Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Preparaat van gewassen menselijke bloedplaatjes voor kwantitatieve metabole fluxstudies

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67639

⸱

10 januari 2025

 ,  ,  , 
1Depeartment of Chemical and Biological Engineering, Colorado School of Mines, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 3Department of Pediatrics, Section of Hematology, Oncology, and Bone Marrow Transplant, University of Colorado Denver, Anschutz Medical Campus, 4Quantitative Biosciences and Engineering, Colorado School of Mines

In dit artikel

Samenvatting

Het metabolisme van bloedplaatjes is van belang, vooral omdat het betrekking heeft op de rol van hyper- en hypoactiviteit van bloedplaatjes bij bloedingen en trombotische aandoeningen. Het isoleren van bloedplaatjes uit plasma is noodzakelijk voor sommige metabole testen; Hier wordt een methode gepresenteerd voor het isoleren van intracellulaire metabolieten uit gewassen bloedplaatjes.

Samenvatting

Bloedplaatjes zijn bloedcellen die een integrale rol spelen bij hemostase en de aangeboren immuunrespons. Hyper- en hypoactiviteit van bloedplaatjes zijn betrokken bij stofwisselingsstoornissen, waardoor het risico op zowel trombose als bloedingen toeneemt. Activering van bloedplaatjes en metabolisme zijn nauw met elkaar verbonden, met de talrijke methoden om de eerste te meten, maar relatief weinig voor de laatste. Om het metabolisme van bloedplaatjes te bestuderen zonder de tussenkomst van andere bloedcellen en plasmacomponenten, moeten bloedplaatjes worden geïsoleerd, een proces dat niet triviaal is vanwege de gevoeligheid voor afschuiving van bloedplaatjes en het vermogen om onomkeerbaar te activeren. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor bloedplaatjesisolatie (wassen) dat rustige bloedplaatjes produceert die gevoelig zijn voor stimulatie door bloedplaatjestagonisten. Opeenvolgende centrifugatiestappen worden gebruikt met de toevoeging van bloedplaatjesremmers om bloedplaatjes uit volbloed te isoleren en ze opnieuw te suspenderen in een gecontroleerde, isosmotische buffer. Deze methode produceert reproduceerbaar 30%-40% herstel van bloedplaatjes uit volbloed met lage activering, zoals gemeten door markers van granulesecretie en integrine-activiteit. Het aantal bloedplaatjes en de brandstofconcentratie kunnen nauwkeurig worden geregeld, zodat de gebruiker een verscheidenheid aan metabolische situaties kan onderzoeken.

Inleiding

Bloedplaatjes zijn kleine (2-4 μm diameter), kerncellen die een belangrijke rol spelen bij hemostase, het strak gereguleerde proces van stolselvorming1. Hoewel ze van vitaal belang zijn voor de vasculaire integriteit, zijn bloedplaatjes ook betrokken bij ongunstige gezondheidsgebeurtenissen. Bloedplaatjes zijn betrokken bij diepe veneuze trombose (DVT) en arteriële trombose (AT), dit zijn stolsels die bloedvaten afsluiten, wat leidt tot een verminderde bloedtoevoer ter plaatse, of, als stukjes van het stolsel afbreken (emboliseren), kunnen ze de bloedtoevoer naar de longen, het hart of de hersenen blokkeren 2,3,4,5,6,7 . Hyperreactiviteit van bloedplaatjes is een comorbiditeit van hypertensie, diabetes en kanker, wat leidt tot een verhoogde incidentie van DVT en AT 8,9,10. Activering van bloedplaatjes en metabolisme zijn nauw met elkaar verbonden11,12, wat leidt tot een grotere belangstelling voor het richten op het metabolisme van bloedplaatjes als therapeutische strategie13,14. Er is discussie over de exacte metabole herbedrading die optreedt bij activering, en dit is een actief vakgebied15. Deze toegenomen belangstelling voor dysfunctie van bloedplaatjes bij ziekten en de verbanden met het metabolisme onderstreept de noodzaak van een herhaalbare methode om bloedplaatjes te isoleren en hun metabolisme te bestuderen.

