Methodenartikel

Cryosectie en immunokleuring van het binnenoorweefsel van muizen: van embryonale tot volwassen stadia

DOI:

10.3791/67647

⸱

11 april 2025

 , 
1Department of Biology, Georgetown University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol, bedoeld voor beginnende gebruikers van binnenoorweefsel van muizen, beschrijft uitgebreid de stappen voor het verwerken van de binnenoren van muizen in verschillende ontwikkelingsstadia voor sectie-immunokleuring.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft algemene histologiemethoden voor het bereiden van binnenoormonsters van embryonale, neonatale en volwassen muizen. Het doel van dit protocol is om een eenvoudige en gestandaardiseerde methode te bieden voor de verwerking van binnenoorweefsel voor onderzoekers, mogelijk nieuw in het veld, die geïnteresseerd zijn in het werken met het slakkenhuis van de muis. Hier zijn protocollen opgenomen voor dissectie, fixatie, inbedding, cryosectie en immunokleuring. Sectie immunokleuring is een van de beste methoden om individuele cellen te onderzoeken binnen de context van het gehele slakkenhuis.

Belangrijke stappen zijn onder meer het ontleden van het binnenoor weg van de schedel, het fixeren van het weefsel met 4% paraformaldehyde, inbedding met een optimale snijtemperatuurverbinding, cryosectie en immunokleuring met antilichamen gericht op specifieke eiwitten die tot expressie worden gebracht door het slakkenhuis.

Inbegrepen in onze methoden zijn speciale overwegingen gemaakt voor het slakkenhuis, gezien de
vorm en structuur. Redelijk goede focus- en dissectievaardigheden zijn nodig, aangezien weefselbeschadiging de kwaliteit van immunokleuring en consistentie tussen monsters kan beïnvloeden. Met de procedures die wij schetsen, kunnen de meeste gebruikers echter in een paar weken getraind worden om mooie voorbereidingen te treffen. Over het algemeen biedt dit protocol een waardevolle manier om onderzoek te bevorderen om de auditieve ontwikkeling, functie en ziekte in muismodellen te begrijpen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inzicht in de auditieve ontwikkeling en functie is cruciaal voor het karakteriseren en aanpakken van verschillende vormen van gehoorverlies. Er zijn veel risicofactoren voor gehoorverlies en omvatten diabetes 1,2, hypertensie 3,4,5, auto-immuunziekten 6,7, bacteriële meningitis 8,9 en verschillende neurodegeneratieve aandoeningen 10,11,12,13. Bovendien kunnen bepaalde medicijnen, zoals sommige antibiotica en chemotherapiemedicijnen, ook een negatieve invloed hebben op het gehoor14. Naast de onmiddellijke uitdagingen van auditieve stoornissen, kan gehoorverlies een negatieve invloed hebben op de cognitieve functie en angst en stress verhogen, wat kan correleren met cognitieve stoornissen en achteruitgang van de geestelijke gezondheid 11,15,16. Door dit protocol te publiceren, willen we eventuele barrières voor het betreden van auditief onderzoek wegnemen, vooral voor mensen zonder eerdere ervaring met het slakkenhuis. In deze gids wordt uitgelegd hoe u binnenoormonsters kunt bereiden van embryonale, juveniele (neonatale) en volwassen muizen. Het doel van dit protocol is om een eenvoudige benadering te bieden voor de verwerking van binnenoorweefsel, waarbij reproduceerbaarheid en consistentie in alle experimenten worden gegarandeerd. Sectie immunokleuring is een van de beste methoden voor het onderzoeken van verschillende celtypen in de context van het hele slakkenhuis; In andere omstandigheden kan immunokleuring op de hele berg voordeliger zijn (bijv. het onderzoeken van de morfologie van de stereocilia van haarcellen of eiwitlokalisatie).

