolommen 5-8).
3. Bereid de gelcondities voor zoals hierboven vermeld en verwijder tijdens het incuberen in LAP de media met een aspirator of een pipet van de putplaat met cellen. Pas op dat u de bodem van de plaat niet verstoort.
4. Voeg celvolgkleurstof toe aan putjes volgens de instructies van de fabrikant, weergegeven in afbeelding 1B. Zorg ervoor dat de gel volledig is voorbereid zoals beschreven in stap 1 voordat u de kleurstof voor het volgen van cellen uit putjes opzuigt.
5. Voeg 20 μL van elke gelconditie toe aan de putjes met een positieve verplaatsingspipet zonder de bodem van de plaat aan te raken.
   OPMERKING: De beste testomstandigheden treden op wanneer de gel rechtstreeks naar het midden van de put wordt gepipetteerd.
6. Draai met behulp van een centrifugeopzetstuk met een draaiende rotor bij 25 °C gedurende 15 s met een versnelling en vertraging van 8 op 100 x g om de gel plat te maken. Draai de plaat 180° om en draai opnieuw op 100 x g gedurende 15 s om een gelijkmatige gelverdeling over de putbodem te garanderen, zoals te zien is in figuur 1C.
7. Aseptisch verknoopt de gel vanaf de bovenkant (Figuur 1D) door gefocusseerd licht (365 nm, 34,4 mW/^cm2) gedurende 30 s op het monster toe te passen om de steiger uit te gloeien, waarbij 200 μL media wordt toegevoegd aan elk putje met cellen nadat alle steigers zijn gevormd. Laat de cellen 30 minuten bij 37 °C incuberen zodat ze zich aan de korrelige steiger kunnen hechten voordat ze worden afgebeeld.
8. Om het migratiegedrag vast te leggen dat is samengevat in figuur 1E, beeldt u cellen af met behulp van een confocale microscoop. Zoek het laagste focuspunt voor een gebied van de plaat waar cellen ten minste 80% samenvloeien en stel dit in als de onderrand van de z-stack.
   1. Zoek het hoogste punt van het fluorescerende signaal van de cel en stel dit in als de bovenrand van de z-stack. Gebruik een stapgrootte van 5 μm of kleiner voor de beste resolutie.
9. Stel ten minste drie putjes af om de monolaag van de cel en de niet-migrerende celhoogten weer te geven. Het t = 0-tijdstip wordt weergegeven vanuit zowel het bovenaanzicht als het zijaanzicht in Figuur 2A. Incubeer een nacht nadat de beeldvorming is voltooid.
   OPMERKING: Deze cellen werden afgebeeld met een 4x-objectief en de belichting werd consistent gehouden voor alle putten.
10. Bij t = 24 uur beginnen cellen door de korrelige steiger te stijgen, zoals te zien is in figuur 2B vanaf boven- en zijaanzichten. Herhaal de beeldvormingsstappen zoals uitgevoerd voor t = 0 uur met dezelfde parameters. Gebruik de vorige hoogte van de fase als referentie of zoek cellen die nog niet zijn gemigreerd en stel dat in als de onderrand van de z-stack.
11. Herhaal de stappen voor alle putjes en zorg ervoor dat elke put wordt opgeslagen als een afzonderlijke afbeelding voor eenvoudige analyse.
    OPMERKING: Tijdstippen kunnen worden afgebeeld voor langere tijdstippen, afhankelijk van experimentele beperkingen en de methode voor het volgen van fluorescentie van cellen.
12. Steigers kunnen worden bevestigd en gebeitst voor aanvullende statistieken. Zuig op het gewenste eindtijdstip de media met een pipet uit de putjes en gooi ze weg. Was elk goed voorzichtig met 200 μL steriel PBS, twee keer gedurende 5 minuten elk. Voeg 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe gedurende 20 minuten, aspireer en gooi weg. Putjes kunnen direct worden gekleurd of maximaal een week bij 4 °C in 1x PBS worden bewaard.

