Methodenartikel

Structurele biologie en analytische chemie benaderingen voor het karakteriseren van C-glycoside metabole enzymen in de menselijke darmmicrobiota

1.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67629

⸱

23 mei 2025

 ,  ,  ,  , 
1The School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Recente studies benadrukken de rol van enzymen van de menselijke darmmicrobiota bij het metaboliseren van C-glycosiden. Hier presenteren we een uitgebreide methodologie die analytische chemietechnieken (LC-MS/MS en NMR) integreert met structurele biologische benaderingen om de structurele en enzymatische reactieketens van deze C-glycoside-metaboliserende enzymen systematisch te karakteriseren.

Samenvatting

De darmmicrobiota is naar voren gekomen als een belangrijke modulator van de gezondheid van de gastheer, vooral vanwege het vermogen om voedingsglycosiden te metaboliseren. Hoewel C-glycosiden een superieure chemische stabiliteit en weerstand tegen enzymatische splitsing vertonen in vergelijking met O-glycosiden, kunnen gespecialiseerde darmbacteriën ze selectief metaboliseren, waardoor hun biologische beschikbaarheid verbetert. Sinds de identificatie van microbiële C-glycosidase-enzymen zijn de precieze reactiemechanismen nog steeds onvolledig begrepen, en gestandaardiseerde methodologieën voor het bestuderen van deze processen zijn nog steeds niet goed ingeburgerd. Om deze kloof te dichten, hebben we een geïntegreerde multidisciplinaire aanpak geïntroduceerd die structurele biologie, enzymologie en analytische technieken combineert, waaronder vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) en nucleaire magnetische resonantie (NMR), om deze enzymatische activiteiten systematisch te karakteriseren. Deze alomvattende benadering maakt een nauwkeurige karakterisering van het C-glycosidemetabolisme op moleculair, enzymatisch en metabolisch niveau mogelijk.

Inleiding

Onlangs heeft de menselijke darmmicrobiota veel aandacht gekregen vanwege zijn cruciale rol bij het ondersteunen van de gezondheid van de gastheer 1,2. Deze microbiële gemeenschappen metaboliseren van de gastheer afgeleide verbindingen en produceren biologisch actieve metabolieten 1,2,3. Flavonoïden, een van de meest voorkomende natuurlijke verbindingen in onze dagelijkse voeding, bestaan bijvoorbeeld voornamelijk als O- of C-glycosiden, die zelf slecht worden opgenomen in de menselijke darm4. Darmmicrobiota kan deze glycosiden echter omzetten in meer bioactieve derivaten, zoals secundaire glycosiden of aglyconen, waardoor hun oplosbaarheid wordt verminderd en hun absorptie wordt verbeterd, waardoor hun bioactiviteiten worden verbeterd in vergelijking met hun oorspronkelijke vormen 5,6.

Historisch gezien zijn de hydrolysemechanismen van O-glycosiden uitgebreid bestudeerd 7,8. De C-glycosiden, gekenmerkt door hun C-C glycosidische bindingen, vertonen een grotere chemische stabiliteit en weerstand tegen splitsing 9,10. Desondanks hebben bepaalde darmbacteriën het vermogen ontwikkeld om C-glycosiden te deglycosyleren 11,12. In 1988 toonden Hattori et al. voor het eerst aan dat sommige darmbacteriën glycosylgroepen uit C-glycosiden13 konden verwijderen. Latere studies isoleerden de eerste bacteriestam die in staat was tot deze activiteit, waardoor verder onderzoek naar de splitsingsmechanismen van C-glycoside mogelijk werd14. Tot op heden is echter slechts een beperkt aantal intestinale bacteriestammen en C-glycoside-metaboliserende enzymen geïdentificeerd en gekarakteriseerd 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Recente studies hebben aangetoond dat de deglycosyleringspuerarine-enzymen (daidzeïne-8-C-glucoside) (DgpA/B/C) in de PUE-stam in staat zijn om puerarine te splitsen in daidzeïne en glucose via een proces in twee stappen: DgpA, een oxidoreductase van de Gfo/Idh/MocA-familie, oxideert puerarin tot 3''-oxo-puerarine, dat vervolgens een β-eliminatiereactie ondergaat die wordt gemedieerd door het DgpB/C-complex om de aglycon en glucose10 te produceren, 26. okt. Desalniettemin blijven de structurele en functionele kenmerken van C-glycoside-metaboliserende enzymen, met name het DgpA/B/C-systeem, onvolledig begrepen, en is er behoefte aan meer geavanceerde methodologieën, met name de integratie van biologische en chemische strategieën, om het onderzoek op dit gebied vooruit te helpen24.

Om deze kloof te dichten, gebruiken we geïntegreerde multidisciplinaire benaderingen om de metabolische reactie van de menselijke darmmicrobiota DgpA/B/C te onderzoeken. In deze reactie katalyseert DgpA de glycosyloxidatie van C-glycosiden, vervolgens vormen DgpB en DgpC een DgpB/C-complex dat specifiek de geoxideerde C-glycosideproducten splitst 10,26,27. We hebben eerst recombinante expressie en zuivering van DgpA en DgpB/C afzonderlijk uitgevoerd. De gezuiverde DgpA- en DgpB/C-eiwitten werden vervolgens gekristalliseerd en hun driedimensionale structuren werden bepaald door middel van röntgenkristallografie. Ten slotte hebben we de C-glycoside-splitsingsfunctie gereconstrueerd met behulp van het volledige DgpA/B/C-enzymsysteem, met uitgebreide metabole productanalyse uitgevoerd via gekoppelde LC-MS/MS- en NMR-spectroscopie27. Op basis van deze benaderingen hebben we het C-glycosidemetabolisme bestudeerd dat wordt gekatalyseerd door het DgpA/B/C-enzymsysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Eiwitproductie en -zuivering

