Methodenartikel

2.5D-model voor ex vivo mechanische karakterisering van kiemende angiogenese in levend weefsel

DOI:

10.3791/67641

⸱

28 februari 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Soft Tissue Engineering and Mechanobiology, Eindhoven University of Technology, 2Institute for Complex Molecular Systems, Eindhoven University of Technology, 3Institute for Bioengineering of Catalonia, The Barcelona Institute of Science and Technology, 4Faculty of Science and Engineering, Cell Biology, Åbo Akademi University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ontkiemende angiogenese, fundamenteel voor ontwikkeling en ziekte, omvat complexe moleculaire en mechanische processen. We presenteren een veelzijdig 2.5D ex vivo model dat cellulaire ontspruiting uit de halsslagaders van varkens analyseert, waarbij stijfheidsafhankelijke angiogenese en verschillende leider-volgercelmechanica worden onthuld. Dit model helpt bij het bevorderen van strategieën voor weefselmanipulatie en benaderingen van kankertherapie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kiemende angiogenese is de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande bloedvaten en is van groot belang voor fysiologische zoals weefselgroei en -herstel en pathologische processen, waaronder kanker en metastase. Het meerstapsproces van het ontkiemen van angiogenese is een moleculair en mechanisch aangedreven proces. Het bestaat uit inductie van cellulaire spruit door vasculaire endotheliale groeifactor, leider/volger-celselectie door Notch-signalering, gerichte migratie van endotheelcellen en vaatfusie en stabilisatie. In de loop der jaren zijn er verschillende angiogenesemodellen ontwikkeld om de onderliggende mechanismen van cellulaire kieming beter te begrijpen. Ondanks vooruitgang in het begrijpen van de moleculaire drijfveren van kiemende angiogenese, blijft de rol van mechanische signalen en de mechanische aanjager van kiemende angiogenese onderbelicht vanwege beperkingen in bestaande modellen. In deze studie hebben we een 2,5D ex vivo model ontworpen dat ons in staat stelt om cellulaire ontkieming uit een halsslagader van een varken mechanisch te karakteriseren met behulp van tractiekrachtmicroscopie. Het model identificeert verschillende krachtpatronen in de spruit, waarbij leidercellen trekkrachten uitoefenen en volgcellen duwende krachten uitoefenen op de matrix. De veelzijdigheid van het model maakt het mogelijk om zowel chemische als mechanische signalen, zoals matrixstijfheid, te manipuleren, waardoor het relevanter wordt voor verschillende micro-omgevingen. Hier tonen we aan dat het begin van ontkiemende angiogenese stijfheidsafhankelijk is. Het gepresenteerde 2.5D-model voor het kwantificeren van cellulaire trekkrachten bij kiemende angiogenese biedt een vereenvoudigde maar fysiologisch relevante methode, die ons begrip van cellulaire reacties op mechanische signalen verbetert, wat weefselmanipulatie en therapeutische strategieën tegen tumorangiogenese zou kunnen bevorderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Angiogenese is het proces van de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande bloedvaten. Dit proces is essentieel tijdens de embryonale ontwikkeling, wondgenezing en kankerprogressie, die allemaal verband houden met biomechanische veranderingen in de micro-omgeving 1,2,3,4. Bij het begin van angiogenese geven hypoxische of beschadigde weefsels vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) af die de endotheelcellen van naburige bloedvaten activeert om endotheliale spruiten te vormen - waarbij twee verschillende leider- en volgerfenotypes worden overgenomen via de moleculaire Notch-signaleringsroute5. Bij de vorming van endotheliale spruiten, een fenomeen dat bekend staat als kiemende angiogenese, zullen leidercellen de omringende extracellulaire matrix degraderen om collectief naar de VEGF-stimulus te migreren zonder cel-celverklevingen met de achterblijvende volgcellen te verliezen 6,7.

In de afgelopen decennia zijn er steeds meer ontkiemende angiogenese-assays beschreven die collectieve celmigratie onderzoeken via verschillende methodologieën, die elk verschillende voordelen en beperkingen bieden. Deze tests beoordelen de gecoördineerde beweging van celgroepen, zoals endotheelcellen, door middel van 3D-matrices, waardoor cellulair gedrag zoals ontkiemen, invasie en collectieve migratie in een gecontroleerde omgeving kan worden bestudeerd 8,9,10. In vivo kiemangiogenese-assays bieden een uitgebreide evaluatie binnen een levend organisme, waarbij ingewikkelde interacties worden vastgelegd, maar zijn tijdrovend, kostbaar, vatbaar voor grote variabiliteit en moeilijk te kwantificeren11,12. In vitro kiemangiogenese-assays maken nauwkeurige controle mogelijk over experimentele omstandigheden met een hoge reproduceerbaarheid en nauwkeurige kwantificering, maar repliceren mogelijk niet volledig in vivo complexiteiten 11,12,13. Daarentegen gebruiken ex vivo kiemangiogenese-assays, waarvan de aortaringtest het meest uitgevoerde model is, weefsels buiten het organisme, waardoor de fysiologische relevantie behouden blijft en in vivo complicaties worden vermeden 14,15,16. Ondanks dat ze technisch uitdagend zijn en soms worstelen met de levensvatbaarheid van weefsels, bieden ex vivo-modellen een waardevolle balans tussen complexiteit en controle, waardoor ze een veelbelovende benadering zijn voor het bestuderen van kiemende angiogenese. Hoewel deze modellen op grote schaal zijn gebruikt om de moleculaire drijfveren van ontkiemende angiogenese te bestuderen, blijft het effect van mechanische signalen en het mechanische gedrag van cellen slecht begrepen.

Meercellige migratie tijdens het ontkiemen van angiogenese is sterk afhankelijk van cellulaire mechanica, aangezien op actomyosine gebaseerde contractiele krachten de invasie van endotheelcellen in de omringende extracellulaire matrix reguleren 17,18,19,20. In het bijzonder is waargenomen dat niet-spiermyosine II-motoren, de belangrijkste op actine gebaseerde contractiele machines in de cel21, de cellulaire contractiele krachten beheersen tijdens het ontkiemen van angiogenese22,23. De leidercel is waarschijnlijk het overheersende krachtgenererende element van de spruit, aangezien de vervormingen van de omringende 3D-extracellulaire matrix significant hoger zijn rond de leidercel, met name nabijgelegen actinerijke cellulaire uitsteeksels23,24, vergeleken met zijn volgelingen 22,23,25. Ondanks dit groeiende bewijs van het belang van cellulaire contractiliteit bij het ontkiemen van angiogenese in 3D, ontbreekt een methode voor spatiotemporele mechanische karakterisering van cellulaire mechanica van ontkiemende angiogenese.

Het algemene doel van deze studie is het ontwikkelen van een methode die de mechanische karakterisering van cellulaire migratie tijdens het ontkiemen mogelijk maakt. Door spatiotemporele karakterisering van mechanische krachten in een biologisch relevante context te bereiken, willen we nieuwe inzichten verschaffen in hoe cellulaire mechanica de vorming van angiogene spruiten beïnvloedt. Daartoe hebben we een 2,5D-modelsysteem ontwikkeld door een 2D-polyacrylamide (PAA) hydrogel te maken, er een halsslagadervel op te zaaien en deze te bedekken met een dunne laag collageen type I-gel om een gelokaliseerde 3D-omgeving voor de cellen tot stand te brengen. Meercellige spruiten migreerden uit de arteriële plaat op de PAA-collageengelinterface. Het voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande technieken is dat de 2D PAA-hydrogel analyses mogelijk maakt door middel van trekkrachtmicroscopie (TFM) - een bekende veelzijdige techniek waarbij cellen zich hechten aan een elastisch 2D-substraat en het substraat vervormen bij cellulaire trekkrachten26. Deze vervormingen kunnen worden opgevangen en cellulaire trekkrachten kunnen worden berekend op basis van de mechanische eigenschappen van het substraat26. Door TFM aan te passen voor gebruik in ex vivo levende weefsels, willen we de kloof tussen in vitro controle en in vivo relevantie overbruggen, door een beter begrip te krijgen van mechanische krachten tijdens angiogenese.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werden halsslagaders van varkens gebruikt. Varkenshalsslagaders werden geoogst van Nederlandse Landrace hybride varkens - leeftijd 5-7 maanden en gewicht (levend) 80-120 kg - verkregen van een lokaal slachthuis. De protocollen waren in overeenstemming met de EG-verordeningen 1069/2009 met betrekking tot slachtdiermateriaal voor diagnose en onderzoek onder toezicht van de Nederlandse overheid (Ministerie van Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit) en werden goedgekeurd door de bijbehorende wettelijke autoriteiten voor dierenwelzijn (Voedsel- en Warenautoriteit). Ethische goedkeuring was niet vereist omdat weefsel werd geoogst uit bijproducten van reeds beëindigde dieren. De tijd tussen overlijden en weefseltransport is 10-25 minuten, afhankelijk van het slachthuis.

