Methodenartikel

Isolatie van kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van mesenchymale stamcellen uit monsters met een groot volume met GMP-conformiteit voor klinische onderzoeken

DOI:

10.3791/67644

⸱

28 maart 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Southwest Hospital/Southwest Eye Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 2Key Lab of Visual Damage and Regeneration & Restoration of Chongqing, 3Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 4Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University) and Key Laboratory of Tumor Immunopathology, 5Army 953 Hospital, Shigatse Branch of Xinqiao Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University), 6Jinfeng Laboratory, 7Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Army Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van mesenchymale stamcellen (MSC-sEV's) zijn onderstreept als een celvrije behandelingsmodaliteit met minimale nadelige effecten. Deze studie biedt een protocol dat hemodialyse combineert met ultracentrifugatie, waardoor de tijd die aan het hele proces wordt besteed aanzienlijk wordt verminderd en de naleving van de normen voor goede productiepraktijken (GMP) wordt gegarandeerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes (sEV) afgeleid van mesenchymale stamcellen (MSC-sEV's) zijn onderstreept als een celvrije behandelingsmodaliteit met minimale bijwerkingen. Traditionele extractiemethoden zoals ultracentrifugatie en chromatografie met uitsluiting van grootte worden daarentegen beperkt door hun tijdsintensiteit, kosten en schaalbaarheid. Om deze beperkingen te overwinnen, stellen we een methode voor die een hemodialysator en ultracentrifugatie integreert. Deze aanpak maakt gebruik van een hemodialyse-apparaat met een 100 kDa moleculair gewicht cut-off (MWCO) membraan, dat selectief sEV's concentreert terwijl een overvloed aan eiwitten wordt gefilterd, waardoor de opbrengst en zuiverheid van sEV's worden verbeterd. Deze eerste zuiveringsstap wordt gevolgd door ultracentrifugatie om de sEV-bereiding verder te verfijnen. De integratie van deze twee technologieën verminderde niet alleen de tijd die aan het hele proces werd besteed aanzienlijk, maar zorgde er ook voor dat werd voldaan aan de normen voor goede productiepraktijken (GMP). De methode toont hier een hoge efficiëntie aan bij het isoleren van sEV's uit een groot aantal monsters, wat een aanzienlijke vooruitgang biedt ten opzichte van traditionele methoden. Dit protocol is veelbelovend voor het versnellen van de vertaling van op EV gebaseerde therapieën naar de klinische praktijk door een schaalbare, kosteneffectieve en GMP-conforme oplossing te bieden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kleine extracellulaire blaasjes afgeleid van mesenchymale stamcellen (MSC-sEV's) zijn heterogene blaasjes verrijkt met meerdere componenten zoals mRNA, micro-RNA, cytokines, lipiden en metabolieten1. In de afgelopen jaren hebben veel onderzoeken het immense therapeutische potentieel van MSC-SEV's onderstreept als een celvrije behandelingsmodaliteit met minimale nadelige effecten2, wat veelbelovend is voor het aanpakken van een spectrum van aandoeningen, waaronder veroudering, weefseldegeneratie, kanker en ontstekingsaandoeningen 3,4,5,6. Desalniettemin blijft er een kritieke uitdaging bestaan bij de grootschalige extractie van sEV, waarbij traditionele methoden ofwel moeizaam tijdrovend of economisch onhaalbaar blijken te zijn. Bovendien is het waarborgen van reproduceerbaarheid van het grootste belang voor de klinische toepassing en vertaling van op EV gebaseerde therapieën7. Onderzoekers hebben dringend behoefte aan een zuiveringsmethode die niet alleen eenvoudig en efficiënt is, maar ook voldoet aan de Good Manufacturing Practice (GMP)-normen8.

De conventionele zuiveringsmethoden, waaronder ultracentrifugatie, ultrafiltratie, chromatografie met uitsluiting van grootte, immunoaffiniteit en polymeerprecipitatie, zijn uitgebreid toegepast in eerder onderzoek9. Over het algemeen vertonen traditionele methoden voor sEV-isolatie beperkingen zoals een lage opbrengst, aangetaste zuiverheid en uitdagingen bij het voldoen aan strenge aseptische normen. Bovendien heeft eerder onderzoek het potentieel gerapporteerd van veelbelovende technieken zoals microfluïdische systemen10,11, labelvrije magnetische isolatie12 en covalente chemie-isolatie13 voor het bereiken van uitstekende prestaties. De vereiste voor gespecialiseerde apparatuur maakt het echter een uitdaging voor de meeste onderzoeksteams om deze geavanceerde technieken toe te passen. Samenvattend blijft de efficiënte methode om sEV's van GMP-kwaliteit te isoleren uit een groot aantal monsters een cruciaal obstakel, dat de vooruitgang van talrijke teams in zowel onderzoek als klinische toepassingen beperkt.