  1. Bouw van uitdrukkingsvector
    OPMERKING: In deze studie dienen de DgpA-, DgpB- en DgpC-genen van de menselijke darmmicrobiota, PUE-stam , als modelsysteem. De eerste stap omvat het gebruik van expressieplasmiden om de overeenkomstige recombinante eiwitten te produceren.
    1. Verkrijg de DgpA/B/C-genclustersequentie (GenBank: LC422372.1) van NCBI. Synthetiseer vervolgens het DgpA/B/C-DNA en kloon individueel DgpA-, DgpB- en DgpC-genen tot een gemodificeerde pET-28a-vector, die het doeleiwit zal produceren met de N-terminale SUMO en 6×His-tag (His-SUMO-tag)28.
    2. Transformeer elk van de DgpA-, DgpB- of DgpC-plasmiden in E. coli BL21 (DE3) competente cellen. Kweek vervolgens bacteriën in LB-medium met 50 μg/ml kanamycine bij 37 °C.
    3. Voeg 0,2 mM IPTG toe aan het medium wanneer de bacteriedichtheid (OD600) 0,6 bereikt. Kweek de bacteriën gedurende 16 uur bij 16 °C.
    4. Centrifugeer elk van de DgpA-, DgpB- en DgpC-bacteriecultuur die bacteriecultuur tot expressie brengt bij 4.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de celpellet in 20 ml buffer A (tabel 1) voor elke 1 l bacteriecultuur.
  2. Zuivering van eiwit
    OPMERKING: Zeer zuivere, voldoende hoeveelheden recombinante enzymen zijn essentieel voor functionele karakterisering en structurele biologiestudies. DgpB en DgpC vormen een stabiel eiwitcomplex (vormen spontaan het DgpB/C-complex tijdens de lysisprocedure) voor functionaliteit10,26. Vervolgens wordt de zuivering van het DgpA-eiwit en het DgpB/C-complex uitgevoerd.
    1. Voeg 1 mM PMSF toe aan de bacteriële resuspensie. Meng de DgpB- en DgpC-bacteriesuspensie uit stap 1.1.4 door elkaar en lyseer vervolgens de DgpA-bacteriesuspensie of het mengsel van DgpB en DgpC (tot een functioneel DgpB/C-complex) met behulp van een ultrasone celverstoorder.
    2. Centrifugeer het bacterielysaat bij 48.000 x g gedurende 40 minuten bij 4 °C. Bewaar het bovenstaande dat het eiwit bevat en gooi de bacteriekorrel weg.
    3. Zuiver DgpA of DgpB/C-complex uit het bovenstaande met behulp van een nikkelaffiniteitschromatografie (Ni-NTA)-kolom. Elueer de gebonden eiwitten door een imidazoolconcentratiegradiënt van 0 - 50% toe te passen met Buffer A en Buffer B (Tabel 1) in de ÄKTA-luchtreiniger.
    4. Neem 10 μL geëlueerde monsters en meng deze met 2 μL van 5 × eiwitkleurstof, voer vervolgens SDS-PAGE-elektroforese uit bij 220 V gedurende 45 minuten met behulp van een verticaal elektroforesesysteem, gevolgd door Coomassie Blue-kleuring om eiwitbanden te visualiseren. Verzamel fracties die DgpA of het DgpB/C-complex bevatten op basis van SDS-PAGE-analyse voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: De DgpA (44 kDa) met een His-SUMO-tag (17 kDa) band migreert met ongeveer 61 kDa (Figuur 2D), terwijl DgpC (33 kDa) met een His-SUMO-tag (17 kDa) ongeveer 50 kDa migreert, en DgpB (15 kDa) met een His-SUMO-tag (17 kDa) migreert rond de 33 kDa (Figuur 2J).
    5. Dialyseer de DgpA- of DgpB/C-complexmonsters uit stap 1.2.3 met behulp van een dialysemembraan met een molecuulgewicht van 10 kDa tegen Buffer C om imidazool te verwijderen, en met ubiquitine-achtig protease 1 (ULP1; Tabel van materialen) enzym om de His-SUMO-tag29 te verwijderen.
    6. Laad het gedialyseerde eiwitmonster in buffer C (tabel 1) door de ionenuitwisselingschromatografiekolom (Q-kolom). Elueer vervolgens het gebonden eiwit uit de kolom met behulp van een natriumchlorideconcentratiegradiënt van 100 mM tot 600 mM, bereid met Buffer C en Buffer D (Tabel 1) in de ÄKTA-luchtreiniger.
    7. Voer de SDS-PAGE-analyse uit van DgpA en het DgpB/C-complex geëlueerd uit de Q-kolom als stap 1.2.3, waarbij de molecuulgewichten worden genoteerd: His-SUMO-tag (17 kDa), DgpA (44 kDa), oligomere banden van DgpA (boven 95 kDa) (Figuur 2E), DgpB (15 kDa), DgpC (33 kDa), oligomere banden van DgpB en DgpC (tussen 53 kDa en 95 kDa) (Figuur 2K).
    8. Zuiver het eiwit met behulp van een grootte-uitsluitingskolom (SEC) met buffer E (tabel 1). Voer een SDS-PAGE-analyse uit met behulp van eiwitten uit de elutiefractie, gevolgd door Coomassie Blue-kleuring om eiwitbanden te visualiseren. Verzamel de fracties die het doeleiwit DgpA of DgpB/C-complex bevatten na analyse met SDS-PAGE.
      OPMERKING: De DgpA-band wordt gezien bij ongeveer 44 kDa met een oligomeriseerde DgpA-band boven 95 kDa (Figuur 2F), terwijl DgpC rond de 33 kDa ligt en DgpB rond de 15 kDa met oligomeriseerde DgpB en DgpC (tussen 53 kDa en 95 kDa) (Figuur 2L).
    9. Meet de eiwitconcentratie van DgpA of DgpB/C-complex met behulp van een nanodruppel bij 280 nm. Concentreer vervolgens het DgpA- of DgpB/C-complex tot ongeveer 20 mg/ml met ultrafiltratiebuizen, verdeel ze en vries ze snel in met vloeibare stikstof. Bewaar DgpA of DgpB/C complex bij -80 °C voor toekomstig gebruik.
  3. Verzameling van gegevens over circulair dichroïsme (CD) spectrum
    OPMERKING: Aangezien de door DgpA gekatalyseerde glycosyloxidatie dient als de cruciale initiatiestap in de metabole route, werd CD-spectroscopie specifiek gebruikt om zowel de juiste vouwtoestand als de secundaire structurele integriteit van DgpA te verifiëren. Deze structurele parameters zijn van cruciaal belang voor zowel enzymatische activiteit als succesvolle eiwitkristallisatie.
    1. Verdun het DgpA-eiwit tot 0,2 mg/ml met 1 x PBS-buffer (pH 7,4) (tabel 1).
    2. Laad 1x PBS-buffer (pH 7,4) in een kwartscuvet en registreer het basislijn CD-spectrum over 200 - 260 nm met behulp van een CD-spectrometer om secundaire structuur- en vouwtoestandsverschillen27 gevoelig te detecteren.
    3. Vervang de buffercuvet door eiwitmonsters uit 1.3.1, neem het CD-spectrum op over 200 - 260 nm en trek de bufferbasislijn af om het CD-spectrum voor het eiwitmonster te krijgen.
    4. Verzamel drie scans voor nauwkeurigheid en analyseer de gegevens op secundaire structuurkenmerken en eiwitvouwtoestand (Figuur 3G, 3H).