OPMERKING: De materiaaltabel geeft een overzicht van de details, apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt. Protocollen voor 2D- en 3D-monsters worden beschreven in het aanvullend bestand 1.

1. Voorbereiding van 2D polyacrylamide (PAA) substraten

  1. Bereid in de zuurkast bindselaanoplossing door 12:1:1 absolute ethanol (voor synthese), azijnzuur en bindsilaan te mengen bij respectievelijk 4286 μl, 357 μl en 357 μl. Incubeer 120 μL/putje bindsilaanoplossing op een plaat met 12 putjes op glazen bodem gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    LET OP: Absolute ethanol is een licht ontvlambare vloeistof en damp (H225) en veroorzaakt ernstige oogirritatie (H319). Azijnzuur is een ontvlambare vloeistof en damp (H226) en veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel (H314). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een zuurkast.
  2. Was in de zuurkast de 12-kleps plaat met glazen bodem 3x met absolute ethanol (industrieel) met behulp van een spuitfles. Gooi de ethanol weg.
  3. Droog de 12-puts plaat met glazen bodem af met stikstofgas. Als er een witte glace op de bovenkant van de glazen bodem verschijnt, was wassen niet voldoende. Was de plaat met 12 putjes aan de glazen bodem opnieuw.
  4. Bereid het PAA-gelmengsel volgens de verhoudingen in tabel 1.
    1. Voeg PBS toe aan een microcentrifugebuisje en resuspendeer 40% acrylamide, 2% bis-acrylamide en fluorescerende markers in het gelmengsel. Vortex de oplossing vlak voor de bereiding van de gel.
    2. Voeg zo snel mogelijk 10% APS en TEMED toe aan de oplossing en vortex na de toevoeging van elk element. Pipetteer een druppel van 11,5 μL gelmengsel op de glazen bodem van elk putje en plaats voorzichtig een dekglaasje van 13 mm op de druppel.
    3. Tik en draai zachtjes op de plaat om het gelmengsel gelijkmatig onder het dekglaasje te verdelen. Als er luchtbellen verschijnen, verwijder deze dan door het dekglaasje voorzichtig op te tillen. Laat de gels 1 uur polymeriseren bij kamertemperatuur. Controleer de polymerisatie met behulp van het resterende gelmengsel in de tube. Gepolymeriseerde PAA-gels in de plaat met 12 putjes zullen een binnenste halo vertonen.
      LET OP: Acrylamide is schadelijk bij inslikken of inademing (H302 + H332), veroorzaakt huidirritatie (H315), kan een allergische huidreactie veroorzaken (H317), veroorzaakt ernstige oogirritatie (H319), kan genetische defecten veroorzaken (H340), kan kanker veroorzaken (H350), wordt verdacht van schadelijk voor de vruchtbaarheid (H361f) en veroorzaakt schade aan organen bij langdurige of herhaalde blootstelling bij inslikken (H372). APS kan het vuur versterken (oxidatiemiddel, H272), schadelijk zijn bij inslikken (H302), huidirritatie veroorzaken (H315), een allergische huidreactie veroorzaken (H317), ernstige oogirritatie veroorzaken (H319), allergie- of astmasymptomen of ademhalingsmoeilijkheden veroorzaken bij inademing (H334) en irritatie van de luchtwegen veroorzaken (H335). TEMED is een licht ontvlambare vloeistof en damp (H225), schadelijk bij inslikken (H302), veroorzaakt ernstige brandwonden en oogletsel (H314) en is giftig bij inademing (H331). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen.
  5. Voeg na polymerisatie PBS toe aan de put. Gebruik een pincet en/of een gebogen naald om het dekglaasje voorzichtig op te tillen en te verwijderen. Was gels één keer in PBS.
  6. Om de collageencoating van de PAA-gels te vergemakkelijken, moeten de gels worden gefunctionaliseerd met behulp van de crosslinker Sulfo-SANPAH. Voeg 75 μL 1 mg/ml Sulfo-SANPAH opgelost in ultrapuur water toe aan de PAA-gel en incubeer gedurende 5 minuten onder 365 nm UV-licht.
    OPMERKING: Houd Sulfo-SANPAH beschermd tegen licht en voeg ultrapuur water toe vlak voor UV-incubatie. Een verkleuring is zichtbaar van lichtrood (vóór UV-licht incubatie) tot donkerrood (na UV-licht incubatie).
    LET OP: Sulfo-SANPAH veroorzaakt ernstige oogirritatie (H319).
  7. Voer in de bioveiligheidskast een snelle steriele PBS-wasbeurt uit van de Sulfo-SANPAH op de gels. Was daarom de gefunctionaliseerde PAA-gels 2x in steriel PBS gedurende 10 minuten.
    OPMERKING: Vanaf dit punt in het protocol worden alle stappen onder steriele omstandigheden uitgevoerd.
  8. Bereid in de bioveiligheidskast een 0,1 mg/ml collageen type IV-oplossing in PBS op ijs. Pineer 50 μL 0,1 mg/ml collageen type IV druppel bovenop de gefunctionaliseerde PAA-gel en incubeer een nacht bij 4 °C.
  9. Was de gels 2x in steriel PBS. Verwijder de PBS en laat de gels 5 minuten drogen.
  10. Pineer een druppel van 50 μl endotheelcelgroei (ECG) op de gels en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C en 5% CO2.
    OPMERKING: Het incuberen van de gels in het ECG-medium verbetert de cel- en weefselaanhechting aan de gels.

2. Bereiding van gemodificeerde Krebs-oplossing voor transport

OPMERKING: Bereid de gemodificeerde Krebs-oplossing vers. In dit protocol wordt de gemodificeerde Krebs-oplossing 1 dag voor het oogsten van weefsel bereid.