Menselijke bloedplaatjes worden meestal verkregen door venapunctie en vervolgens geïsoleerd uit volbloed.  Gewassen bloedplaatjes worden gescheiden van volbloed via opeenvolgende was- en centrifugatiestappen16. Dit werd oorspronkelijk gedaan door Mustard's groep17, en enigszins aangepast door Cazenave's groep18. Een ander alternatief zijn gelgefilterde bloedplaatjes, die kunnen worden verkregen uit bloedplaatjesrijk plasma (PRP) door chromatografie met uitsluiting van grootte met behulp van een verpakte kolom agarosegelkralen19. Er bestaan veel wasprotocollen voor zowel menselijk bloed als bloed van knaagdieren en zijn geoptimaliseerd voor verschillende tests 20,21,22,23, maar niet voor het meten van het metabolisme van bloedplaatjes.

Technieken om het metabolisme van bloedplaatjes te bestuderen zijn onder meer bio-energetische metingen via Seahorse XF-analysator 11,24,25,26,27, extracellulaire fluxmetingen 11,13,24, metabolomics 14,28 en isotoopondersteunde metabole fluxanalyse (13C-MFA)29. In metabolomische onderzoeken is het doel meestal om veranderde routes tussen twee verschillende aandoeningen te bepalen (bijvoorbeeld rust versus geactiveerde bloedplaatjes14). Metabolomische studies omvatten het gebruik van vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS). Deze studies kunnen worden gedaan voor intra- of extracellulaire metabolieten en worden vaak gekoppeld aan pathway-analyse of hoofdcomponentenanalyse (PCA)14,28. Isotoopondersteunde metabole fluxanalyse (13C-MFA) omvat het voeden van cellen met een gelabeld substraat dat bekend staat als een tracer, en meten hoe deze tracer zich voortplant via een reactienetwerk met LC-MS. Deze techniek maakt de berekening van fluxen via metabole routes mogelijk met een resolutie vanhet reactieniveau 29,30. In volbloed en bloedplaatjesrijk plasma (PRP) is de brandstofconcentratie (glucose, glutamine, acetaat, enz.) onderhevig aan variabiliteit tussen donor en albumine en geslachtshormoonbindend globuline dat in plasma aanwezig is, kan de actieve concentratie van hormonen, geneesmiddelen en andere biologisch relevante moleculen veranderen31. Gewassen bloedplaatjes bieden een methode om bloedplaatjes te suspenderen in een door de gebruiker gedefinieerd medium, inclusief bekende brandstofconcentraties, dat compatibel is met 13C-MFA32.

Hier wordt een methode beschreven voor het wassen van bloedplaatjes om bloedplaatjes te produceren die kunnen worden gebruikt in metabole tests. Het protocol produceert slapende bloedplaatjes met een lage besmetting van rode bloedcellen en witte bloedcellen.  De activeringsstatus van bloedplaatjes werd gecontroleerd via flowcytometrie van bloedplaatjesactiveringsmarkers. Dit protocol bereikt op reproduceerbare wijze ten minste 30%-40% herstel van bloedplaatjes ten opzichte van het aantal bloedplaatjes in volbloed. De gewassen bloedplaatjes die met deze techniek worden verkregen, zijn geschikt voor de metabole analysetechnieken en de intracellulaire metabolietextractiemethode kan worden aangepast aan de analyse naar keuze van de gebruiker (LC-MS, GC-MS, fotometrische test, enz.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De studie kreeg de goedkeuring van de Institutional Review Board van de Anschutz Medical Campus van de Universiteit van Colorado. Van alle deelnemers aan de studie werd schriftelijke toestemming verkregen. Deelnemers meldden dat ze de afgelopen 48 uur geen alcohol of niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) hadden gebruikt in de afgelopen tien dagen. Dit project wordt ondersteund door het National Heart, Lung and Blood Institute van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer R61HL141794.