De reden hiervoor komt voort uit uitdagingen bij het werken met het slakkenhuis van de muis. Het kleine formaat, de unieke spoel en de delicate structuur17 vereisen gespecialiseerde technieken voor nauwkeurige dissectie, fixatie, inbedding, cryosectie en immunokleuring. De spiraalvorm van het slakkenhuis betekent dat inbedding zorgvuldige aandacht voor oriëntatie vereist om ervoor te zorgen dat elke draaiing van het slakkenhuis behouden blijft, wat cruciaal is voor het verkrijgen van consistente secties. Bovendien ondergaat het slakkenhuis, naarmate het ouder wordt, ossificatie18, wat betekent dat het geleidelijk verandert in bot, wat het behoud van weefsel kan bemoeilijken en ontkalking noodzakelijk kan maken. Cryosectie immunokleuring biedt verschillende voordelen ten opzichte van alternatieve preparaten (zoals immunokleuring op de hele berg). De belangrijkste voordelen van cryosecties zijn het algemene behoud van eiwitten en nucleïnezuren, en de relatief dunne ~2D-secties zorgen voor consistente en nauwkeurige metingen. Bovendien kunnen alle cochleaire celtypen worden bewaard en gevisualiseerd, en kan het de kwaliteit van de immunokleuring verbeteren. In tegenstelling tot veel cochleaire preparaten voor hele montage, behoudt cryosectie structuren zoals het spiraalligament, de stria vascularis, het membraan van Reissner en het tectoriale membraan. Zie de volgende eerdere publicaties voor voorbeelden van hoogwaardige sectie immunokleuring van embryonale 19,20,21, neonatale 22,23,24 en volwassen 25,26 binnenoren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Georgetown University. Alle muizen in deze studie werden gehouden in overeenstemming met het Georgetown University Institutional Animal Care and Use Committee (protocol #1147). In de eerste postnatale week is ontkalking niet nodig, omdat de temporale botstructuren nog niet volledig ontwikkeld zijn. Cochleae van muizen van P6 jaar en ouder vereisen echter ontkalking en een andere dissectiemethode. In ons protocol werden mannelijke en vrouwelijke NCI Cr:NIH(S) (NIH Swiss) muizen gebruikt, en op E16.5, P0 en P30. Voor elk onderdeel noteren we tussen haakjes hoe lang elke stap naar verwachting zal duren voor beginners. Veel van de stappen zullen sneller worden door te oefenen.

1. Monsterverzameling van embryonale en juveniele binnenoor (~75 min)

  1. Euthanaseer en onthoofd muizen in overeenstemming met een goedgekeurd dierstudieprotocol.
  2. Maak met een fijne dissectieschaar voorzichtig een incisie in de middellijn langs de hoofdhuid, beginnend bij de nek en zich uitstrekkend naar de snuit, waarbij u de huid zijwaarts duwt (eerste snede).
  3. Plaats het onderste schaarblad bij het foramen magnum en het bovenste schaarblad bij de schedel. Snijd de bovenste helft van de schedel af tot aan de neus (tweede snede).
  4. Trek de schaar terug uit de gedeeltelijk ingesneden kop, plaats vervolgens het onderste schaarblad aan de onderkant van de schedel en de bovenste schaar eindigt bij het foramen magnum. Snijd de onderste helft van het hoofd af tot aan de neus (derde snede).
    OPMERKING: Het is belangrijk dat de schaarbladen dwars door de middellijn snijden en gemakkelijk en met weinig moeite snijden. Dit zorgt ervoor dat de schaarbladen precies tussen het linker- en rechteroor snijden.
  5. Op dit punt is het hoofd van de muis in tweeën gedeeld langs de rostrale-caudale as. Maak met een fijne tang en schaar voorzichtig al het zachte weefsel rond het slaapbeen, zoals hersenen, spieren en bindweefsel, los. Vermijd beschadiging van het bot of de omliggende structuren.
  6. Plaats de halve koppen van de muis in putjes van een bord met 24 putjes met 1x PBS op kamertemperatuur. Nadat elke kop is verwerkt, vervangt u de 1x PBS-oplossing door 4% PFA-oplossing (voor fixatie) en incubeert u gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (meestal 20 °C).
    OPMERKING: De fixatietijd kan variëren, afhankelijk van de eiwitten die moeten worden gedetecteerd en/of de bindingswerkzaamheid van verschillende antilichamen.
  7. Spoel na 45 minuten de tissue 3 x 5-10 minuten uit met 1x PBS.
  8. Bewaar de monsters in 1x PBS bij 4 °C of ga naar de volgende stap en ontleed ze. Voor langdurige opslag bewaren in 1x PBS met 0,1% natriumazide bij 4 °C.
  9. Gooi al het resterende muizenweefsel weg volgens de richtlijnen van de instelling voor het verwijderen van biologisch gevaar/weefsel.