2. Eiwitkristallografie en structuurbepaling

OPMERKING: Na bevestiging dat DgpA de juiste vouwing en structurele integriteit behield, werden structurele biologische benaderingen gebruikt om de driedimensionale structuren van beide DgpA te bepalen. Aangezien de katalytische competentie van het DgpB/C-complex biochemisch was bevestigd door middel van eerdere functionele assays 10,26,27, werd de spectrale verificatiestap van de CD weggelaten.

  1. Groei en optimalisatie van eiwitkristallen
    1. Meng 0,5 μL gezuiverd DgpA (20 mg/ml) of DgpB/C-complex (20 mg/ml) met een gelijk volume (0,5 μL) reservoiroplossing uit kristallisatiekits op kristalplaten met 48 putjes in een zittende druppelmethode30. Breng de kristalplaten over naar 16 °C voor kristalgroei.
      OPMERKING: Observeer deze zitdruppels met een microscoop om de omstandigheden te identificeren (inclusief eiwitconcentratie en neerslagstoffen, zoals PEG 3350, magnesiumformiaat, enz.) voor DgpA of DgpB/C complexe kristalgroei.
    2. Voer kristallisatieoptimalisatie uit voor zowel DgpA als het DgpB/C-complex met behulp van de hangende druppeldampdiffusiemethode30.
    3. Begin voor DgpA met de aandoening die is geïdentificeerd in stap 2.1.1 (20 mM magnesiumformiaat, 20% PEG3350) en pas een orthogonale optimalisatiebenadering toe door zes PEG3350 concentratiegradiënten (17%, 18%, 19%, 20%, 21% en 22%) te testen tegen vier concentratiegradiënten van magnesiumformiaat (16 mM, 18 mM, 20 mM en 22 mM)30.
    4. Bereid kristallisatiedruppels voor door 0,8 μL DgpA-eiwitoplossing (10 of 20 mg/ml) te mengen met 0,8 μl reservoiroplossing op gesilaniseerde glazen dekglaasjes. Keer vervolgens de dekglaasjes om over kristallisatieplaten met 24 putjes en incubeer bij 16 °C voor kristalgroei.
    5. Volg voor de optimalisatie van het DgpB/C-complex dezelfde aanpak: meng 0,8 μL eiwitcomplex (10 of 20 mg/ml) met 0,8 μL reservoiroplossing met magnesiumacetaat (16, 18, 20 of 22 mM) en PEG 8000 (8%, 9%, 10%, 11%, 12% of 13%). Hang op dezelfde manier druppels op gesilaniseerde dekglaasjes over platen met 24 putjes en incubeer bij 16°C.
    6. Laat de eiwitkristallen van het DgpA- en DgpB/C-complex tot volle grootte groeien totdat ze niet meer groeien, en breng de kristallen vervolgens gedurende 30 minuten over naar een weekoplossing met reservoirbuffer en 5 mM van de substraatverbindingen (glucose en puerarine) van het DgpA- en DgpB/C-complex.
    7. Breng de kristallen, waaronder DgpA (met glucose of substraatvrij) en DgpB/C-complex (substraatvrij), over naar een cryoprotectieve oplossing die de inweekbufferconditie bevat, aangevuld met 25% glycerol en bewaar ze onmiddellijk in vloeibare stikstof voor gegevensverzameling.
      OPMERKING: Hoewel zowel DgpA als de DgpB/C-complexkristallen doordrenkt waren met substraten (glucose en puerarine), werd alleen glucose met succes opgenomen in het katalytische centrum van DgpA. Bijgevolg werden drie verschillende kristalvormen verkregen voor structurele analyse: DgpA met glucose (Figuur 3E); substraatvrij DgpA (Figuur 3B-C); en substraatvrij DgpB/C-complex (Figuur 3D). De cryoprotectieve oplossing beschermt eiwitkristallen door ijsvorming tijdens flash-koeling in vloeibare stikstof te voorkomen, waardoor hun structurele integriteit behouden blijft en door straling veroorzaakte schade tot een minimum wordt beperkt. De oplossing wordt meestal geformuleerd met behulp van de moedervloeistof als basis en wordt aangevuld met geoptimaliseerde concentraties cryoprotectanten (bijv. glycerol of ethyleenglycol).
  2. Gegevensverzameling en structuurbepaling
    1. Verzamel de röntgendiffractiegegevens van het kristal voor DgpA met glucose of in substraatvrije vorm, en DgpB/C-complex in substraatvrije vorm bij de Shanghai Synchrotron Radiation Facility (SSRF) van de Shanghai National Protein Science Facility (NFPS) met een invallende golflengte van 0,978 Å.
    2. Verwerk de drie sets röntgendiffractiegegevens, waaronder DgpA en DgpB/C-complex, met behulp van kristallografische gegevensverwerkingssoftware31. Laad eerst de onbewerkte gegevens en voer vervolgens achtereenvolgens de index-, integratie- en schaalfuncties uit door op de overeenkomstige knoppen in de software te klikken. Genereer een verwerkt uitvoerbestand (output.sca) dat geschikt is voor het bepalen van de structuur daarna.
    3. Bepaal de structuren van DgpA met glucose of in substraatvrije vorm (Figuur 3B-C, 3E) en DgpB/C-complex in substraatvrij (Figuur 3D) met behulp van de moleculaire vervangingsmethode (Materiaaltabel). En verfijn vervolgens de structuren en elektronenkaarten door relevante liganden op te nemen (zoals glucose, Mn2+, H2O, enz.)31. okt.