Ultracentrifugatie is de meest gebruikte methode voor sEV-isolatie en wordt erkend als de gouden standaardmethode14,15. Het is een techniek die gebruik maakt van verschillen in dichtheid en grootte om sEV's te isoleren. Geïsoleerde sEV's worden gewoonlijk gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om resterende verontreinigingen te verwijderen. Vervolgens wordt over het algemeen een geschikt volume PBS gebruikt om de gespoelde sEV's opnieuw te suspenderen en kunnen verschillende verwachte concentraties sEV's worden geoogst door het volume PBS te regelen. Bovendien wordt gemeld dat de zuiverheid van plasma-sEV's verkregen door ultracentrifugatie beter lijkt te zijn dan die van plasma-sEV's geïsoleerd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC), en de sEV's verkregen door ultracentrifugatie hebben lagere niet-vesiculaire extracellulaire deeltjes (NVEP's) onzuiverheden. Dit maakt ultracentrifugatie ook de meest gebruikte en moeilijk te vervangen in veel behandelingen die hoge concentraties sEV's vereisen. Naast kwaliteit en zuiverheid is echter ook efficiëntie een factor die niet kan worden genegeerd bij grootschalige sEV-extractie. Tot nu toe kan een enkele ronde van ultracentrifugatie een monstervolume tot ongeveer 600 ml ondersteunen, wat bepaalt dat het moeilijk is om aan de vraag naar grootschalige extractie te voldoen door alleen ultracentrifugatie16.

Een hemodialyse-apparaat bestaat uit een op membraan gebaseerde module die duizenden holle vezels bevat. Bloed circuleert door deze vezels in een afgesloten cilindrische kamer17. De bestanddelen van het bloed kunnen selectief door deze membranen gaan op basis van hun moleculaire grootte en ionconcentratie. In de kliniek wordt het veel gebruikt als kunstnier om afvalstoffen en overtollig vocht uit het bloed van patiënten te verwijderen 18,19,20. Met andere woorden, de hemodialysator heeft ook het potentieel om monsters met een groot volume te concentreren, vertrouwend op een proces dat vergelijkbaar is met tangentiële stroomfiltratie (TFF). In de recente richtlijn van de International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) worden sEV-concentraten geschikt geacht voor monsters met een groot volume, zoals celkweekmedium. Na tientallen jaren van ontwikkeling zijn hemodialyzers op grote schaal toegepast in ziekenhuizen, ondersteund door een overvloed aan volwassen verbruiksartikelen en een pool van bekwame operators, waardoor het gemakkelijker wordt om het monster steriel te houden.

Deze studie presenteert een sEV-zuiveringsmethode op basis van een hemodialysator en ultracentrifuge die compatibel zijn met GMP's. Hier kiezen we dialysatoren met een molecuulgewichtgrens van 100 kDa (MWCO), waarvan is aangetoond dat ze sEV's effectief opvangen en talloze eiwitten filteren22. Ultracentrifugatie biedt ook een stap voor verdere zuivering. Het werk toont aan dat de hemodialyzer even geschikt is voor de concentratie van sEV's. Dit protocol stelt onderzoekers in staat om sEV's efficiënt te isoleren uit monsters met een groot volume. We hebben de klinische studie geregistreerd in het Chinese Clinical Trial Registry (ChiCTR, NO. ChiCTR2200059018), die nog aan de gang is en nog niet is voltooid. Hoewel klinische gegevens op dit moment niet direct beschikbaar zijn voor publicatie, is een betrouwbare, grootschalige, efficiënte en conforme methode voor het produceren van sEV's zoals gerapporteerd in dit protocol een voorwaarde voor het uitvoeren van preklinische en klinische onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol is goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Human Research Ethics Committee van het Southwest Hospital.

1. Verwijderen van celresten van het kweekmedium

OPMERKING: De onderstaande procedures moeten worden uitgevoerd in een GMP-conforme omgeving, vooral wanneer de monsters direct aan de omgeving kunnen worden blootgesteld.