1. Bloedafname

  1. Ingesteld voor bloedafname. Het wordt aanbevolen om bloedafname uit te voeren door een getrainde flebotomist.
  2. Voer een venapunctie uit op de binnenarm met een naald van 19 G.
  3. Verzamel de eerste ~2 ml in een vacutainer zonder additieven en gooi deze weg. Dit is om chemische signaalmoleculen uit beschadigde endotheelcellen te verwijderen die bloedplaatjes kunnen activeren. Nadat de eerste 2 ml is verzameld, verwijdert u de tourniquet om de schuifspanning op de bloedplaatjes te verminderen.
  4. Verzamel de rest van het bloed in anticoagulente citraatdextrose (ACD-A) vacutainers in een verhouding van 14:3 (bloed: ACD-A). Keer elke vacutainer na bloedafname voorzichtig om om bloed en antistollingsmiddel te mengen.

2. Bloedplaatjes wassen

figure-protocol-1
Figuur 1: Opeenvolgende centrifugatie- en resuspensiestappen bij het wassen van bloedplaatjes. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

OPMERKING: Vermijd het ontstaan van luchtbellen. Gebruik transferpipetten om luchtbellen te verwijderen wanneer ze worden gevormd, vooral voorafgaand aan het centrifugeren. Elke keer dat de buisjes bloed/bloedplaatjes open/gesloten zijn, is het aan te raden om in de buis te ademen voordat u de dop sluit om het CO2 -gehalte te verhogen.

  1. Verwarm de centrifuge voor op 37 °C om de temperatuureffecten te verminderen. Houd de centrifuge tussen elke centrifugatiestap in het protocol op 37 °C.
  2. Verwarm het waterbad voor op 37 °C. Plaats de gemodificeerde Tyrode's buffer met glucose in het waterbad.
    OPMERKING: het gewijzigde bufferrecept van Tyrode is te vinden in aanvullend bestand 1.
  3. Combineer het verzamelde volbloed van alle vacutainers in conische buisjes van 50 ml polypropyleen. Gebruik een afgeschuinde pipetpunt die in een hoek van 45° is gesneden en neem het juiste monstervolume om een celtelling uit te voeren (zie Cellen tellen).
  4. Verwijder eventuele luchtbellen die zijn ontstaan door voorzichtig op te zuigen met een transferpipet met smalle boring.
  5. Laat het bloed 25 minuten rusten in een waterbad bij 37 °C, waardoor bloedplaatjes in een omkeerbaar geactiveerde toestand (van verwijdering uit het lichaam, overdracht van buis naar buis, enz.) kunnen terugkeren naar een rusttoestand.
  6. Om activering tijdens het centrifugeren te voorkomen, voegt u 500 nM prostaglandine I2 (BGI2) en 0,02 E/ml apyrase toe aan volbloed en mengt u voorzichtig door één keer om te keren.  Verwijder eventuele luchtbellen die zijn ontstaan met behulp van een transferpipet met smalle boring.
    OPMERKING: Instructies voor het juiste BGA2 - en apyraserecept zijn te vinden in aanvullend bestand 1.
  7. Centrifugeer volbloed om bloedplaatjesrijk plasma (PRP) te verkrijgen (15 minuten bij 250 x g voor 42 ml volbloed) zonder rem (37 °C).
  8. Verzamel voorzichtig de PRP (bovenste gele laag boven de buffy coat en rode bloedlaag) in een nieuwe conische buis van 50 ml met behulp van een transferpipet met brede boring.
  9. Kantel tijdens het overbrengen een schone conische buis en laat de PRP voorzichtig langs de zijkant van de buis lopen. Vermijd luchtbellen.
  10. Laat ongeveer 3 mm PRP achter om de buffy coat (de laag witte bloedcellen tussen de PRP en het rode bloed) niet te verstoren. Als dit wordt verstoord, ziet dit eruit als een plotselinge werveling van wit in de transferpipet.
  11. Neem het aantal cellen (zie Bloedplaatjes tellen) om het resuspensievolume voor de volgende wasstap te bepalen.
  12. Laat 10 minuten rusten bij 37 °C.
  13. Neem met behulp van een afgeschuinde pipetpunt een monster voor flowcytometrie (zie Flowcytometrie).
  14. Voeg 500 nM BGA2 en 0,02 E/ml apyrase toe aan PRP en meng door één keer voorzichtig om te keren.
  15. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1000 x g bij 37 °C (acceleratie: 0 rem: 0). Gebruik geen rem. De pellet is niet compact en een plotselinge rem kan hermixen veroorzaken.
  16. Bepaal tijdens het centrifugeren het resuspensievolume. Ga uit van 75% herstel. Maak de celdichtheid ongeveer 3x105 cellen/μL.
  17. Zuig het bovenstaande aan met behulp van een plastic transferpipet met brede boring voor het bulkvolume en een pipet van 1 ml (ongesneden punt) voor de rest van de vloeistof in de buurt van de pellet. Vermijd het aanraken van de pellet aan de onderkant van de buis.
  18. Voeg 500 nM BGA2 en 0,02 E/ml apyrase toe aan de gemodificeerde buffer van Tyrode. Voeg langzaam de berekende hoeveelheid buffer toe vanaf stap 16 door langs de zijkant van de conische buis naar beneden te druppelen.
  19. Gebruik een afgeschuinde punt en een pipetpunt van 1 ml om de pellet voorzichtig opnieuw te suspenderen door meerdere keren voorzichtig op en neer te pipetteren.
    1. Stel het volume in op 300 μL, druk de zuiger helemaal in terwijl deze zich boven de vloeistoflijn bevindt, plaats de pipet onder de vloeistof en kom tot aan de eerste stop. Hierdoor kan de wetenschapper de pellet opnieuw suspenderen zonder per ongeluk luchtbellen te creëren die de bloedplaatjes kunnen activeren.
    2. Af en toe zit er een ring van zichtbare rode bloedcellen op de bodem van de pellet. Vermijd het opnieuw suspenderen hiervan.
  20. Zodra de pellet is geresuspendeerd, gebruikt u een transferpipet met brede boring om de geresuspendeerde pellet over te brengen naar een nieuwe conische buis, waarbij eventuele rode bloedcellen of zichtbaar samengeklonterde cellen achterblijven.
  21. Herhaal stap 11-20. Zorg ervoor dat u 500 nM BGA2 en 0,02 E/ml van een nieuw aliquot toevoegt aan de gewijzigde Tyrode's buffer (gebruik de gewijzigde Tyrode's buffer van stap 18 niet opnieuw, BGA2 is te onstabiel).
  22. Neem een monster voor het aantal cellen. Pas de bloedplaatjesconcentratie indien nodig aan met de gewijzigde buffer van Tyrode.
  23. Gebruik een afgeschuinde pipetpunt om een monster te nemen voor flowcytometrie.
  24. Laat de bloedplaatjes 1 uur rusten bij 37 °C om de remmers de tijd te geven om uit te werken en om eventuele omkeerbaar geactiveerde bloedplaatjes terug te laten keren naar een rusttoestand.
  25. Meng voorzichtig met een pipet met brede boring. Neem monsters voor flowcytometrie.
  26. De gewassen, rustende bloedplaatjes zijn nu klaar om te worden gebruikt voor metabole analyse.