  1. Steriliseer een transportfles door middel van autoclaveren. Vul een glazen fles met 90% (315 ml) van het totale benodigde transportvolume (350 ml) ultrapuur water. Zorg ervoor dat de watertemperatuur 15-20 °C is.
  2. Terwijl u het water voorzichtig roert met behulp van een roermagneet, voegt u 9,6 g/L (3,36 g) Krebs-Henseleit Buffer toe en roert u tot het is opgelost. Spoel de weegboot met een pasteurpipet af met een kleine hoeveelheid oplossing om alle sporen van poeder in de oplossing op te nemen. Verwarm de oplossing niet.
  3. Voeg al roerend 0,373 g/L (130,55 mg) calciumchloride (CaCl2) toe aan de oplossing en roer tot het is opgelost. Spoel de weegboot af met een kleine hoeveelheid oplossing.
    LET OP: H319 veroorzaakt ernstige oogirritatie.
  4. Voeg al roerend 2,1 g/L (0,63 g) natriumbicarbonaat (NaHCO3) toe aan de oplossing en roer tot het is opgelost. Spoel de weegboot af met een kleine hoeveelheid oplossing.
  5. Voeg al roerend 1 x 10-1 mM (13,15 mg) papaverine toe aan de oplossing en roer tot het is opgelost. Spoel de weegboot af met een kleine hoeveelheid oplossing.
    OPMERKING: Papaverine is een gladde spierverslapper die wordt gebruikt om overmatige vasoconstrictie te voorkomen die wordt veroorzaakt door het snijden en hanteren van het vat tijdens het oogsten.
    LET OP: H301 is giftig bij inslikken.
  6. Voeg in de zuurkast 0,05 mM (1,2 μl) 2-mercaptoethanol toe aan de oplossing en roer.
    OPMERKING: 2-mercaptoethanol wordt gebruikt om een laag niveau van zuurstofradicalen te behouden.
    LET OP: 2-mercaptoethanol is giftig bij inslikken of inademing (H301 + H331), dodelijk bij contact met de huid (H310), veroorzaakt huidirritatie (H315), kan een allergische huidreactie veroorzaken (H317), veroorzaakt ernstig oogletsel (H318), wordt ervan verdacht het ongeboren kind te beschadigen (H361d), kan schade aan organen veroorzaken door langdurige of herhaalde blootstelling bij inslikken (H373) en is zeer giftig voor in het water levende organismen met langdurige gevolgen (H410). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen en werk in een zuurkast.
  7. Stel tijdens het roeren de pH in op 7,2 door 1 N (1 M) HCl of 1 N (1 M) NaOH toe te voegen. Het uiteindelijke pH-doel is 7,4, maar de pH kan tijdens filtratie met 0,1-0,3 pH-eenheden stijgen.
    LET OP: HCl bevat gas onder druk; het kan exploderen bij verhitting (H280), ernstige brandwonden en oogletsel veroorzaken (H314) en is giftig bij inademing (H331). Draag persoonlijke beschermingsmiddelen.
  8. Blijf werken in een bioveiligheidskast. Voeg 10% ultrapuur water toe om de oplossing tot het uiteindelijke volume te brengen.
  9. Steriliseer de oplossing onmiddellijk door filtratie met behulp van een membraan met een porositeit van 0,22 μm. Doseer de steriele oplossing direct in een steriele fles. Voeg 7 ml 2% penicilline/streptomyocine (P/S) toe aan de oplossing.
    LET OP: Tijdens het transport wordt 2% P/S aan het medium toegevoegd om alle bacteriën te verwijderen. Tijdens weefselkweek wordt 1% P/S aan het medium toegevoegd.
  10. Bewaar de gemodificeerde Krebs-oplossing bij 4 °C tot het weefsel is geoogst.

3. Weefsel oogsten

  1. Afhankelijk van het slachthuis, varkens verdoven door middel van elektrische schokken of CO2 . Hang vervolgens varkens aan een achterpoot, verbloed en dood verklaard.
  2. Voordat u aan het schone slachtproces begint, verbrandt u varkens voor ontharing, schroeit u ze om de laatste haren te verwijderen en steriliseert u de buitenkant van het karkas.
  3. Haal de varkens uit de ingewanden door een incisie in de middellijn langs de buik te maken en de inwendige organen voorzichtig te verwijderen. Afhankelijk van het slachthuis zat de halsslagader nog vast aan het karkas van het varken, of was de halsslagader al uit het karkas verwijderd met het plukken van thoracale organen.
  4. Oogst met een scherp mes de halsslagader met wat achtergebleven omringend weefsel van het karkas of keelweefsel zonder de slagader aan te raken of mechanische belasting uit te oefenen.
  5. Plaats het weefsel met de halsslagader in de transportfles met steriele gemodificeerde Krebs-oplossing door de fles kort te openen. Keer de fles één keer om om ervoor te zorgen dat het hele weefsel bedekt is met Krebs-oplossing. Transporteer de weefsels op ijs naar het laboratorium. Het transport duurt ongeveer 30-45 minuten.

4. Weefsel dissectie

  1. Steriliseer dissectieapparatuur, chirurgisch pincet (ruwe behandeling), pincet met epoxycoating met ronde punt (fijne behandeling), scalpel, knijper en dekglaasjes door middel van autoclaveren.
  2. Bereid de bioveiligheidskast voor op het oogsten/transporteren van weefsel. Bedek het dissectiegebied met een chirurgisch laken. Monteer dissectieapparatuur (in steriele buisjes van 50 ml), chirurgische mesjes en steriele dekglaasjes. Vul twee grote petrischalen met steriele PBS om een snijbak voor te bereiden. Incubeer de weefselkweek in een klein petrischaaltje met ECG-medium bij 37 °C.
  3. Breng na weefseltransport in de bioveiligheidskast de halsslagader over van de transportfles (gevuld met gemodificeerde Krebs-oplossing) naar een grote petrischaal gevuld met steriel PBS met behulp van het chirurgische pincet.
  4. Verwijder overtollig weefsel rond de halsslagader met behulp van het chirurgisch pincet en de scalpel om een duidelijk zicht op de halsslagader te creëren.
  5. Verwijder 2-3 cm van beide uiteinden van de halsslagader om gebieden in de buurt van slagadervertakkingen te verwijderen door met een scalpel te snijden. Verwijder de arteriële fascia rond de halsslagader met behulp van het pincet met fijne ronde punt.
    OPMERKING: Het vernieuwen van het scalpelmes helpt om de fascia nauwkeuriger te snijden.
  6. Breng de halsslagader over naar een nieuwe grote petrischaal gevuld met steriele PBS. Verwijder het resterende dunne laagje arteriële fascia zoveel mogelijk.
    OPMERKING: Hoe langer de halsslagader in PBS is, hoe meer stukjes fascia de neiging hebben om los te raken. Het verwijderen van fascia is belangrijk omdat dit het zicht tijdens microscopie belemmert.
  7. Snijd de schone halsslagader in ringen van ongeveer 2 mm breed. Breng de ringen van de halsslagader over in het voorverwarmde kleine petrischaaltje gevuld met ECG-medium en houd op 37 °C.

5. Weefsel zaaien

OPMERKING: De weefselhechting is getest door geen dekglaasje, een steriel onbehandeld dekglaasje of een steriel pluronisch behandeld dekglaasje (1% w/v pluronisch in PBS, dekglaasjes 's nachts geïncubeerd en voor gebruik gewassen in steriel ultrapuur water) van verschillende grootte bovenop het slagadervel toe te voegen na het zaaien op de PAA-hydrogel.

  1. Verwijder ECG-mediumdruppels uit gels. Breng een ring van de halsslagader over naar een schoon medium petrischaaltje gevuld met steriel PBS.
  2. Knip met het pincet en het scalpel met ronde punt de ring doormidden. Ontleed een halve ring in vellen van ongeveer 2 mm breed om arteriële vellen te maken met afmetingen 2 x 2 mm. Let op de oriëntatie van de endotheelzijde van de arteriële plaat. Kromming en wat resterende fascia van de arteriële plaat kunnen helpen bij het bepalen van deze oriëntatie.
    OPMERKING: De grootte van de ringen van de halsslagader kan variëren. Grote ringen leveren ongeveer 6-8 vellen op, terwijl kleine ringen 3-4 vellen opleveren. Grote ringen hebben een betere hechting door minder kromming in de arteriële plaat.
  3. Pak met het pincet met ronde punt het arteriële vel aan de achterkant van het vel (buiten de vaatwand) vast en plaats het vel aan de rand van de PAA-gel met de endotheliale binnenbekleding naar het PAA-substraat gericht om beschadiging van het PAA-substraat te voorkomen bij het plaatsen van de plaat.
  4. Beweeg met het pincet of de knijper de arteriële plaat heel voorzichtig naar het midden van de PAA-hydrogel zonder de gel aan te raken. Plaats het arteriële vel aan de rand van de gel (het weefsel kan aan het pincet of de knijper blijven plakken).
    OPMERKING: Kleine restanten van arteriële fascia aan de buitenkant van de vaatwand creëren een gemakkelijk handvat voor het vastpakken van de arteriële plaat, terwijl de endotheliale binnenbekleding van de vaatwand erg glad is.
  5. Voeg 50 μL ECG-medium toe bovenop de arteriële plaat die op het PAA-substraat is geplaatst. Ty om de druppel ECG-medium bovenop de gel te houden.
  6. Plaats met het pincet met ronde punt een droog dekglaasje van 13 mm op de arteriële plaat op het PAA-substraat in medium. Gebruik de binnenrand van de glasbodem om het dekglaasje voorzichtig te laten zakken totdat het de mediumdruppel raakt en het medium zich eronder verspreidt.
    OPMERKING: De dekglaasjes van 13 mm zijn voordelig omdat ze nauw aansluiten bij de grootte van de binnenwand van de glazen bodemputplaat. Als u het dekglaasje te snel laat zakken, zal het weefsel naar de rand van het dekglaasje verplaatsen.
  7. Laat het weefsel 5 uur hechten bij 37 °C en 5% CO2 voordat u 1 ml ECG-medium aan elk putje toevoegt. Plaats de arteriële plaat op het PAA-substraat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 24 uur.