  1. Gezien de eis van microbiota-vrij, moet u ervoor zorgen dat het filter en de rubberen slang worden geautoclaveerd voor effectieve sterilisatie. Zorg ervoor dat alle andere verbruiksartikelen die in aanraking kunnen komen met het kweekmedium steriel zijn en in een verzegelde verpakking zitten. Voer het proces uit van het verwijderen van celresten in een laminaire stromingskast.
  2. Monteer het 0.45 μm en 0.22 μm filtratiemembraan op het filterapparaat. Sluit een slangenpomp (zie materiaaltabel) en het filterapparaat aan op de rubberen slang. Plaats het 0.45 μm-membraan boven het 0.22 μm-membraan; anders kan het de filtratie-efficiëntie verminderen (Figuur 1). Let op het onderscheid tussen de voor- en achterkant van het microfiltratiemembraan.
  3. Start de slangenpomp voor de filtratie. Aangedreven door de pomp gaat het mesenchymale stamcelbasale medium (MSCBM) met 5% supplement (zie materiaaltabel) vanaf het ene uiteinde door het filter en kan het gefilterde kweekmedium aan het andere uiteinde van het filter worden verkregen, zoals weergegeven in (Figuur 1). Verzamel het gefilterde kweekmedium in een drainagezak met dubbele kanalen. Behoud de integriteit van het filtersysteem door de snelheid van de peristaltische pomp te optimaliseren en het filtermembraan indien nodig te vervangen.
  4. Nadat de filtratie is voltooid, sluit u de inlaatklep op de afvoerzak en sluit u deze verder af met parafilm (zie materiaaltabel). Ga verder met de volgende stap of bewaar het gefilterde celkweekmedium tijdelijk bij 4 °C.

2. Het gefilterde kweekmedium concentreren met een hemodialyzer

OPMERKING: Gebruik geen Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) dat fenolrood bevat in celcultuur, aangezien de bloedlekdetector in de hemodialysator wordt geactiveerd of sluit de bloedlekdetector af in de hemodialyzerinstelling.

  1. Bereid de verbruiksartikelen voor.
    1. Bereid bloedlijnen, 100 kDa MWCO high-flux polysulfonmembranen, bloeddialysator, infusieset, fysiologische zoutoplossing, infuuszak, jodiumoplossing en wattenstaafjes voor vóór concentratie (zie Tabel met materialen).
  2. Schakel het systeem in en test zelf.
    1. Controleer de aansluiting van de voedingskabel van de hemodialysator en schakel de hoofdstroom in.
    2. Wacht tot de machine de volledige zelfdiagnoseprocedure heeft voltooid.
  3. Installeer de bloedlijnen en dialysator.
    1. Controleer de houdbaarheidsdata van de wegwerpbloedlijnen en de bloeddialysator, zorg voor de integriteit van de buitenverpakking en controleer op eventuele schade aan de lijnen.
    2. Installeer de slang in dezelfde richting als de bloedstroom in het extracorporale circuit en sluit achtereenvolgens de aftakkleppen om een gesloten circulatie te vormen.
  4. Start de spoelprocedure.
    1. Gebruik een infusieset om de fysiologische zoutoplossing (zonder heparine) van een slang vóór de pomp op het dialysecircuit aan te sluiten. Sluit de veneuze inzamelplaats aan op de afvalvloeistofzak.
      OPMERKING: De fysiologische zoutoplossing mag geen heparine of andere anticoagulantia bevatten.
    2. Sluit de dialysetoevoer-/retourleidingen aan op de dialyzer.
    3. Start de hemodialyzer en stel het debiet in op 80-100 ml/min. Verdrijf alle lucht uit het dialysecircuit en de dialysator om ervoor te zorgen dat het hele slangsysteem met vloeistof is gevuld.
    4. Stel het vloeistofvlak in de arteriële en veneuze kamers in op ongeveer 2/3 vol. De zoutoplossing stroomt achtereenvolgens door de arteriële lijn, de dialyzer, de veneuze lijn en de afvalvloeistofzak.
  5. Start de ultrafiltratieconcentratie.
    1. Hang na het voltooien van de spoelprocedure de afvoerzak met het gefilterde kweekmedium op de infuusstandaard, desinfecteer het uitvoerkanaal met met jodium doordrenkte wattenstaafjes en sluit het uitvoerkanaal van de afvoerzak aan op een voorpomppoort met behulp van een infusieset.
    2. Sluit je aan bij de arteriële poort en de veneuze poort van de bloedlijnen. Breng een geïsoleerd dialysecircuit voor ultrafiltratie (ISO-UF, ultrafiltratie zonder dialysaatstroom) tot stand (Figuur 1).
    3. Pas het doelvolume van de ultrafiltratie op de dialysemachine aan zodat deze overeenkomt met de totale hoeveelheid vloeistof die in de afvoerzak aanwezig is. Stel de dialysetijd van de ultrafiltratie in op de minimale operationele tijd van het systeem. Nadat de parameters met succes zijn ingesteld, start u de ultrafiltratie.
      OPMERKING: Door de berekening van het hemodialysesysteem zal de dialysetijd niet te kort zijn, maar in een gematigder tempo worden gehandhaafd.
  6. Verkrijg de geconcentreerde vloeistof.
    1. Nadat het beoogde uitdrogingsvolume is bereikt, sluit u de arteriële klem en sluit u de veneuze poort aan op een steriele infuuszak.
    2. Open de pre-pomppoort van de wegwerpbloedlijnen die zijn uitgerust met een luchtfilter. Activeer de bloedpomp met een snelheid van ongeveer 50 ml/min, waardoor de vloeistof in de bloedlijnen weer van de arteriële lijn naar de veneuze lijn kan circuleren. Trek alle geconcentreerde vloeistof, ongeveer 158 ml, uit het circuit terug in de steriele infuuszak.
    3. Vang in het late stadium van de concentratie de verspilde vloeistof op uit de dialysaatretourleiding. Pas opeenvolgende processen toe die identiek zijn aan die van het geconcentreerde kweekmedium op het afvalvloeistofmonster om eventueel onbedoeld verlies van sEV's tijdens de concentratie te controleren.
    4. Sluit alle kleppen en verwijder de infuuszak, dialysator en alle leidingen. Schakel de stroomtoevoer uit en desinfecteer de machine door deze af te vegen.