2. Dissectie van embryonale en juveniele binnenoormonsters (3 - 5 minuten per monster)

  1. Zoek het slaapbeen/binnenoorkapsel in het halve hoofd van de muis. Het neemt dezelfde positie in als het buitenoor, maar bevindt zich in het schedelbot. Maak met een fijne tang voorzichtig al het zachte weefsel rond het binnenoorkapsel los. Zodra de binnenoorcapsule is losgemaakt, begint u met het doorknippen van het weefsel rond de binnenoorcapsule.
  2. Zodra de binnenoorcapsule grotendeels is bevrijd van het schedelweefsel, oefent u voorzichtig druk uit op het omliggende gebied van de binnenoorcapsule met behulp van een tang om deze volledig los te maken.
    NOTITIE: Oefen geleidelijke druk uit om de binnenoorcapsule los te maken van de omringende opzetstukken. Voorkom beschadiging van de binnenoorcapsule. Omdat het zich vroeg ontwikkelende binnenoor vrij zacht is, moet u geen direct contact met uw tang maken.
  3. Bewaar de monsters van het binnenoor zoals in stap 1.8 en gooi al het resterende vuil van het gefixeerde hoofdweefsel weg.

3. Afname en dissectie van monsters van het binnenoor bij volwassenen (~75 min + 2 - 3 dagen EDTA-behandeling)

  1. Euthanaseer en onthoofd muizen volgens een goedgekeurd dierstudieprotocol.
  2. Maak met een scherpe dissectieschaar voorzichtig een incisie in de middellijn langs de hoofdhuid, beginnend bij de nek en zich uitstrekkend naar de snuit. Vouw de huid terug om de schedel bloot te leggen (eerste snede).
  3. Plaats het onderste schaarblad bij het foramen magnum en het bovenste schaarblad bij de schedel. Snijd de bovenste helft van de schedel af tot aan de neus (tweede snede).
    NOTITIE: Tijdens deze stap zult u matig "kraken" van de schaarbladen opmerken; Dit is normaal.
  4. Trek de schaar terug uit de gedeeltelijk ingesneden kop en plaats vervolgens het onderste schaarblad op de onderkant van de schedel en het bovenste schaarblad op het foramen magnum. Snijd de onderste helft van het hoofd af tot aan de neus (derde snede), zorg ervoor dat u langs de middellijn gaat om ervoor te zorgen dat de mesjes de binnenkant van het oor missen.
    OPMERKING: Dwing de schaar niet door het weefsel; Dit kan erop duiden dat de mesjes een van de binnenoren raken.
  5. Maak voor elke halve kop met een tang en een schaar al het zachte weefsel rond het slaapbeen los, zoals de hersenen, spieren en bindweefsel.
    OPMERKING: Wees voorzichtig om beschadiging van het slaapbeen of de omliggende structuren te voorkomen.
  6. Terwijl het omringende weefsel is opgeruimd, "reverse curl" het schedelweefsel met de vingers en gebruik een duim om voorzichtig druk uit te oefenen op de onderkant van het slaapbeen. Oefen geleidelijke druk uit terwijl u het bot losmaakt van de omliggende aanhechtingen.
    OPMERKING: Terwijl er druk wordt uitgeoefend, komt het binnenoorkapsel geleidelijk los van de omliggende botten van de schedel. Met zachte manipulatie zou het bot relatief gemakkelijk naar buiten moeten springen.
  7. Zodra de binnenoorcapsule is verwijderd, spoelt u deze af met 1x PBS.
