Methodenartikel

Live beeldvorming van het recyclen van synaptische blaasjes in de neuromusculaire overgang van ontlede larvale zebravissen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67633

⸱

7 februari 2025

 , 
1Department of Physiology, Osaka Medical and Pharmaceutical University

In dit artikel

Samenvatting

De neuromusculaire overgang van de zebravislarve is een aantrekkelijk model voor het bestuderen van synaptische fysiologie. Het is vatbaar voor vele experimentele technieken, waaronder elektrofysiologie en optische beeldvorming. Hier beschrijven we een protocol voor het in beeld brengen van synaptische transmissie met behulp van een op pHluorin gebaseerde sonde onder een rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop.

Samenvatting

Neuronale communicatie wordt gemedieerd door synaptische transmissie, die voornamelijk afhangt van de afgifte van neurotransmitters die zijn opgeslagen in synaptische blaasjes (SV's) als reactie op een actiepotentiaal (AP). Aangezien SV's lokaal worden gerecycled aan de presynaptische terminal, is coördinatie van SV-exocytose en endocytose belangrijk voor aanhoudende synaptische transmissie. Een pH-gevoelig groen fluorescerend eiwit, pHluorin genaamd, biedt een krachtig hulpmiddel om SV exo/endocytose te controleren door het op het SV-lumen te richten. Het volgen van AP-gestuurde SV-recycling met de op pHluorin gebaseerde sondes is echter nog steeds grotendeels beperkt tot in vitro kweekpreparaten, omdat de introductie van genetisch gecodeerde sondes en de daaropvolgende optische beeldvorming in het algemeen technisch uitdagend is voor in vivo diermodellen of weefselpreparaten. Zebrafish is een modelsysteem dat waardevolle functies biedt, waaronder gemakkelijke genetische manipulatie, optische helderheid en snelle externe ontwikkeling. We hebben onlangs een transgene zebravis gegenereerd die een pHluorin-gelabelde sonde sterk tot expressie brengt op motorneuronterminals en een protocol ontwikkeld om AP-gestuurde SV exo/endocytose op de neuromusculaire overgang (NMJ) te monitoren, een gerenommeerd synapsmodel dat zich in vivo vormt. In dit artikel laten we zien hoe je larvale zebravis NMJ-preparaat bereidt dat geschikt is voor pHluorin-beeldvorming. We laten ook zien dat het preparaat time-lapse-beeldvorming mogelijk maakt onder een conventionele rechtopstaande epifluorescentiemicroscoop, wat een kosteneffectief platform biedt voor het analyseren van de NMJ-functie.

Inleiding

Synaptische transmissie, gemedieerd door afgifte van neurotransmitters uit synaptische blaasjes (SV's) aan het presynaptische uiteinde, is een fundamenteel proces dat ten grondslag ligt aan zenuwfunctie1. In vroege studies werd synaptische transmissie voornamelijk gemeten door elektrofysiologische technieken die de postsynaptische respons detecteren die wordt opgewekt door neurotransmitters en hun receptoren. In de afgelopen decennia zijn er echter verschillende soorten beeldvormingstechnieken ontwikkeld die presynaptische functie2 direct in beeld brengen. Een van de meest gebruikte sondes is een pH-gevoelig groen fluorescerend eiwit genaamd pHluorin 3,4.

Recycling van synaptische blaasjes (SV's) aan de presynaptische terminal is een cruciaal proces voor de aanhoudende overdracht van neurotransmitters5. Na de afgifte van neurotransmitters door exocytose van SV's, waarvan het lumen over het algemeen op een zure pHvan 6,7 wordt gehouden, worden het membraan en de SV-eiwitten onmiddellijk uit het plasmamembraan gehaald door endocytose. Nieuw gevormde SV's worden vervolgens opnieuw verzuurd en neurotransmitters worden opnieuw geladen. Wanneer pHluorin in het SV-lumen wordt gericht door het te fuseren met het SV-eiwit, vertoont het minimale fluorescentie in rusttoestand. Bij SV-exocytose wordt het echter blootgesteld aan de neutrale pH in de extracellulaire ruimte, wat resulteert in heldere fluorescentie. Vervolgens neemt de fluorescentie geleidelijk af na de SV-herverzuring. Daarom maakt pHluorin-fluorescentie het mogelijk om SV-recyclingprocessen te monitoren.