3. Scheiden van de sEV's met ultracentrifuge

  1. Breng het geconcentreerde kweekmedium over in ultracentrifugebuisjes en balanceer ze vervolgens.
  2. Centrifugeer in een ultracentrifuge van klinische kwaliteit (zie materiaaltabel) bij 110.000 × g gedurende 70 minuten, was vervolgens de pellet met een steriele zoutoplossing en ga verder met een tweede centrifugatie bij 110.000 × g gedurende nog eens 70 minuten.
  3. Resuspendeer de gepelleteerde sEV's in een geschikte hoeveelheid steriele zoutoplossing.
  4. Breng de sEV's over naar een steriele buis voor verder onderzoek of bewaar ze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

4. Karakterisering van verkregen sEV's

  1. Analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA)
    1. Verdun de verkregen sEV's (1 μl) met PBS (1 ml) (zie materiaaltabel). Pas het aantal sEV's dat zichtbaar is in het huidige gezichtsveld aan naar tussen 50 en 200.
    2. Injecteer het verdunde monster voorzichtig in de monsterput en vermijd het introduceren van luchtbellen.
    3. Voer de meting uit wanneer het aantal deeltjes in het gezichtsveld zo hoog en stabiel mogelijk is voor alle posities. De analyseparameters zijn als volgt: Max. gebied: 1000, Min. Gebied: 10, Min. Helderheid: 30, Spoorlengte: 15, Temperatuur: 25 °C, Gevoeligheid: 75.
    4. Meet elk monster minstens drie keer.
  2. Analyse van Western blotting
    1. Verdun de sEVs-oplossing in PBS. Gebruik een bicinchoninezuur (BCA) eiwittestkit (zie materiaaltabel) om de eiwitconcentratie te meten.
    2. Kook de sEV's in de monsterbuffer gedurende 5 minuten bij 100 °C.
    3. Bereid een 12% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gel voor op elektroforese (SDS-PAGE) (zie materiaaltabel). Zet het gelelektroforese-apparaat in elkaar. Laad gelijke hoeveelheden eiwit van elk monster in de SDS-PAGE-gelputjes. Stel de spanning van de elektroforese in op 80 V voor concentratie en 100 V voor scheiding.
    4. Activeer het polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan (zie materiaaltabel) gedurende 1 minuut met methanol en week vervolgens het PVDF-membraan in de overdrachtsbuffer voordat u verder gaat met de overdracht bij 100 V gedurende 1 uur.
    5. Dompel het PVDF-membraan onder in TBST-buffer (20 mM Tris, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20) met 5% runderserumalbumine (BSA; zie materiaaltabel) en blokkeer vervolgens gedurende 30 minuten.
    6. Incubeer het PVDF-membraan met het primaire antilichaam een nacht bij 4 °C op een schudder. De primaire antilichamen die worden gebruikt zijn de volgende: humaan anti-CD63 (verdunning 1:1000), humaan anti-CD9 (verdunning 1:1000) en humaan anti-HSP70 (verdunning 1:1000) (zie tabel met materialen).
    7. Was het PVDF-membraan de volgende dag vijf keer gedurende 5 minuten met TBST-oplossing en incubeer vervolgens gedurende 1 uur met HRP-geconjugeerd secundair antilichaam (verdunning 1:10000) (zie materiaaltabel) bij kamertemperatuur (RT).
    8. Gebruik na vijf keer wassen met TBST een chemiluminescentiedetectiereagens voor beeldvorming op een chemoluminescentiesysteem.
  3. Transmissie elektronenmicroscopie
    1. Voeg een 20 μL PBS-verdunde monsterdruppel toe aan een vetvrij papier. Plaats vervolgens een koperen rooster (zie Materiaaltabel) op de druppel zodat de monsterdruppel het koperen rooster kan bedekken en laat het 20 minuten op RT staan.
    2. Absorbeer overtollige vloeistof met filtreerpapier. Fixeer de monsters vervolgens gedurende 2 minuten in een oplossing van 20 μl van 2% paraformaldehyde, 2% glutaaraldehyde en 0,05 M fosfaatoplossing.
    3. Spoel het koperen rooster driemaal af met dubbel gedestilleerd water en bevlek vervolgens met 20 μL 2% fosfowolfstaalzuur (PTA) gedurende 1 minuut bij RT.