6. Creatie van het 2.5D-model

  1. Autoclaaf een pincet met ronde punt voor het verwijderen van dekglaasjes. Bereid 1 M NaOH in ultrapuur water, steriliseer door filtratie door een filter met een poriegrootte van 0,22 μm en bewaar bij 4 °C.
    OPMERKING: 1 M NaOH kan worden hergebruikt in toekomstige experimenten.
  2. Gebruik een steriele scherpe naald met een gebogen punt om het 13 mm dekglaasje heel voorzichtig van het slagadervel te tillen en verwijder het dekglaasje. Gebruik de binnenring van de glazen bodem goed als steun om het dekglaasje op te tillen en te verwijderen. Elke zijwaartse beweging verhoogt het risico dat de arteriële plaat loskomt van het PAA-substraat.
  3. Bereid in een steriele microcentrifugebuis het mengsel van collageen type I volgens tabel 2 op ijs. Bij toevoeging van collageen type I en NaOH aan de oplossing, zeer goed suspenderen en de tube één keer omkeren om ervoor te zorgen dat het mengsel homogeen wordt gemengd.
    OPMERKING: Bij toevoeging van collageen type I aan het mengsel wordt het lichtroze gekleurde mengsel kleurloos. Bij toevoeging van NaOH wordt het kleurloze mengsel lichtroze.
  4. Verwijder het medium uit de put met behulp van een vacuümzuigsysteem. Verwijder het medium dat het weefsel omringt zoveel mogelijk zonder het weefsel aan te raken.
    OPMERKING: Te veel medium rond de arteriële plaat voorkomt dat de collageentype I-gel deze omringt.
  5. Voeg een druppel van 10 μL collageen type I gelmengsel toe op elke slagaderplaat en laat de collageen type I gel 1 uur polymeriseren bij 37 °C en 5% CO2.
  6. Voeg heel voorzichtig 1 ml voorverwarmd ECG-medium toe aan elk putje en plaats de monsters op 37 °C en 5% CO2.

7. Live beeldvorming van cellen

OPMERKING: Live celbeeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een Leica DMi8 of Nikon Ti2 Eclipse epi-fluorescentiemicroscoop uitgerust met thermische, CO2 - en vochtigheidsregeling en bestuurd met Leica- of NIS-software. Adaptieve scherpstelregeling (Leica) en perfect scherpstelsysteem (Nikon) werden gebruikt om de scherpstelling in de tijd te behouden.

  1. Controleer na 24 uur kweek in het 2.5D-systeem op ontkiemende angiogenese. Sommige arteriële vellen beginnen al cellulaire spruiten te vormen na 24 uur kweken, terwijl andere vellen wat meer tijd nodig hebben om endotheliale kieming op gang te brengen.
  2. Als de ontkiemende angiogenese is gestart, ververs dan het ECG-medium en plaats de plaat met 12 putjes in de fasehouder in de 37 °C voorverwarmde incubatiebox van de microscoop.
  3. Kies het doel dat u interesseert. In dit onderzoek werden verschillende doelstellingen gebruikt, gebruik een 10x doelstelling om een globaal overzicht te creëren van de vorming van cellulaire spruiten en een 20x doelstelling om TFM uit te voeren.
  4. Definieer kanalen die u interesseren. Visualiseer voor TFM-doeleinden de cellulaire spruiten met behulp van fasecontrast en visualiseer de fluorescerende markers (donkerrood) in het PAA-substraat met behulp van een fluorescerend kanaal met een golflengte van 660 nm.
  5. Selecteer (meerdere) interessegebieden en zoek het focusvlak. Schakel het scherpstelsysteem in (adaptieve scherpstelregeling op Leica DMi8 of perfect scherpstelsysteem op Nikon Ti2 Eclipse) om een stabiele scherpstelling te garanderen via timelapse-beeldvorming.
  6. Definieer de time-lapse van interesse door een tijdsinterval en time-lapse-lengte te selecteren. In dit onderzoek werden verschillende tijdsintervallen (5-20 min) en timelapse-lengtes (4-24 uur) gebruikt voor verschillende doeleinden.
  7. Voor TFM-doeleinden, na timelapse-beeldvorming, verwijdert u ontgroeiende cellen door enkele druppeltjes van 5% SDS toe te voegen aan ultrapuur water en wacht u enkele minuten. Neem voor elke geselecteerde positie een z-stack (een z-hoogte van 2 μm werd gedefinieerd met een stapgrootte van 0,2 μm) van de fluorescerende markers in het PAA-substraat om een ontspannen toestand van de fluorescerende markers als referentiebeeld te verkrijgen.
    OPMERKING: Z-stack-beeldvorming wordt uitgevoerd omdat cellen de fluorescerende markeringen in de z-richting kunnen trekken of duwen.

8. Analyse van tractiekrachtmicroscopie

  1. Lijn timelapse-afbeeldingen uit en snijd ze bij ten opzichte van de beste referentieafbeelding voor nauwkeurige analyse.
  2. Om verplaatsingen van fluorescerende markers in de PAA-hydrogel te meten, voert u Particle Image Velocimetry (PIV) uit tussen een timelapse-beeld en het referentiebeeld met behulp van aangepaste MatLab-codes. Verdeel binnen de PIV-analyse de afbeeldingen in ondervragingsvensters van 32 bij 32 pixels met 0,5 overlap.
  3. Bereken de trekkrachten uit de verplaatsingen van de fluorescerende markers door middel van Fourier-transformatie-gebaseerde tractiemicroscopie van een oneindige gel met een eindige geldikte met behulp van de Boussinesq-vergelijking27.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Door middel van het beschreven protocol kunnen we ex vivo kiemende angiogenese induceren uit een halsslagader van varkens bovenop een 2D PAA-hydrogel bedekt met een dunne laag collageen type I gel, waardoor een 2,5D ex vivo kiemangiogenesemodel ontstaat. Dit model stelt ons in staat om conventionele TFM uit te voeren en de cellulaire trekkrachten van ontkiemende angiogenese op de PAA-gelinterface in ruimte en tijd te meten.

Om het 2.5D-model vast te stellen, hebben we eerst een 2D-polyacrylamide (PAA) hydrogel voorbereid die is ingebed met fluorescerende markers, gevolgd door een nachtelijke coating met type IV collageen (d-1 tot d0). Op dag 0 (d0) werd een arteriële halsslagader op de met collageen IV gecoate hydrogel geplaatst en 's nachts bevestigd (d0 tot d1). Vervolgens werd een dunne laag collageen type I-gel over de arteriële plaat aangebracht, waarna beeldvorming op dag 1 (d1) werd gestart om cellulaire kieming te monitoren en fluorescerende markers te volgen voor mechanische analyse (d1 tot d2). Om de kiemangiogenese in het 2,5D-model te verifiëren, voerden we de conventionele ex vivo kiemangiogenese uit in een 3D collageen type I gel parallel. Hiervoor werd een dunne laag collageen type I-gel bereid, gevolgd door het zaaien van de halsslagader en vervolgens bedekt met een extra collageenlaag (d0). Angiogene kieming werd in de loop van de tijd gevolgd. Daarnaast hebben we getracht om ontkiemende angiogenese in 2D te induceren om de complexiteit van het model verder te verminderen. De experimentele procedure weerspiegelde die van het 2,5D-model, met als belangrijkste verschil de uitsluiting van de bovenste collageen type I gellaag. Een overzicht van de drie modellen, inclusief hun experimentele procedures, wordt beschreven in figuur 1. Halsslagaders werden geoogst van varkens uit het plaatselijke slachthuis en vervoerd in steriele verse Krebs-oplossing. In de bioveiligheidskast werd overtollig weefsel rond de halsslagader verwijderd om ervoor te zorgen dat er geen visuele beperking van ontkiemende angiogenese tijdens live timelapse-beeldvorming optreedt (Figuur 2A-E). Zodra de slagader vrij was van overtollig weefsel, werd de slagader gesneden in slagaderringen van 2 mm breed en werden ringen gesneden in arteriële vellen met een afmeting van 2 x 2 mm (Figuur 2F).