  8. Vul een sylgardschaaltje met 4% PFA en plaats het onder de microscoop. Plaats een enkel uitpuilend binnenoor in de sylgardschaal.
  9. Onderzoek het binnenoor op aangehecht zacht weefsel of bot en verwijder dit voorzichtig.
  10. Zoek het ovale raam en verwijder de stijgbeugels voorzichtig met een tang.
  11. Zoek het ronde venster en prik een klein gaatje om er zeker van te zijn dat er geen omringend weefsel verstopt raakt.
  12. Open een klein gaatje in de top met een fijne tang. Spoel het slakkenhuis door met een P20-pipet gevuld met 4% PFA om te fixeren. Zorg ervoor dat u visualiseert dat er vloeistof (verdund bloed, endolymfe/perilymfe) uit het ovale raam komt.
  13. Plaats het vaste slakkenhuis in een plaat met 24 putjes gevuld met 4% PFA. Markeer de tijd. Incubeer 30-60 minuten bij kamertemperatuur met zacht roeren (tuimelschakelaar of nootvormer) en spoel het monster vervolgens 3 x 5-10 minuten met 1x PBS-oplossing.
  14. Plaats de tissue na de laatste spoeling in 1,25 mM EDTA en laat het 2-3 dagen schommelen bij 4 °C.
  15. Gooi het resterende muizenweefsel op de juiste manier weg volgens de richtlijnen van de instelling voor biologisch gevaar/verwijdering van weefsel.
  16. Spoel na de EDTA-behandeling de tissue 3 x 5 minuten uit met 1x PBS.
  17. Bewaar de monsters in 1x PBS bij 4 °C of ga naar de volgende stap en ontleed ze. Bewaar de monsters voor langdurige opslag in 1x PBS met 0,1% natriumazide bij 4 °C.

4. Voorbereiding van het binnenoormonster voor cryosectie (~24 uur)

  1. Plaats de ontlede binnenoorcapsule in 10% sucrose (in 1x PBS) en laat deze minimaal 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Wanneer de monsters volledig in evenwicht zijn, zinken ze naar de bodem van de buis.
  2. Gooi de 10% sucrose-oplossing weg, voeg 20% sucrose toe in 1x PBS en laat nog 2 uur incubatie bij kamertemperatuur.
  3. Gooi de 20% sucrose-oplossing weg, voeg 30% sucrose toe in 1x PBS en incubeer een nacht (minimaal) bij 4 °C.
    OPMERKING: Deze stap kan worden teruggebracht tot 2 uur, maar een nachtelijke incubatie levert de beste resultaten op. Het weefsel kan gedurende langere tijd in elk percentage sucrose blijven zitten.
    1. Verwijder de helft van de 30% sucrose-oplossing en vul de ruimte met een optimale snijtemperatuur (OCT) -verbinding. Laat het minimaal 30 minuten en maximaal 2 uur rocken.
      OPMERKING: Als u de monsters langere tijd in OCT laat liggen, zal het weefsel krimpen.
  4. Breng de monsters over naar gelabelde cryomallen die zijn gevuld met OCT.
  5. Controleer de cochleaire oriëntatie onder de microscoop in het ingebedde cryoblok. Controleer voor "standaard" cochleaire doorsneden of de concave kant van het binnenoor naar de smalle zijden van de cryomold is gericht.
  6. Doe droogijs in een kleine container en voeg 5-10 ml ethanol of dimethylbutaan toe. Plaats de cryomallen + OCT + monster op borrelend droogijs om het blok snel te bevriezen.
  7. Bewaar de monsters bij -80 °C.