    4. Absorbeer overtollige vloeistof met filterpapier. Droog de roosters een nacht voordat ze worden geanalyseerd door middel van transmissie-elektronenmicroscopie (zie materiaaltabel).
      OPMERKING: De aanbevolen instellingen voor TEM zijn als volgt: Belichting: 1,0 s, HT-spanning 100,00 kV, Straalstroom: 50 μA, Spotgrootte: 1, Modus: TEM. Deze instellingen kunnen worden gewijzigd volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Morfologische karakterisering van sEV's
In de laatste concentratiefase werd de verspilde vloeistof ook opgevangen zoals beschreven. Het geconcentreerde medium en de verspilde vloeistof werden respectievelijk ultragecentrifugeerd. We verzamelden de neerslag voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) analyse. Zoals verwacht werd een aanzienlijk aantal komvormige nanoblaasjes waargenomen in de groep met geconcentreerd medium (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Traditionele methoden voor de isolatie van sEV's omvatten differentiële ultracentrifugatie, chromatografie met uitsluiting van grootte en PEG-precipitatie, elk met zijn eigen voor- en nadelen. Hoewel samensmelting van deze ongelijksoortige technieken de opbrengst of zuiverheid van sEV's kan verbeteren, introduceren extra stappen vaak meer mogelijkheden voor monstercontaminatie. Er zijn geïntegreerde systemen op de markt verschenen die beweren sEV's in bulk te extraheren en te voldoen aan...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door financiering van de National Science Foundation of China (822101167, naar BB) en de Natural Science Foundation of Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0020 naar BB), Chongqing PhD "Through Train" Scientific Research Project of China (CSTB2022BSXM-JCX0031 naar BB) en National Science Foundation of China (82271132 naar YL). We zijn dankbaar voor de hulp van de afdeling Nefrologie, het eerste aangesloten ziekenhuis, de derde militaire medische universiteit (Army Medical University) en het Institute of Pathology and Southwest Cancer Center, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medical University) voor de apparatuur en technische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-CD63SBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:1000 verdunning
Anti-CD9SBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:1000 verdunning
Anti-HSP70SBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:1000 verdunning
Bicinchoninic Acid Protein Assay KitBeyotimeP0012
BloodlinesFresenius Medical CareAP16641
Bovine serum albumin 5%Solarbio9048-46-8
Cell culture supplementHeliosHPCPLCGL055% (v/v) in celcultuurmedium
Copper gridPreciseRGRS  GP-SMPG-1
DialyzerHelixoneFX8100 kDa MWCO
Drainage bagCZRUIDEYLD-01
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD63A-11:10000 verdunning
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-CD9A-11:10000 verdunning
Goat Anti-Rabbit HRPSBI System BiosciencesEXOAB-Hsp70A-11:10000 verdunning
Mesenchymal Stem Cell Basal Medium (MSCBM)DakeweDKW34-BM20500
Microfiltration membraneshanghaixingyaWKLM-50-100.45 μm en 0.22 μm 
ParafilmFisher Scientific1337416
Peristaltic pumpLongerPumpYZ1515x
Phosphate buffer salineSolarbioP1022-500ml
Immun-Blot PVDF MembraneBIO-RAD1620177
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitBeyotimeP0012AC
SDS-PAGE Sample Loading BufferBeyotimeP0015A
Super ECL Plus Western Blotting SubstrateBIOGROUNDBG0001
TBST bufferSolarbioT1081
Ultracentrifuge tubes 38.5 mLBeckman344058
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBIO-RAD
HemodialyzerNIKKISODBB-27
Nanoparticle Tracking AnalysisZetaViewPMX120Om deeltjesgrootte
verdeling en deeltjes
concentratie te meten
Transmission Electron MicroscopyJEOLJEM-1400PLUSAanbevolen instellingen?Exposure: 1,0 s, HT Voltafe 100,00 kV, Beam Curr: 50 μA, Spot Size: 1, Mode: TEM.
UltracentrifugeBECKMAN COULTEROPTIMA XPN-100SW 28Ti SwingingBucket Rotor