3. Monolayer-based Ascending Migration Assay (MAMA) methode: 3D-beeldanalyse

1. Open voor batchconversies de IMARIS-software voor beeldconversie. Sleep de microscopie-afbeeldingen naar de conversiesoftware en kies een map in de software-arena om te importeren. Druk op Alles starten. De geconverteerde afbeeldingen verschijnen in de arena als .ims-bestanden.
   OPMERKING: Als de voxelgrootte niet is opgenomen in de metagegevens van de afbeelding, raadpleegt u de specificaties van de individuele confocale beeldvorming om de waarde te vinden. Als alternatief kan de voxelgrootte worden benaderd als de stapgrootte die tijdens de beeldvorming wordt gebruikt.
2. Open de software door te dubbelklikken op het IMARIS Arena-pictogram op het bureaublad en een afbeelding uit de arena te selecteren.
3. De afbeelding wordt automatisch geladen in het analysetabblad '3D-weergave' dat te zien is in het pictogrammenpaneel van de werkbalk bovenaan. Klik op het tabblad Image Proc in de hoofdwerkbalk.
4. Klik linksboven in het zijpaneel op het vervolgkeuzemenu voor kanaal 1 en selecteer Achtergrond aftrekken. Druk op Ok onder aan het paneel om terug te keren naar '3D-weergave'. Representatieve afbeeldingen voor t = 0 uur en t = 24 uur staan respectievelijk in Figuur 2A,B.
5. Klik in de kleine werkbalk net boven het menu van het zijpaneel op het pictogram met afgeronde blauwe vormen, Nieuwe oppervlakken toevoegen, om een tabblad met bewerkbare objecten te maken met de naam 'Oppervlakken 1'.
6. Een interface voor het maken van parameters en algoritme-instellingen wordt geopend aan de onderkant van het menupaneel. Genereer handmatig de parameters die voor alle replica's moeten worden gebruikt door op de blauwe pijlknop onder aan de interface te klikken. Zorg ervoor dat het juiste bronkanaal is geselecteerd en vink het vakje 'Vloeiend' aan.
   1. Stel de oppervlaktedetails in op 0,7 μm en selecteer Achtergrond aftrekken (lokaal contrast). Typ de gemiddelde cellengte in het vak 'Diameter van de grootste bol die in het object past'. Druk onderaan op dezelfde blauwe pijl als u klaar bent.
      OPMERKING: Deze waarde kan worden geschat met behulp van het tabblad 'Segment' in de werkbalk en het meten van de breedte van gemiddelde cellen.
7. Bepaal voor drempels het intensiteitshistogram waarbij alleen de helderste cellen zijn gesegmenteerd. Beweeg met behulp van de slicer op en neer door de afbeeldingsstapel om ervoor te zorgen dat deze zo nauwkeurig mogelijk is.
   1. Selecteer Inschakelen voor 'Aanraakobjecten splitsen (regio groeiend)' en stel de diameter van de zaadpunten in op dezelfde diameter als eerder gebruikt. Zorg ervoor dat de drempelwaarde 'Op basis van intensiteit' is geselecteerd en klik op de blauwe pijl naar rechts.
8. De volgende twee stappen, Filter Seed Points en Filter Surfaces, kunnen worden aangepast door verschillende metingen om ervoor te zorgen dat de gegenereerde oppervlakken nauwkeurig zijn; Voor een basislijnanalyse is echter geen extra filtering nodig. Als er geen verandering nodig is, klikt u op de blauwe pijlknop .
   OPMERKING: De laatste stap maakt een verdere classificatie van het oppervlak mogelijk, afhankelijk van de gewenste output. Nadat er bewerkingen zijn aangebracht, klikt u op de groene pijlknop om het maken van de oppervlakken te voltooien.
9. Om de creatieparameters op te slaan voor batchanalyse, klikt u op het toverstokpictogram Creatie. Klik op Winkelparameters voor Batch en geef het een naam en klik vervolgens op Ok. Representatieve verwerkte beelden voor t = 0 en t = 24 uur worden respectievelijk weergegeven in figuur 2C,D.
   OPMERKING: Alle objecten binnen een geselecteerd 'oppervlak' kunnen worden geclassificeerd in sets op basis van verschillende eigenschappen die door de beeldconversiesoftware worden gegeven, zoals oppervlakte, volume, intensiteit en afstand tot andere gemaakte oppervlakken.
10. Oppervlakte-eigenschappen worden gevonden door het tabblad Statistieken te selecteren. Om alle celhoogtes te verzamelen, klikt u op het tabblad Gedetailleerd en selecteert u Specifieke waarden en Positie Z in de opeenvolgende vervolgkeuzemenu's. Klik op het enkele pictogram Opslaan om alle z-posities en alle classificaties die in een .xls-bestand zijn gemaakt, op te slaan. Herhaal dit voor alle afbeeldingen.
11. Zoek de mediane z-positie van niet-migrerende cellen uit het representatieve beeld en trek alle z-posities onder dat getal af van elke testconditie.
    OPMERKING: Migratiewaarden worden gerapporteerd als het gemiddelde van medianen voor elke technische replicatietoestand boven niet-migrerende celhoogte. Ze kunnen worden gerapporteerd als mediane hoogte, te zien in Figuur 3A, of als vouwverandering in migratiehoogte voor het gewenste tijdstip in vergelijking met t = 0, te zien in Figuur 3B.

4. Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay (PLOSMA)-methode: celcultuur en hangende druppelcultuur voor 3D-sferoïden

OPMERKING: Dit protocol beschrijft celcultuur en hangende druppelcultuur, aangepast aan het protocol van Nandi et ^al.14.

1. Ontdooi HDF's volgens het protocol van de fabrikant. Doorgang indien nodig totdat de gewenste doorgang is bereikt.
2. Bereid in een aseptische celkweekkap een petrischaal voor door 10 ml PBS aan de bodem toe te voegen en het deksel om te draaien zodat de buitenkant bovenop de celcultuurkap rust.
3. Voeg het juiste aantal cellen (bepaald aan de hand van het aantal cellen) toe aan een microcentrifugebuisje. Voeg celvolgstof verdund in media toe. Breng het totale volume op 1 ml met opgewarmde media.
   OPMERKING: Sferoïden moeten ongeveer 8000 cellen per sferoïde zijn, maar kunnen veranderen op basis van het celtype.
4. Incubeer de celoplossing gedurende 45 minuten bij 37 °C. Draai de cellen naar beneden volgens de door de fabrikant aanbevolen snelheid en zuig de supernatant op.
5. Resuspendeer cellen in 1:100 methylcellulose in media.
6. Pipetteer 20 μL druppels van de cel/media-oplossing op het deksel van de petrischaal.
7. Keer het deksel zelfverzekerd, snel en voorzichtig om en plaats het op de onderste helft van de petrischaal met PBS.
8. Incubeer de druppels gedurende ten minste 24 uur.
   OPMERKING: Sferoïde vorming kan worden gevolgd door middel van helderveldmicroscopie.

5. Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay (PLOSMA) methode: Zaaien van celsferoïden op granulaire hydrogel

OPMERKING: Het volgende proces is samengevat in figuur 4A.

1. Om de PLOSM-methode in te stellen die wordt beschreven in figuur 4A, voegt u aseptisch 15 μL gel toe met behulp van een verdringingspipet aan putjes in een doorzichtige plaat met 96 putjes.
2. Draai met behulp van een plaatdraaiende rotorcentrifuge gedurende 10 s op 1000 x g om de gel plat te maken. Draai de plaat 180° om en draai opnieuw op 1000 x g gedurende 10 s om een gelijkmatige gelverdeling over de bodem van de put te garanderen.
3. Zodra een gelijkmatige vlakheid is bereikt, wordt de gel aseptisch van bovenaf verknoopt door gericht licht (365 nm, 33,4 mW/^cm2) gedurende 30 s op het monster toe te passen om de steiger uit te gloeien.
4. Verplaats de petrischaal met hangende druppels aseptisch in de aseptische weefselkweekkap en keer het deksel om.
5. Neem met een pipet van 20 μl langzaam een druppel op totdat de sferoïde de pipetpunt binnendringt. Werp de druppel uit op de steiger in het midden van de put.
6. Herhaal de vorige stappen voor alle putjes. Zorg ervoor dat elk putje een sferoïde heeft door te bevestigen met helderveld- of fluorescerende microscopie.
7. Incubeer de putplaat gedurende 2 uur bij 37 °C zodat de sferoïden zich aan de steiger kunnen hechten.
8. Pipetteer een extra 15 μL gel bovenop elke sferoïde. Om een gelijkmatige gelverdeling te garanderen, centrifugeert u de plaat op 300 x g gedurende 15 s in elke richting.
9. Gloei de bovenste gellaag gedurende 30 s met behulp van UV (365 nm) licht bij 33,4 mW/^cm2. Pipettemedia bovenop elke steiger om het totale volume van de put op 200 μL te brengen.
   OPMERKING: Steigers zullen op dit punt erg droog zijn, dus voeg media druppelsgewijs toe langs de zijkant van de put om te voorkomen dat de sferoïde losraakt.

6. Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay (PLOSMA) methode: Confocale beeldvorming van sferoïden

OPMERKING: Het gemak van beeldvorming is afhankelijk van het beeldvormingssysteem. Plaats de sferoïde in de put met een korte belichtingstijd. De cellen werden in beeld gebracht met behulp van het FITC-kanaal (488 nm). De kleurstof die voor de cellen werd gebruikt, had een excitatie bij 492 nm en een emissie bij 517 nm. 10x vergroting zorgt voor meer detail ten opzichte van 4x vergroting.

1. Zoek het laagste faseniveau (z-hoogte) waarop cellen nog steeds in focus zijn. Stel dit in als de ondergrens van de z-stack.
2. Zoek het hoogste faseniveau (z-hoogte) waarop cellen nog steeds in focus zijn. Stel dit in als de bovengrens van de z-stack.
   OPMERKING: De beste beeldvormingsresultaten omvatten een stapgrootte van kleiner dan of gelijk aan 5 μm om de resolutie op celschaal te behouden. Er kunnen compromissen zijn tussen beeldvormingssnelheid en resolutie, afhankelijk van het confocale microscoopsysteem.
3. Beeld alle sferoïden af zoals beschreven bij t = 0 en 24 uur. Afhankelijk van de experimentele beperkingen kan ook een 48-uurs tijdstip worden afgebeeld. Representatieve maximale projectiebeelden van t = 0 en t = 24 zijn te zien in figuur 4B.

7. Parallel Layered Outward Spheroid Migration Assay (PLOSMA) methode: 3D-beeldanalyse

1. Importeer afbeeldingen in de analysesoftware zoals beschreven in stap 3.1 tot en met 3.4. Klik in de rechterbovenhoek van het linkerdeelvenster op het vervolgkeuzemenu voor kanaal 1 en selecteer Achtergrondaftrekking. Druk op Ok onder aan het paneel.
2. Eenmaal terug in de 3D-weergave, drukt u op Auto Alle kanalen aanpassen in het pop-upvenster Beeldschermaanpassing en corrigeert u indien nodig.
3. Klik in de kleinere werkbalk net boven het zijmenu op het pictogram Nieuw referentiekader toevoegen in afbeelding 5A met drie orthogonale pijlen om een nieuw tabblad met de naam 'Referentiekader 1' toe te voegen.
4. Verplaats de oorsprong naar het midden van de sferoïde in alle drie de vlakken, zoals gevisualiseerd in Figuur 5B.
5. Klik in dezelfde werkbalk als de drie orthogonale pijlen op het pictogram met oranje bollen en voeg nieuwe vlekken toe om een tabblad met de naam 'Vlekken 1' te maken. Druk op de blauwe pijlknop.
6. Stel onder Spotdetectie de geschatte XY-diameter in op de geschatte diameter van de cellen. Druk op de blauwe pijlknop.
   OPMERKING: Voor HDF's is dit aantal 15,0 μm.
7. Pas voor drempelwaarden het intensiteitshistogram aan om alleen de helderste delen te omcirkelen. Beweeg met behulp van de slicer op en neer door de afbeeldingsstapel om ervoor te zorgen dat deze zo nauwkeurig mogelijk is. Druk op de blauwe pijl naar de volgende.
8. Druk op de groene knop Uitvoeren om de analyse te voltooien.
9. Schakel Renderen op slicer uit of klik op het gele vierkante pictogram aan de rechterkant van het installatiepaneel.
10. Klik op het tabblad Statistieken . Selecteer in het eerste vervolgkeuzemenu de optie Specifieke waarden. Selecteer in het tweede vervolgkeuzemenu de optie Afstand tot referentiekader van herkomst. Alle waarden voor de geselecteerde oppervlakken worden weergegeven, zoals te zien is in Afbeelding 5C. Klik op het pictogram voor één keer opslaan , waarmee een .xls bestand wordt gedownload.
11. Sla de wijzigingen in de afbeelding en de analyses op door op het pictogram Opslaan in de hoofdwerkbalk te drukken. Figuur 6A geeft een 3D-weergave weer van een sferoïdebeeld dat na 24 uur is gemaakt, terwijl Figuur 6B de IMARIS Spots-functie weergeeft die verspreide cellen markeert, met een kleurcode op basis van de afstand tot het referentiekader van herkomst.
12. Normaliseer de geëxporteerde gegevens naar de t = 0-afbeeldingen en bereken het gemiddelde van de afgelegde cellulaire afstand en z-hoogte voor elke sferoïde om voor elk monster een enkele waarde te verkrijgen. Figuur 7A,B geeft respectievelijk representatieve grafieken weer voor elke output.

Results

Dit protocol heeft tot doel de noodzakelijke stappen voor twee nieuwe granulaire scaffoldmigratietesten in detail te beschrijven. De MAMA-methode kan worden gebruikt om cellulaire infiltratie op een weefselinterface te evalueren. Granulaire hydrogels zijn een complexer systeem dan bulkhydrogels en zijn daarom inherent complexer om te verwerken voor migratie ^9,20. Het is belangrijk om het stapsgewijze proces te begrijpen dat in figuur 1 wordt beschreven. Elke stap bouwt voort op de volgende en is in dit protocol geoptimaliseerd. Het zaaien van HDF's met een dichtheid van 120.000 cellen/^cm2 zal resulteren in een samenvloeiing van ten minste 80% 's nachts (Figuur 1A), en deze niet-fluorescerende cellen kunnen het beste op de dag van het experiment worden gelabeld met celvolgkleurstof om het beeldvormingspotentieel te maximaliseren (Figuur 1B). Dit protocol komt overeen met de lagere middelpuntvliedende kracht die wordt gebruikt bij het passeren van HDF om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden. Vanwege de hoek die wordt geproduceerd voor een enkele centrifugatiestap, is het noodzakelijk om de plaat 180° om te draaien om ervoor te zorgen dat de gel verschuift om het bodemoppervlak van de putjes volledig te bedekken (Figuur 1C). Door cellen na het gloeien 30 minuten in de incubator te laten herstellen (Figuur 1D) blijft de levensvatbaarheid van de cellen behouden en ontstaat een optimale migratie (Figuur 1E). Een groot gebied van een plaat met 96 putjes kan worden afgebeeld met een 4x objectief en worden gematcht van tijdstip 0-24 uur (Figuur 2A,B) om het celgedrag op grote schaal te beoordelen. Het verwerken van de resulterende z-stack-afbeeldingen in de analysesoftware biedt geavanceerde analyses voor meerdere grote datasets in een gebruiksvriendelijke interface. Dit protocol vat de stappen samen om gegevenssets te maken voor celhoogte, of positie Z, op elk tijdstip dat wordt gevisualiseerd met de representatieve afbeeldingen in Figuur 2B,C. Analyse van de verwerkte gegevens is te zien in figuur 3A, gevisualiseerd met behulp van het gemiddelde van de mediane hoogten en hun standaarddeviatie van elk tijdstip, en de vouwveranderingshoogte van niet-migrerende cellen bij t = 0 uur wordt weergegeven in figuur 3B. De onderliggende gegevens van deze methode zijn doorgaans niet-normaal verdeeld, dus medianen zijn robuustere vergelijkingsmaatstaven en worden daarom gebruikt om de gegevens samen te vatten.

Evenzo kan de PLOSM-methode worden gebruikt om de beweeglijkheid van afgeleverde cellen in een 3D-granulaire hydrogelsteiger te evalueren. Figuur 4A schetst de stappen naar de PLOSMA-methode, en het is vooral belangrijk om de sferoïde in het midden van de put te zaaien. Het wordt aanbevolen om de sferoïde in het gezichtsveld te centreren, maar deze is afhankelijk van de mogelijkheden van de microscoop. Figuur 4B toont representatieve beelden van sferoïde spreiding voor t = 0 uur en t = 24 uur, genomen met een vergroting van 10x in het FITC-kanaal (488 nm). In de software kan een oorsprongsreferentiekader worden gemaakt en aangepast aan elke z-stack (Figuur 5A,B). De software kan de radiale afstand tot dat oorsprongsreferentiekader volgen en exporteren als de gewenste dataset (Figuur 5C). Figuur 6A toont een representatief beeld van de 3D-weergave van de t = 24 h sferoïde, terwijl Figuur 6B de Spots-functie van de software toont. Een voorbeeld van de verwerkte gegevens is weergegeven in figuur 7. Figuur 7A geeft de gemiddelde afstand weer die is afgelegd vanaf het centrum, genormaliseerd naar de afstanden van dag 0. Figuur 7B isoleert de afstanden die alleen in het z-vlak zijn afgelegd, aangezien dat de richting is die de PLOSMÄ-methode wil bestuderen.