Om ervoor te zorgen dat angiogenese bovenop de PAA-hydrogelinterface binnen het 2,5D- en 2D-model ontkiemt, hebben we de arteriële vellen gezaaid met de binnenste endotheelcelzijde naar de collageen type IV gecoate PAA-hydrogel en hebben we ze laten hechten. Om de bevestiging van de arteriële plaat aan de PAA hydrogel te optimaliseren, hebben we het effect getest van de toevoeging van een anti-fouling gecoate 12 mm glazen dekslip bovenop de arteriële plaat. Na 24 uur werd het dekglaasje verwijderd en werd de efficiëntie van de bevestiging gemeten aan de hand van het percentage arteriële vellen dat aan de PAA-hydrogel was bevestigd. We zagen dat de toevoeging van een glazen dekglaasje - onafhankelijk van de aangroeiwerende coating - de hechtingsefficiëntie van de arteriële platen bovenop de PAA-hydrogel verhoogde in vergelijking met geen dekglaasje (Figuur 3A-D). Vervolgens testten we het effect van de diameter (12 of 13 mm) van het glazen dekglaasje op de hechtingsefficiëntie van de arteriële plaat, terwijl de binnenste put van de plaat 14 mm was. We hebben vastgesteld dat een dekslip van 13 mm de hechtingsefficiëntie van de arteriële platen bovenop de PAA-hydrogel verhoogt in vergelijking met een dekslip van 12 mm (Figuur 3E-G), aangezien schuifkrachten tijdens het verwijderen van de dekslip worden geminimaliseerd. We gingen door met het gebruik van een onbehandeld dekglaasje van 13 mm voor de bevestiging van de slagaderplaat aan de PAA-hydrogel in zowel de 2.5D- als de 2D-modellen.

Nadat de arteriële plaat aan de PAA-hydrogel was bevestigd, voegden we een dunne laag collageen type I-gel toe bovenop de arteriële plaat om een 2,5D-omgeving te creëren. We hebben de monsters gedurende 5 dagen gekweekt en de monsters onderzocht op ontkiemende angiogenese. We hebben de vorming van cellulaire spruiten waargenomen in het 3D-model (Figuur 4A), consistent met eerder gerapporteerde ex vivo kiemangiogenese in de literatuur 28,29,30. Binnen het 2,5D-model zagen we een vergelijkbare organisatie van cellulaire spruiten in vergelijking met het 3D-model (Figuur 4B). Cellulaire spruiten werden op meerdere hoogtes gevormd (Video 1), ook bij de PAA-interface. Bovendien wordt kiemende angiogenese gekenmerkt door een hoge proliferatie van leider- en volgercellen, een fenomeen dat we hebben waargenomen tijdens het ontkiemen in het 2,5D-model (Video 2). Bij het kweken van een arteriële plaat in 2D migreren cellen van verschillende oorsprong (aanvullende figuur 1) als monolagen uit het weefsel, waardoor de organisatie van cellulaire spruiten ontbreekt (Figuur 4C). Omdat we geen ontkiemende angiogenese hebben waargenomen in het 2D-model, hebben we dit model uitgesloten van latere analyses. Al met al heeft de arteriële plaat een lokale 3D-omgeving nodig om ontkiemende angiogenese te induceren, wat het potentieel van het 2,5D ex vivo model van ontkiemende angiogenese aantoont.

Bovendien is het 2.5D-modelsysteem een veelzijdig systeem waarmee gebruikers het effect van mechanische signalen uit de cellulaire micro-omgeving kunnen onderzoeken, bijvoorbeeld matrixstijfheid. Matrixstijfheid van een 3D collageen type I hydrogel - de hydrogel die vaak wordt gebruikt voor ex vivo kiemende angiogenese - is afhankelijk van de concentratie van ECM-eiwit, waarbij een toename van de eiwitconcentratie correleert met een toename van de matrixstijfheid32. Het typische bereik van collageen type I-concentratie om deze 3D-hydrogel kiemende angiogenese te laten induceren, is 1-4 mg/ml, wat overeenkomt met een matrixstijfheid van 1 Pa tot 1 kPa 32,33,34. Lagere concentraties kunnen te zacht zijn om structurele ondersteuning te bieden, terwijl hogere concentraties de celbeweging kunnen remmen. De fysiologische stijfheid van endotheelweefsel is 1 kPa35, wat kan worden nagebootst met een 3D collageen type I hydrogel. Tumorvorming en -progressie worden echter geassocieerd met weefselverstijving4, wat de noodzaak benadrukt van een model dat een hogere matrixstijfheid kan bereiken om tumorangiogenese te bestuderen. De substraatstijfheid van PAA-hydrogels - de stijfheid die wordt waargenomen door de endotheelcellen van de arteriële plaat - kan gemakkelijk worden afgestemd binnen het bereik van 1 tot tientallen kPa. Hier onderzochten we het effect van PAA-substraatstijfheid op het begin van kiemende angiogenese aan de hand van het percentage monsters dat de vorming van cellulaire spruiten initieerde op de dag nadat de collageen type I-laag was toegevoegd. We zagen dat meer arteriële vellen vroege tekenen van cellulaire spruiten vertoonden wanneer ze werden gekweekt op een fysiologisch zachte (1 kPa) PAA-hydrogel in vergelijking met een pathologische stijve (12 kPa) PAA-hydrogel (Figuur 5), wat het potentieel van dit model aantoont om het effect van matrixstijfheid op kiemende angiogenese te bestuderen. Naast afstembare substraatstijfheid maken deze substraten de systematische modulatie mogelijk van andere mechanische signalen (bijv. matrixsamenstelling en dichtheid) en chemische signalen (bijv. remming van moleculaire regulatoren door conditionering van het kweekmedium), wat de veelzijdigheid van dit 2,5D ex vivo kiemangiogenesemodel aantoont.

Om de cellulaire mechanica bij het ontkiemen van angiogenese te kwantificeren, hebben we conventionele tractiekrachtmicroscopie (TFM) uitgevoerd op cellulaire spruiten die zich hebben gevormd op de 2D PAA-interface. Een dag na de toevoeging van de collageen type I-laag voerden we live celbeeldvorming uit van de cellen (Figuur 6A) en de fluorescerende markers ingebed in de PAA-hydrogel. Verplaatsingen van de fluorescerende markers werden gemeten met behulp van Particle Image Velocimetry (Figuur 6B) en cellulaire tracties werden berekend met behulp van de mechanische eigenschappen van de PAA-hydrogel (Figuur 6C). Met dit 2.5D ex vivo model zagen we aanvankelijk trekkrachten op de uitsteeksels van de leidercel van een cellulaire spruit, gevolgd door duwkrachten langs de cellulaire spruit - zowel aan de achterkant van de leidercel als aan de volgcellen (Figuur 6C).