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tan, F., et al. Clinical applications of stem cell-derived exosomes. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 17(2024).
  2. Xia, Y., Zhang, J., Liu, G., Wolfram, J. Immunogenicity of extracellular vesicles. Adv Mater. 36 (33), e2403199(2024).
  3. Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  4. Harrell, C. R., Jovicic, N., Djonov, V., Arsenijevic, N., Volarevic, V. Mesenchymal stem cell-derived exosomes and other extracellular vesicles as new remedies in the therapy of inflammatory diseases. Cells. 8 (12), 1605(2019).
  5. Lin, Z., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cancer therapy resistance: Recent advances and therapeutic potential. Mol Cancer. 21 (1), 179(2022).
  6. Matsuzaka, Y., Yashiro, R. Therapeutic strategy of mesenchymal-stem-cell-derived extracellular vesicles as regenerative medicine. Int J Mol Sci. 23 (12), 6480(2022).
  7. Syromiatnikova, V., Prokopeva, A., Gomzikova, M. Methods of the large-scale production of extracellular vesicles. Int J Mol Sci. 23 (18), 10522(2022).
  8. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  9. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  10. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7871(2023).
  11. Shin, S., et al. Separation of extracellular nanovesicles and apoptotic bodies from cancer cell culture broth using tunable microfluidic systems. Sci Rep. 7 (1), 9907(2017).
  12. Zeng, L., et al. Extraction of small extracellular vesicles by label-free and biocompatible on-chip magnetic separation. Lab Chip. 22 (13), 2476-2488 (2022).
  13. Dong, J., et al. Coupling nanostructured microchips with covalent chemistry enables purification of sarcoma-derived extracellular vesicles for downstream functional studies. Adv Funct Mater. 30 (49), 2003237(2020).
  14. Meng, Y., et al. Direct isolation of small extracellular vesicles from human blood using viscoelastic microfluidics. Sci Adv. 9 (40), eadi5296(2023).
  15. Martins, T. S., Vaz, M., Henriques, A. G. A review on comparative studies addressing exosome isolation methods from body fluids. Anal Bioanal Chem. 415 (7), 1239-1263 (2023).
  16. Börger, V., Staubach, S., Dittrich, R., Stambouli, O., Giebel, B. Scaled isolation of mesenchymal stem/stromal cell-derived extracellular vesicles. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e128(2020).
  17. Mohajerani, F., Clark, W. R., Ronco, C., Narsimhan, V. Mass transport in high-flux hemodialysis: Application of engineering principles to clinical prescription. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (5), 749-756 (2022).
  18. Zawada, A. M., et al. Impact of hydrophilic modification of synthetic dialysis membranes on hemocompatibility and performance. Membranes (Basel). 12 (10), 932(2022).
  19. Ghannoum, M., Roberts, D. M. Management of poisonings and intoxications. Clin J Am Soc Nephrol. 18 (9), 1210-1221 (2023).
  20. Khan, M. S., et al. Managing heart failure in patients on dialysis: State-of-the-art review. J Card Fail. 29 (1), 87-107 (2023).
  21. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: Exodus. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  22. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  23. Koch, L. F., et al. Novel insights into the isolation of extracellular vesicles by anion exchange chromatography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1298892(2023).
  24. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  25. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  26. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  27. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hemodialyse isolatieultracentrifugatiegrootte uitsluitingEV zuiveringcelvrije therapie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen