Methodenartikel

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/67648

⸱

31 januari 2025

 , 
1Department of Immunology, Harvard Medical School, 2Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Samenvatting

De long wordt continu blootgesteld aan ziekteverwekkers en andere schadelijke prikkels uit de omgeving, waardoor hij kwetsbaar wordt voor schade, disfunctie en de ontwikkeling van ziekten. Studies waarbij gebruik wordt gemaakt van muismodellen van luchtweginfectie, allergie, fibrose en kanker zijn van cruciaal belang geweest om mechanismen van ziekteprogressie aan het licht te brengen en therapeutische doelen te identificeren. De meeste onderzoeken gericht op de muizenlong geven echter prioriteit aan de isolatie van immuuncellen of epitheelcellen, in plaats van beide populaties gelijktijdig. Hier beschrijven we een methode voor het bereiden van een uitgebreide eencellige suspensie van zowel immuun- als niet-immuunpopulaties die geschikt zijn voor flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze populaties omvatten epitheelcellen, endotheelcellen, fibroblasten en een verscheidenheid aan subsets van myeloïde cellen. Dit protocol omvat bronchoalveolaire lavage en daaropvolgende inflatie van de longen met dispase. Longen worden vervolgens verteerd in een liberasemengsel. Deze verwerkingsmethode maakt een verscheidenheid aan verschillende celtypen vrij en resulteert in een eencellige suspensie die geen handmatige dissociatie tegen een filter vereist, waardoor de overleving van cellen wordt bevorderd en grote aantallen levende cellen worden opgeleverd voor stroomafwaartse analyses. In dit protocol definiëren we ook poortschema's voor subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen in zowel naïeve als met griep geïnfecteerde longen. Gelijktijdige isolatie van levende immuun- en niet-immuuncellen is de sleutel tot het ondervragen van intercellulaire overspraak en het verkrijgen van een beter begrip van longbiologie bij gezondheid en ziekte.

Inleiding

De long bestaat uit de luchtwegen, longblaasjes en interstitium. Immuun- en niet-immuuncellen bevinden zich in deze compartimenten om bij te dragen aan zowel de homeostatische longfunctie (gasuitwisseling) als de verdediging van de gastheer tegen omgevingsfactoren, zoals virale infectie. De grote en kleine luchtwegen, of de bronchiën en bronchiolen, zijn bekleed met epitheelcellen. De overheersende epitheelcellen in deze regio's zijn knots- en trilhaarcellen die verantwoordelijk zijn voor het afscheiden van beschermende moleculen en het vergemakkelijken van de mucociliaire klaring1. De longblaasjes zijn de meest distale structuren in de long, bekleed door twee epitheelceltypen, alveolaire type I-cellen (ATI's) en alveolaire type II-cellen (ATII's). ATI's zijn verantwoordelijk voor de gasuitwisseling en ATII's scheiden oppervlakteactieve stoffen af en recyclen deze om de juiste oppervlaktespanning te garanderen 2,3. ATII's zijn zelfvernieuwend en kunnen ook differentiëren in ATI's, een rol die vooral relevant is na longschade4. Bovendien bieden ATII's een ondersteunende niche voor het belangrijkste immuunceltype dat de alveolaire niche bevolkt, alveolaire macrofagen (AM's)5,6. Naast het epitheel vormen fibroblasten, endotheelcellen en interstitiële macrofagen (IM's) (die zowel zenuw- als vaatgeassocieerd kunnen zijn) het interstitium 7,8,9,10. Als reactie op infectie en letsel sterven talloze longcellen af en infiltreren immuuncellen, waaronder monocyten en neutrofielen, in het weefsel11,12. Long-infiltrerende monocyten differentiëren tot macrofagen en kunnen op lange termijn bijdragen aan het macrofaagcompartiment13.