Figuur 1: Monolayer-based Ascending Migration Assay celcultuur en beeldvorming. Schema van de belangrijkste stappen in de cel- en gelverwerking voor MAMA. (A) Cellen worden 's nachts tot samenvloeiing gekweekt en (B) celvolgstof wordt toegevoegd vlak voor de toevoeging van korrelige gel. De steiger wordt geassembleerd via (C) plaatcentrifugatie en gestabiliseerd met (D) fotoverknoping. Beeldvorming op meerdere tijdstippen maakt (E) visualisatie van opwaartse celmigratie mogelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: MAMA beeldverwerking. Representatieve beelden van beeldverwerking. Vergelijking van boven- en zijaanzicht van onbewerkte confocale beelden bij (A) t = 0 en (B) t = 24 uur in het FITC-kanaal bij 4x vergroting. (B) Vergelijking van boven- en zijaanzicht van de verwerkte celpositie Z-hoogtes bij (C) t = 0 en (D) t = 24 uur. Verwerking gedurende 24 uur omvat het aftrekken van mediane niet-migrerende z-hoogten. Schaalbalken = 500 μm. Afkortingen: MAMA = Monolayer-based Ascending Migration Assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Analyse van de output van MAMA-celmigratie. (A) Mediane positie Z en standaarddeviatie van celhoogten in elk duplicaat (n = 6) op tijdstippen t = 0 (27,0 μm ± 1,4 μm) en t = 24 uur (46,6 μm ± 10,8 μm). (B) Migratie van cellen na 24 uur genormaliseerd naar 0 uur en gerapporteerd als vouwverandering (1,8 ± 0,4). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Parallelle laag Outward Spheroid Migration Assay (PLOSMA) celcultuur en beeldvorming. (A) Schematisch beschrijvende stappen van steigerlagen. (B) Projecties van sferoïden met maximale intensiteit, genomen om 0 en 24 uur. Beelden werden gemaakt via confocale fluorescerende microscopie in het FITC-kanaal (488 nm) met een vergroting van 10x. Schaalbalken = 200 μm. Afkortingen: PLOSMA = Parallel Layer Outward Spheroid Migration Assay. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Aanmaken van een nieuw referentiekader voor de herkomst. (A) De knop voor het nieuwe oorsprongsreferentiekader omlijnd met een rood vak. (B) De nieuwe oorsprong is ingesteld op het centrum van de sferoïde in alle drie de dimensies. (C) De getoonde outputstatistieken zijn de afstanden van celoppervlakken tot het oorsprongsreferentiekader, dat beschrijft hoe ver cellen vanuit het centrum zijn gemigreerd. Schaalbalk = 120 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 6: 3D-weergaven van de ingebedde sferoïde om 24 uur. (A) Bewerkte sferoïde in 3D-ruimte. (B) Het centrum van dezelfde sferoïde werd bepaald met behulp van de oorsprongsreferentiekaderfunctie in IMARIS, en de celspreiding wordt kleurgecodeerd op basis van de afstand tot de oorsprong. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Voorbeelduitgangen voor PLOSMA. (A) Voorbeeld PLOSMA-resultaten met de afgelegde afstand in μm. De gemiddelde afgelegde afstand was 240,8 μm ± 36,87 μm. (B) Z-hoogte vouwverandering (t_f/t₀) van sferoïde kieming. De gemiddelde vouwverandering was 3,82 ± 1,495. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft twee in vitro modellen voor het karakteriseren van celmigratie in 3D voor wondgenezing en weefselintegratie. Het eerste model, de op monolaag gebaseerde migratietest, is gebaseerd op correct gehechte en confluente cellen. Dit protocol is ontwikkeld met een fibroblastceltype en geoptimaliseerd bij een zaaidichtheid van 1,20,000 cellen/^cm2. Door deze dichtheid kunnen cellen 's nachts groeien tot een samenvloeiing van ten minste 80% gelijkmatig over de bodem van de putplaat. Deze stap zorgt voor migratie in de z-richting binnen ten minste 24 uur; Als de confluentie te laag is bij toevoeging van de gellaag, kunnen cellen zich blijven verspreiden over het weefselkweekplastic en in de gel, wat resulteert in een niet-uniform, vertraagd migratiepatroon, dat werd waargenomen tijdens de optimalisatie. Ongelijke migratiehoogtes kunnen nog steeds worden waargenomen in gebieden met minder dichte cellen, zelfs bij 80% confluentie. Goed gerepliceerde cellen verminderen de ruis van dit celgedrag. Te confluente cellen kunnen het optillen van cellen tijdens de centrifugatieperiode en mogelijk celdood veroorzaken. Deze variabiliteit wordt aangepakt door een consistent aantal cellen te zaaien en door een consistent beeldgebied vast te leggen om de juiste gegevensvergelijkingen mogelijk te maken. Voor zover de auteur weet, is plaatcentrifugatie niet gepubliceerd voor het afvlakken van gels, maar centrifugatie wordt vaak gebruikt voor het passeren van cellen en het hanteren van biomaterie^21,22. Door de snelheid aan te passen aan de passeersnelheden blijft de levensvatbaarheid van de cel behouden voor een verdere optimale celverwerking.

De belangrijkste uitdaging bij deze methode is het maximaliseren van de beeldresolutie en -diepte, terwijl de beeldvormingstijd wordt geminimaliseerd om de beste analyse te garanderen. De kleurstof voor het volgen van groene cellen is voldoende helder om een 96-wells in beeld te brengen met een stapgrootte van 5 μm of minder en een belichtingstijd tot 1000 ms. Door de belichtingstijd te verkorten, wordt de tijd dat cellen zich niet in incubatieomstandigheden bevinden, verminderd, maar wordt ook de resolutie verminderd. Deze parameters moeten op basis van een individuele microscoop worden geoptimaliseerd, maar de variabiliteit wordt verminderd door ervoor te zorgen dat alle beelden binnen één onderzoek met dezelfde instellingen worden vastgelegd.