In baanbrekende studies werd synaptobrevin/VAMP 2, het vesiculaire SNARE-eiwit (oplosbare NSF-gehechte eiwitreceptor) dat verantwoordelijk is voor synaptische vesikelsfusie in synapsen van de voorhersenen8 en de meest voorkomende onder SV-eiwitten9, geselecteerd als fusiepartner voor pHluorin, en het resulterende fusie-eiwit werd aangeduid als synaptopHluorin (SpH)3,4. SpH vertoonde echter een lage signaal-ruisverhouding (S/N) vanwege de substantiële oppervlakte-expressie van de sonde. Daarom zijn andere SV-eiwitten getest als dragerpartners 10,11,12. Tot op heden is aangetoond dat vesiculaire transporters de laagste oppervlakte-expressie vertonen 13,14,15. Het gebruik van deze sondes werd aanvankelijk vastgesteld in gekweekte neuronen van zoogdieren om AP-gestuurde SV-recycling te volgen 8,9,10,11,12,13 en is uitgebreid naar andere preparaten, waaronder ontlede weefsels en in vivo dieren 16,17,18,19,20,21,22.

Larvale zebravis is een modelsysteem met waardevolle kenmerken, waaronder gemakkelijke genetische manipulatie, optische helderheid en snelle externe ontwikkeling. Transgene zebravis die pHluorin tot expressie brengt gefuseerd met synaptofysine, Syphy genaamd, werd gegenereerd en toegepast in meerdere experimentele opstellingen, b.v. het monitoren van spontane SV-fusie van spinale neuronen in vivo21, AP-onafhankelijke SV-recycling bij lint-type synapsen in vivo20,22 of in geïsoleerde cellen 23,24,25. De toepassing van pHluorin-beeldvorming van AP-gestuurde SV-recycling in het zebravismodel is echter nog beperkt.

De neuromusculaire junctie (NMJ) dient als een aantrekkelijk model om synaptische fysiologiete bestuderen 26, en verschillende onderzoeken hebben met succes beeldvorming uitgevoerd AP-gestuurde SV-recycling met SpH bij muis18,19. Het gebruik van NMJ's voor SV-recycling in zebravissen werd ontwikkeld door Wen et al.16. Onlangs hebben we Tg-zebravissen gegenereerd die pHluorin sterk tot expressie brengen, gelabeld met een vesiculaire GABA-transporter (VGAT), specifiek in motorneuronen27. Deze sonde bevat ook een HaloTag in combinatie met pHluorin aan de luminale staart van VGAT en wordt daarom VpHalo genoemd. Hoewel VGAT niet endogeen tot expressie komt in cholinerge motorneuronen, hebben we bevestigd dat VpHalo lokaliseert naar alle SV-pools en op de juiste manier wordt gerecycled als reactie op AP's door elektrofysiologische opname, activiteitsafhankelijke SV-labeling te combineren met HaloTag-liganden en live beeldvorming van pHluorin27. Door het hoge expressieniveau en een minimale oppervlaktefractie van VpHalo maakte NMJ-preparaat van deze Tg-vis het mogelijk om AP-gestuurde SV-recycling met een goede S/N-verhouding te monitoren. Bovendien maakt de schaarse verdeling van NMJ's in de transparante behuizing confocale laserscanmicroscopie overbodig voor dit doel. Hoewel het monitoren van AP-gestuurde SV-recycling in intacte zebravissen de wenselijke toekomstige richting is, is het van primair belang om het NMJ-preparaat vast te stellen dat geschikt is om het gebruik van de op pHluorin gebaseerde sonde onder goed gecontroleerde omstandigheden te valideren, zoals werd gedaan in gekweekte preparaten 3,4,10,11,12,13,14,15 . Hier beschrijven we een dissectieprotocol om een NMJ-monster van een larvale zebravis voor te bereiden dat kan worden gebruikt voor meerdere soorten experimenten, bijv. patchklemregistratie van eindplaatstromen, HaloTag-labeling van gerecyclede SV's en pHluorin live imaging, zoals hierboven besproken. Verder hebben we ons gericht op en een gedetailleerd protocol opgesteld voor de live beeldvorming van pHluorin met behulp van dit NMJ-preparaat onder een conventionele epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een elektrisch stimulatieapparaat en een oplossingsperfusiesysteem.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van dieren aan de Osaka Medical and Pharmaceutical University. Zebravissen werden grootgebracht en onderhouden onder een licht- tot 10-uurs donkercyclus. De embryo's en larven werden op 28-30 °C gehouden in eiwater met 0,006% zeezout en 0,01% methyleenblauw. De experimenten werden 4-7 dagen na de bevruchting (dpf) uitgevoerd. Het wordt aanbevolen om de vissen twee keer per dag te voeren vanaf 5 dpf wanneer experimenten worden uitgevoerd na 6 dpf. Het medium moet voor elke voeding worden vervangen.