De huidige methoden voor het bereiden van eencellige suspensies uit de muizenlong zijn over het algemeen gebaseerd op collagenase en vereisen fysieke dissociatie van weefsel14. Dit kan resulteren in een laag aantal levensvatbare niet-immuuncelpopulaties. Sommige protocollen om epitheelcellen te isoleren zijn gebaseerd op dispase en leveren grotere hoeveelheden levende epitheelcellen op; Deze protocollen onderzoeken echter over het algemeen niet de opbrengst en levensvatbaarheid van immuuncellen 15,16,17. Flowcytometrie is een veelgebruikte methode die wordt gebruikt om celpopulaties in een verteerd weefsel te onderscheiden. Bij aanvang is de flowcytometrie voor AM's, IM's, monocyten en neutrofielen duidelijk afgebakend. Tijdens ontsteking wordt het poortingsproces echter variabel en uitdagend om te interpreteren vanwege het continuüm in de expressie van oppervlaktemarkers van infiltrerende monocyten die differentiëren tot macrofagen. Daarom schetst het hierin gepresenteerde protocol ook poortstrategieën om myeloïde celpopulaties te identificeren die van belang zijn na infectie.

Robuuste dissociatie van longepitheel- en myeloïde cellen is essentieel om hun homeostatische en ontstekingsfuncties te onderscheiden. Een methode om deze celcompartimenten parallel te isoleren, maakt de stroomafwaartse analyses mogelijk van belangrijke celtypen die zowel de gezondheid behouden als ziekten veroorzaken. Een schematisch overzicht van de workflow van dit protocol is te vinden in Figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol voldoet aan de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Harvard Medical School (subsidienummers: R35GM150816 en P30DK043351). Vrouwelijke C57BL/6J-muizen in de leeftijd van 8-12 weken werden gebruikt voor de experimenten. Dit protocol is ook geschikt voor mannelijke muizen. De details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, zijn te vinden in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van materialen

  1. Ontdooi de noodzakelijke enzymen op ijs, waaronder dispase, liberase en DNAse.
  2. Bereid andere noodzakelijke reagentia voor. Vul een spuit van 10 ml met 5 ml 2 mM EDTA in DPBS en plaats deze met een naald van 27 G. Vul de spuit van 1 ml met DPBS en bevestig de katheter.

2. De longen oogsten

  1. Euthanaseer de muis door intraperitoneale injectie van 400-500 mg/kg en 25-100 mg/kg ketamine/xylazinemengsel (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Ga verder met dissectie zodra de muis niet meer reageert op het beknellen van het voetkussen (~5 min).
    OPMERKING: Een ketamine/xylazine-mengsel wordt gebruikt voor euthanasie in plaats van kooldioxide om door verstikking veroorzaakte bloedingen en infiltratie van immuuncellen te voorkomen die de resultaten kunnen verstoren.
  2. Spuit de muis in met 70% ethanol. Ontleed de muis met behulp van een fijne chirurgische schaar en #7 pincet. Maak met een schaar een incisie in de buik en knip zijdelings door het buikvlies.
    1. Maak een kleine snee in het diafragma om het vacuüm op te heffen. Snijd het middenrif en de onderste ribbenkast uit de lichaamsholte om de longen en het hart bloot te leggen.
  3. Bevochtig de longen met 5 ml 2 ml EDTA in DPBS in een spuit van 10 ml voorzien van een naald van 27 G. Perfusie wordt uitgevoerd door met de naald de basis van het hart binnen te gaan, van rechts naar de linker hartkamer te leiden en langzaam vloeistof uit de spuit18 te gieten.
    OPMERKING: Perfusie moet langzaam worden uitgevoerd om gescheurd vaatstelsel te voorkomen.
  4. Open de ribbenkast bij het borstbeen door de zijkanten van de ribbenkast weg te snijden en snijd vervolgens verticaal door het borstbeen om de luchtpijp19 bloot te leggen. Knip zoveel mogelijk spier- en bindweefsel weg met een fijne schaar en #7 pincet zonder de luchtpijp of longen te doorboren.
  5. Wikkel de luchtpijp in hechtdraad (maat 2-0) alsof u deze wilt afbinden, maar zonder vast te draaien. Snijd de luchtpijp zijdelings in en breng de katheter in. Zet de hechting stevig om de katheter vast door de hechtdraad strak te trekken. Breng de katheter niet verder dan 1 cm in de long.
  6. Blaas de longen op met 1 ml DPBS. Trek de DPBS eruit door de spuit langzaam terug te trekken. Blaas de longen opnieuw op met dezelfde DPBS en trek de spuit opnieuw terug om bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) te oogsten.
  7. Koppel de spuit los van de katheter en laat de katheter ingebracht. Doseer BALF in een microcentrifugebuisje.
  8. Vul dezelfde spuit van 1 ml met 1 ml dispase en bevestig deze opnieuw aan de katheter. Doseer de spuit om de longen op te blazen met dispase. Span tijdens het verwijderen van de katheter de hechtdraad rond de luchtpijp aan om lekkage van dispase te voorkomen.
  9. Snijd de luchtpijp zijdelings door. Verwijder de longen uit de lichaamsholte door het bindweefsel langs de achterkant van de ribbenkast door te snijden terwijl u een tang gebruikt om de longen en luchtpijp omhoog te trekken.
  10. Verwijder het hart uit de longen. Plaats de longen in 5 ml DPBS op ijs.
  11. Neem nu de afgescheiden BALF en draai deze gedurende 5 minuten bij 4 °C naar beneden op 400 x g . Het bovenstaande kan naar behoefte worden verdeeld en opgeslagen. Er moet een zichtbare celpellet zijn die kan worden geresuspendeerd in 100 μL RPMI.
    OPMERKING: Men kan tot 2 uur wachten om door te gaan met de spijsvertering, waardoor meerdere muizen tegelijk kunnen worden geoogst.