3. Bloedplaatjes tellen

  1. Bloedplaatjes kunnen worden geteld met behulp van een geautomatiseerde bloedcelteller (volg de instructies van de fabrikant) of een hemocytometer33.

4. Flowcytometrie

  1. Voorbereiding
    1. Gedetailleerde protocollen en beoordelingen van best practices voor het opzetten van antilichaammengsels en het voorbereiden van de flowcytometer om de activering van bloedplaatjes te meten, zijn elders te vinden34,35.
  2. Monsterneming
    1. Wanneer u een monster neemt voor flowcytometrie, verzamelt u de bloedplaatjesuspensie met behulp van een afgeschuinde pipetpunt. Voeg dit langzaam toe aan een microcentrifugebuisje met antilichamen en veeg dan voorzichtig om te mengen. Laat 30 s incuberen.
    2. Breng met behulp van de afgeschuinde pipetpunt de bloedplaatjesuspensuspensie/antilichaammix over naar de juiste put op de plaat met 96 putjes.
    3. Voeg onmiddellijk fixant toe aan de put om cellen te fixeren.
    4. Draai binnen 8 uur na fixatie op de flowcytometer.
  3. Gevoeligheidstests voor agonisten
    1. Zet na het wassen 2 conische tubes van 15 ml opzij, één voor een rustregeling en één als trombine-geactiveerde regeling.
    2. Piket voorzichtig 100 μl bloedplaatjesuspensie in elke conische buis met behulp van een afgeschuinde pipetpunt. Laat 1 uur rusten bij 37 °C.
    3. Voeg na het uur rust 0,1 E/ml trombine toe aan de ene tube (instructies voor de bereiding van trombine zijn te vinden in aanvullend dossier 1) en het voertuig aan de andere. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    4. Neem een flowcytometriemonster van elk buisje om de gevoeligheid van bloedplaatjes voor agonist te bepalen.