Een belangrijke opmerking voor de analyse van MAMA's is dat het elimineren van de cellen op of onder de monolaaghoogte vereist om ervoor te zorgen dat alleen migrerende cellen in aanmerking komen voor statistische tests. Dienovereenkomstig worden de medianen van replicate putten gerapporteerd vanwege de niet-Gaussiaanse verdelingsaard van de celposities na filtering. Vergelijking tussen groepen kan worden gevisualiseerd met een histogram en medianen kunnen statistisch worden geanalyseerd met een niet-parametrische test.

Ondanks deze uitdagingen is de op monolagen gebaseerde opwaartse migratiemethode op zijn eenvoudigst een reproduceerbare test voor 3D-celinfiltratie van poreuze steigers. Om de mechanistische effecten van celmigratie te bestuderen, moet u ervoor zorgen dat de parameters passen bij het celtype dat wordt bestudeerd. Dit kan de toevoeging van chemotactische of haptotactische componenten omvatten, in de gel of in de media. Menselijke dermale fibroblast complete media omvatten migrerende chemokines, maar andere celtypen die meer specifieke signalen gebruiken, vereisen aanpassing van de test dienovereenkomstig. Deze test leent zich wel voor het testen van meerdere soorten variabelen; De reikwijdte hiervan wordt echter niet in dit protocol behandeld. De MAMA biedt een fysiologisch relevante omgeving die analoog is aan de celverplaatsing van bulkweefsel naar een geïnjecteerde poreuze hydrogel in vivo.

Voor de PLOSMA-methode is de plaatsing van de sferoïden in het midden van de steiger van cruciaal belang voor succesvolle beeldvorming en betekenisvolle celmigratie in drie dimensies. De exacte uitzaaiing van de sferoïde in het midden van de gel is afhankelijk van de gebruiker. Daartoe helpt het stabiliseren van de pipet in de cilinder met de niet-dominante hand van de gebruiker bij het centreren, en de effectiviteit van de zaaipositie kan worden bevestigd met behulp van helderveld- of fluorescerende microscopie. Een niet-gecentreerde sferoïde kan worden verholpen door een tweede poging met een nieuwe sferoïde, hetzij op dezelfde steiger of op een nieuwe steiger. Om deze reden raden de auteurs aan om meer sferoïden te maken dan nodig is en meer MAP-gel voor te bereiden dan nodig is.

De tweede laag centrifugatiestap zorgt ervoor dat de sferoïde (1) gelijkmatig wordt bedekt door de gel en (2) in staat is om zich gelijkmatig naar boven en naar beneden in de gel te verspreiden, wat cruciaal is voor het bestuderen van afgeleverde cellen. Centrifugatie kan er ook voor zorgen dat de sferoïde van het midden naar de randen van de put beweegt, en hoewel dit protocol dit fenomeen beperkt door de centrifugatiestappen en het volume van de gel die voor elke laag wordt gebruikt (15 μL) te optimaliseren voor een gelijkmatige verdeling, elimineert het de beweging ervan niet volledig. De exacte centrifugatiesnelheid en timing die nodig zijn om de sferoïde beweging te verminderen, moeten mogelijk worden aangepast aan het model van de centrifuge; De specificatie die in dit protocol wordt beschreven, kan echter worden gebruikt als benchmark voor individuele optimalisatie. Een andere benadering is om de sferoïden 2 uur incubatietijd te geven om zich aan de steiger te hechten voordat de tweede laag gel wordt toegevoegd. Sferoïde beweging wordt bijzonder goed verzacht wanneer beide strategieën worden geïmplementeerd. Ten slotte is deze methode vanwege het meerstaps centrifugatieproces mogelijk niet geschikt voor minder winterharde cellijnen.

Afgezien van de logistiek van het plateren van de sferoïden in de PLOSMA-methode, zijn er beperkingen tijdens het verkrijgen van afbeeldingen. De sferoïde kan worden afgebeeld met een vergroting van 4x of 10x, maar gebruik voor de beste resultaten een vergroting van ten minste 10x en verklein de stapgrootte van de z-stacks tot 2-5 μm. De vergroting moet gedurende het hele onderzoek consistent zijn. De beeldvormingstijd neemt toe met een hogere resolutie, dus beperk het aantal monsters in elke putplaat (4-8 putjes per plaat) om de tijd buiten de incubator te minimaliseren. Een live-imaging-opstelling kan ook de tracking verbeteren en meer inzichten bieden.