5. Secties van de binnenoren (~25 min per monster)

  1. Breng de cryoblokken over naar de kamer van een cryostaat die is voorgekoeld tot -20 °C. Laat de monsters daar 30-60 minuten in evenwicht komen.
  2. Markeer met een potlood de kant van het cryoblok die overeenkomt met de cochleaire positie om de juiste oriëntatie voor het snijden te garanderen.
  3. Voeg een kleine plas OCT toe aan de boorkop en plaats het cryoblok erop, brede kant (zonder de potloodmarkering) naar beneden.
  4. Plaats de klauwplaat + OCT + monster in de gekoelde cryostaatkamer, zodat de OCT volledig kan bevriezen. Plaats na een paar minuten de boorkop + monster op de boorkophouder met de potloodmarkering naar rechts of links gericht.
  5. Knip het blok af totdat het weefsel zichtbaar is (gebruik 40 μm als triminstelling).
  6. Zodra het weefsel zichtbaar is, oogst u een sectie van 12 μm met objectglaasjes die zijn ontworpen voor cryosectie en controleert u de sectielocatie onder een microscoop.
  7. Als u cochleaire bochten nadert, oogst dan 12 μm secties en controleer de positie af en toe, tot voorbij alle bochten.
    OPMERKING: Het aantal secties per dia kan variëren, maar we krijgen meestal 8-10 secties per dia en ongeveer 6 dia's per slakkenhuis.
  8. Bewaar de glaasjes bij -80 °C.