5. Bemonstering voor kwantitatieve analyse van de metabole flux

  1. Afschrikken
    OPMERKING: Het blusmetabolisme is een noodzakelijke stap voor het meten van nauwkeurige metabolische fluxen. Het snel afkoelen van cellen en het handhaven van hun temperatuur op of onder 4 °C vertraagt het metabolisme zodanig dat kan worden aangenomen dat het in wezen tot stilstand is gebracht, zodat de bemonsterde cellen het metabolisme van cellen uit de bulk nauwkeurig weerspiegelen. Er zijn verschillende methoden die kunnen worden gebruikt, maar om de behoefte aan snelle koeling in evenwicht te brengen en lekkage tot een minimum te beperken, gebruikt u koude (-4 °C) normale zoutoplossing36. Als zout de daaropvolgende analyse verstoort, kan een andere vloeistof worden gebruikt (methanol/water, ethanol, enz.)37. okt. 37.
    1. Bereid en vries aliquots van normale zoutoplossing in. Maak elke zoutoplossing aliquot op 6x het volume van het gewenste monster.
      OPMERKING: het recept voor normale zoutoplossing is te vinden in aanvullend bestand 1.
    2. Koel de microcentrifuge voor tot 0 °C.
    3. Verzamel bloedplaatjesuspensuspensie in gedeeltelijk ingevroren normale zoutoplossing (< -4 °C) in een verhouding van 1:6 (verzamel bijvoorbeeld 150 μL bloedplaatjesuspensuspensie in 750 μL zoutoplossing in microcentrifugebuisjes).
      OPMERKING: Laat de bloedplaatjes/zoutoplossing niet langer dan 15 minuten op ijs liggen.
    4. Centrifugeren bij 16.000 x g, 0 °C gedurende 10 min.
    5. Bewaar het bovenstaande voor externe metabolietanalyse en de pellet voor intracellulaire metabolietextractie en meting. Bewaar beide bij -20 °C tot ze klaar zijn voor analyse.
    6. Herhaal dit proces over het gewenste tijdsinterval en het aantal tijdstippen van het monster.
  2. Intracellulaire metabolietextractie
    1. Voeg 0,5 ml voorgekoeld 7:3 methanolwater bij -20 °C toe aan de gebluste pellet. Draai krachtig gedurende 1 min.
    2. Vries in vloeibare stikstof in, ontdooi bij 0 °C en herhaal vervolgens nog 2 cycli.
    3. Centrifugeer de suspensies gedurende 10 minuten bij 16.000 x g bij -4 °C.
    4. Vang het bovenstaande op in een nieuwe microcentrifugebuis.
    5. Gebruik de pellet uit stap 3 en herhaal het extractieprotocol (stap 1-3) met 50:50 methanol:water. Voeg het tweede verzamelde uittreksel toe aan het eerste. Een nacht drogen.
    6. Resuspendeer het gedroogde extract in 150 μl water van LC-MS-kwaliteit (of een ander oplosmiddel dat geschikt is voor de beoogde analyse). Meng gedurende 15 minuten op 4 °C. Kort vortex en overbrengen naar microcentrifugebuisjes van 0,22 μm om celresten te verwijderen. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g en 4 °C.