3. Het verteren van de longen

  1. Bereid de digest mix voor. Voeg 83 μg/ml liberase (50 μl stockoplossing) en 100 μg/ml DNAse (15 μl stockoplossing) toe in 3 ml RPMI per long.
  2. Ontleed de vijf lobben van de longen en gooi eventueel bindweefsel weg19,20. Hak de long met een schaar 1 minuut af op een glasplaatje.
  3. Breng de gehakte long over in een centrifugebuis van 50 ml met behulp van een dissectieschaar. Voeg de celpellet die uit BALF is teruggewonnen en in RPMI is geresuspendeerd, toe aan de centrifugebuis. Voeg 3 ml digest mix toe aan de buis met het monster met behulp van een serologische pipet van 5 ml.
  4. Pipette-longverteringsmengsel 2-3 keer op en neer. Plaats bij 37 °C in een orbitale schudder bij 140 tpm met digestiebuizen die gedurende 40 minuten in een hoek van 45 graden zijn geplaatst.

4. Voorbereiding van de eencellige suspensie

  1. Verwijder de centrifugebuisjes van 50 ml uit de orbitale shaker en plaats ze op ijs. Pipetlongverteringsmengsel 5-6 keer op en neer. Filtreer door een celzeef van 70 μm in een nieuwe buis van 50 ml. Spoel de resterende cellen door het filter en neutraliseer enzymen met 10 ml 5% FBS in RPMI.
  2. Centrifugeer gedurende 5 min 4 °C op 600 x g. Zuig het bovenstaande op met behulp van een vacuümzuiger of pipet. Resuspendeer in 1 ml ACK-lysisbuffer en incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen (RBC's) te lyseren. Voeg 9 ml PBS toe en pipetteer op en neer.
  3. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g. Zuig supernatans op met behulp van een vacuümzuiger of pipet. Resuspendeer in 1 ml FACS-buffer (1% FBS in PBS) en filtreer door een gaas van 64 μm in een microcentrifugebuisje met behulp van een p1000-pipet.

