Methodenartikel

Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota

1.3K weergaven

DOI:

10.3791/67629

23 mei 2025

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Recente studies benadrukken de rol van enzymen van de menselijke darmmicrobiota bij het metaboliseren van C-glycosiden. Hier presenteren we een uitgebreide methodologie die analytische chemietechnieken (LC-MS/MS en NMR) integreert met structurele biologische benaderingen om de structurele en enzymatische reactieketens van deze C-glycoside-metaboliserende enzymen systematisch te karakteriseren.

Samenvatting

De darmmicrobiota is naar voren gekomen als een belangrijke modulator van de gezondheid van de gastheer, vooral vanwege het vermogen om voedingsglycosiden te metaboliseren. Hoewel C-glycosiden een superieure chemische stabiliteit en weerstand tegen enzymatische splitsing vertonen in vergelijking met O-glycosiden, kunnen gespecialiseerde darmbacteriën ze selectief metaboliseren, waardoor hun biologische beschikbaarheid verbetert. Sinds de identificatie van microbiële C-glycosidase-enzymen zijn de precieze reactiemechanismen nog steeds onvolledig begrepen, en gestandaardiseerde methodologieën voor het bestuderen van deze processen zijn nog steeds niet goed ingeburgerd. Om deze kloof te dichten, hebben we een geïntegreerde multidisciplinaire aanpak geïntroduceerd die structurele biologie, enzymologie en analytische technieken combineert, waaronder vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR), om deze enzymatische activiteiten systematisch te karakteriseren. Deze alomvattende benadering maakt een nauwkeurige karakterisering van het C-glycosidemetabolisme op moleculair, enzymatisch en metabolisch niveau mogelijk.

Inleiding

Onlangs heeft de menselijke darmmicrobiota veel aandacht gekregen vanwege zijn cruciale rol bij het ondersteunen van de gezondheid van de gastheer 1,2. Deze microbiële gemeenschappen metaboliseren van de gastheer afgeleide verbindingen en produceren biologisch actieve metabolieten 1,2,3. Flavonoïden, een van de meest voorkomende natuurlijke verbindingen in onze dagelijkse voeding, bestaan bijvoorbeeld voornamelijk als O- of C-glycosiden, die zelf slecht worden opgenomen in de....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Eiwitproductie en -zuivering

  1. Bouw van uitdrukkingsvector
    OPMERKING: In deze studie dienen de DgpA-, DgpB- en DgpC-genen van de menselijke darmmicrobiota, PUE-stam , als modelsysteem. De eerste stap omvat het gebruik van expressieplasmiden om de overeenkomstige recombinante eiwitten te produceren.
    1. Verkrijg de DgpA/B/C-genclustersequentie (GenBank: LC422372.1) van NCBI. Synthetiseer vervolgens het DgpA/B/C-DNA en kloon individueel DgpA-, DgpB- en DgpC-genen tot een gemodificeerde pET-28a-vector, die het doeleiwit zal produceren met de N-terminale SUMO en 6×His-tag (His-SUMO-tag)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens de procedures die zijn beschreven in Figuur 1hebben we eerst de DgpA-, DgpB- en DgpC-genen tot expressie gebracht in E. coli BL21(DE3) cellen. Omdat DgpB en DgpC een stabiel enzymcomplex vormen (DgpB/C-complex)10,26,27,34werden cellen die deze twee eiwitten tot expressie brengen gec.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Momenteel blijven de structurele en functionele kenmerken van C-glycosidemetabolisme-enzymen in het veld onduidelijk en ontbreken geschikte onderzoeksmethoden 10,24,26. Door gebruik te maken van de aanzienlijke voordelen van gecombineerde chemie en biotechnologie 40,41,42,43,44,45, stelt de studie een onderzoeksmethodologie voor die gebruik maakt van structurele biologie, enzy.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt gefinancierd met het Startup-fondsprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) tot WM, het noodfonds tegen COVID-19-programma bij BUCM (1000061223476) tot WM, het innovatieteam en het talententeeltprogramma van de nationale administratie van traditionele Chinese geneeskunde (ZYYCXTD-C-202006) tot WM en het onafhankelijke onderzoeksproject voor afgestudeerde studenten bij BUCM(ZJKT2023012) tot HP. We danken alle lableden in het Wenfu Ma-lab voor hun nuttige discussie.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,6-dichloorindoofenol (DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-Mercaptoethanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 × Protein Loading DyeSangon BiotechC508320
AzijnzuurShanghai MACKLINA111247
AcetonitrilThermo Fisher Scientific™?InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR SpectrometerBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifuge 5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus CD spectrometerApplied PhotophysicsChirascan™ 
DaidzeïneShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) competent cellenThermo Fisher Scientific™?InvitrogenEC0114
GenisteïneShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genisteïne-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad SoftwareVersion?Prism 9Bereken de Km en kcat kinetische parameters
HiLoad Superdex 200 pg preparatieve SEC kolommenCytiva28989335
HisTrap HP His tag eiwitzuiveringskolommenCytiva17524802
HiTrap Q FF anionenuitwisselingschromatografiekolomCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc versie 723
HPLC kolom TC-C18(2), 170Å, 5 µm, 4.6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid?IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactoseSigma-Aldrich17814
LC-20AT, hogeprestatievloeistofchromatografieShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
ManganchlorideShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MethanolThermo Fisher Scientific™?InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 Stereo MicroscoopOLYMPUS SZX7
fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixThe Phenix development team1.21.2Phenix is een uitgebreide softwaresuite voor eiwitkristallenstructuurbepaling, die SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) en MR (Molecular Replacement) methoden met Phaser-software omvat.
Preparatief hogeprestatievloeistofchromatograafWaters2545/2998
ProteïnekristallisatiekitHampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarineShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
SchudincubatorShanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd ZQZY-AF8
SnakeSkin™ dialysemembraan, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™?Invitrogen88245
Oplosbare zetmeelSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Superspeed CentrifugeThermo Fisher Scientific™75006590
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate ReaderMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop Micro-Volume Spectrofotometer SpecificatiesMOLECULAR DEVICESQuickDrop
SucroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep ColumnWaters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™?InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Ubiquitine-achtige protease 1Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen12588018
Ultra laag temperatuurvriezerThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Vakuumcentrifugaal concentratorBeijing JM TechnologyCV600
VitexineSigma-Aldrich49513

Referenties

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C glycosidemetabolismedarmmicrobiota enzymenprote nkristallografieLC MS analyseNMR spectroscopieenzymkinetiekchromatografische zuiveringflavonoidemetabolisme

Gerelateerde artikelen