3. Monitoring van reactieactiviteit en bepaling van kinetische parameters

OPMERKING: Het DgpA/B/C-systeem bemiddelt C-glycosidetransformaties via een gedefinieerde cascade in twee stappen: DgpA initieert de katalyse door het suikerdeel te oxideren, waardoor een tussenproduct wordt gegenereerd dat het DgpB/C-complex vervolgens splitst of isomeriseert 10,26,27. In deze studie verwijst DgpA/B/C naar de enzymen die verantwoordelijk zijn voor deze reactiecascade, terwijl moet worden opgemerkt dat er geen directe interactie optreedt tussen DgpA en het DgpB/C-complex. Deze gekoppelde activiteit kan rigoureus worden gekwantificeerd met behulp van drie complementaire benaderingen: HPLC-productanalyse, DCPIP-gekoppelde spectrofotometrische assays die de elektronenoverdracht monitoren, of gedetailleerde kinetische karakterisering van de reactieparameters27,32. In het bijzonder werden de C-glycoside-splitsingsproducten (daidzeïne) gegenereerd door DgpA/B/C-katalyse geanalyseerd door HPLC (UV-detectie bij 265 nm). De productvorming werd gekwantificeerd aan de hand van een standaardkalibratiecurve (de methode voor het vaststellen van de standaardcurve wordt in detail beschreven in de noot onder stap 3.3.2.), en kinetische parameters werden bepaald door de productvormingssnelheden aan te passen aan het Michaelis-Menten-model door middel van niet-lineaire regressieanalyse27,32. De remmingstest die het effect van glucose op de splitsing van puerarin C-glycosidische binding meet, leverde ondersteunend bewijs dat sacchariden kunnen dienen als substraten voor DgpA. Vervolgens volgt de DCPIP-test de suikeroxidatiereacties door de reductie van blauwgekleurd 2,6-dichloorfenolidolenol (DCPIP) tot kleurloos leuco-DCPIP te meten, aangezien het elektronen van geoxideerde suikers33 accepteert, waardoor de katalytische activiteit van DgpA wordt weerspiegeld.