figure-results-1
Figuur 1: Experimentele modellen en procedures. (links) Geteste experimentele modellen. Het 2.5D-model vertegenwoordigt een arteriële plaat die bovenop een platte collageen type IV gecoate polyacrylamide (PAA) hydrogel wordt geplaatst en bedekt is met een dunne laag collageen type I hydrogel. Het 3D-model vertegenwoordigt een arteriële plaat ingeklemd tussen twee lagen collageen type I-gel, een systeem waarvan bekend is dat het kiemende angiogenese induceert36. Het 2D-model stelt een arteriële plaat voor die bovenop een platte collageen type IV gecoate PAA-hydrogel wordt geplaatst. (rechts) Experimentele procedures voor overeenkomstige modellen. Voor zowel het 2D- als het 2.5D-model werd de dag voor het zaaien (d-1) een PAA-hydrogel bereid en werd de collageen type IV-coating 's nachts uitgevoerd. De halsslagader werd geoogst van varkens, ontleed in arteriële vellen, op dag 0 (d0) op de hydrogel gezaaid en 's nachts bevestigd (d1). Voor 2.5D-monsters werd een dunne laag collageen type I-gel op de arteriële plaat geplaatst. Mechanische analyse werd uitgevoerd na het begin van het ontkiemen op dag 2 (d2). Voor 2D-monsters werd het medium op dag 1 (d1) ververst. Voor het 3D-model werd vlak voor het zaaien op dag 0 (d0) een laagje collageen type I gel aangemaakt. De slagaderplaat werd bovenop de collageen type I laag gezaaid en bedekt met een tweede laag collageen type I. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Dissectiestappen van de halsslagader (d0). A) Halsslagaders met een lengte van ongeveer 10 cm zijn geoogst van varkens uit het plaatselijke slachthuis. (B) Overtollig weefsel en ongeveer 2 cm van de rand (om te voorkomen dat het te dicht bij vertakkingspunten komt, (B') werden weggegooid. (C-E) De halsslagader werd gevild (C), gedrenkt in PBS (D) en al het resterende weefsel werd gevild om een duidelijk zicht tijdens beeldvorming (E) te garanderen. (F) De schone halsslagader wordt in slagaderringen gesneden met een breedte van ongeveer 2 mm. Elke ring is gesneden in 4 arteriële vellen met een afmeting van ongeveer 2 x 2 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: De efficiëntie van de bevestiging van slagaderplaten neemt toe bij gebruik van een glazen dekstrookje van 13 mm (d1). (A-D) Effect van een glazen dekstrookje op de bevestiging van de arteriële plaat aan de polyacrylamide (PAA) hydrogel. Er is een vergelijking gemaakt tussen geen glazen dekslip (A), een onbehandeld glazen dekslip (B) en een aangroeiwerend gecoate glazen dekslip met Pluronic F127 (C). De efficiëntie van de bevestiging werd gemeten aan de hand van het aantal arteriële vellen dat na verwijdering van het dekglaasje aan de PAA-hydrogel werd bevestigd in vergelijking met het totale aantal monsters: geen dekglaasje (4 van de 36), onbehandeld dekglaasje (10 van de 36) en aangroeiwerend gecoat dekglaasje (9 van de 36; D). (E-G) Effect van de grootte van een onbehandeld glazen dekglaasje op de bevestiging van arteriële plaat aan de PAA-hydrogel. Er is een vergelijking gemaakt tussen een onbehandeld 12 mm glazen dekglaasje (E) en een onbehandeld 13 mm glazen dekglaasje (F) in een putje van 14 mm. De efficiëntie van de bevestiging werd gemeten aan de hand van het aantal arteriële vellen dat na verwijdering van het dekglaasje aan de PAA-hydrogel was bevestigd in vergelijking met het totale aantal monsters: 12 mm dekglaasje (10 van de 36) en 13 mm dekglaasje (52 van de 72; G). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Dimensionaliteit van het model definieert de organisatie tijdens cellulaire uitgroei (d2+). Cellen migreren uit het weefsel in een spruitorganisatie in het 3D-model (links), vergelijkbaar met het 2,5D-model (midden). Cellen migreren uit het weefsel in een monolaagse organisatie in de 2D-opstelling (rechts). De schaalbalk geeft 250 μm aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Het begin van endotheliale kieming in het 2,5D-model is afhankelijk van de stijfheid van het polyacrylamide-hydrogelsubstraat (d2). (A-B) Arteriële plaat bedekt met een dunne laag collageen type I gel bovenop een zachte (A; 1 kPa) of stijve (B; 12 kPa) polyacrylamide (PAA) hydrogel op dag 2 van het protocol (1 dag na toevoeging van de laag collageen type I gel). (C) Het begin van het ontkiemen werd gemeten aan de hand van het aantal arteriële vellen dat al tekenen van cellulaire uitgroei vertoont in vergelijking met het totale aantal monsters: zacht (7 van de 24) en stijf (3 van de 24). Schaalbalk staat voor 1 mm (A, B) of 500 μm (A', B'). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Karakterisering van de trekkracht tijdens vroege kiemende angiogenese. Beeldvorming van cellen in de tijd (0-4 uur) wordt weergegeven in de bovenste rij. Overeenkomstige fluorescerende markers, verplaatsingen (0-2 μm) en cellulaire tracties (0-50 Pa) op een PAA-hydrogelsubstraat van 1 kPa worden respectievelijk in de middelste en onderste rij weergegeven. Inzoomen van cellulaire tracties om 0 uur, 2 uur en 4 uur worden in oranje weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: 2.5D ex vivo kiemangiogenese modelmethode die mechanische karakterisering van cellulaire spruiten mogelijk maakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1 kPa12 kPa
PBS435 μL373,7 μl
40% acrylamide50 μL93,8 μL
2% bis-acrylamide7,5 μL25 μL
Fluorescerende marker (donkerrood)5 μL5 μL
10% APS2,5 μL2,5 μL
GEAARD0,25 μL0,25 μL

Tabel 1: PAA-gel mengsel verhoudingen.

formuleVolume per plaat met 12 putjes (130 μL)
ECG-mediumVECG=Vdefinitief-V col1-V NaOH82,16 μl
Collageen type IVkol1=(Vdefinitief*Cdefinitief)/Cvoorraad46 μL
NaOHVNaOH=0.04*Vkolom 11,84 μL

Tabel 2: Collageen type I gel mengt volumes met behulp van afkortingen van volume (V) en concentratie (C).

Video 1: Timelapse-beeldvorming van cellulaire kiemvorming binnen het 2.5D-model. Cellen werden in beeld gebracht met behulp van fasecontrastbeeldvorming over een periode van 22 uur met een tijdsinterval van 17,5 minuten. Cellulaire spruiten werden gevormd op meerdere hoogtes binnen de collageen type I gellaag, zoals waargenomen door de verschillende brandvlakken. De schaalbalk staat voor 100 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: Hoge proliferatiesnelheid van cellen in cellulaire spruiten binnen het 2.5D-model. Cellen werden in beeld gebracht met behulp van fasecontrastbeeldvorming over een periode van 22 uur met een tijdsinterval van 17,5 minuten. Zowel leiders als volgcellen vermenigvuldigen zich tijdens timelapse-beeldvorming. De schaalbalk staat voor 100 μm. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Cellulair fenotype in 2D-model (d2+) door immunofluorescentiekleuring. (A) Immunofluorescentie (IF) kleuring van de celkern (DAPI), endotheelcelmarker (CD31) en fibroblastmarker (alfa-gladde spieractine; α-SMA). (B) IF-kleuring van de celkern (DAPI), endotheelcelmarker (CD31) en gladde spiercelmarker (calponine). De schaalbalk staat voor 100 μm. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Protocol voor immunofluorescentiekleuring. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kiemende angiogenese - de vorming van nieuwe bloedvaten - is een complex proces dat wordt gereguleerd door zowel moleculaire als mechanische mechanismen. Hoewel er de afgelopen decennia veel 3D-modellen zijn ontwikkeld om de moleculaire drijfveren (bijv. VEGF- en Notch-signalering) van kiemende angiogenese te bestuderen, is er vanwege modelbeperkingen slechts weinig bekend over cellulaire mechanica. Traction Force Microscopy (TFM) is een bekende techniek voor het kwantificeren van cellulaire krachten in ruimte en tijd, waarbij 2D-substraatvervormingen worden omgezet in cellulaire tracties. Daarom beschrijven we in dit protocol een 2,5D ex vivo model, wat betekent dat we de cellen lokaal voorzien van een 3D-omgeving met behoud van de eenvoud van een 2D-model dat het mogelijk maakt om trekkrachten tijdens het ontkiemen van angiogenese te kwantificeren (Figuur 1). Om dit te doen, hebben we een arteriële plaat van varkens voorbereid en gezaaid (endotheelzijde naar beneden; Figuur 2) bovenop een collageen type IV gecoate polyacrylamide (PAA) hydrogel met fluorescerende markers. Na het bevestigen van de slagaderplaat met behulp van een glazen dekglaasje van 13 mm (Figuur 3), voegen we een dunne laag collageen type I hydrogel toe die de vorming van cellulaire spruiten mogelijk maakt (Figuur 4). Met behulp van dit model laten we zien dat tijdens cellulaire kieming 22,23,24,25, leidercellen trekkrachten uitoefenen (zoals werd waargenomen in de literatuur 19,20,21,22), maar ook dat volgcellen duwende krachten uitoefenen (Figuur 6). De resolutie van het tractieveld die via ons protocol wordt verkregen, maakt kwantitatieve analyses mogelijk van cellulaire kinematica en dynamiek, zowel in tijd als in ruimte, die typerend zijn voor werken waarbij gebruik wordt gemaakt van tractiekrachtmicroscopie op conforme substraten 37,38,39.