6. Sectie immunokleuring (~1 - 3 dagen)

  1. Haal de glaasjes uit de vriezer van -80 °C en laat ze ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen.
  2. Label de objectglaasjes met een potlood met de antilichamen die zullen worden gebruikt.
  3. Trek de randen over met behulp van een hydrofobe marker (bijv. Hydrofobe barrière peroxidase-antiperoxidase pen (PAP)).
  4. Rehydrateer de monsters in 1x PBS gedurende 5 minuten.
  5. Gooi de 1x PBS van dia's weg en voeg 1x PBS + 0.1% Triton X-100 (0.1% PBSTx) toe aan de dia's gedurende 20 minuten om te permeabiliseren.
  6. Verwijder 0,1% PBSTx van het objectglaasje en voeg 200 μL van de blokkeeroplossing toe voor een incubatie van 1-2 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Blokkering is een cruciale stap in immunokleuringstechnieken zoals immunohistochemie en immunofluorescentie, waar het de niet-specifieke binding van antilichamen aan weefsels of cellen voorkomt. Zie voor meer informatie Lewis' gids voor het selecteren van controle- en blokkeringsreagentia27. Een veelgebruikte blokkeeroplossing is 10% Normal Donkey Serum in 0,5% PBSTx, maar dit is alleen van toepassing wanneer secundaire antilichamen afkomstig van ezels worden gebruikt.
  7. Spoel snel met 1x PBS, voeg 200 μL primaire antilichaamoplossing toe, bestaande uit 0,5% PBSTx en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of een nacht bij 4 °C. Gebruik voor de primaire antilichamen in figuur 1 de volgende verdunningen: 1:200 voor Plexine-B1, 1:200 voor Sox2, 1:1.000 elk voor Tuj1, Myo6 en Myo7A (zie ook Materialenlijst).
    OPMERKING: Elk primair antilichaam gedraagt zich anders, afhankelijk van de epitoopbindende eigenschappen en het vermogen om weefselmonsters binnen te dringen.
  8. Na de behandeling met primaire antilichamen 4 x 30 minuten spoelen in PBSTx, 200 μL secundaire antilichaamoplossing toegemaakt in 0,5% PBSTx (materialenlijst) en 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Soms kan het nuttig zijn om secundaire antilichaamoplossingen gedurende 30 minuten op volle snelheid bij 4 °C te draaien om ongewenst neerslag te pelleteren. Als de secundaire oplossingen zijn gecentrifugeerd, raak dan de bodem van de buis niet aan met de pipetpunt.
  9. Spoel gedurende 4 x 30 minuten in PBSTx (of spoel 's nachts uit) en monteer de dia's vervolgens met een montagemedium dat fotobleken helpt voorkomen (bijv. Fluoromount).
  10. Voeg een dekglaasje van het juiste formaat toe met een dikte die geschikt is voor de beeldvormingsopstelling (bijv. nr. 1 dekglaasjes, die 0,13-0,16 mm dik zijn).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren voorbeelden uit ons eigen laboratorium van de apex en basale draaiing van een embryonaal dag 16,5 (E16.5) muizenslakkenhuis en de basale draaiing vanaf postnatale dag 0 (P0) en P30 slakkenhuis. Deze monsters zijn doorgesneden en immunogekleurd met behulp van markers voor haarcellen (Myo7A en Myo6), spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's; Tuj1), glia en steuncellen (Sox2) en Plexine-B1, dat het basaalmembraan rond het cochleaire kanaal en SGN's labelt. De dwarsdoorsneden va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende belangrijke stappen voor succesvolle cryosectie en immunokleuring. Een goede fixatie van het cochleaire weefsel is essentieel, en de duur van de fixatie is ook belangrijk, die kan variëren afhankelijk van het antilichaam. Hoewel de meeste antilichamen beter werken met een kortere fixatietijd, zoals 45 minuten in PFA, kunnen sommige doelepitopen nachtelijke fixatie verdragen. Op basis van onze ervaring zorgt een fixatie van 45 minuten voor voldoende conservering en i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.A.D. en T.M.C. werden ondersteund door NIH-subsidies 5R01DC016595-07 (aan T.M.C.) en 5R01DC018040-05 (Michael Deans, Univ. Utah, PI). Voorbeeldmicrofoto's in figuur 1A-H werden gegenereerd door Dr. Kaidi Zhang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals
Triton X-100Thermo Fisher Scientific, Inc.BP151-500
PBSCorning, Inc.46-013-CM
EDTASigma-Aldrich, LLC.60-00-4
Sucrose VWR International, Inc.97061-432
Sodium azide Amresco, Inc.0639-250G
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences15714
EthanolDecon labs, Inc.v1001
Dimethylbutaan Thermo Fisher Scientific, Inc.19387-AP
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)VWR International, Inc.25608-930
Specifiek apparatuur
CryostatThermo Fisher Scientific, Inc.14-071-459
DissectiepincettenElectron Microscopy Sciences72700-DZ
Hydrofobe barrière Peroxidase-Antiperoxidase Pen (PAP) Vector Laboratories, Inc.H-4000
Confocale microscoopCarl Zeiss Microscopy, LLC.LSM 880
P20 micropipetGilson, Inc.F144056M
Dissectie schaarThermo Fisher Scientific, Inc.08-951-20
Sylgard schotelElectron Microscopy Sciences24236-10
CentrifugeEppendorf5424R
Montagematerialen
FluoromountElectron Microscopy Sciences17984-25
Superfrost plus slidesThermo Fisher Scientific, Inc.1255015
Immunostainereagentia
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch, Inc.017-000-121
Anti-muis FAB-fragmenten Jackson ImmunoResearch, Inc.715-007-003
BlokHenAves labs, Inc.BH-1001
Tuj1 (beta-III-tubulin) muis monoklonaal antilichaamBiolegend, Inc.MMS-435P
Sox2 geiten polyklonaal antilichaamR&D Systems, Inc.AF2018
Myo6 konijn polyklonaal antilichaamProteus Biosciences25–6791
Myo7A konijn polyklonaal antilichaamThermo Fisher Scientific, Inc.PA1-936
Plexin-B1 geiten polyklonaal antilichaamR&D Systems, Inc.AF3749
Secundaire antilichamen (gemaakt in ezel; Alexa-488, Cy3, Cy5)Jackson ImmunoResearch, Inc.zie catalogus