5. Flowcytometrie en stroomafwaartse analyses

  1. Als u flowcytometrie of door fluorescentie geactiveerde celsortering uitvoert in een plaat met 96 putjes, kleurt u ongeveer 1-2 miljoen cellen per putje, of een fractie van 8% van de longsuspensie.
  2. Draai de cellen naar beneden. Alle spins in een plaat met 96 putjes moeten gedurende 2,5 min (4 °C) bij 600 x g worden uitgevoerd. Veeg het bovenstaande weg en was de cellen eenmaal door ze opnieuw te suspenderen in 200 μl DPBS. Draai naar beneden en veeg.
  3. Als cellen moeten worden gekleurd voor flowcytometrie-analyse, ga dan verder met de volgende kleuringsprocedure.
    1. Resuspendeer cellen in levende/dode Zombie-kleuring (1:150) en Fc-blok (1:250) in 25 μL DPBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
    2. Bereid de antilichaamkleuringsmix voor in een concentratie van 2x in de FACS-buffer.
      OPMERKING: Een kleuringsmengsel moet alle markers in het myeloïde paneel (tabel 1) of het epitheelpaneel (tabel 2) bevatten in de aangegeven concentraties.
    3. Voeg 25 μl kleuringsmengsel toe aan 25 μl longsuspensie in een plaat en incubeer 30 minuten in het donker op ijs. Het totale kleuringsvolume moet nu 50 μL zijn en primaire antilichamen moeten hun uiteindelijke 1x kleuringsconcentratie hebben.
    4. Voeg 150 μL FACS-buffer toe, draai gedurende 2,5 minuut bij 4 °C bij 600 x g en schakel de supernatant uit. Was tweemaal in 200 μL FACS-buffer.
    5. Als intracellulaire kleuring nodig is, fixeer de cellen dan met een intracellulaire fixatiekit. Als intracellulaire kleuring niet nodig is, kunnen de cellen gedurende 20 minuten worden gefixeerd in 4% PFA in DPBS.
    6. Was het fixeermiddel driemaal af met 200 μL FACS-buffer. Monsters kunnen geresuspendeerd worden bewaard in 200 μL FACS-buffer bij 4 °C in het donker gedurende 2-3 dagen. Voordat monsters worden genomen, kan het tellen van kralen worden toegevoegd om het aantal cellen te kwantificeren.
  4. Als cellen moeten worden gesorteerd, gaat u verder met de volgende kleuringsprocedure.
    1. Resuspendeer cellen in 1x kleuringsantilichaammix met Fc-blok (1:250). Incubeer gedurende 30 minuten op ijs in het donker.
    2. Voeg 150 μL FACS-buffer toe, draai gedurende 2,5 minuut bij 4 °C bij 600 x g en schakel de supernatant uit. Was driemaal met 200 μl FACS-buffer en suspendeer opnieuw in 200 μl FACS-buffer alvorens te sorteren.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om vóór het sorteren een levensvatbare kleurstof, zoals DAPI, aan cellen toe te voegen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een succesvolle digestie zal resulteren in ongeveer 20-25 miljoen cellen met een levensvatbaarheid van 90%-95%. Als ongeveer 25.000 telkralen worden toegevoegd aan een 8% fractie van de long, zouden kralen 1%-3% van de verzamelde gebeurtenissen moeten compromitteren. Na het afschermen van singlets zou ongeveer 90%-95% van de cellen Zombie Aqua-negatief moeten zijn (wat de levensvatbaarheid aangeeft) (Figuur 2A, Figuur 3A).