    7. Haal uit de centrifuge, pipetteer nog eens 50 μL optima-water op het filter en centrifugeer opnieuw (5 min, 16.000 x g en 4 °C) om het filter te spoelen. Verzamel voor analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve resultaten in figuur 2 vertegenwoordigen 6 verschillende bloeddonoren, waaronder 3 mannen en 3 vrouwen. De trombocytenopbrengst ten opzichte van volbloed wordt weergegeven in figuur 2A. Het uiteindelijke herstel van bloedplaatjes was gemiddeld 52% ± 3% (standaarddeviatie, n=6). Het uiteindelijke aantal bloedplaatjes in vergelijking met de besmetting van witte bloedcellen werd gemeten met behulp van een geautomati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Bloedplaatjes zijn erg gevoelig voor hun omgeving, waaronder schuifspanning en de aanwezigheid van agonisten 38,39. Dit maakt bloedplaatjes moeilijk te hanteren en te isoleren, waardoor het gebruik van remmers en pipetten met brede boring cruciaal is40. Een goede opslag en bereiding van BGA2 is van vitaal belang, aangezien het niet bereiden van BGA2 in basis PBS zal leiden tot een sne...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflict te melden.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag Dr. Emily Janus-Bell en Clarisse Mouriaux van het lab van Dr. Pierre Mangin en Katrina Bark van het lab van Dr. Jorge DiPaola bedanken voor hun begeleiding en advies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.22 µM filter Spin-X tubesMillapore-SigmaCLS8160Reagensvoorbereiding
19 G x 3/4" naaldMcKesson Corporation448406Flebotomie
21 G 1,5 inch naald met luer-lockAmazonB0C39PJD23Reagensvoorbereiding
96 well plate, half areaGreiner Bio-One675101Flow cytometry
ACD-A vacutainers Fisher Scientific364606Flebotomie
AdapterMcKesson Corporation609Flebotomie
AlcoholdoekjeVWR15648-916Flebotomie
Apyrase uit aardappelsSigmaA6410-100UNReagensvoorbereiding
CD42a monoklonaal antilichaamThermo Fisher Scientific48-0428-42Flow cytometry
Gekoelde microcentrifuge ThermoFisher Scientific75002441Blussing
D-GlucoseSigmaG7021Reagensvoorbereiding
FITC Anti-Fibrinogeen antilichaamAbcam4217Flow cytometry
Flow cytometerBeckman Coulter82922828Flow cytometry
GaasVWR76049-110Flebotomie
GlycerolSigma AldrichG5516Reagensvoorbereiding
HEPESSigma AldrichH4034Reagensvoorbereiding
Menselijke alpha-trombineProlytixHCT-0020Flow cytometry
KClSigma AldrichP9333Reagensvoorbereiding
KH2PO4Sigma AldrichP5655Reagensvoorbereiding
MgCl2SigmaM8266Reagensvoorbereiding
MicrocentrifugebuizenVWR87003-292Algemeen
Na2HPO4SigmaS3264Reagensvoorbereiding
NaClSigma AldrichS7653Reagensvoorbereiding
NaHCO3Sigma AldrichS5761Reagensvoorbereiding
Nauwe transferpijpVWR16001-176Trombocyetwassing
Paraformaldehyde oplossing, 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692Flow cytometry
PECy5 Muis Anti-Mens CD62PBD Pharmingen551142Flow cytometry
Plate dekselThermo Fisher ScientificAB0626Flow cytometry
Polypropyleen 15 mL kegelbuizenVWR89039-658Reagensvoorbereiding
Polypropyleen 50 mL kegelbuizenVWR352070Trombocyetwassing
Prostaglandine I2 (natriumzout)Cayman Chemical18220Reagensvoorbereiding
SKC Inc. C-Chip Wegwerp HemocytometersFisher Scientific22-600-100Celtelling
SpuitBD Pharmingen14-823-41Reagensvoorbereiding
TourniquetVWR76235-371Flebotomie
VakuumflesnaaldhouderBD364815Flebotomie
VortexerVWR102091-234Reagensvoorbereiding
WaterbadThermo Fisher ScientificTSGP02Trombocyetwassing
Brede transferpijpVWR76285-362Trombocyetwassing