  1. Monitoring van de DgpA/B/C-activiteit door HPLC
    1. Voer de DgpA/B/C-gekatalyseerde C-glycosidesplitsings- of isomerisatiereactie uit in 500 μL Buffer F (Tabel 1) met 20 μM DgpA en DgpB/C-complex (vanaf stap 1.2.7), en 0,1 mM vanwel: puerarin of genisteïne-8-C-glucoside voor splitsingsreacties, of daidzin of genistin voor isomerisatiereacties27. Voer de reacties gedurende 8 uur uit bij 37 °C en beëindig ze door 1,5 ml methanol aan het reactiemengsel toe te voegen.
    2. Centrifugeer de reactieoplossing bij 16.000 g × gedurende 15 minuten om het eiwitneerslag te verwijderen dat is gevormd als gevolg van door methanol geïnduceerde enzymdenaturatie. Filtreer het bovenstaande met behulp van een filtermembraan van 0,22 μm.
    3. Voer HPLC-analyse uit met gradiënt-elutie, met een debiet van 1 ml/min met een injectievolume van 10 μl en een detectiegolflengte van UV 265 nm.
      OPMERKING: De mobiele fasen waren acetonitril (mobiele fase A) en 0,1% waterig azijnzuur (mobiele fase B), met gradiënt-elutie. De gradiënt van de mobiele fase-elutie is als volgt: 5%-20% A bij 0-5 min, 20%-45% A bij 5-15 min, 45%-52% A bij 15-18 min, 52%-55% A bij 18-19 min, 55%-5% A bij 19-21 min en 5% A bij 21-23 min. Het DgpA/B/C-enzymsysteem vertoont duidelijk verschillende katalytische efficiënties ten opzichte van substraten zoals daidzin en genistine, wat resulteert in substantiële variaties in hun respectieve productvormingssnelheden. Om de kinetiek van de substraatconversie en de dynamiek van productaccumulatie kwantitatief te beoordelen, werd een uitgebreide tijdverloopanalyse uitgevoerd met behulp van HPLC met intervallen van 0, 2, 4, 6, 12, 16, 20, 24, 36 en 48 uur.
  2. Monitoring van de DgpA-activiteit met 2,6-dichloorfenol-indofenol (DCPIP)-test
    OPMERKING: De DCPIP-test bewaakt de suikeroxidatie door de reductie van blauwe DCPIP tot kleurloze leuco-DCPIP te meten, aangezien deze elektronen van geoxideerde suikers accepteert33. Hier werd de DCIPIP-reportertest gebruikt om de DgpA-oxidatieactiviteit ten opzichte van verschillende geglycosyleerde verbindingen, monosachariden, disachariden of polysacchariden vast te leggen. Wildtype DgpA en zijn suikerbindende defecte mutanten, waaronder D182A, Δ (308-316) en Δ (311-316) werden gebruikt27.
    1. Incubeer 0,8 mM DCPIP, 50 μM eiwit inclusief wildtype DgpA en zijn drie suikerbindende defecte mutanten (DgpA D182A, DgpA Δ (308-316) of DgpA Δ (311-316)), met 10 mM substraten waaronder puerarin, vitexine, genistin, oplosbaar zetmeel, maltotriose, lactose, sucrose, glucose of maltose in 1x PBS-buffer (pH 7,4).
    2. Registreer na 20 uur reactie de absorptieverandering van DCPIP bij 600 nm met behulp van een microplaatlezer33.
  3. Bepaling van de remmingssnelheid van glucose op de C-glycosidische bindingssplitsingsreactie van puerarin
    OPMERKING: DgpA behoort tot de enzymfamilie van suikeroxidoreductase, die in staat is het suikerdeel van C-glycosiden te oxideren. Figuur 3E laat zien dat glucose gebonden is aan het DgpA-katalytisch centrum, en het protocol om de DgpA-structuur te bepalen wordt gedetailleerd beschreven in stap 2.2.3. Om de competitieve binding van DgpA tussen glucose en het C-glycoside puerair te onderzoeken, werden de volgende experimenten uitgevoerd.
    1. Voer de reactie uit in 1 × PBS-buffer (pH 7,4). Voeg verschillende concentraties glucose (1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM, 80 mM en 100 mM) toe aan het C-glycoside (puerarin) splitsingsreactiesysteem zoals beschreven in stap 3.1. Voer de reactie uit bij 37 °C gedurende 12 uur.
    2. Voer een kwantitatieve analyse van het product (daidzeïne) uit met behulp van de HPLC-kalibratiecurve voor de referentieverbinding (standaard daidzeïne). Bereken de inhibitiesnelheid door eerst het verschil in productopbrengst te bepalen tussen reacties met variërende glucoseconcentraties en ongeremde C-glycoside-splitsingsreacties (zonder glucose), en dit verschil vervolgens te delen door de productopbrengst van de ongeremde reactie.
      OPMERKING: Om een kalibratiecurve voor kwantitatieve HPLC-analyse te genereren, bereidt u een seriële verdunning voor van een referentiestandaard (bijv. puerarin of daidzeïne) over een concentratiebereik (bijv. 0.1-1 mM, in stappen van 0.1 mM). Analyseer elke concentratie door HPLC, registreer de piekgebieden en zet ze uit tegen de overeenkomstige standaardconcentraties. Voer een lineaire regressieanalyse uit (y = mx + b, waarbij y = piekgebied, x = concentratie) om de standaardcurve vast te stellen. De regressievergelijking kan vervolgens worden gebruikt om onbekende monsterconcentraties uit hun gemeten piekgebieden te interpoleren.
  4. Bepaling van kinetische parameters
    OPMERKING: De kinetische parameters worden algemeen erkend als kritische gouden standaarden voor het kwantitatief evalueren van enzymatische katalytische efficiëntie. Om DgpA/B/C-gekatalyseerde reacties kwantitatief te beoordelen, werden de kinetische parameters voor de C-glycoside puerarine-splitsingsreacties gekatalyseerd door DgpA/B/C bepaald.
    1. Bereid substraat C-glycoside (puerarin) concentratiegradiënten voor (variërend van 0,01 tot 4 mM in 2-voudige stappen) voor de DgpA/B/C-gekatalyseerde C-glycoside-splitsingsreactie.
    2. Voer de reactie gedurende 8 uur uit bij 37 °C volgens de in stap 3.1 beschreven methode. Voer een kwantitatieve analyse van het product (daidzeïne) uit met behulp van de HPLC-kalibratiecurve van standaard daidzeïne. Bereken vervolgens de reactiesnelheid (productvormingssnelheid) door de gekwantificeerde hoeveelheid te delen door de reactietijd.
    3. Bepaal de kinetische parameters Km en kcat door de berekende reactiesnelheid en substraatconcentratie aan te passen aan het Michaelis-Menten-model met behulp van statistische software (Materiaaltabel).

4. Bereiding en opsporing van het reactietussenproduct

OPMERKING: Naast de C-glycoside-splitsingsactiviteit katalyseert DgpA/B/C ook de isomerisatie van O-glycosiden tot C-glycosiden. Daarom, wanneer O-glycosiden worden gebruikt als substraten voor DgpA/B/C, zullen de tussenproducten worden geproduceerd als de geïsomeriseerde C-glycosiden. Om het tussenproduct (puerarin) te karakteriseren, werd de tussenliggende verbinding gezuiverd en vervolgens geanalyseerd met behulp van analytische chemische hulpmiddelen, waaronder LC-MS/MS en NMR-spectroscopie.