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bainbridge, K. E., Hoffman, H. J., Cowie, C. C. Diabetes and hearing impairment in the United States: Audiometric evidence from the National Health and Nutrition Examination Survey, 1999 to 2004 . Ann Intern Med. 149 (1), 1-10 (1999).
  2. Baiduc, R. R., Helzner, E. P. Epidemiology of diabetes and hearing loss. Semin Hear. 40 (4), 281-291 (2019).
  3. Agarwal, S., Mishra, A., Jagade, M., Kasbekar, V., Nagle, S. K. Effects of hypertension on hearing. Indian J Otolaryngol Head Neck Surg. 65 (Suppl 3), 614-618 (2013).
  4. Przewoźny, T., Gójska-Grymajło, A., Kwarciany, M., Gąsecki, D., Narkiewicz, K. Hypertension and cochlear hearing loss. Blood Press. 24 (4), 199-205 (2015).
  5. Babarinde, J. A., Adeyemo, A. A., Adeoye, A. M. Hearing loss and hypertension: exploring the linkage. The Egyptian Journal of Otolaryngology. 37 (1), 1-6 (2021).
  6. Mijovic, T., Zeitouni, A., Colmegna, I. Autoimmune sensorineural hearing loss: the otology-rheumatology interface. Rheumatology (Oxford). 52 (5), 780-789 (2013).
  7. Mancini, P., et al. Hearing loss in autoimmune disorders: Prevalence and therapeutic options. Autoimmun Rev. 17 (7), 644-652 (2018).
  8. Persson, F., Bjar, N., Hermansson, A., Gisselsson-Solen, M. Hearing loss after bacterial meningitis, a retrospective study. Acta Otolaryngol. 142 (3-4), 298-301 (2022).
  9. Kutz, J. W., Simon, L. M., Chennupati, S. K., Giannoni, C. M., Manolidis, S. Clinical predictors for hearing loss in children with bacterial meningitis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 132 (9), 941-945 (2006).
  10. Li, S., et al. Hearing loss in neurological disorders. Front Cell Dev Biol. 9, 716300(2021).
  11. Shen, Y., et al. Cognitive decline, dementia, Alzheimer's disease and presbycusis: Examination of the possible molecular mechanism. Front Neurosci. 12, 12(2018).
  12. Profant, O., et al. Auditory dysfunction in patients with Huntington's disease. Clin Neurophysiol. 128 (10), 1946-1953 (2017).
  13. Jafari, Z., Kolb, B. E., Mohajerani, M. H. Auditory dysfunction in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (4), 537-550 (2020).
  14. Rybak, L. P., Ramkumar, V. Ototoxicity. Kidney Int. 72 (8), 931-935 (2007).
  15. Demirhan, M. A., Celebisoy, N. Cognitive functions in episodic vestibular disorders: Meniere's disease and vestibular migraine. J Vestib Res. 33 (1), 63-70 (2023).
  16. Shoham, N., Lewis, G., Favarato, G., Cooper, C. Prevalence of anxiety disorders and symptoms in people with hearing impairment: a systematic review. Soc Psychiatry Psychiatr Epidemiol. 54 (6), 649-660 (2019).
  17. Manley, G. A., Gummer, A. W., Popper, A. N., Fay, R. R. The cochlea: What it is, where it came from, and what is special about it. Understanding the Cochlea. Springer Handbook of Auditory Research. 62, Springer. Cham. 17-32 (2017).
  18. Bai, J., et al. Three-dimensionally visualized ossification and mineralization process of the otic capsule in a postnatal developmental mouse. Laryngoscope Investig Otolaryngol. 8 (4), 1036-1043 (2023).
  19. Dabdoub, A., et al. Sox2 signaling in prosensory domain specification and subsequent hair cell differentiation in the developing cochlea. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (47), 18396-18401 (2008).
  20. Mann, Z. F., Chang, W., Lee, K. Y., King, K. A., Kelley, M. W. Expression and function of scleraxis in the developing auditory system. PLoS One. 8 (9), e75521(2013).