Bovendien demonstreren we de veelzijdigheid van dit 2.5D ex vivo model van ontkiemende angiogenese door de mechanische signalen van de micro-omgeving te veranderen (Figuur 5). Terwijl ontkiemende angiogenese normaal gesproken optreedt bij een fysiologische stijfheid van 1 kPa35 - die kan worden nagebootst door een 3D collageen type I hydrogel, vindt tumorangiogenese plaats in een verstijfde micro-omgeving40 - wat buiten het stijfheidsbereik van conventionele 3D collageen type I hydrogels ligt. De stijfheid van het PAA-substraat kan eenvoudig worden aangepast door de verhouding van crosslinkers te wijzigen om een hogere substraatstijfheid te genereren. Met behulp van dit model onthullen we dat het begin van ontkiemende angiogenese afhankelijk is van stijfheid. Deze substraten bieden niet alleen afstembare stijfheid, maar maken ook een systematische modulatie van verschillende andere mechanische signalen mogelijk, bijvoorbeeld de samenstelling en dichtheid van de matrix. Bovendien stelt dit model ons in staat om cellulaire mechanica te bestuderen terwijl we moleculaire regulatoren manipuleren met behulp van conditionering van het medium (bijv. het effect van remming op Notch-signalering op cellulaire mechanica) om de mechanobiologische mechanismen van kiemende angiogenese te begrijpen. Dit toont het nut aan van dit 2.5D ex vivo model van ontkiemende angiogenese in een staal van verschillende micro-omgevingen.

Het model dat we presenteren, maakt gebruik van conventionele 2D TFM, die een eenvoudigere analyse, een hogere ruimtelijke resolutie en eenvoudigere implementatie biedt in vergelijking met 3D (visco-elastische) TFM, waardoor het toegankelijker en kosteneffectiever is26,41. 3D (visco-elastische) TFM biedt echter een meer fysiologisch relevante omgeving door trekkrachten in alle drie de dimensies vast te leggen en rekening te houden met de complexe mechanische eigenschappen van de extracellulaire matrix, waardoor diepere inzichten worden geboden in het gedrag van cellen in een meer realistische context 42,43,44,45. Dit effect van dimensionaliteit wijst ook op een beperking van dit 2,5D-model. We gebruiken 2D TFM in de veronderstelling dat cellen migreren op een 2D-substraat. Hoewel dit in dit 2,5D-model het geval is, bevinden cellen zich in een lokale 3D-omgeving en hechten ze zich dus aan de collageen type I gellaag en oefenen ze krachten uit in deze gellaag. De veronderstelling die we binnen deze analyse hebben aangenomen, is dat de collageen type I gellaag niet mechanisch gekoppeld is (geen krachtoverdracht tussen deze twee hydrogels) aan de PAA-interface vanwege het verschil in orde van grootte in matrixstijfheid, waardoor het effect van cellulaire krachten op de collageen type I-laag wordt geminimaliseerd. Dit maakt de krachtkarakterisering met behulp van het 2.5D ex vivo model een vereenvoudigde weergave van de krachten die door de cellen worden gegenereerd. Bovendien vereist dit protocol precisie en is het uitgebreid met verschillende stappen waarbij monsters verloren kunnen gaan, bijv. (i) problemen met de zichtbaarheid van cellen als gevolg van overmatig weefsel rond de arteriële plaat (Figuur 2), (ii) een op de drie monsters hecht zich niet aan het PAA-substraat (Figuur 3), (iii) niet alle monsters zullen de vorming van cellulaire spruiten initiëren (Figuur 5), (iv) cellulaire spruiten vormen zich niet op het PAA-substraat, en (v) onscherpe fluorescerende markers bij gebruik van een dikke arteriële plaat bovenop een PAA-hydrogel met lage stijfheid. Daarom hebben we deze methode geoptimaliseerd voor een plaat met 12 putjes om ervoor te zorgen dat er voldoende interessegebieden zijn om mechanische analyse van kiemende angiogenese uit te voeren.

Concluderend kan de gepresenteerde aanpak voor de vereenvoudigde karakterisering van cellulaire trekkrachten van ontkiemende angiogenese van een levende varkensslagader met behulp van een 2,5D-model (Figuur 7) helpen bij het creëren van nauwkeurigere en real-time inzichten in de mechanische interacties tijdens angiogenese binnen een natuurlijke weefselcontext, waardoor de studie van dynamische cellulaire processen met verminderde complexiteit en verbeterde reproduceerbaarheid in vergelijking met volledig 3D-systemen wordt vergemakkelijkt. Dit zou ons begrip kunnen vergroten van hoe cellen reageren op mechanische signalen in een meer fysiologisch relevante omgeving, terwijl de analytische eenvoud van 2D-methoden behouden blijft. Deze kennis zou het gebied van weefselmanipulatie vooruit kunnen helpen met als doel bloedvaten te creëren, maar ook om therapeutische geneesmiddelen te vinden voor de preventie van tumorangiogenese met als doel tumorgroei te beperken en metastase te verminderen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We danken de mensen van LifeTec voor het oogsten en transporteren van de halsslagaders van varkens van het plaatselijke slachthuis; Leon Hermans, Pim van den Bersselaar en Adrià Villacrosa Ribas (TU/e, ICMS) voor de vruchtbare discussies over experimentele procedures en mechanische karakteriseringsanalyse. We zijn dankbaar voor de steun van de European Research Council (771168), de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (024.003.013), de Academie van Finland (307133, 316882, 330411 en 337531) en de Centers of Excellence in Cellular Mechanostasis (CellMech) van de Åbo Akademi University Foundation.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2% bis-acrylamideBio-Rad1610143
2-mercaptoethanolMerck Life Science60-24-2
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateBind-SilaneSigma-Aldrich440159-100ML
40% acrylamideBio-Rad1610140
Aboslute ethanol (for analysis)VWR International1.00983.1000
Absolute ethanol (industrial)VWR International83813.41
Acetic acid, glacial 100%Merck1000562500
Ammonium persulfateAPSBio-Rad7727-54-0
antibody (primary) - calponinabcamab46794
antibody (primary) - CD31SerotecMCA1746
antibody (primary) - α-smooth muscle actinαSMADakoM0851
antibody (secondary) - goat-anti-mouse-IgG1 Alexa 488Molecular ProbesA21121
antibody (secondary) - goat-anti-mouse-IgG2a Alexa 555Molecular ProbesA21137
antibody (secondary) - goat-anti-rabbit-IgG Alexa 555Molecular ProbesA21428
AutoclaveAstell
Calcium chloride dihydrateCaCl2Calbiochem208291-250GM
Collagen type I, rat-tailCorning354236
Collagen type IV, human placentaMerck Life ScienceC5533-5MG
Endothelial Cell Growth MediumECG mediumPromocellC-22111
Expoxy-coated round tip tweezerfine tweezerRubis PinzetteE78144-2A
Fluorescent marker, dark redInvitrogenF8807
Glass coverslips, Ø13 mm, #1EprediaCB00130RA120MNZ0
Glass coverslips, Ø13 mm, #1.5EprediaCB00120RAC20MNZ0
Hydrochloride acid, 25%HClMerck1.100316.1000
Krebs-Henseleit bufferSigma-AldrichK3753
Microscope, Leica Application Suite X software, version 3.5.7.23225Leica Microsystems
Microscope, Leica DMi8 epifluorescent microscopeLeica Microsystems
Microscope, Nikon Ti2 EclipseNikon
Microscope, NIS-Elements AR softwareNikon
N,N,N',N'-tetramethylethane-1,2-diamineTEMEDMerck Life Science110-18-9
Nalgene bottleThermo Scientific2187-0016
Needle, 21Gx1"Henke Sass WolfHK4710008025
Normal serum, goatGibco10098792
Papaverine hydrochlorideSigma61-25-6
Penicillin/Streptomyocin (10 000 U/mL)P/SGibco15140163
Petri-dish, large (145x20mm)Greiner Bio-one639160
Petri-dish, small (60x15mm)Greiner Bio-one628160
Phosphate Buffered SalinePBSSigmaP4417
Pluronic F-127Merck Life ScienceP2443-250G
Puncture needle, sharp closed tipunknown
Scalpel, no. 4Swann-Morton
Sodium hydrogen carbonateNaHCO3VWR International144-55-8
sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino)hexanoateSulfo-SANPAHThermo Scientific22589
Surgical blade, no. 20Swann-Morton
Surgical drape sheetFoliodrape2775001
Surgical tweezerLettix400024
Triton X-100Merck9036-19-5
UV lampAnalytik Jena95-0042-13 
well plate, 96-well, F-bottomGreiner Bio-one655180
well plate, glass bottom 12-wellMatTekP12G-0-14-F

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carmeliet, P. Angiogenesis in health and disease. Nat Med. 9 (6), 653-660 (2003).
  2. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nat Med. 1, 27-30 (1995).
  3. Kretschmer, M., Rüdiger, D., Zahler, S. Mechanical aspects of angiogenesis. Cancers. 13 (19), 4987(2021).
  4. Bordeleau, F., et al. Matrix stiffening promotes a tumor vasculature phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (3), 492-497 (2017).
  5. Blanco, R., Gerhardt, H. VEGF and Notch in tip and stalk cell selection. Cold Spring Harb Perspect Med. 3 (1), a006569(2013).
  6. Adams, R. H., Alitalo, K. Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 464-478 (2007).
  7. Carmeliet, P., De Smet, F., Loges, S., Mazzone, M. Branching morphogenesis and antiangiogenesis candidates: tip cells lead the way. Nat Rev Clin Oncol. 6, 315-326 (2009).
  8. Salam, N., et al. Assessment of migration of human mscs through fibrin hydrogels as a tool for formulation optimisation. Materials. 11 (9), 1781(2018).
  9. Solbu, A. A., et al. Assessing cell migration in hydrogels: An overview of relevant materials and methods. Materials Today Bio. 18, 100537(2023).
  10. Cao, W., Li, X., Zuo, X., Gao, C. Migration of endothelial cells into photo-responsive hydrogels with tunable modulus under the presence of pro-inflammatory macrophages. Regenerat Biomater. 6 (5), 259-267 (2019).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
  12. Staton, C. A., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int J Exp Path. 85, 233-248 (2004).
  13. Ngo, T. X., et al. In Vitro models for angiogenesis research: A review. Int J Tissue Regenerat. 5, 37-45 (2014).
  14. Tomita, Y., et al. An ex vivo choroid sprouting assay of ocular microvascular angiogenesis. J Vis Exp. (162), e61677(2020).
  15. Kapoor, A., Chen, C. G., Iozzo, R. V. A simplified aortic ring assay: A useful ex vivo method to assess biochemical and functional parameters of angiogenesis. Matrix Biol Plus. 6-7, 100025(2020).
  16. Stiffey-Wilusz, J., Boice, J. A., Ronan, J., Fletcher, A. M., Anderson, M. S. An ex vivo angiogenesis assay utilizing commercial porcine carotid artery: Modification of the rat aortic ring assay. Angiogenesis. 4 (1), 3-9 (2001).
  17. Kniazeva, E., Putnam, A. J. Endothelial cell traction and ECM density influence both capillary morphogenesis and maintenance in 3-D. Am J Physiol Cell Physiol. 297 (1), C179-C187 (2009).
  18. Davidson, C. D., Wang, W. Y., Zaimi, I., Jayco, D. K. P., Baker, B. M. Cell force-mediated matrix reorganization underlies multicellular network assembly. Sc Rep. 9 (1), 12(2019).
  19. Lyle, K. S., Corleto, J. A., Wittmann, T. Microtubule dynamics regulation contributes to endothelial morphogenesis. BioArchitecture. 2 (6), 220-227 (2012).
  20. Kniazeva, E., et al. Quantification of local matrix deformations and mechanical properties during capillary morphogenesis in 3D. Integrat Biol. 4 (4), 431-439 (2012).
  21. Quintanilla, M. A., Hammer, J. A., Beach, J. R. Non-muscle myosin 2 at a glance. J Cell Sci. 136 (5), jcs.260890(2023).
  22. Fischer, R. S., Gardel, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Waterman, C. M. Local cortical tension by myosin II guides 3D endothelial cell branching. Curr Biol. 19 (3), 260-265 (2009).
  23. Yoon, C., et al. Myosin IIA–mediated forces regulate multicellular integrity during vascular sprouting. Mol Biol Cell. 30 (16), 1974-1984 (2019).
  24. Du, Y., et al. Three-dimensional characterization of mechanical interactions between endothelial cells and extracellular matrix during angiogenic sprouting. Sci Rep. 6, 21362(2016).
  25. Vaeyens, M. M., et al. Matrix deformations around angiogenic sprouts correlate to sprout dynamics and suggest pulling activity. Angiogenesis. 23 (3), 315-324 (2020).
  26. Style, R. W., et al. Traction force microscopy in physics and biology. Soft Matter. 10 (23), 4047-4055 (2014).
  27. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nat Phys. 5 (6), 426-430 (2009).
  28. Santos-Oliveira, P., et al. The force at the tip - modelling tension and proliferation in sprouting angiogenesis. PLoS Comput Biol. 11 (8), e1004436(2015).
  29. Boreddy, S. R., Sahu, R. P., Srivastava, S. K. Benzyl isothiocyanate suppresses pancreatic tumor angiogenesis and invasion by inhibiting HIF-α/VEGF/Rho-GTPases: Pivotal role of STAT-3. PLoS One. 6 (10), 0025799(2011).
  30. Teng, R. J., Eis, A., Bakhutashvili, I., Arul, N., Konduri, G. G. Increased superoxide production contributes to the impaired angiogenesis of fetal pulmonary arteries with in utero pulmonary hypertension. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (1), L184-L195 (2009).
  31. Costa, G., et al. Asymmetric division coordinates collective cell migration in angiogenesis. Nature Cell Biol. 18 (12), 1292-1301 (2016).
  32. Slater, K., Partridge, J., Nandivada, H. Corning tuning the elastic moduli of Corning Matrigel and collagen I 3D matrices by varying the protein concentration. , Corning Incorporated, Life Sciences, MA USA. (2019).
  33. Lee, J., et al. Effect of chain flexibility on cell adhesion: Semi-flexible model-based analysis of cell adhesion to hydrogels. Sci Rep. 9 (1), 2463(2019).
  34. Motte, S., Kaufman, L. J. Strain stiffening in collagen i networks. Biopolymers. 99 (1), 35-46 (2013).
  35. Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. A tense situation: Forcing tumour progression. Nat Rev Cancer. 9 (2), 108-122 (2009).
  36. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr Prot Cell Biol. 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  37. Labernadie, A., et al. A mechanically active heterotypic E-cadherin/N-cadherin adhesion enables fibroblasts to drive cancer cell invasion. Nat Cell Biol. 19 (3), 224-237 (2017).
  38. Bazellières, E., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
  39. Uroz, M., et al. Traction forces at the cytokinetic ring regulate cell division and polyploidy in the migrating zebrafish epicardium. Nat Mater. 18 (9), 1015-1023 (2019).
  40. Dong, C., Nastaran, Z., Konstantopoulos, K. Biomechanics in oncology. , Springer Nature. Switzerland, AG. (2018).
  41. Schwarz, U. S., Soiné, J. R. D. Traction force microscopy on soft elastic substrates: A guide to recent computational advances. Biochim Biophys Acta. 1853 (11), 3095-3104 (2015).
  42. Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
  43. Legant, W. R., et al. Multidimensional traction force microscopy reveals out-of-plane rotational moments about focal adhesions. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 881-886 (2013).
  44. Steinwachs, J., et al. Three-dimensional force microscopy of cells in biopolymer networks. Nat Meth. 13 (2), 171-176 (2016).
  45. Franck, C., Maskarinec, S. A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Three-dimensional traction force microscopy: A new tool for quantifying cell-matrix interactions. PLoS One. 6 (3), e17833(2011).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Tractiekrachtmicroscopieex vivo modelporcine halsslagadercellulaire mechanicamatrixstijfheidendotheelcellenarteri le sheetcultuurfluorescentiekraal imagingweefselengineering

Gerelateerde artikelen