Methodenartikel
* These authors contributed equally
Recente studies benadrukken de rol van enzymen van de menselijke darmmicrobiota bij het metaboliseren van C-glycosiden. Hier presenteren we een uitgebreide methodologie die analytische chemietechnieken (LC-MS/MS en NMR) integreert met structurele biologische benaderingen om de structurele en enzymatische reactieketens van deze C-glycoside-metaboliserende enzymen systematisch te karakteriseren.
De darmmicrobiota is naar voren gekomen als een belangrijke modulator van de gezondheid van de gastheer, vooral vanwege het vermogen om voedingsglycosiden te metaboliseren. Hoewel C-glycosiden een superieure chemische stabiliteit en weerstand tegen enzymatische splitsing vertonen in vergelijking met O-glycosiden, kunnen gespecialiseerde darmbacteriën ze selectief metaboliseren, waardoor hun biologische beschikbaarheid verbetert. Sinds de identificatie van microbiële C-glycosidase-enzymen zijn de precieze reactiemechanismen nog steeds onvolledig begrepen, en gestandaardiseerde methodologieën voor het bestuderen van deze processen zijn nog steeds niet goed ingeburgerd. Om deze kloof te dichten, hebben we een geïntegreerde multidisciplinaire aanpak geïntroduceerd die structurele biologie, enzymologie en analytische technieken combineert, waaronder vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR), om deze enzymatische activiteiten systematisch te karakteriseren. Deze alomvattende benadering maakt een nauwkeurige karakterisering van het C-glycosidemetabolisme op moleculair, enzymatisch en metabolisch niveau mogelijk.
Onlangs heeft de menselijke darmmicrobiota veel aandacht gekregen vanwege zijn cruciale rol bij het ondersteunen van de gezondheid van de gastheer 1,2. Deze microbiële gemeenschappen metaboliseren van de gastheer afgeleide verbindingen en produceren biologisch actieve metabolieten 1,2,3. Flavonoïden, een van de meest voorkomende natuurlijke verbindingen in onze dagelijkse voeding, bestaan bijvoorbeeld voornamelijk als O- of C-glycosiden, die zelf slecht worden opgenomen in de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. Eiwitproductie en -zuivering
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Volgens de procedures die zijn beschreven in Figuur 1hebben we eerst de DgpA-, DgpB- en DgpC-genen tot expressie gebracht in E. coli BL21(DE3) cellen. Omdat DgpB en DgpC een stabiel enzymcomplex vormen (DgpB/C-complex)10,26,27,34werden cellen die deze twee eiwitten tot expressie brengen gec.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Momenteel blijven de structurele en functionele kenmerken van C-glycosidemetabolisme-enzymen in het veld onduidelijk en ontbreken geschikte onderzoeksmethoden 10,24,26. Door gebruik te maken van de aanzienlijke voordelen van gecombineerde chemie en biotechnologie 40,41,42,43,44,45, stelt de studie een onderzoeksmethodologie voor die gebruik maakt van structurele biologie, enzy.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.
Deze studie wordt gefinancierd met het Startup-fondsprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) tot WM, het noodfonds tegen COVID-19-programma bij BUCM (1000061223476) tot WM, het innovatieteam en het talententeeltprogramma van de nationale administratie van traditionele Chinese geneeskunde (ZYYCXTD-C-202006) tot WM en het onafhankelijke onderzoeksproject voor afgestudeerde studenten bij BUCM(ZJKT2023012) tot HP. We danken alle lableden in het Wenfu Ma-lab voor hun nuttige discussie.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 2,6-dichloorindoofenol (DCPIP) | Solarbio Science and Technology | D6350 | |
| 2-Mercaptoethanol(β-ME) | Sigma-Aldrich | 08168 | |
| 5 × Protein Loading Dye | Sangon Biotech | C508320 | |
| Azijnzuur | Shanghai MACKLIN | A111247 | |
| Acetonitril | Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen | A12147 | |
| Bruker Avance III HD 700 MHz NMR Spectrometer | Bruker | AVANCE III HD 700MHz | |
| Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHz | Bruker | AVANCE III 400 MHz | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 022620601 | |
| Chirascan™ plus CD spectrometer | Applied Photophysics | Chirascan™ | |
| Daidzeïne | Shanghai Yuanye Bio-Technology | B20227 | |
| Daidzin | Shanghai Yuanye Bio-Technology | B20226 | |
| Dithiothreitol(DTT) | Solarbio Science and Technology | D8220 | |
| E. coli BL21 (DE3) competent cellen | Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen | EC0114 | |
| Genisteïne | Shanghai Yuanye Bio-Technology | S31565 | |
| Genisteïne-8-C-glucoside | Shanghai Yuanye Bio-Technology | BP2095 | |
| Genistin | Shanghai Yuanye Bio-Technology | S31591 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad Software | Version?Prism 9 | Bereken de Km en kcat kinetische parameters |
| HiLoad Superdex 200 pg preparatieve SEC kolommen | Cytiva | 28989335 | |
| HisTrap HP His tag eiwitzuiveringskolommen | Cytiva | 17524802 | |
| HiTrap Q FF anionenuitwisselingschromatografiekolom | Cytiva | 17515601 | |
| HKL-3000 | HKL research Inc | versie 723 | |
| HPLC kolom TC-C18(2), 170Å, 5 µm, 4.6 x 250 mm | Agilent Technologies | 518925-902 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid?IPTG) | Sigma-Aldrich | PHG0010 | |
| Lactose | Sigma-Aldrich | 17814 | |
| LC-20AT, hogeprestatievloeistofchromatografie | Shimadzu | LC20AT | |
| Maltose | Sigma-Aldrich | 47288 | |
| Maltotriose | Sigma-Aldrich | 443713 | |
| Manganchloride | Shanghai Yuanye Bio-Technology | S31112 | |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen | M23142 | |
| NAD+ | Solarbio Science and Technology | N8110 | |
| Olympus SZX12 Stereo Microscoop | OLYMPUS | SZX7 | |
| fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Phenix | The Phenix development team | 1.21.2 | Phenix is een uitgebreide softwaresuite voor eiwitkristallenstructuurbepaling, die SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) en MR (Molecular Replacement) methoden met Phaser-software omvat. |
| Preparatief hogeprestatievloeistofchromatograaf | Waters | 2545/2998 | |
| Proteïnekristallisatiekit | Hampton Research | HR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098 | |
| Puerarine | Shanghai Yuanye Bio-Technology | B20446 | |
| Schudincubator | Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd | ZQZY-AF8 | |
| SnakeSkin™ dialysemembraan, 10 kDa MWCO, 35 mm | Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen | 88245 | |
| Oplosbare zetmeel | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Sorvall LYNX 6000 Superspeed Centrifuge | Thermo Fisher Scientific™ | 75006590 | |
| SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader | MOLECULAR DEVICES | SpectraMax i3x | |
| SpectraMax QuickDrop Micro-Volume Spectrofotometer Specificaties | MOLECULAR DEVICES | QuickDrop | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| SunFire C18 OBD Prep Column | Waters | 186002741 | |
| Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVE | Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| Ubiquitine-achtige protease 1 | Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen | 12588018 | |
| Ultra laag temperatuurvriezer | Thermo Fisher Scientific | 905GP-ULTS | |
| Vakuumcentrifugaal concentrator | Beijing JM Technology | CV600 | |
| Vitexine | Sigma-Aldrich | 49513 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken
Toestemming aanvragen