Omdat granulaire hydrogels unieke topologie en ontwerpparameters hebben, waaronder inherent volume, porositeit, mechanische sterkte en, in sommige gevallen, bioactiviteit, is het noodzakelijk om het celgedrag met betrekking tot deze aspecten met zoveel mogelijk getrouwheid te bestuderen. De PLOSMA-methode is ontworpen om de beweging van cellen te modelleren na de bevalling of nadat cellen volledig in een korrelige gel zijn gekomen. Omdat de cellen gedwongen worden te migreren door de poriën die inherent zijn aan de granulaire hydrogelgeometrie, isoleert de PLOSMA-methode effectief porositeit als invloed op het celgedrag. Mogelijke toepassingen voor deze test zijn celafgifte in situ en weefselintegratie in een granulaire scaffold, met name in de wondgenezingsruimte²³.

Beide protocollen zijn ontwikkeld met primaire menselijke dermale fibroblasten vanwege de rol van fibroblastmigratie bij weefselherstel en -hermodellering ^4,24, maar het migratiegedrag van eventuele aanhangende cellen kan worden gemeten als reactie op verandering van de poreuze steiger - inclusief toevoegingen van groeifactoren en oppervlakte-/bulksamenstelling van gel. Deze veranderingen kunnen het nodig maken om deze tests aan te passen voor merkbare resultaten. Parameters die verdere optimalisatie vereisen, zijn onder meer de dichtheid van het zaaien van cellen, de duur van het experiment en/of de analysepijplijn. IMARIS is een krachtige beeldvormingsanalysetool die wordt gebruikt voor celmigratieanalyse en mogelijkheden heeft die verder gaan dan wat hier wordt beschreven, waaronder het classificeren van alle objecten binnen een geselecteerd 'oppervlak' in sets op basis van verschillende eigenschappen zoals oppervlakte, volume, intensiteit en afstand tot andere gecreëerde oppervlakken. Er zijn veel online bronnen om verdere analysemethoden te bepalen.

De twee hier beschreven methoden hebben niet alleen betrekking op de initiële toestand van weefselintroductie in een korrelig materiaal op een fysiologische manier, maar ook op de daaropvolgende celrespons wanneer deze volledig in het materiaal is ingebed. Zoals bij alle migratietesten, zijn de aanwezige cellen in staat om parallel aan beweging te prolifereren, maar het ontwerp van de beschreven testen verstoort de proliferatie niet en zorgt er dus voor dat er geen onnodige impact op de analyse is. Beide methoden zijn compatibel met eindpuntkleuring naast longitudinale beeldvorming, die PFA-fixatie gebruikt om statistieken zoals cytoskelet, collageenafzetting, proliferatie en meer te detecteren. Het gebruik van de geschetste methoden evolueert naar een nauwkeurigere spatio-temporele weergave van 3D-celmigratie die celinfiltratie gebruikt als een meetbare parameter in tegenstelling tot eerdere methoden 1,6,14,15,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 Phalloidin	ThermoFisher	A22287
Bovine Serum Albumin	VWR International	332
CellTracker Green CMFDS Dye, 1 mg	ThermoFisher	C2925	20 x 50 ug eenheden, 492/517 nm
Centrifuge	ThermoFisher	75016085	ST Plus Series
Clear 96 well plate	MilliPore Sigma	CLS3997-50EA
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	MT-25950CQC	250 mL
Fibroblast Basal Medium	ATCC	PCS-201-030	480 mL, phenol-red-vrij
Fibroblast Growth Kit - Low Serum	ATCC	PCS-201-041	7.5 mM L-glut,5 ng/mL rh FGF basic, 5 ug/mL rh Insulin, 1 ug/mL Hydrocortisone, 50 ug/mL Ascorbinezuur, 2% FBS
FIJI (ImageJ)	NIH		Openbare toegang downloaden
Human Dermal Fibroblasts	ATCC	PCS-201-012	Volwassen humane dermale fibroblasten
ImageXpress Micro Confocal	Molecular Devices		Spinning Disc confocale microscoop met 4x, 10x vergroting
IMARIS	Oxford Instruments		3/4D beeldvisualisatie- en analysesoftware, eigendom
Incubator	ThermoFisher	Finnpipette F2 variabele volume pipetten	HeraCell Vios 160i CO2 Incubator, 165L
M-20 Microplate Swinging Bucket Rotor	ThermoFisher	75003624
Methylcellulose	Fisher Scientific	9004-67-5	Labkwaliteit, poedervorm
Microcentrifuge tube	Fisherbrand	05-408-129	1.5 mL microcentrifugebuizen
Paraformaldehyde (4%)	Alfa Aesar	AAJ19943K2	Voor fixatie
Petri dish	Corning	08-757-100A	Bacteriologische petrischalen met deksel 35 x 10 mm
Pipettes	ThermoFisher	4642080	Finnpipette F2 variabele volume pipetten
Steriel PBS	Gibco	10010-023
Triton-X	Fisher Scientific	327371000