  1. Bereiding van het reactietussenproduct in DgpA/B/C-gekatalyseerde C-glycoside isomerisatiereactie 27
    1. Bereid de DgpA/B/C-gekatalyseerde O- naar C-glycoside-isomerisatiereactie met 0,2 mM O-glycoside (daidzin) als substraten en 20 μM DgpA- en DgpB/C-complex in een reactievolume van 90 ml, volgens het protocol beschreven in de bovenstaande stap 3.1.
    2. Zuiver het tussenproduct C-glycoside (puerarin) met behulp van een preparatieve HPLC bij de gradiënt-elutiestrategie (NOTE).
      OPMERKING: De mobiele fasen waren acetonitril (mobiele fase A) en 0,1% waterig azijnzuur (mobiele fase B), met gradiënt-elutie. De gradiënt van de mobiele fase-elutie is als volgt: 5%-20% A bij 0-5 min, 20%-45% A bij 5-15 min, 45%-52% A bij 15-18 min, 52%-55% A bij 18-19 min, 55%-5% A bij 19-21 min en 5% A bij 21-23 min.
    3. Bereken de concentratie van het gezuiverde tussenproduct met behulp van de standaard kalibratie HPLC-curve in stap 3.3.2, neem ongeveer 6 mg puerarin in het 90 ml reactiesysteem in stap 4.1.1 en droog vervolgens de gezuiverde tussenproducten met een vacuümcentrifugaalconcentrator voor toekomstig gebruik.
  2. Karakterisering van reactietussenproduct met LC-MS/MS
    1. Verzamel de gedroogde tussenproducten uit stap 4.1.3. Weeg 100 μg van de van daidzin afgeleide tussenproducten af en los het vervolgens op in 2 ml methanol om een uiteindelijke concentratie van 50 μg/ml te bereiken. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 13.500 x g en verzamel het bovenstaande voor LC-MS/MS-analyse.
    2. Gebruik hetzelfde HPLC-gradiënt-elutieprogramma in stap 4.1.2 voor LC-MS/MS-analyse met een injectievolume van 5 μl.
  3. Karakterisering van reactietussenproduct met NMR
    1. Los 4 mg van de gezuiverde tussenproducten van de daidzin-reactie op in 340 μl dimethylsulfoxide-d 6 voor 1H en 13C NMR-spectroscopie. Stel de instrumentparameters als volgt in: temperatuur op 298 K, vulplaatje 3 keer, pulsbreedte 18 μs, relaxatievertraging 1,5 s, 48 scans, met andere parameters op standaardinstellingen27.
    2. Verzamel de NMR 1H en 13C spectra met behulp van een 600 MHz NMR instrument.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens de procedures die zijn beschreven in Figuur 1hebben we eerst de DgpA-, DgpB- en DgpC-genen tot expressie gebracht in E. coli BL21(DE3) cellen. Omdat DgpB en DgpC een stabiel enzymcomplex vormen (DgpB/C-complex)10,26,27,34werden cellen die deze twee eiwitten tot expressie brengen gec...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Momenteel blijven de structurele en functionele kenmerken van C-glycosidemetabolisme-enzymen in het veld onduidelijk en ontbreken geschikte onderzoeksmethoden 10,24,26. Door gebruik te maken van de aanzienlijke voordelen van gecombineerde chemie en biotechnologie 40,41,42,43,44,45, stelt de studie een onderzoeksmethodologie voor die gebruik maakt van structurele biologie, enzy...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt gefinancierd met het Startup-fondsprogramma van de Beijing University of Chinese Medicine (BUCM) (90011451310011) tot WM, het noodfonds tegen COVID-19-programma bij BUCM (1000061223476) tot WM, het innovatieteam en het talententeeltprogramma van de nationale administratie van traditionele Chinese geneeskunde (ZYYCXTD-C-202006) tot WM en het onafhankelijke onderzoeksproject voor afgestudeerde studenten bij BUCM(ZJKT2023012) tot HP. We danken alle lableden in het Wenfu Ma-lab voor hun nuttige discussie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2,6-dichloorindoofenol (DCPIP)Solarbio Science and TechnologyD6350
2-Mercaptoethanol(β-ME)Sigma-Aldrich08168
  5 × Protein Loading DyeSangon BiotechC508320
AzijnzuurShanghai MACKLINA111247
AcetonitrilThermo Fisher Scientific™?InvitrogenA12147
Bruker Avance III HD 700 MHz NMR SpectrometerBrukerAVANCE III HD 700MHz
Bruker Ultrashield 400 Plus 400MHzBrukerAVANCE III 400 MHz
Centrifuge 5424REppendorf022620601
Chirascan™ plus CD spectrometerApplied PhotophysicsChirascan™ 
DaidzeïneShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20227
DaidzinShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20226
Dithiothreitol(DTT)Solarbio Science and TechnologyD8220
E. coli BL21 (DE3) competent cellenThermo Fisher Scientific™?InvitrogenEC0114
GenisteïneShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31565
Genisteïne-8-C-glucosideShanghai Yuanye Bio-TechnologyBP2095
GenistinShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31591
GlucoseSigma-AldrichG8270
GraphPad Prism 9GraphPad SoftwareVersion?Prism 9Bereken de Km en kcat kinetische parameters
HiLoad Superdex 200 pg preparatieve SEC kolommenCytiva28989335
HisTrap HP His tag eiwitzuiveringskolommenCytiva17524802
HiTrap Q FF anionenuitwisselingschromatografiekolomCytiva17515601
HKL-3000HKL research Inc versie 723
HPLC kolom TC-C18(2), 170Å, 5 µm, 4.6 x 250 mmAgilent Technologies518925-902
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid?IPTG)Sigma-AldrichPHG0010
LactoseSigma-Aldrich17814
LC-20AT, hogeprestatievloeistofchromatografieShimadzuLC20AT
MaltoseSigma-Aldrich47288
MaltotrioseSigma-Aldrich443713
ManganchlorideShanghai Yuanye Bio-TechnologyS31112
MethanolThermo Fisher Scientific™?InvitrogenM23142
NAD+Solarbio Science and TechnologyN8110
Olympus SZX12 Stereo MicroscoopOLYMPUS SZX7
fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)Sigma-AldrichP7626 
PhenixThe Phenix development team1.21.2Phenix is een uitgebreide softwaresuite voor eiwitkristallenstructuurbepaling, die SAD (Single-wavelength Anomalous Dispersion) en MR (Molecular Replacement) methoden met Phaser-software omvat.
Preparatief hogeprestatievloeistofchromatograafWaters2545/2998
ProteïnekristallisatiekitHampton ResearchHR2-110/HR2-112/HR2-144/HR2-126/HR2-098
PuerarineShanghai Yuanye Bio-TechnologyB20446
SchudincubatorShanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd ZQZY-AF8
SnakeSkin™ dialysemembraan, 10 kDa MWCO, 35 mmThermo Fisher Scientific™?Invitrogen88245
Oplosbare zetmeelSigma-AldrichS9765
Sorvall LYNX 6000 Superspeed CentrifugeThermo Fisher Scientific™75006590
SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate ReaderMOLECULAR DEVICESSpectraMax i3x 
SpectraMax QuickDrop Micro-Volume Spectrofotometer SpecificatiesMOLECULAR DEVICESQuickDrop
SucroseSigma-AldrichS5016
SunFire C18 OBD Prep ColumnWaters186002741
Thermo Fisher Scientific Q EXACTIVEThermo Fisher Scientific™?InvitrogenIQLAAEGAAPFALGMBDK
Ubiquitine-achtige protease 1Thermo Fisher Scientific™?Invitrogen12588018
Ultra laag temperatuurvriezerThermo Fisher Scientific905GP-ULTS
Vakuumcentrifugaal concentratorBeijing JM TechnologyCV600
VitexineSigma-Aldrich49513