<...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol schetst een longdigestie van muizen die ongeveer 20-25 miljoen cellen per muis isoleert met een levensvatbaarheid van 90%-95%. Het maakt het bovendien mogelijk om BALF te verzamelen voor verdere analyse. De resulterende celsuspensie is compatibel met meerdere laboratoriumtechnieken, waaronder flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering om cellen te isoleren voor sequencing of celkweek. In het kort, na perfusie wordt BALF verzameld en worden de longen opgeblazen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R35GM150816 en P30DK043351), de Charles H. Hood Foundation en het Harvard Stem Cell Institute. We danken Alexander Mann en alle andere leden van het Franklin-laboratorium voor hun hulp en advies bij het ontwerpen en verfijnen van de schema's en analyses van de flowcytometrie. We danken ook de Immunology Flow Cytometry Core aan de Harvard Medical School. Flowcytometrie-analyse werd uitgevoerd met behulp van FlowJo. Figuurschema's zijn gemaakt met behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL syringe with Slip TipVWRBD309659
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMT
10 mL pipettes (disposable)Fisher Scientific12-567-603
10 mL Syringe with BD Luer-Lok TipVWR75846-756
123 count eBeads Counting BeadsThermo Scientific01-1234-42
12-channel pipette (30-300ul)USA Scientific 7112-3300
16% paraformaldehydeVWR100503-917
23 G needle with regular bevelVWR305194
27 G needle with regular bevelVWRBD305109
5 mL pipettes (disposable)Thermo Fisher Scientific170373
50 mL centrifuge tubesOlympus 28-108
96-well round bottom plateCorning3797
ACK lysing bufferGibcoA100492-01
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11cBioLegend117311
Anti-F4/80 Rat Monoclonal Antibody (PE (Phycoerythrin)/Cy7)BioLegend123114
APC anti-mouse CD64 (FcγRI)BioLegend139306
APC/Cyanine7 anti-mouse CD45BioLegend103115
BD Insyte Autoguard Shielded IV CathetersVWR381423
Brilliant Violet 421 anti-mouse I-A/I-E (MHC-II)BioLegend107632
Brilliant Violet 421 anti-mouse/human CD11bBioLegend101235
Brilliant Violet 605 anti-mouse Ly-6CBioLegend128036
Brilliant Violet 711 anti-mouse CD45BioLegend103147
C57BL/6J mice Jackson Laboratories
Cd140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), PE-Cyanine7, eBioscienceLife Technologies25-1401-82
CD170 (Siglec F) Monoclonal Antibody (1RNM44N), PELife Technologies12170280
Cell strainersCorning352350
CentrifugeEppenodorfCentrifuge 5910R
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase)Millipore SigmaDN25-100MGReconstituted at 20 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
DispaseVWR76176-668Thawed once and stored as 1mL aliquots at -20 °C
Dissection forceps (Dumont #7)Fine Science Tools11297-00
Dissection scissorsFine Science Tools14060-09
DPBSThermo Fisher Scientific14190250
eBioscience fixation kitLife Technologies00-5523-00
EDTALife TechnologiesAM9260G
EthanolVWRTX89125170HU
FBSGeminiBio100-106Thawed once and heat-inactivated before long-term storage as aliquots at -20 °C
FITC anti-mouse CD31 AntibodyBioLegend102406
Gibco RPMI 1640 MediumFisher Scientific11-875-093
Glass slidesFisher Scientific12-552-3
graduated reservoirUSA Scientific 1930-2235
Ice bucketCorning432128
Ketamine hydrocholoride injection (100 mg/mL)DechraKetamine and xyalazine euthanization mixture can be kept at 30 mg/mL ketamine hydrochloride and 4.5mg/mL xylazine in sterile DPBS for up to one month.
LiberaseMillipore Sigma5401119001Reconstituted at 5 mg/mL in DPBS as stock solution stored at -20 °C
Lids for 96-well platesFisher Scientific07-201-731
Orbital Incubator ShakerBarnstead Lab-LineSHKE4000
p1000 pipetteEppenodorf3123000063
p1000 tipsUSA Scientific 1122-1830
p200 pipetteEppenodorf3123000055
p200 tipsUSA Scientific 1110-1700
PE anti-mouse CD326 (Ep-CAM)BioLegend118206
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD104 AntibodyBioLegend123614
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse Ly-6GBioLegend127616
Pipet-Aid Drummond4-000-101
Purified anti-mouse CD16/32 BioLegend101302Referred to as "Fc block" in text
Spray bottleVWR23609-182
Suture (Size 2-0)VWR100190-026
UnderpadsVWR56617-014
Xysed (xylazine 100mg/mL)PivetalSee ketamine hydrocholoride notes above. 
Zombie Aqua Fixable Viability KitBioLegend423102