1. Bereiding van oplossingen

  1. Bereid 200 ml extracellulaire oplossing voor (112 mM NaCl, 2 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,3-7,4). Meng 6,4 ml 3,5 M NaCl, 0,4 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M HEPES (pH 7,5), 0,4 ml 1 M CaCl2, 0,2 ml 1 M MgCl2 en 360 mg glucose en voeg ultrapuur water toe aan 200 ml. Als de pH buiten het bereik van 7,3-7,4 ligt, pas deze dan aan met 1 M NaOH. Gebruik de vers bereide extracellulaire oplossing voor elk experiment.
  2. Bereid 100 ml extracellulaire oplossing voor die 3 μM D-tubocurarine (D-TBC) bevat. Voeg 20 μL 15 mM D-TBC stockoplossing toe aan 100 ml extracellulaire oplossing.
    OPMERKING: D-TBC stockoplossing wordt bereid in water en bewaard bij -20 °C.
    LET OP: Draag handschoenen en trof voorbereidingen in de kap bij het hanteren van D-TBC-poeder. Handschoenen worden ook aanbevolen bij het hanteren van de D-TBC-oplossing.
  3. Bereid 25 ml extracellulaire oplossing met 0,02% tricaïne (MS-222). Voeg 0,5 ml 1% tricaïne stockoplossing toe aan 25 ml extracellulaire oplossing.
    OPMERKING: Tricaïne stockoplossing wordt bereid in water en bewaard bij 4 °C. Tricaïne wordt alleen gebruikt voor dissectie, niet tijdens beeldvorming.

2. Bereiding van bipolaire elektrode uit het capillair van thetaglas

  1. Trek aan de capillairen van thetaglas met behulp van de micropipettrekker zodat de puntdiameter in het bereik van 3-10 μm ligt (Figuur 1A).
    OPMERKING: We raden een protocol aan met twee of meer stappen om het haarvaten te trekken.
  2. Sluit de theta-glazen pipet (1,17 mm binnendiameter met 0,165 mm septumdikte) aan op de stimulusisolator. Vul de pipet met de extracellulaire oplossing. Steek een dunne platinadraad (diameter 0.1 mm) in elke opening van het thetaglascapillair en sluit het achterste uiteinde van de draad aan op de stimulusisolator (Figuur 1B). Pas op dat u de twee platinadraden niet kortsluit.

3. Voorbereiding van het monster

OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor gebruik met Tg(hb9:tTAad, TRE:TagRFP-P2A-VpHalo) zebravislarven27, waarbij de volgende twee eiwitten, verbonden door een P2A-splitsingspeptide, specifiek in motorneuronen bicistronisch tot expressie werden gebracht: een reporter rood fluorescerend eiwit TagRFP en een sensoreiwit VpHalo, dat een fusie-eiwit is van pHluorin en HaloTag naar het luminale deel van VGAT (Figuur 2A). De hb9-promotor stuurt de expressie van de tTAad (tetracycline-controlled transactivator-advanced) aan, die op zijn beurt de expressie van de genen onder de tetracycline-responselement (TRE) samengestelde promotor induceert. Het Tet-induceerbare expressiesysteem verhoogt het niveau van eiwitexpressie. pHluorin maakt live monitoring van activiteitsafhankelijke SV-recycling mogelijk, terwijl HaloTag SV's visualiseert die gedurende een bepaalde periode worden gerecycled door het gefuseerde eiwit covalent te labelen (Figuur 2A). Hoewel beide methoden unieke voordelen hebben, richten we ons in dit artikel op pHluorin-beeldvorming.

  1. Giet 25 ml extracellulaire oplossing met 0,02% tricaan in de glazen petrischaal.
  2. Breng voor dissectie een larve over naar de petrischaal. Schil de huid van de larve met twee fijne tangen. Gebruik de eerste tang om de larve op zijn plaats te houden en knijp met de andere tang in de huid aan de dorsale zijde van de zwemblaas (Figuur 3A).
  3. Verwijder de zwemblaas, inwendige organen en het hoofd met scalpels. De huid aan beide zijden van het lichaam van de vis kan vaak tegelijkertijd worden verwijderd, zie Video 1.