Referenties

  1. Gomaa, E. Z. Human gut microbiota/microbiome in health and diseases: a review. Antonie Van Leeuwenhoek. 113 (12), 2019-2040 (2020).
  2. Thursby, E., Juge, N. Introduction to the human gut microbiota. Biochem J. 474 (11), 1823-1836 (2017).
  3. Nie, Q., et al. Gut symbionts alleviate MASH through a secondary bile acid biosynthetic pathway. Cell. 187 (11), 2717-2734.e33 (2024).
  4. Xie, L., et al. Comparison of flavonoid O-glycoside, C-glycoside and their aglycones on antioxidant capacity and metabolism during in vitro digestion and in vivo. Foods. 11 (6), (2022).
  5. Zhang, S. -J., Guo, J. -R., Kang, A., Di, L. -Q. Advance in studies on gut microbiota in de-glycosylation of traditional Chinese medicine glycosides. Zhongguo Zhong yao za zhi= Zhongguo Zhongyao ZazhiChina Journal of Chinese Materia Medica. 38 (10), 1459-1466 (2013).
  6. Xie, G. -Z., Hui, H. -Y., Peng, M. -J., Tan, Z. -J. Biotransformation of glycosides in herbal medicine by gut microbiota. World Chinese Journal of Digestology. 26 (4), 221(2018).
  7. Vuong, T. V., Wilson, D. B. Glycoside hydrolases: catalytic base/nucleophile diversity. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 195-205 (2010).
  8. Davies, G., Henrissat, B. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure. 3 (9), 853-859 (1995).
  9. Ito, T., Fujimoto, S., Shimosaka, M., Taguchi, G. Production of C-glucosides of flavonoids and related compounds by Escherichia coli expressing buckwheat C-glucosyltransferase. Plant Biotechnology. 31 (5), 519-524 (2014).
  10. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104, 1883-1890 (2020).
  11. Che, Q. M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Metabolism of aloesin and related compounds by human intestinal bacteria: a bacterial cleavage of the C-glucosyl bond and the subsequent reduction of the acetonyl side chain. Chem Pharm Bull (Tokyo). 39 (3), 704-708 (1991).
  12. Wei, B., et al. Discovery and mechanism of intestinal bacteria in enzymatic cleavage of C-C glycosidic bonds. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (5), 1883-1890 (2020).
  13. HATTORI, M., et al. Metabolism of barbaloin by intestinal bacteria. Chem Pharm Bull (Tokyo). 36 (11), 4462-4466 (1988).
  14. Che, Q. -M., Akao, T., Hattori, M., Kobashi, K., Namba, T. Isolation of a human intestinal bacterium capable of transforming barbaloin to aloe-emodin anthrone1. Planta medica. 57 (01), 15-19 (1991).
  15. Braune, A., Blaut, M. Deglycosylation of puerarin and other aromatic C-glucosides by a newly isolated human intestinal bacterium. Environ Microbiol. 13 (2), 482-494 (2011).
  16. Braune, A., Blaut, M. Intestinal bacterium Eubacterium cellulosolvens deglycosylates flavonoid C-and O-glucosides. Appl Environ Microbiol. 78 (22), 8151-8153 (2012).
  17. Hasanah, U., Miki, K., Nitoda, T., Kanzaki, H. Aerobic bioconversion of C-glycoside mangiferin into its aglycone norathyriol by an isolated mouse intestinal bacterium. Biosci Biotechnol Biochem. 85 (4), 989-997 (2021).
  18. Kim, D. -H., et al. Intestinal bacterial metabolism of flavonoids and its relation to some biological activities. Arch Pharm Res. 21, 17-23 (1998).
  19. Kim, M., Lee, J., Han, J. Deglycosylation of isoflavone C-glycosides by newly isolated human intestinal bacteria. J Sci Food Agric. 95 (9), 1925-1931 (2015).
  20. Tao, Z., et al. Isolation and identification of Enterococcus gallinarum P581a, a strain of intestinal bacteria deglycosylating flavone C-glycosides. J Gen Appl Microbiol. 68 (3), 125-133 (2022).
  21. Wang, S., et al. A newly isolated human intestinal strain deglycosylating flavonoid C-glycosides. Arch Microbiol. 204 (6), 310(2022).
  22. Xu, J., et al. Application of ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry to determine the metabolites of orientin produced by human intestinal bacteria. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 944, 123-127 (2014).
  23. Zheng, S., et al. A newly isolated human intestinal bacterium strain capable of deglycosylating flavone C-glycosides and its functional properties. Microb Cell Fact. 18, 1-10 (2019).