Referenties

  1. Versteeg, H. H., Heemskerk, J. W., Levi, M., Reitsma, P. H. New fundamentals in hemostasis. Physiol Rev. 93 (1), 327-358 (2013).
  2. Webera, M., et al. Enhanced platelet aggregation with trap-6 and collagen in platelet aggregometry in patients with venous thromboembolism. Thromb Res. 107, 325-328 (2002).
  3. Herbert, J. M., Bernat, A., Maffrand, J. P. Importance of platelets in experimental venous thrombosis in the rat. Blood. 80 (9), 2281-2286 (1992).
  4. Puurunen, M. K., Hwang, S. J., O'donnell, C. J., Tofler, G., Johnson, A. D. Platelet function as a risk factor for venous thromboembolism in the framingham heart study. Thromb Res. 151, 57-62 (2017).
  5. Montoro-Garcia, S., Schindewolf, M., Stanford, S., Larsen, O. H., Thiele, T. The role of platelets in venous thromboembolism. Semin Thromb Hemost. 42 (3), 242-251 (2016).
  6. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: An update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2017).
  7. Yeung, J., Li, W., Holinstat, M. Platelet signaling and disease: Targeted therapy for thrombosis and other related diseases. Pharmacol Rev. 70 (3), 526-548 (2018).
  8. Ferreiro, J. L., Gomez-Hospital, J. A., Angiolillo, D. J. Platelet abnormalities in diabetes mellitus. Diab Vasc Dis Res. 7 (4), 251-259 (2010).
  9. Buergy, D., Wenz, F., Groden, C., Brockmann, M. A. Tumor-platelet interaction in solid tumors. Int J Cancer. 130 (12), 2747-2760 (2012).
  10. Gkaliagkousi, E., Passacquale, G., Douma, S., Zamboulis, C., Ferro, A. Platelet activation in essential hypertension: Implications for antiplatelet treatment. Am J Hypertens. 23 (3), 229-236 (2010).
  11. Fidler, T. P., et al. Deletion of GLUT1 and GLUT3 reveals multiple roles for glucose metabolism in platelet and megakaryocyte function. Cell Rep. 20 (4), 881-894 (2017).
  12. Fidler, T. P., et al. Glucose metabolism is required for platelet hyperactivation in a murine model of type 1 diabetes. Diabetes. 68 (5), 932-938 (2019).
  13. Kulkarni, P. P., et al. Aerobic glycolysis fuels platelet activation: Small-molecule modulators of platelet metabolism as anti-thrombotic agents. Haematologica. 104 (4), 806-818 (2019).
  14. Ghatge, M., Flora, G. D., Nayak, M. K., Chauhan, A. K. Platelet metabolic profiling reveals glycolytic and 1-carbon metabolites are essential for gp vi-stimulated human platelets-brief report. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (2), 409-416 (2024).
  15. Ravera, S., Signorello, M. G., Panfoli, I. Platelet metabolic flexibility: A matter of substrate and location. Cells. 12 (13), (2023).
  16. Hechler, B., Dupuis, A., Mangin, P. H., Gachet, C. Platelet preparation for function testing in the laboratory and clinic: Historical and practical aspects. Res Pract Thromb Haemost. 3 (4), 615-625 (2019).
  17. Mustard, J. F., Perry, D. W., Ardille, N. G., Packham, M. A. Preparation of suspensions of washed platelets from humans. British Journal of Haematology. 22, 193-204 (1972).
  18. Cazenave, J. P., et al. Preparation of washed platelet suspensions from human and rodent blood. Methods Mol Biol. 272, 13-28 (2004).
  19. Fine, K., Ashbrook, P., Brigden, L., Maldonado, J., Didishelm, P. Gel-filtered human platelets. Ultrastructure, function, and role of proteins in inhibition of aggregation by aspirin. Am J Pathol. 84 (1), (1976).
  20. Weiss, L., et al. An optimized protocol to isolate quiescent washed platelets from human whole blood and generate platelet releasate under clinical conditions. STAR Protoc. 4 (2), 102150(2023).
  21. Burzynski, L. C., Pugh, N., Clarke, M. C. H. Platelet isolation and activation assays. Bio Protoc. 9 (20), e3405(2019).
  22. Aurbach, K., Spindler, M., Haining, E. J., Bender, M., Pleines, I. Blood collection, platelet isolation and measurement of platelet count and size in mice-a practical guide. Platelets. 30 (6), 698-707 (2018).