4. Plaatsing van het monster in de beeldkamer en inbrengen van de stimulerende elektrode

OPMERKING: Omdat de luminale pH van de SV in rust lager is dan pH 6,0, is pHluorin-fluorescentie bij NMJ's in levende vissen nauwelijks waarneembaar (Figuur 2B). Toen het SV-lumen echter alkalisch was, werd een beperkte lokalisatie van VpHalo naar NMJ's waargenomen (Figuur 2C). Met name het confocale z-stack-beeld van de NMJ's toonde aan dat ze elkaar niet overlapten in het xy-vlak, behalve de randen van de lichaamssegmenten (Figuur 2C). Op basis van deze waarneming stelden we dat de epifluorescentiemicroscoop toepasbaar was voor live beeldvorming van VpHalo in zebravislarven, wat werd gevalideerd zoals beschreven in het volgende protocol.

  1. Breng het monster over naar de beeldkamer (Figuur 3B) met behulp van een glazen pasteurpipet met een vuurgepolijste punt. Bevestig het monster mechanisch met een nylondraad die op een C-vormige platinadraad is gelijmd, zodat het onder een hoek staat die ongeveer evenwijdig is aan de stimulerende elektrode. (Figuur 3C).
    OPMERKING: In het laboratorium werd een C-vormige platinadraad met een nylondraad vervaardigd. Ongeveer 1 cm platinadraad met een diameter van 0,5 mm werd in een C-vorm gevormd en met een hamer afgetapt om deze plat te maken. Nylondraad kan worden verkregen uit huishoudelijke artikelen. We lijmden de nylondraad, die werd verkregen door een keukenafdruiprek uit elkaar te halen die verkrijgbaar was in een supermarkt. Een soortgelijk fixatieapparaat wordt routinematig gebruikt in het hersenplakexperiment28.
  2. Perfuseer het monster continu met een extracellulaire oplossing die 3 μM D-TBC bevat met een snelheid van ongeveer 1,0 ml/min met behulp van een zwaartekrachtperfusiesysteem.
    NOTITIE: Het wordt aanbevolen om de kamertemperatuur te regelen met behulp van een in-line oplossingsverwarmer.
  3. Steek de stimulatie-elektrode in het ruggenmerg. Houd de elektrode die in stap 2 uit de theta-glaspipet is bereid op de pipethouder die is uitgerust met de gemotoriseerde micromanipulator. Steek de elektrode in het monster zodat de punt zich in de buurt van de spinale motorneuronen bevindt, die zich aan de ventrale zijde van het ruggenmerg bevinden en in dit monster kunnen worden geïdentificeerd als TagRFP-positieve neuronen (Figuur 3D). Beweeg de elektrode in een schuine hoek van het aangrenzende segment naar de doelpositie.
    OPMERKING: De grens tussen lichaamssegmenten is dicht en moeilijk te doordringen, dus het is noodzakelijk om de elektrode langzaam in te drukken. De positie van de elektrodepunt is erg belangrijk. Als het zich ver van het ruggenmerg bevindt, stimuleert het de aangrenzende spieren rechtstreeks, wat resulteert in een groot beeld dat afdrijft in de daaropvolgende time-lapse-beeldvorming.

5. Beeldacquisitie

  1. Selecteer het beeldvormingsgebied. Selecteer op basis van het live-beeld van TagRFP-fluorescentie een beeldvormingsgebied dat meer dan een paar boutons omvat en die op de grens van het lichaamssegment uitsluit (Figuur 2C en Figuur 4A). Kies het gebied binnen hetzelfde lichaamssegment van de stimulatie-elektrode, omdat de innervatie van motorneuronen beperkt is binnen een enkel lichaamssegment29,30. Schakel de fluorescentiefiltereenheid in voor GFP/pHluorin-fluorescentie.
    OPMERKING: In deze experimentele opstelling werd pHluorin afgebeeld met 470/40 nm excitatie en 510/20 nm emissiefilters. TagRFP werd in beeld gebracht met 555/20 nm excitatie en 595/44 nm emissiefilters. Micro-Manager-software wordt gebruikt om de beeldacquisitie tegelijkertijd te regelen met een wetenschappelijke cMOS-camera en de TTL-sluiter van de LED-lichtbron. Om beeldacquisitie en elektrische stimulatie te synchroniseren, wordt Arduino gebruikt als een digitaal I/O-apparaat. Een andere optie waarvoor geen script nodig is, is het gebruik van Digidata en de bijbehorende software van Molecular Devices.
  2. Bepaal de instelling van beeldacquisitiesoftware en digitaal I/O-apparaat zodat beeldacquisitie en elektrische stimulatie worden gesynchroniseerd. Optimaliseer de belichting en intensiteit van de lichtbron om een voldoende helder beeld te verkrijgen in een time-lapse-modus van 1 Hz zonder verzadiging en voer de belichtingstijd in het veld Belichting [ms] van het hoofdvenster van Micro-Manager in.
  3. Bepaal de stimulatiefrequentie, het aantal actiepotentialen (AP's) en de tijd tussen het begin van de beeldacquisitie en de stimulatietoediening, en codeer ze in het Arduino-script. Bepaal afhankelijk van de parameters het aantal verkregen afbeeldingen dat overeenkomt met de totale duur van de beeldacquisitie en voer dit in het veld Aantal van het venster Multidimensionale acquisitie van de Micro-Manager in. Stel 1 s in het veld Interval in om 1 Hz time-lapse-beeldvorming te bereiken. Lever voor elektrische stimulatie pulsen met een constante spanning van 1 ms (70 mV) via de stimulusisolator.
  4. Beeldacquisitie uitvoeren. Voer de opdracht digitizer uit en voer beeldacquisitie uit. Controleer of er geen onaanvaardbare beeldafwijking is en of pHluorin-reacties kunnen worden waargenomen. Anders is de positie van de elektrode onjuist. Keer terug naar stap 4.2.
    OPMERKING: Weefselbeschadiging die mogelijk de pHluorin-respons kan beïnvloeden, kan gemakkelijk worden geïdentificeerd aan de hand van het DIC-beeld van spiervezels. Als er geen pHluorin-respons wordt waargenomen bij afwezigheid van dergelijke schade, kan de plaatsing van de elektrode onjuist zijn. Dit kan worden geïdentificeerd als grote beeldafwijking omdat een onjuiste positionering van de elektrode spiercontractie veroorzaakt, zoals beschreven in stap 4.2. Het andere probleem dat er soms toe leidt dat de pHluorin-respons niet wordt opgewekt, is lucht die vastzit in het thetaglascapillair, wat leidt tot elektrische isolatie van de elektrode. Spiercontractie als gevolg van een verkeerde positionering van de elektroden veroorzaakt beeldafwijking in de Z-as, die niet kan worden gecorrigeerd in latere beeldanalyses (zie stap 6.5). Daarom wordt aanbevolen om gegevens met grote beelddrifts tijdens de beeldacquisitie te identificeren en uit te sluiten.
  5. Verander, afhankelijk van het doel van het experiment, de stimulatie-intensiteit (d.w.z. frequentie en aantal pulsen) en/of temperatuur. Sla de time-lapse-afbeeldingen op als een tijdreeksstapel van TIFF-afbeeldingen. Zie video 2.

6. Beeldanalyse

OPMERKING: Gebruik Fiji om de volgende beeldverwerking en -analyse uit te voeren. Gebruik Microsoft Excel of vergelijkbare spreadsheetsoftware om de meetresultaten te berekenen. Gebruik Igor Pro om curve-aanpassing uit te voeren op het verkregen resultaat.

  1. Maak een verschilafbeelding die actieve synapsen benadrukt, zoals hieronder wordt beschreven.
    1. Open de stapel tijdreeksen met afbeeldingen in Fiji door Bestand > Openen te kiezen. Als de weergegeven beelden zwak zijn, kiest u Afbeelding >Aanpassen >Helderheid/contrast >Auto. Klik niet op Toepassen, omdat hierdoor de signaalintensiteit wordt herschaald, waardoor verdere analyse onmogelijk wordt. Kies Analyseer > Schaal instellen en voer de kalibratiefactor in die is gedefinieerd in de beeldvormingstoestand.
    2. Maak een stapel van vijf afbeeldingen die tijdens de pre-stimulusperiode zijn gemaakt door Afbeelding > Duplicaat te selecteren en een geschikt nummer in te voeren dat het bereik van de afbeeldingsreeks aangeeft (bijv. 11-15 voor het experiment met een pre-stimulusperiode van 15 s).
    3. Selecteer Afbeelding > stapels > Z-project en selecteer Gemiddelde intensiteit in het vervolgkeuzemenu Projectietype. Druk op OK om een representatief beeld te maken van de pre-stimulusperiode (Figuur 4B). Het middelingsproces is belangrijk om het effect van signaalfluctuaties te verminderen.
    4. Maak een gemiddeld beeld van de periode na de stimulus met behulp van vergelijkbare verwerking (Figuur 4B). Dupliceer een stapel van vijf afbeeldingen onmiddellijk na het einde van de stimulatie (bijv. de 26-30eafbeelding voor de 15 s pre-stimulusperiode en 10 s stimulusperiode-experiment). Selecteer Bewerken > Afbeeldingscalculator en stel de gemiddelde afbeelding vóór de stimulus en de gemiddelde afbeelding na de stimulus in als respectievelijk Afbeelding 1 en Afbeelding 2 in de vervolgkeuzemenu's.
    5. Selecteer Aftrekken in het vervolgkeuzemenu Bewerking en druk op OK om een verschilafbeelding te maken die actieve synapsen markeert (Afbeelding 4B).
  2. Definieer de interessegebieden (ROI's) die moeten worden geanalyseerd.
    1. Selecteer Bewerken > Selectie > Specificeer en maak een cirkelvormige ROI met een diameter van 7 μm op de verschilafbeelding die in stap 6.1 is gemaakt. Plaats de ROI op de gemarkeerde actieve synaps en druk op T om de ROI toe te voegen in de ROI Manager. In het representatieve resultaat dat in figuur 4C-D wordt weergegeven, werden 6 ROI's gepositioneerd rond de boutons.
    2. Plaats nog eens 5 ROI's van dezelfde grootte in regio's waar geen signaaltoename wordt waargenomen. Gebruik hun gemiddelde fluorescentie als achtergrondsignaal in de volgende stap. Sla de ROI's op door Meer >Opslaan te selecteren in het menu ROI-beheer.
  3. Meet de signaalintensiteit en bereken de substantiële verandering in fluorescentie.
    1. Selecteer de oorspronkelijke tijdreeksstapel en breng de ROI's die in stap 6.2 zijn opgeslagen over naar de stapel. Schakel Analyseren > Metingen instellen in en schakel alleen het selectievakje Gemiddelde grijze waarde in. Meet de gemiddelde fluorescentie-intensiteit in de ROI's over alle tijdstippen door Meer > Multi Measure te selecteren in het menu ROI Manager.
    2. Kopieer alle waarden in het resultatenvenster en plak ze in een spreadsheetprogramma. Bereken het gemiddelde achtergrondsignaal van de 5 achtergrond-ROI's en trek dit af van elke synaptische ROI, wat zorgt voor een substantiële verandering van fluorescentie in elke bouton (Figuur 4D). Gemiddelde van alle gegevens van een enkele weergave (in dit geval 6 boutons), geteld als n = 1 experiment. In figuur 4E wordt elk spoor dat door middeling wordt verkregen, weergegeven als F/F0 door de waarde op alle tijdstippen te delen door de gemiddelde waarde tijdens de initiële basislijnperiode.
  4. Schat de fluorescentievervaltijdconstante (tau) door curve-fitting.
    1. Open een nieuwe gegevenstabel in Igor Pro door Venster > Nieuwe tabel te selecteren. Kopieer het tijdstip en de gegevens van F/F0 uit de spreadsheet en plak ze in een andere rij in de tabel. Kies Venster > Nieuwe grafiek, selecteer F/F0-gegevens als Y-golf en tijdpuntgegevens als X-golf en druk op Doe het om een grafiek te maken.
    2. Kies Venster > Toon informatie en definieer het bereik van de gegevens die moeten worden geanalyseerd door de ene cursor op de signaalpiek en de andere op het einde van het spoor te plaatsen. Kies Analyse > Curve Fitting en selecteer exp_XOffset in het vervolgkeuzemenu Functie en de juiste X- en Y-golven in het vervolgkeuzemenu Golf.
    3. Klik op Gegevensopties en druk op de cursorknop om het aanpassingsbereik voor de curve in te stellen. Klik op Coëfficiënten, voer 1 in voor Y0 en druk op Doen. Curve-aanpassing volgens deze procedure levert een tau-waarde op die de snelheid van fluorescentieverval weergeeft, die de snelheden van SV-endocytose en herverzuring weerspiegelt.
  5. Voer handmatige driftcorrectie uit (optioneel) zoals hieronder beschreven.
    1. Als er beeldafwijking optreedt en de geselecteerde plek tijdens de beeldacquisitieperiode buiten de ROI met een diameter van 7 μm beweegt, voert u de plug-in Handmatige driftcorrectie uit. Open de stapel met tijdreeksafbeeldingen in Fiji door Bestand > Openen te selecteren. Selecteer het gereedschap Aanwijzen door op de werkbalk Aanwijzen te klikken.
    2. Zoek de helderste bouton als oriëntatiepunt en plaats een punt in het midden ervan. Druk op T om het punt toe te voegen aan de ROI-manager. Herhaal dit proces voor de hele reeks afbeeldingen. Geef de eerste afbeelding weer en selecteer Plug-ins > Registratie > handmatige driftcorrectie. Sla de stapel gecorrigeerde afbeeldingsreeksen op als een nieuw bestand en gebruik het voor analyse.
      OPMERKING: Hoewel X-Y-drift kan worden gecorrigeerd, is overmatige Z-drift niet corrigeerbaar met deze methode.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als het ontlede monster wordt bereid zonder ernstige weefselbeschadiging en de stimulatie-elektrode op de juiste manier in het ruggenmerg wordt ingebracht, kan een robuuste pHluorin-respons worden opgewekt door hoogfrequente elektrische stimulatie (Figuur 4D,E). De pre-stimulus baseline fluorescentie was waarschijnlijk te wijten aan de sonde die aanwezig was op het oppervlak van de presynaps. De toename van de fluorescentie tijdens stimulati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De larvale zebravis NMJ is een opkomend modelsysteem voor de studie van synaptische fysiologie en pathologie26,31. Een transgene zebravis die SpH op een neuronspecifieke manier tot expressie brengt, is al gegenereerd en gebruikt voor de analyse van een mutant die een locomotorisch defect vertoont17. Wen et al.17 toonden een ongeveer 2-voudige toename van pHluorin-fluorescentie aan t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er wordt geen belangenconflict aangegeven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant 18K06882 aan F. O.; en Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI Grant 21K06429 en 24K10020 aan Y.E.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
40x water immersion objectiveOlympusLUMPLFLN40XW
4ch gravity flow perfusion systemALAVCPlus-4G
5x objectiveOlympusNPLN5X
Custum made imaging chamberPhysiotechcustum madeEen zwarte acrylplaat (10,7 cm diameter, 3 mm dik) met een putje (1 cm diameter aan de onderkant, 1,5 cm diameter aan de bovenkant) die ongeveer 0,5 ml perfusato bevat. 
Digital I/O deviceArduinoUno Rev3
D-Tubocurarine dichloride pentahydrateSigma93750
ExcelMicrosoftMicrosoft Office Professional Plus 2016
Fiji / imageJhttps://imagej.net/imageJ 1.54f
Fine forcepsAsOne7-562-05 (Dumont #5)
Glass Pasteur pipetteIWAKIIK-PAS-5PHet punt moet worden bijgesneden en vuur gepolijst tot het einddiameter 1,5–2 mm is. 
Glass Petri dishAsOne1-4564-06
Igor ProWaveMetricsVer. 6.37
Inline solution heaterWarner InstrumentsSF-28
LED illumination systemX-cyteXYLIS
Methylen blueWako133-06962
Micro-Managerhttps://micro-manager.org/Ver. 2.0.0
Mini magnetic clamp for perfusion tubeWarner Instruments64-1553
Motorized micromanipulatorScientificaPatchStar
Motorized movable sample plateScientificaMMSP
Pipette holderNarishigeH-13
Pipette pullerNarishigePC-100
Platinum wire (φ0.1mm)NilacoPT-351165
Platinum wire (φ0.5 mm)NiacoPT-351381
ScalpelAsOne8-3086-02 (Feather #11)
Scientific cMOS cameraThorlabsCC215MU
Sea saltNAPQOInstant Ocean
Stereo microscopeOlympusSZX7
Stimulus isolaterAMPIISO-FLEX
Suction tubeWarner InstrumentsST-3, 64-1406
Temperature controllerWarner InstrumentsTC-324C
Theta glass capillarySutter InstrumentBT-150-10
Tricaine (MS-222)TCIT0941
Upright microscopeOlympusBX51WI

Referenties

  1. Sudhof, T. C. The synaptic vesicle cycle. Ann Rev Neurosci. 27, 509-547 (2004).
  2. Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
  3. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with ph-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  4. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of phluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  5. Chanaday, N. L., Cousin, M. A., Milosevic, I., Watanabe, S., Morgan, J. R. The synaptic vesicle cycle revisited: New insights into the modes and mechanisms. J Neurosci. 39 (42), 8209-8216 (2019).
  6. Egashira, Y., Takase, M., Takamori, S. Monitoring of vacuolar-type h+ atpase-mediated proton influx into synaptic vesicles. J Neurosci. 35 (8), 3701-3710 (2015).
  7. Egashira, Y., et al. Unique ph dynamics in gabaergic synaptic vesicles illuminates the mechanism and kinetics of gaba loading. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10702-10707 (2016).
  8. Schoch, S., et al. Snare function analyzed in synaptobrevin/vamp knockout mice. Science. 294 (5544), 1117-1122 (2001).
  9. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127 (4), 831-846 (2006).
  10. Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
  11. Fernandez-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
  12. Kwon, S. E., Chapman, E. R. Synaptophysin regulates the kinetics of synaptic vesicle endocytosis in central neurons. Neuron. 70 (5), 847-854 (2011).
  13. Voglmaier, S. M., et al. Distinct endocytic pathways control the rate and extent of synaptic vesicle protein recycling. Neuron. 51 (1), 71-84 (2006).
  14. Balaji, J., Ryan, T. A. Single-vesicle imaging reveals that synaptic vesicle exocytosis and endocytosis are coupled by a single stochastic mode. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (51), 20576-20581 (2007).
  15. Santos, M. S., Park, C. K., Foss, S. M., Li, H., Voglmaier, S. M. Sorting of the vesicular gaba transporter to functional vesicle pools by an atypical dileucine-like motif. J Neurosci. 33 (26), 10634-10646 (2013).
  16. Wen, H., et al. Synchronous and asynchronous modes of synaptic transmission utilize different calcium sources. Elife. 2, e01206(2013).
  17. Wen, H., Hubbard, J. M., Wang, W. C., Brehm, P. Fatigue in rapsyn-deficient zebrafish reflects defective transmitter release. J Neurosci. 36 (42), 10870-10882 (2016).
  18. Wyatt, R. M., Balice-Gordon, R. J. Heterogeneity in synaptic vesicle release at neuromuscular synapses of mice expressing synaptophluorin. J Neurosci. 28 (1), 325-335 (2008).
  19. Tabares, L., et al. Monitoring synaptic function at the neuromuscular junction of a mouse expressing synaptophluorin. J Neurosci. 27 (20), 5422-5430 (2007).
  20. Odermatt, B., Nikolaev, A., Lagnado, L. Encoding of luminance and contrast by linear and nonlinear synapses in the retina. Neuron. 73 (4), 758-773 (2012).
  21. Almeida, R. G., et al. Myelination induces axonal hotspots of synaptic vesicle fusion that promote sheath growth. Curr Biol. 31 (17), 3743-3754.e5 (2021).
  22. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nat Comm. 9 (1), 1388(2018).
  23. Vaithianathan, T., Henry, D., Akmentin, W., Matthews, G. Nanoscale dynamics of synaptic vesicle trafficking and fusion at the presynaptic active zone. eLife. 5, e13245(2016).
  24. Vaithianathan, T., Wollmuth, L. P., Henry, D., Zenisek, D., Matthews, G. Tracking newly released synaptic vesicle proteins at ribbon active zones. iScience. 17, 10-23 (2019).
  25. Shrestha, A. P., Vaithianathan, T. Tracking the dynamics of single fused synaptic vesicle proteins from a single ribbon active zone in zebrafish retinal bipolar cells. STAR Protoc. 3 (1), 101107(2022).
  26. Egashira, Y., Zempo, B., Sakata, S., Ono, F. Recent advances in neuromuscular junction research prompted by the zebrafish model. Curr Opinion Physiol. 4, 70-75 (2018).
  27. Egashira, Y., Kumade, A., Ojida, A., Ono, F. Spontaneously recycling synaptic vesicles constitute readily releasable vesicles in intact neuromuscular synapses. J Neurosci. 42 (17), 3523-3536 (2022).
  28. Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording synaptic plasticity in acute hippocampal slices maintained in a small-volume recycling-, perfusion-, and submersion-type chamber system. J Vis Exp. (131), e55936(2018).
  29. Myers, P. Z., Eisen, J. S., Westerfield, M. Development and axonal outgrowth of identified motoneurons in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2278-2289 (1986).
  30. Westerfield, M., Mcmurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  31. Brehm, P., Wen, H. Zebrafish neuromuscular junction: The power of n. Neurosci Lett. 713, 134503(2019).
  32. Ben Fredj, N., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. J Neurosci. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Mandal, A., et al. Retrograde mitochondrial transport is essential for organelle distribution and health in zebrafish neurons. J Neurosci. 41 (7), 1371-1392 (2021).
  34. Wong, H. C., Drerup, C. M. Using fluorescent indicators for in vivo quantification of spontaneous or evoked motor neuron presynaptic activity in transgenic zebrafish. STAR Protoc. 3 (4), 101766(2022).
  35. Truckenbrodt, S., Rizzoli, S. O. Spontaneous vesicle recycling in the synaptic bouton. Front Cell Neurosci. 8, 409(2014).
  36. Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular ph. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (1), 50-61 (2010).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

pHluorine imagingactiepotentiaalstimulatieepifluorescentiemicroscopiesynaptische transmissieexocytoseendocytosemotorneuronterminals

Gerelateerde artikelen