  24. Braune, A., Engst, W., Blaut, M. Identification and functional expression of genes encoding flavonoid O-and C-glycosidases in intestinal bacteria. Environ Microbiol. 18 (7), 2117-2129 (2016).
  25. Kumano, T., et al. FAD-dependent C-glycoside-metabolizing enzymes in microorganisms: Screening, characterization, and crystal structure analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 118 (40), e2106580118(2021).
  26. Nakamura, K., Zhu, S., Komatsu, K., Hattori, M., Iwashima, M. Deglycosylation of the isoflavone C-glucoside puerarin by a combination of two recombinant bacterial enzymes and 3-oxo-glucose. Appl Environ Microbiol. 86 (14), e00607-e00620 (2020).
  27. He, P., et al. Structural mechanism of a dual-functional enzyme DgpA/B/C as both a C-glycoside cleaving enzyme and an O- to C-glycoside isomerase. Acta Pharm Sin B. 13 (1), 246-255 (2023).
  28. Wang, Z., et al. Pro isomerization in MLL1 PHD3-bromo cassette connects H3K4me readout to CyP33 and HDAC-mediated repression. Cell. 141 (7), 1183-1194 (2010).
  29. Mossessova, E., Lima, C. D. Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast. Mol Cell. 5 (5), 865-876 (2000).
  30. Delucas, L. J., et al. Protein crystallization: virtual screening and optimization. Prog Biophys Mol Biol. 88 (3), 285-309 (2005).
  31. Minor, W., Cymborowski, M., Otwinowski, Z., Chruszcz, M. HKL-3000: the integration of data reduction and structure solution--from diffraction images to an initial model in minutes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 8), 859-866 (2006).
  32. Li, M., et al. An efficient C-glycoside production platform enabled by rationally tuning the chemoselectivity of glycosyltransferases. Nat Commun. 15 (1), 8893(2024).
  33. Peters, B., et al. Characterization of membrane-bound dehydrogenases from Gluconobacter oxydans 621H via whole-cell activity assays using multideletion strains. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (14), 6397-6412 (2013).
  34. Nasseri, S. A., et al. An alternative broad-specificity pathway for glycan breakdown in bacteria. Nature. 631 (8019), 199-206 (2024).
  35. Rose, J. P., Wang, B. C. SAD phasing: History, current impact and future opportunities. Arch Biochem Biophys. 602, 80-94 (2016).
  36. Abramson, J., et al. Accurate structure prediction of biomolecular interactions with AlphaFold 3. Nature. 630 (8016), 493-500 (2024).
  37. Taberman, H., Parkkinen, T., Rouvinen, J. Structural and functional features of the NAD(P) dependent Gfo/Idh/MocA protein family oxidoreductases. Protein Sci. 25 (4), 778-786 (2016).
  38. Jahn, B., et al. Understanding the chemistry of the artificial electron acceptors PES, PMS, DCPIP and Wurster's Blue in methanol dehydrogenase assays. J. Biol. Inorg. Chem. 25, 199-212 (2020).
  39. Yu, L., et al. Biotransformation of puerarin into puerarin-6 ″-O-phosphate by Bacillus cereus. J Ind Microbiol Biotechnol. 39 (2), 299-305 (2012).
  40. Lin, H., et al. Lysineless HiBiT and NanoLuc tagging systems as alternative tools for monitoring targeted protein degradation. ACS Med Chem Lett. 15 (8), 1367-1375 (2024).
  41. Ma, K., et al. A Widespread Radical-Mediated Glycolysis Pathway. J Am Chem Soc. 146 (38), 26187-26197 (2024).
  42. Yang, L., Lei, S., Xu, W. Rising above: exploring the therapeutic potential of natural product-based compounds in human cancer treatment. Tradit Med Res. 10 (3), 18(2025).
  43. Zhu, C., Cook, S. P. A concise synthesis of (+)-artemisinin. J Am Chem Soc. 134 (33), 13577-13579 (2012).
  44. Schade, A. E., et al. AKT and EZH2 inhibitors kill TNBCs by hijacking mechanisms of involution. Nature. , 1-9 (2024).
  45. Karpinska, K., et al. Selective degradation of MLK3 by a novel CEP1347-VHL-02 PROTAC compound limits the oncogenic potential of TNBC. J Med Chem. 67 (17), 15012-15028 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C glycosidemetabolismedarmmicrobiota enzymenprote nkristallografieLC MS analyseNMR spectroscopieenzymkinetiekchromatografische zuiveringflavonoidemetabolisme

Gerelateerde artikelen