  21. Wang, Z., et al. The purinergic receptor P2rx3 is required for spiral ganglion neuron branch refinement during development. eNeuro. 7 (4), (2020).
  22. Matern, M., et al. Gfi1Cre mice have early onset progressive hearing loss and induce recombination in numerous inner ear non-hair cells. Sci Rep. 7, 42079(2017).
  23. Woods, C., Montcouquiol, M., Kelley, M. W. Math1 regulates development of the sensory epithelium in the mammalian cochlea. Nat Neurosci. 7 (12), 1310-1318 (2004).
  24. Zhang, K. D., Coate, T. M. Recent advances in the development and function of type II spiral ganglion neurons in the mammalian inner ear. Semin Cell Dev Biol. 65, 80-87 (2017).
  25. Brooks, P. M., et al. Pou3f4-expressing otic mesenchyme cells promote spiral ganglion neuron survival in the postnatal mouse cochlea. J Comp Neurol. 528 (12), 1967-1985 (2020).
  26. Zhang, Y., et al. Pericytes control vascular stability and auditory spiral ganglion neuron survival. Elife. 12, e83486(2023).
  27. Lewis, M. A guide to selecting control and blocking reagents. , https://www.jacksonimmuno.com/secondary-antibody-resource/technical-tips/controls-diluents-blocking/ (2018).
  28. Song, L., McGee, J., Walsh, E. J. Frequency-and level-dependent changes in auditory brainstem responses (ABRS) in developing mice. J Acoust Soc Am. 119 (4), 2242-2257 (2006).
  29. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole-mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), e53561(2016).
  30. Driver, E. C., Northrop, A., Kelley, M. W. Cell migration, intercalation and growth regulate mammalian cochlear extension. Development. 144 (20), 3766-3776 (2017).
  31. Babola, T. A., et al. Purinergic signaling controls spontaneous activity in the auditory system throughout early development. J Neurosci. 41 (4), 594-612 (2021).
  32. Donadieu, E., et al. Improved cryosections and specific immunohistochemical methods for detecting hypoxia in mouse and rat cochleae. Acta Histochem. 109 (3), 177-184 (2007).
  33. Rio, C., Dikkes, P., Liberman, M. C., Corfas, G. Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice. J Comp Neurol. 442 (2), 156-162 (2002).
  34. Ahmad, S., Chen, S., Sun, J., Lin, X. Connexins 26 and 30 are co-assembled to form gap junctions in the cochlea of mice. Biochem Biophys Res Commun. 307 (2), 362-368 (2003).
  35. Li, X., et al. Spag6 mutant mice have defects in development and function of spiral ganglion neurons, apoptosis, and higher sensitivity to paclitaxel. Sci Rep. 7 (1), 8638(2017).
  36. Gratton, M. A., Rao, V. H., Meehan, D. T., Askew, C., Cosgrove, D. Matrix metalloproteinase dysregulation in the stria vascularis of mice with Alport syndrome: implications for capillary basement membrane pathology. Am J Pathol. 166 (5), 1465-1474 (2005).
  37. Goodyear, R. J., et al. Accelerated age-related degradation of the tectorial membrane in the Ceacam16βgal/βgal null mutant mouse, a model for late-onset human hereditary deafness DFNB113. Front Mol Neurosci. 12, 147(2019).
  38. Zupančič, D., Terčelj, M., Štrus, B., Veranič, P. How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section. Protoplasma. 254 (5), 1931-1939 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Cryosectie van de muis cochleaimmunokleuring van het binnenoorcochleaire dwarsnedenweefselfixatieOCT inbeddingparaformaldehyde fixatieauditieve ontwikkelingcochleaire dissectiehistologische methoden

Gerelateerde artikelen