  23. Narciso, M. G., Nasimuzzaman, M. Purification of platelets from mouse blood. J Vis Exp. (147), (2019).
  24. Aibibula, M., Naseem, K. M., Sturmey, R. G. Glucose metabolism and metabolic flexibility in blood platelets. J Thromb Haemost. 16 (11), 2300-2314 (2018).
  25. Ravi, S., et al. Metabolic plasticity in resting and thrombin-activated platelets. PLoS One. 10 (4), e0123597(2015).
  26. Nayak, M. K., et al. an inhibitor of pyruvate dehydrogenase kinases, inhibits platelet aggregation and arterial thrombosis. Blood Advances. 2, (2018).
  27. Hadley, J. B., et al. Hormones, age, and sex affect platelet responsiveness in vitro. Transfusion. 62 (9), 1882-1893 (2022).
  28. Paglia, G., et al. Comprehensive metabolomic study of platelets reveals the expression of discrete metabolic phenotypes during storage. Transfusion. 54 (11), 2911-2923 (2014).
  29. Sake, C. L., et al. Isotopically nonstationary (13)c metabolic flux analysis in resting and activated human platelets. Metab Eng. 69, 313-322 (2022).
  30. Antoniewicz, M. R. A guide to metabolic flux analysis in metabolic engineering: Methods, tools and applications. Metab Eng. 63, 2-12 (2021).
  31. Larsen, M. T., Kuhlmann, M., Hvam, M. L., Howard, K. A. Albumin-based drug delivery: Harnessing nature to cure disease. Mol Cell Ther. 4 (3), (2016).
  32. Balduini, C. L., Noris, P. P. latelet count and aging. Haematologica. 9 (6), 953-955 (2014).
  33. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology. Using a hemacytometer to count cells. , (2023).
  34. Spurgeon, B. E. J., Naseem, K. M. Platelet flow cytometry: Instrument setup, controls, and panel performance. Cytometry B Clin Cytom. 98 (1), 19-27 (2020).
  35. Van Velzen, J. F., Laros-Van Gorkom, B. A., Pop, G. A., Van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  36. Sake, C. L., Newman, D. M., Boyle, N. R. Evaluation of quenching methods for metabolite recovery in photoautotrophic synechococcus sp. Pcc 7002. Biotechnol Prog. 36 (5), e3015(2020).
  37. Sapcariu, S. C., et al. Simultaneous extraction of proteins and metabolites from cells in culture. MethodsX. 1, 74-80 (2014).
  38. Rana, A., Westein, E., Niego, B., Hagemeyer, C. E. Shear-dependent platelet aggregation: Mechanisms and therapeutic opportunities. Front Cardiovasc Med. 6, 141(2019).
  39. Ding, J., et al. Quantification of shear-induced platelet activation: High shear stresses for short exposure time. Artif Organs. 39 (7), 576-583 (2015).
  40. Ardlie, N., Perry, D., Packham, M., Mustard, J. Influence of apyrase on stability of suspensions of washed rabbit platelets. Proc Soc Exp Biol Med. 136 (4), (1971).
  41. Rao, G. H. R., Reddy, K. R., Hagert, K., White, J. G. Influence of ph on the prostacyclin (pg12) mediated inhibition of platelet function. Prostaglandins Medicine. 4, 263-273 (1980).
  42. Navred, K., et al. A simplified flow cytometric method for detection of inherited platelet disorders-a comparison to the gold standard light transmission aggregometry. PLoS One. 14 (1), e0211130(2019).
  43. Aldrighi, J. M., et al. Platelet activation status decreases after menopause. Gynecol Endocrinol. 20 (5), 249-257 (2005).
  44. Bausset, O., et al. Formulation and storage of platelet-rich plasma homemade product. Biores Open Access. 1 (3), 115-123 (2012).
  45. Nayak, M. K., et al. The metabolic enzyme pyruvate kinase m2 regulates platelet function and arterial thrombosis. Blood. 137 (12), 1658-1668 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Isolatie van bloedplaatjesmetabolisme van bloedplaatjesactivatie van bloedplaatjesflowcytometriebehandeling met trombineprotocol voor het wassen van bloedplaatjesherstel van bloedplaatjesbloedplaatjesagonisten
Preparaat van gewassen menselijke bloedplaatjes voor kwantitatieve metabole fluxstudies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.