Referenties

  1. Wanner, A., Salathé, M., O'Riordan, T. G. Mucociliary clearance in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 154 (6), 1868-1902 (1996).
  2. Mason, R. J., Williams, M. C. Type II alveolar cell. Defender of the alveolus. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 81-91 (1977).
  3. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir Res. 2 (1), 33-46 (2001).
  4. Basil, M. C., Alysandratos, K. -D., Kotton, D. N., Morrisey, E. E. Lung repair and regeneration: Advanced models and insights into human disease. Cell Stem Cell. 31 (4), 439-454 (2024).
  5. Hussell, T., Bell, T. J. Alveolar macrophages: plasticity in a tissue-specific context. Nat Rev Immunol. 14 (2), 81-93 (2014).
  6. Gschwend, J., et al. Alveolar macrophages rely on GM-CSF from alveolar epithelial type 2 cells before and after birth. J Exp Med. 218 (1), e20210745(2021).
  7. Gillich, A., et al. Capillary cell-type specialization in the alveolus. Nature. 586 (7831), 785-789 (2020).
  8. Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nat Commun. 10 (1), 3964(2019).
  9. Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), eaat3773(2019).
  10. Tsukui, T., et al. Collagen-producing lung cell atlas identifies multiple subsets with distinct localization and relevance to fibrosis. Nat Commun. 11 (1), 1920(1920).
  11. Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nat Immunol. 21 (2), 145-157 (2020).
  12. Johansson, C., Kirsebom, F. C. M. Neutrophils in respiratory viral infections. Mucosal Immunol. 14 (4), 815-827 (2021).
  13. Li, F., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages autonomously determine severe outcome of respiratory viral infection. Sci Immunol. 7 (71), eabj5761(2022).
  14. Moll, H. P., et al. Orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study PD-L1 expression. J Vis Exp. (143), e58101(2019).
  15. Warshamana, G. S., Corti, M., Brody, A. R. TNF-α, PDGF, TGF-β1 expression by primary mouse bronchiolar-alveolar epithelial and mesenchymal cells: TNF-α induces TGF-β1. Exp Mol Pathol. 71 (1), 13-33 (2001).
  16. Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 14 (3), 309-315 (1996).
  17. Quantius, J., et al. Influenza virus infects epithelial stem/progenitor cells of the distal lung: Impact on Fgfr2b-driven epithelial repair. PLoS Pathog. 12 (5), e1005544(2016).
  18. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. BIO Protoc. 11 (8), e3988(2021).
  19. Morton, J., Snider, T. A. Guidelines for collection and processing of lungs from aged mice for histological studies. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 7 (1), 1313676(2017).
  20. Bijgaart, R. J. E., van den Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo live imaging of lung metastasis and their microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
  21. Shi, W., et al. Isolation and purification of immune cells from the liver. Int Immunopharmacol. 85, 106632(2020).
  22. Short, K. R., et al. Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions. Eur Respir J. 47 (3), 954-966 (2016).
  23. Laidlaw, B. J., et al. CD4+ T cell help guides formation of CD103+ lung-resident memory CD8+ T cells during influenza viral infection. Immunity. 41 (4), 633-645 (2014).
  24. D'Agostino, M. R., et al. Protocol for isolation and characterization of lung tissue-resident memory T cells and airway-trained innate immunity after intranasal vaccination in mice. STAR Protoc. 3 (2), 101652(2022).
  25. Waal, A. M., de Hiemstra, P. S., Ottenhoff, T. H., Joosten, S. A., vander Does, A. M. Lung epithelial cells interact with immune cells and bacteria to shape the microenvironment in tuberculosis. Thorax. 77 (4), 408-416 (2022).
  26. Bhattacharya, J., Westphalen, K. Macrophage-epithelial interactions in pulmonary alveoli. Semin Immunopathol. 38 (4), 461-469 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muislongcellenisolatie van myelo de cellenisolatie van epitheelcellensingle cell suspensieflowcytometriecell sortingbronchoalveolaire lavagelongdigestieisolatie van immuuncellengating van celpopulaties

Gerelateerde artikelen